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I PARCIAL DE BACTERIOLOGIA PRACTICO VALIDO PARA LA EVALUACIN TRIMESTRAL COLABORACION DE LA CATEDRA DE BACTERIOLOGIA PRACTICA PARA LOS ESTUDIANTES SIN COSTO ALGUNO. ESTE DOCUMENTO PUEDE SER REPRODUCIDO SIN NINGUN PROBLEMA LEGAL DIGALE NO A LA CORRUPCIN Y

NO A

LA COMPRA DE FOLLETOS A CAMBIO DE PUNTOS.

Nota: Cada Presidente de grupo acercarse a la secretaria para sacar copia y distribuir entre sus compaeros.

INDICE

INTRODUCCION.
BIOSEGURIDAD EN MICROBIOLOGIA. INSTRUMNETOS UTILIZADOS EN BACTERIOLOGIA PRACTICA. TOMA DE MUESTRAS. ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE COLECCIONES SUPURATIVAS. MUESTRAS ESPECIALES PARA EL DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO. TECNICAS EN PREPARACION DE FROTIS Y SU FIJACION. METODOS FISIOLOGICOS DE IDENTIFICACION BACTERIANA. TECNICAS DE COLORACION DE LAS BACTERIAS. MEDIOS DE CULTIVOS DE USOS FRECUENTES EN BACTERIOLOGIA. FAMILIA MICROCOCACEAE. AUTOVACUNAS. FAMILIA ESTREPTOCOCACEAE. FAMILIA NEISERIACEAE. ENFERMEDADES DE TRANSMISION SEXUAL (E.T.S.) CHLAMYDIAS. BACTERIAS BACILARES. COPROCULTIVO. FAMILIA VIBRIOCEAE. UROCULTIVO. HEMOCULTIVO. ANTIBIOGRAMA. REACCIONES INMUNOLOGICAS BACTERIANAS REACCIONES BIOQUIMICAS DE LA ENTEROBACTERIAS. DIAGNOSTICO DE BACTERIAS ANAEROBIAS. CONTROL DE CALIDAD EN MICROBIOLOGIA.

ESPIROQUETAS (TREPONEMAS,LEPTOPIRAS Y BORRELIAS)

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS MDICAS
GUIA PRACTICA DE BACTERIOLOGIA AUTORES:
DR. MIGUEL VARGAS DR. JUAN MORENO DR. ERNESTO RONQUILLO DR. EDMUNDO BUAY DR. CARLOS MOSQUERA DR. EDUARDO FLORENCIA DR. ROBERTO VILLACIS. DRA. JOSEFINA RAMIREZ DRA. HILDA ROSADO DRA. MARTHA GUEVARA( +) DRA. JANETT RECALDE DR. JULIO ROMERO DR. JULIO GUZMAN DR. GONZALO ZAVALA

DR: EDUARDO CHANCAY LOPEZ "COORDINADOR DE LA CATEDRA"

GUAYAQUIL

NOVIEMBRE 1995

REVISADO Y ACTUALIZADO EN JULIO 2002 POR EL DR : EDUARDO CHANCAY L . PROFESOR PRINCIPAL DE LA CATEDRA.

INTRODUCCION
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Esta gua de trabajos prcticos de la Ctedra de Bacteriologa de la Facultad de Ciencias Mdicas de la Universidad Estatal de Guayaquil, nace como una alternativa didctica cientfica, a la propuesta del Rectorado de la referida Universidad de realizar un trabajo monogrfico para el ascenso de Profesores Auxiliares a Profesores Agregados, y la misma se propone los siguientes objetivos: OBJETIVOS GENERALES: 1. - Aplicar los conocimientos tericos-prcticos de la Asignatura. 2. - Ampliar los conocimientos actuales acerca de las Bacterias, y los variados mtodos para su diagnstico. 3. - Profundizar en las tcnicas de Diagnstico Bacteriolgico. 4. - Describir algunos procedimientos fundamentales de la microscopa Bacteriana. 5. - Utilizar adecuadamente los mtodos de aislamiento de los Cultivos Bacterianos. 6. - Demostrar tcnicas especficas de tincin General y especial de las Bacterias. 7. - Usar los instrumentos adecuados en Bacteriologa. 8. - Estudiar la estructura y funcin de las clulas bacterianas. 9. - Dar instrucciones especficas sobre Bioseguridad. 10. - Seleccionar Material adecuado como: Audiovisuales, Grficos y variadas preguntas de evaluacin. 11. - Describir tcnicas actuales sobre Inmunologa Bacteriana. 12. - Conocer e identificar los Diferentes Medios de Cultivos Utilizados en Bacteriologa. La referida gua contiene varios procedimientos y tcnicas comunes. Adems se ha incluido grficos, dibujos y varias preguntas para evaluacin formativa. As mismo, al final de cada captulo se ha incluido una pequea bibliografa para el estudiante que desee obtener una informacin adicional sobre los principios y fenmenos descritos. Pretendemos al mismo tiempo la ambicin de aplicarlo a nuestra Facultad, an en las crisis econmica que incide en la adquisicin de los recursos materiales que se necesitan para desarrollar nuestro trabajo. Intentamos por lo tanto clarificar y difundir un nuevo enfoque paradigmtico en los procesos de Enseanza-Aprendizaje en forma sencilla, pero apoyados en el avance de la ciencia y la tecnologa Educativa Superior. Dr. Eduardo Chancay Lpez COORDINADOR DE LA CATEDRA DE BACTERIOLOGIA

AUTOR:DR EDUARDO CHANCAY L

BIOSEGURIDAD EN MICROBIOLOGIA La Facultad de CC.MM. No tiene ningn estudio acerca de las enfermedades ocasionadas por las prcticas que nuestros estudiantes y docentes realizan a diario en las diferentes ctedras en las que utilizamos materiales de alto riesgo, sea ste: Qumico, Fsico, Biolgico, Humano e infeccioso. Es por esta razn que nuestra Ctedra incorporar desde la presente gua, ste captulo de Bioseguridad en Microbiologa, con el objetivo de: 1. - Conocer y Aplicar el concepto y los principios de BIOSEGURIDAD EN MICROBIOLOGIA. 2. - Dar una serie de normas para la manipulacin correcta de agentes infecciosos, que los Profesores Auxiliares y estudiantes realizaremos durante todo el ao lectivo. DEFINICION.La Bioseguridad es la disciplina que se ocupa de la Prevencin de Riesgo Biolgico en personas, directa o indirectamente expuestos al mismo, producto de un trabajo de manipulacin de agentes infecciosos. Las medidas de Bioseguridad recomendada para los que trabajan con grmenes patgenos estn encomendadas a la Seguridad General y a la Particular de nuestros estudiantes y docentes. PRINCIPIOS DE LA BIOSEGURIDAD.La Bioseguridad consta de tres principios bsicos, para garantizar el aislamiento o contencin adecuada de los agentes infecciosos (Bacterias en nuestro caso). Las mismas son: a.- Tcnicas y Prcticas correctas en el laboratorio. b.- Equipos de Seguridad. C.- Diseo adecuado de las instalaciones del Laboratorio. a.- TECNICAS Y PRACTICAS.Es el elemento ms importante para la Bioseguridad y tiene el mayor peso en la Prevencin Eficiente del Riesgo Biolgico y recoge los procedimientos bsicos del trabajo prcticas de Higiene Personal y la conducta que deben observar los docentes y dicentes b.- EQUIPOS DE BIOSEGURIDAD.A los equipos de seguridad se los denomina tambin Barreras primarias, ya que constituyen la barrera directa entre el personal y el material infeccioso. Por ej. : - Instrumento de pipeteo,
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- Copas de seguridad para centrfugas, - Guantes - Mandil - Mscara respiratorias o faciales - etc. c.- DISEO ADECUADO DE LAS INSTALACIONES.A las instalaciones se las denomina Barreras Secundarias, ya que garantiza la proteccin del personal que trabaja en el edificio y fuera del laboratorio as como de la comunidad, del posible escape accidental de agentes infecciosos del laboratorio de Microbiologa. NORMAS PARA LA BIOSEGURIDAD. 1. - Usar mandil largo adecuado durante las prcticas y quitrselo antes de abandonar el laboratorio. 2. - No sacar jams equipos, medios de cultivos con Bacterias fuera del laboratorio. 3. - No pipetear con la boca. 4. - No comer, beber, fumar, guardar alimentos ni aplicar cosmticos en el laboratorio. 5. - Lavarse las manos despus de manipular el material infeccioso as como antes de abandonar el laboratorio. 6. - Mantener el laboratorio limpio, aseado y desinfectado. 7. - Todos los procedimientos y tcnicas se practicarn de manera que se evite en lo posible la formacin de aerosoles. 8. - Todos los derramamientos, accidentes y exposiciones reales, potencialmente de material infeccioso se notificarn de inmediato al instructor - jefe. 9. - Cada prctica los materiales del vidrio contaminados deben ser colocados en recipientes adecuados. 10. - Al comenzar las prcticas el instructor dar las pautas en forma oral de la bioseguridad.

AUTOR :DR GONZALO ZABALA VILLACIS

INSTRUMENTOS UTILIZADOS EN BACTERIOLOGIA PRACTICA

OBJETIVOS ESPECIFICOS DE LA CLASE. 1. - Que el alumno al final de la clase sea capaz de seleccionar los instrumentos de acuerdo al examen bacteriolgico a realizar. 2. - Que el alumno al final de la clase sea capaz de utilizar correctamente cada instrumento con la tcnica apropiada. 3. - Que el alumno al final de la clase sea capaz de demostrar todos los materiales de vidrio que se utilizan en los diferentes exmenes. 4. - Diferenciar cada instrumento en las diferentes tcnicas bacteriolgicas. MATERIALES Y METODOS: Entre los principales instrumentos usados en Bacteriologa lo podemos clasificar en: Materiales de vidrio, Instrumentos y Aparatos Entre los APARATOS tenemos: Autoclave, Horno, Estufa, Centrfuga, Microscopio Fluorescente, Microscopio Electrnico, Bao Mara, Contador de Colonias, Balanza, Peachmetro, Destilador de Agua. Entre los INSTRUMENTOS tenemos: Pinza portalminas, Aguja de inoculacin, Asa de inoculacin, Bajalengua, Aplicadores de madera, Esptula, Pinzas, Gradillas, Canastillas, Cinta indicadora de esterilizacin. MATERIALES DE VIDRIO. : Pipetas, Tubos de ensayo, Caja de petri, Lminas porta objeto y Cubre objeto, Matraz Erlenmeyer de cuello estrecho y cuello ancho, Matraz fondo plano, Matraz aforado, Densmetro, Probeta, Termmetro, Cubeta para tincin, Vaso de Copln, Vaso de precipitacin, Agitador, Frascos goteros, Mecheros. PIPETAS.Es un utensilio de vidrio cilndrico de gran utilidad que ofrecen un mximo nivel de exactitud y sirven para transferir de un recipiente a otro, cantidades especficas de lquido. Las pipetas son calibradas en 0.1, 0.2, 1, 2, 5, 10, 20 cc. etc. Las pipetas graduadas a partir de 5ml. tienen una boca de aspiracin conformada, que es adecuada para alojar un tapn de algodn. Los tapones de algodn pueden prolongar el tiempo de vertido y por lo tanto influir en la exactitud de la medicin.

El pipeteado a boca est prohibido! Debido al alto riesgo de infeccin. Resulta por lo tanto imprescindible utilizar un auxiliar de pipeteado, que son excelentes en forma y funcin. l ms sencillo y frecuente son las Peras de Goma que son de caucho natural y se adaptan bien a la mano. PIPETAS AUTOMATICAS.Con el advenimiento de la precisin, exactitud y adems con el objeto de romper la comunicacin con la boca del operador se crearon estas pipetas que ya las tenemos en el mercado y que van de pequeas cantidades hasta cantidades mayores, las tenemos de: 1, 5, 20, 25, 50, 100, 200, 250, 500, 1.000 ul. TUBOS DE ENSAYOS.Los tubos de ensayo para cultivo son de vidrio. Hay con bordes rectos y con roscas resistentes a la esterilizacin por vapor (121 C). Existen en diversas longitudes y dimetros. Los tubos con bordes rectos deben ser protegidos por un tapn estril de algodn revestidos de gasa, cuando contienen en su interior sustancias que se desean mantener estriles tales como solucin salina, agua destilada, etc. o en su defecto medios de cultivo (slidos, semislidos, lquidos). El tapn que los protege permite el paso del aire necesario para el crecimiento de las Bacterias, pero impide el paso de las impurezas del medio ambiente, de tal forma que ejercen una funcin filtrante. CAJAS DE PETRI.Las hay de vidrio y de polietileno. Las cajas de petri de vidrio borosilicato vidrio de soda. Elevada calidad de vidrio y de acabado. Fondo y tapa planos tanto en el interior como el exterior. Las cajas de petri sirven para envasar los medios de cultivo slidos, sobre los cuales se efectan siembras en estras para permitir una mejor individualizacin de las colonias. LAMINAS PORTA OBJETO.Son de vidrio ptico y sirven para realizar el frotis a observarse microscpicamente, ya sean estas preparaciones fijados y teidos o en frescos, deben ser con bordes pulidos y antes de su uso deben estar completamente limpios, excepto de polvo y grasa. Tambin hay porta objeto con cavidades, llamadas lminas excavadas. LAMINILLAS CUBRE OBJETO.Se emplean para cubrir las preparaciones en fresco a ser observadas microscpicamente. Las laminillas tienen por finalidad evitar cualquier contaminacin del manipulador, evitar que la preparacin se mueva con la corriente de aire exterior y nos da tambin una mayor superficie de observacin al microscopio. MATRACES.Los hay de cuello ancho y cuello estrecho de fondo plano y matraces aforados.
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MATRACES AFORADOS.Los matraces aforados son recipientes de vidrio, ofrecen un mximo nivel de exactitud. Los matraces aforados se suministran con tapn de PP. , Parte superior cuadrado, con punta de goteo. Este tapn reduce notablemente el peligro de rotura en caso de vuelco y evita que el matraz aforado se caiga al rodar por la mesa del Laboratorio. MATRAZ ERLENMEYER cuello estrecho.Son recipientes de vidrio con reborde y graduacin MATRAZ ERLENMEYER cuello ancho.Al igual que el anterior sino con la particularidad como su nombre lo indica es de cuello ancho. Ambos sirven para lectura del volumen aproximado y depositar medios de cultivo, fundir medios de cultivo en el autoclave. DENSIMETROS.Los densmetros son instrumentos de precisin imprescindible para determinar la densidad de lquidos o la concentracin de sustancias disueltas. PROBETA.Son recipientes de vidrio graduados y rotulados con pico y pie hexagonal que ofrecen un mximo nivel de exactitud. TERMOMETRO.Es un instrumento de vidrio imprescindible para la medicin de la temperatura en el laboratorio. La alta duracin de stos instrumentos de calidad se obtienen de su caracterstica de construccin de una sola pieza. CUBETA PARA TINCION, VASO DE COPLIN.Recipientes de vidrio sirven para mantener en posicin vertical u horizontal las lminas porta objetos, ya sea para someterlos a la accin tintorial de los colorantes tambin para eliminar el aceite de inmersin del frotis teidos despus de haber sido observados. VASO DE PRECIPITACION.Son recipientes de vidrio de forma baja y de forma alta con graduaciones, reborde y pico sirven para mezclar y preparar soluciones. AGITADOR DE VIDRIO.Los agitadores de vidrio son varillas que vienen con bordes redondeados que sirven para agitar y mezclar las soluciones usadas en el laboratorio y en las preparaciones de los medios de cultivos. FRASCOS GOTEROS.Sirven para almacenar diversas sustancias colorantes a ser utilizadas en los distintos mtodos de tincin, como su nombre lo indica permiten vaciar su contenido gota a gota para lo cual debe hacerse coincidir la ranura que existe tanto en la tapa del frasco como la que existe en el cuello del mismo. MECHEROS.9

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Existen de alcohol y de gas; stos ltimos producen una llama mas firme y potente. Los mecheros en general alrededor de la llama dan una rea dentro de la cual el material con el que se trabaja est libre de toda contaminacin con las Bacterias del medio ambiente. La llama del mechero sirve tambin para fijar el frotis a ser teidos y esterilizar el asa de alambre como la aguja del alambre antes y despus de ser usadas, representando stos una aplicacin directa del calor seco (incineracin). Debe recordarse que el mximo poder de la llama se encuentra en la punta de la misma.

INSTRUMENTOS
PINZAS.Las hay con extremos en puntas, redondeados y con extremos cuadrangulares de extraordinaria resistencia qumica y trmica, muy manejables. En Bacteriologa las utilizamos para los antibiogramas con los discos de sensibilidad y en las tinciones de frotis; Que hay unas pinzas llamadas portalminas que sirven para sujetar las lminas porta objeto en el momento que efectuamos la tincin de frotis ASA DE INOCULACION.El asa de inoculacin consiste de un alambre cuyo extremo distal termina en un aro de dimetro variable, dicho alambre est unido por su extremo proximal a un mango metlico. Tienen innumerables usos pero en general sirven para tomar el material con el que vamos a trabajar, ya sea ste una colonia a ser estudiada, gotas de diferentes sustancias lquidas o especmenes tales como heces, sedimento urinario, etc. AGUJA DE INOCULACION. Instrumento igual al anterior con la salvedad, de que el alambre en vez de terminar el aro termina en punta. Sirve para efectuar inoculaciones en la profundidad de los medios de cultivo o tambin cuando queremos individualizar colonia rodeada estrechamente de otras no deseables. Actualmente existen asas y agujas descartables de material de polietileno, la elevada flexibilidad del material permite una siembra suave sin daar la superficie del medio de cultivo, adems no es necesario flamear y enfriar tras cada proceso de trabajo. Por lo tanto ya no existe formacin de aerosoles. BAJALENGUAS.Sirven para deprimir la lengua y facilitar la toma de una muestra de exudado farngeo. Los hay de madera y metlicos, rectos y ligeramente curvos con extremos redondeados. APLICADORES DE MADERA ESTERILES.-

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Sirven para efectuar hisopados farngeos, vaginales, rectales, pticos y desde cualquier lesin productiva o supurativa ESPATULAS.Sirven para coger sustancias y pesarlas, terminan en extremo redondeado o en un extremo en forma de cuchara. CINTA INDICADORA DE ESTERILIZACION.Papel crepado, con colorantes sensibles al calor para esterilizacin al vapor.

APARATOS
AUTOCLAVE.Es un aparato que consiste de un caldero cilndrico de paredes resistentes, cerrado superiormente por una tapa que cierra hermticamente gracias a la interposicin de un empaque apropiado y a la presin ejercida por una serie de tornillos que la apretan. En el interior del cilindro existe un soporte sobre el cual se coloca una cesta metlica conteniendo el material a esterilizar; entre el fondo de la cesta y el caldero queda un espacio que se llena de agua. De modo general se puede considerar que el vapor saturado bajo presin de 15 libras por pulgada cuadrada con una temperatura de 120 C, es suficiente para esterilizar cualquier medio o instrumento de 15 a 30 minutos. HORNO O ESTERILIZADOR.Es un aparato que est constituido por un recipiente que puede ser rectangular o cuadrado de paredes dobles, revestido exteriormente de amianto y calentado por quemadores que pueden ser elctricos, gas, gasolina, Krex, etc. En el interior del horno existen repisas mviles y en la parte superior orificios o chimeneas de ventilacin y un orificio donde se coloca el termmetro graduado hasta 200 C. Generalmente se requiere para lograr la esterilizacin someter los materiales a una temperatura de 180 C por una o dos horas. En los laboratorios se utiliza el horno para esterilizar el material de vidrio tales como pipetas, fiolas, cajas de petri, etc. CONTADOR DE COLONIAS.Es un aparato elctrico que registra la cantidad de colonias que se encuentra en una muestra de cultivo de orina. MICROPLATOS.Son planos de polivinil, que se las utiliza especialmente en pruebas serolgicas: se usan en Pruebas de Fijacin del Complemento, Inhibicin de

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Hemoglutinacn, etc. estas placas estn constituidas por 96 hoyos divididos en filas 8 x12.

BALANZAS
BALANZA ABIERTA DE DOS PLATILLOS.Esta balanza cuenta con dos platillos que reposan en sendas columnas. Puede estar constituida para usarse con pesos separados, o tener un astil graduado en que se coloca una pesa corrediza. Se emplea para pesar cantidades grandes. Su sensibilidad es 0.5gr. (500mg). BALANZA ANALITICA.Esta balanza consta de dos platillos suspendidos de una astil dentro de un estuche de vidrio. Se emplea para pesar cantidades pequeas, cuando se requiere gran precisin. Su sensibilidad es de 0.5mg - 0.1mg. PEACHIMETRO.Es un aparato elctrico que sirve para medir el pH de las soluciones, medios de cultivo, etc. ESTUFA O INCUBADORA.Es un aparato metlico y elctrico suministra la temperatura ideal para el desarrollo de las Bacterias (generalmente de 35 a 37 grados) sembrados en los medios de cultivo. CENTRIFUGA.Es un aparato metlico que sirve para separar en sedimento de la porcin lquida de una sustancia. Se utiliza en los Urocultivos para centrifugar a una velocidad de 2500 r.p.m. durante 5 minutos. MICROSCOPIO ELECTRONICO.Es aquel que proporciona resoluciones (aumentos) de 700 mil dimetros (700 mm) o ms en el cual un campo magntico permite enfocar los rayos caractersticos (electrones) y obtener una imagen en la pantalla fluorescente. Existen dos tipos de microscopio electrnico: el de Barrido (Scanning) y el de Transmisin. El de Barrido permite observar pedazos de tejido de mayor tamao y nos da una imagen tridimensional. El de Transmisin permite observar cortes ultrafinos o tinciones negativas. MICROSCOPIO FLUORESCENTE.-

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Es aquel que est provisto de filtros que permiten observar con luz ultravioleta, sustancias teidas con colorantes fluorescentes. Con ste aparato se puede realizar dos tipos de pruebas: Fluorescencia Directa e Indirecta. BAO MARIA.Es un aparato elctrico que se usa con frecuencia en los laboratorios, el mismo que contiene agua y un termmetro para regular la temperatura. Sirve para incubar (inactivar) diferentes muestras: suero, autovacunas, una temperatura constante de 37 - 56 C. RESTRICCIONES DE LA TECNICA.No se puede emplear los instrumentos modernos ejemplo: pipetas automticas, densmetros por falta de materiales en la facultad que esperamos que se vayan obviando paulatinamente.

DR ERNESTO RONQUILLO

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CLASIFICACION DE LAS MUESTRAS CLINICAS.Segn la posibilidad de que las muestras clnicas para el cultivo bacteriolgico, estn contaminadas con la FLORA NORMAL se pueden dividir en tres reas. Hay distintos procedimiento en cada caso para ACCEDER al PATOGENO. A.- MUESTRAS DE AREAS PROFUNDAS Y CERRADAS DEL CUERPO (DIRECTAS). La muestra recogida contendr solo el germen patgeno. Debe atravesarse la piel para llegar al patgeno utilizando medios quirrgicos o POR ASPIRACION CON AGUJA. Asepsia previa. Ej. Sangre. B.- MUESTRAS DE AREAS PROFUNDAS QUE COMUNICAN CON EL EXTERIOR (INDIRECTAS). La muestra seguramente contendr AMBOS TIPOS DE GERMENES: Patgenos y de la Flora normal, pues estos ltimos estn en "el paso" para acceder al patgeno. Ej. Orina por miccin. C.- MUESTRAS DE AREAS SUPERFICIALES DEL CUERPO. La flora patgena y la no-patgena estn ASOCIADAS en el lugar de la infeccin; ambos tipos son recogidos en la muestra. Los grmenes no patgenos no deben tomarse en cuenta al interpretar los resultados del cultivo. El instrumento mas til en la recoleccin de estos especmenes es la TORUNDA, un aplicador con la punta envuelta en algodn, fibra de poliester, alginato de calcio, o dacrn. Ej. : Piel y membranas mucosas. OBTENCION DE LAS MUESTRAS. ORINA. MATERIAL. - Frasco de vidrio o de plastico estril PROCEDIMIENTO. 1. - En la MUJER puede hacrselo en posicin sentada o en cuclillas. a.- Apartar los labios uretrales con los dedos ndice y anular, desde arriba. b.- Lavar cuidadosamente la vulva con una esponja mojada con una solucin jabonosa no bactericida. Un buen agente de limpieza es el jabn de lavar comn. Repetir 3 veces. Se eliminan los restos del lavado con una gasa estril. c.- La miccin se efecta manteniendo los labios separados, recogiendo una muestra del chorro medio, en un recipiente estril. 2. - En el HOMBRE. a.- Retraer el prepucio y lavar el glande de igual forma. 3. - En el INFANTE.
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a.- Lavar los genitales de la misma manera. b.- Utilizar el Reflejo de Prez. c.- Si fracasa esta maniobra, colocar una bolsita esterilizada sobre los genitales, para recoger espontneamente la orina. En estos casos deber recogerse la primera muestra de la maana. En los dos primeros casos recoger la parte intermedia de la miccin. HECES Las heces debern ser frescas, y si tienen sangre o pus, stas debern seleccionarse para cultivo, pues es all donde abundan los microorganismos patgenos. PROCEDIMIENTO.- Se debe utilizar para la toma de muestra un bajalenguas, cuchillo o cucharilla estriles para transferir al recipiente adecuado estril, una porcin del excremento. - El material fecal deber ser recin emitido. - De heces formadas se transfiere un pedazo del tamao de una nuez, de heces pastosas o lquidos: 1 - 2 ml (una cucharilla cafetera). FARINGE Y NASOFARINGE. PROCEDIMIENTO.- Se deber tomar solo con una visin clara de la faringe, buena luz y utilizando un bajalengua. Se evitar rozar otras estructuras. Prevenir al paciente concurrir en ayunas sin lavarse los dientes con pasta dental. - Se dispondr de dos hisopos, preferentemente humedecidos en tripticasa de soja. - Con los hisopos se tocar el fondo de la garganta, amgdalas, fosas tonsilares y cualquier otro lugar donde exista inflamacin, exudado o ulceracin. El frote debe ser enrgico, de lo contrario ser un espcimen deficiente para el cultivo. - Uno de los hisopos se usar para hacer tinciones, y el otro para hacer cultivo. El estreptococo del grupo A es la nica causa bacteriana comn de faringitis, por ello la estrategia diagnstica en cultivos de garganta tiene por finalidad identificar en forma selectiva este agente. ESPUTO. PROCEDIMIENTO. - El material se recoger en un frasco estril de boca ancha. - Que la expectoracin se efecte, si el paciente est en condiciones de hacerlo despus de cepillarse los dientes y enjuagarse concienzudamente. - Se recoger una expectoracin de la primera hora de la maana, que est mas limpia, inmediatamente despus de una tos profunda en que se expectoren secreciones de los pulmones. - La muestra se procesar enseguida. En LACTANTES, el esputo se obtiene haciendo un frotis de la garganta o mejor an por lavado gstrico ya que los nios generalmente degluten su expectoracin. HEMOCULTIVOS. El hemocultivo consiste en cultivar una cierta cantidad de sangre de un paciente. Como la sangre es lquida orgnico estril, el hallazgo de microorganismos en ella
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indicar infeccin, generalmente de carcter grave. Es esencial un cumplimiento escrupuloso de las normas para la recogida asptica de las muestras. PROCEDIMIENTO. - La toma de la muestra se realiza en la vena superficial de la parte interna de la flexura del codo. Se limpia previamente la zona desinfectndola con yodo y alcohol. Se repite el mismo procedimiento en el tapn de goma del frasco del hemocultivo, manteniendo su contacto por un minuto. - No palpar el sitio de puncin luego de desinfectada la zona. La puncin puede efectuarse con aguja y jeringa, o con los instrumentos de doble aguja que existen especialmente para este fin. - Inocular la sangre directamente en medio de cultivo a la cabecera de la cama. - Ante una bacteremia de origen desconocido es conveniente tomar dos muestras e incubarlas aerbica y anaerobicamente. - Despus de la extraccin de sangre se taponar la herida con algodn y alcohol 70. La cantidad de muestra y el nmero a tomar depender de la edad y circunstancias del paciente. EXUDADO OTICO Las infecciones externas del odo frecuentemente son secundarias a heridas al rascarse las partes externas, con algn objeto punzante, infecciones por virus que se infectan secundariamente, alergias, prcticas de natacin. - La toma se realiza despus de haber limpiado y desinfectado concienzudamente el pabelln auricular. - Si hay supuracin la toma se realiza con hisopo. Si existe fornculo, se efecta con aguja y jeringa. Se realizan las preparaciones microscpicas y se siembra en los medios adecuados. EXUDADOS VAGINAL Y URETRAL. Las enfermedades de transmisin sexual (ETS) pueden causar con Exudado Vaginal o con Ulceras y/o tumoraciones. PROCEDIMIENTO. - Cuando hay sospecha de infeccin vaginal o uterina, se introducir l especul con el mnimo de lubricante que permita la comodidad de la paciente (a veces basta el agua tibia), ya que la mayor parte de los lubricantes son bacteriostticos. - Es til el empleo y envo de dos hisopos con muestra del exudado vaginal, uno seco y otro introducido en un medio de transporte (Stuart, A o Cary-Blair). El primero se utilizar para el examen en fresco y tinciones, y el segundo para los cultivos. - Para investigar la presencia de Gonococo, nunca se tomarn muestras de vulva ni de vagina, pues difcilmente son positivas. La muestra se tomar con ayuda de un especul, despus de haber extrado el tapn mucoso que recubre el crvix, de endocrvix, introduciendo la punta en un hisopo a travs de un catter de luz estrecha colocado en la abertura cervical. De este modo se evita tocar la mucosa cervical reduciendo la posibilidad de contaminacin.
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En el caso de las nias en la pubertad que presentan epitelio vaginal apto para el desarrollo del gonococo, se tomar la muestra de dicho sitio. - Casi la mitad de las mujeres afectadas de gonorrea alojan gonococos en el conducto anal; por lo tanto se har un cultivo rectal. En el caso de las infecciones genitales en el hombre: Una suave presin del pene permite obtener una muestra til para el cultivo y el frotis coloreado con el Gram. TECNICAS DE SIEMBRA BACTERIANA. CONTENIDO Siembra o inoculacin es extender una pequea cantidad de muestra sobre la superficie de la placa con agar, con un sistema de actuacin preestablecido y con la ayuda de una asa de alambre fino o de plstico desechable. Este sistema de separacin recibe el nombre de SIEMBRA POR AGOTAMIENTO EN SUPERFICIE. Las bacterias bien aisladas unas de otras crecern como pequeas masas de microorganismos, alcanzando unos 2 a 3 mm de dimetro al cabo de una incubacin de 18 a 24 horas, denominadas COLONIAS, que a simple vista pueden verse en la superficie del agar. Cada colonia est formada por billones de grmenes y constituyen todos los descendientes de un solo microorganismo que fue a parar a dicho lugar. MATERIAL A UTILIZAR: - Mechero de alcohol. - Tubo de ensayo con l inocul o muestra. - Caja de petri con el medio de cultivo estril. - Asa de inoculacin INOCULACION DE MEDIOS DE CULTIVO EN TUBOS. Los medios se pueden distribuir en tubos ya sea como caldos o en forma de agar. El agar puede ser semislido o slido, generalmente formando un plano inclinado. Para la inoculacin de especmenes se emplea generalmente el asa; para la transferencia de cultivos puros de placas a tubos, la aguja es, habitualmente el instrumento elegido. PROCEDIMIENTO. - Flamee el asa como se ha descrito anteriormente y djela enfriar. - Quite el tapn de rosca (o el algodn) del tubo y tome con el asa una porcin del espcimen. - Vuelva a poner el tapn de rosca (o el algodn) en el tubo que contiene el espcimen. Quite el tapn del tubo que se va a inocular RESIEMBRA BACTERIANA . Es la TRANSFERENCIA de colonias bacterianas de la caja de petri a tubos u otra caja que contienen medios de cultivo esterilizados. Con ste mtodo las cepas que interesan se aslan en CULTIVO PURO. Para ello tocamos la colonia seleccionada
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con el extremo de una aguja esterilizada y transferimos los microorganismos adheridos a la aguja, al medio de cultivo deseado para su mejor proliferacin. MATERIAL. - Asa y aguja de inoculacin - Caja de Petri con colonias a transferir. - Mechero de alcohol - Caja de Petri o tubo (segn el caso) con medio de cultivo estril. CARACTERISTICAS MORFOLOGICAS DE LAS COLONIAS EN LOS MEDIOS DE CULTIVO Los microbilogos utilizan diversas caractersticas de las colonias bacterianas que se desarrollan en la superficie de los medios de cultivo de agar con dos finalidades: - Efectuar la IDENTIFICACION PRESUNTIVA BACTERIANA PRELIMINAR. - COMO GUIA EN LA SELECCION DE PRUEBAS a fin de determinar las caractersticas diferenciales para la identificacin final. CRITERIOS UTLIZADOS. 1. - Tamao (dimetro en mm.) 2. - Forma. 3. - Consistencia. 4. - Elevacin. 7. - Superficie. 5. - Borde (margen). 8. - Densidad. 6. - Color. 9. - Olor.

FORMA: Puntiforme, circular, filamentosa, irregular, rizoide, fusiforme. BORDE de las colonias: Plano, elevado, convexa, acojinada, umbiliforme, umbilicada. COLOR: Blanco, amarillo, negro, naranja, . SUPERFICIE: Brillante, mate, etc. DENSIDAD: Opaca, translcidas, transparentes, etc. CONSISTENCIA: Butirosa, viscosa, membranosa, quebradiza, mucoide. MATERIAL. - Medios de cultivo con las distintas siembras bacterianas. - Fuente de luz. - Lupa. RESTRICCIONES. La interpretacin de cultivos primarios es una habilidad especial que se debe adquirir trabajando con un microbilogo bien capacitado y generalmente se logra dominar slo luego de muchos meses o aos de experiencia. Como ejemplo podemos cita las caractersticas de las colonias en placas de agar de 3 bacilos Gram negativos distintos. Cada una de ellas es tpica de su especie aunque son frecuentes las variaciones: - Las colonias E. Coli son planas con un borde recortado. - Las colonias de Klebsiella pneumoniae tienen un borde completamente liso y una superficie elevada y mucoide.
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- Las colonias de P. Aeruginosa presentan una superficie irregular que recuerda una superficie metlica golpeada repetidamente con un martillo. Colonias en agar sangre que muestran zonas evidentes de hemlisis. El gran tamao de las colonias comparado con las zonas de hemlisis sugiere una especie hemoltica de Staphylococcus. Colonias puntiformes B - hemolticas: sugieren especies de Streptococcus. El reducido tamao de las colonias bacterianas comparado con el gran tamao de la zona de hemlisis B, es altamente sugestivo de esta especie. Colonias lisas diseminadas con pigmentacin verde definida, sugieren la presencia de pseudomonas aeruginosa. El desarrollo colonial profuso y en ondas de dispersin, es caracterstico de Proteus vulgaris o Proteus mirabilis.

MUESTRAS IMPORTANTES DE VARIAS ZONAS Y TIPOS DE INFECCIN Zona/tipo de infeccin tipo de muestra Lquido Tejido Torunda otros

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20 Tracto urinario Vejiga Rin Tracto gastrointestinal Intestino Boca Hgado Tracto biliar Abdomen Tracto respiratorio Nariz Nasofaringe Faringe Pulmn Espacio pleural Odo Ojo

Orina orina Lavados

Biopsia renal Torunda rectal Biopsia heptica heces

Bilis Pus Aspirado peritoneal Lquido asctico Torunda nasal Torunda pernasal Torunda farngea Biopsia pulmonar Torunda auricular Torunda ocular placa de tos: el paciente tose directamente en una placa de agar inoculacin directa de placas de cultivo a la cabecera de la cama

Lavados (V) Esputo Lavado alveolar Lquido pleural

Sistema nervioso central Meninges Encefalitis (herpes) Absceso cerebral

Lquido cefalorra qudeo(L CR)

Pus, LCR

Biopsia cerebral

Tracto genital Uretra Vagina Cerviz endometrio Piel y tejidos blandos Piel Herida Hueso y articulacin Osteomielitis articulacin Septicemia Fiebre de origen desconocido Endocarditis *recogido en la operacin microbacterias

Torunda uretral Torunda vaginal alta Torunda cervical Biopsia endometrial Lquido vesicular (V) Pus Pus aspirado Sangre Sangre Sangre Vlvula cardaca* (V) muestras para virologa (H)muestras para hongos Biopsia cutnea(M) Raspados(H) Hueso* Torunda cutnea (portador) torunda de herida

Microscopia directa y cultivo en la clnica Placas de impresin

Extensin de sangre para parsitos paldicos (M)muestras para

CLASIFICACIN DE MUESTRAS CLNICAS

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A.

A.- MUESTRAS OBTENIDAS DIRECTAMENTE Sitios profundos sin comunicacin: Tejidos u rganos Lquidos orgnicos: Sangre, linfa, pleural Peritoneal, articular Pericrdico, etc. Absceso profundo

TCNICAS PARA ADECUADA RECOLECCIN DE MUESTRAS: Asepsia de la piel Aspiracin con aguja Biopsia quirrgica

VENTAJAS Y RESTRICCIONES DE LA TCNICA:

Normalmente estriles Los resultados (+): Son diagnsticos Los resultados (-) Excluyen la infeccin. Pueden entraar cierto riesgo para el paciente.

B.

B. MUESTRAS OBTENIDAS INDIRECTAMENTE: SITIOS PROFUNDOS CON COMUNICACIN -Exudados inflamatorios -Esputo, orina.

TCNICAS PARA RECOLECCIN ADECUADA DE MUESTRAS: -Eludir las reas Contaminantes -Pruebas cuantitativas -Aspiracin:
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VENTAJAS Y RESTRICCIONES DE LA TCNICA: -Pueden estar contaminadas con F.N -Ms cmodas de obtener.

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-Endocervix, vescula -Fstulas.

Suprapbica, transtraqueal.

-Correlacin de hallazgos clnicos y microbiolgicos.

C.

C. MUESTRAS DE ZONAS DE PIEL Y MUCOSAS: -Piel: Lesiones, heridas, absesos. -Membranas mucosas: Orificios del cuerpo (faringe, intestino), uretas, odo, etc. -Material de colostomia

TCNICAS PARA RECOLECCIN ADECUADA DE MUESTRAS: -Utilizar medios de cultivos selectivos -Investigar agentes etiolgicos especficos. Ej: estreptococo B.H GA.(Faringe) Tifoidea (heces) conocido (exud.uretal) -Ignorar la F.N.

VENTAJAS Y RESTRICCIONES DE LA TEORA -Zonas usualmente contaminadas. -Restringir la bsqueda a grmenes patgenos que no se hallan en el sitio infectado. -No apropiado para cultivos anoerbicos.

1. Flamear el asa y tomar con ella una porcin delgada de la muestra. Colocarla en el agar y distribuirla en el 1/4 superior.
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2. Luego de flamear el asa, se repite el procedimiento previo, giro de 90 a la izq en el 1/4 siguiente, partiendo

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de la zona ltima anteriormente sembrada.

3. El proceso se repite por tercera vez como en 2 hasta cubrir la superficie de la placa.

TRANSFERENCIAS DE UN CULTIVO PURO

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INOCULACIN DE MEDIOS EN TUBO MEDIOS LQUIDOS Caldo de Tioglocolato

MEDIOS INCLINADOS

Agar de Soya, Trypticase O en agar nutritivo base inclinada

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MEDIOS ESPECIALES INCLINADOS

Agar TSI

MEDIOS SEMISLIDOS

Medio CTA

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27 AUTOR:DRA JOSEFINA RAMIREZ

ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE COLECCIONES SUPURATIVAS

OBJETIVO: Al finalizar la clase prctica el alumno ser capaz de: 1. - Seleccionar que medio de cultivo se necesita para el estudio de las colecciones supurativas. 2. - Escoger el medio de cultivo para realizar el estudio de las colecciones supurativas. 3. - Interpretar los resultados. MATERIALES. - Muestra del material supurativo a estudiarse. - Medio de transporte, el cual se escoger dependiendo de la cepa que se va a estudiar. - Lmina porta objeto. - Asa de inoculacin - Mechero. - Solucin salina o agua destilada. - Colorantes. - Microscopio. - Medios de Cultivo, uno slido (agar Sangre) y otro lquido (caldo de Thioglicolato). CONTENIDOS: OBTENCION DE LA MUESTRA: Este prrafo est indicado en el capitulo de toma de muestra MEDIO DE TRANSPORTE.Si la muestra no puede ser sembrada inmediatamente, o hay que mandarla a un laboratorio distante , esta debe colocrsela en un medio de transporte como el de Staurt o el de Amies, as como tambin si se sospecha de la presencia de anaerobios sera mejor utilizar el medio de Cary Blair. METODOLOGIA OBSERVACION MACROSCOPICA:.Al llegar la muestra al laboratorio, se observa macroscpicamente, pues esto nos sirve para orientarnos en el diagnstico. As un pus comn compuesto por grnulos blancos-grisceos es sugestivo de actinomyces;

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una coloracin verde azulada recuerda a pseudomonas, y un olor ftido se relacionara con anaerobios o coliformes. OBSERVACION MICROSCOPICA:.Es indispensable para realizar una extensin fina y homognea del pus y teirla con el mtodo de Gram o de Ziehl-Neelsen, pues su observacin microscpica nos dir los pasos a seguir y los medios de cultivo a utilizar. SIEMBRA DE LAS MUESTRAS: .Los principales productores de pus son los microorganismos que crecen bien en casi todos los medios ordinarios; por lo tanto , el plan sintetizador bastar con sembrar el producto patolgico en dos medios de cultivo, uno slido (que puede ser agar sangre, el mismo que permite aislar la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias o el medio de Lowenstein- Jensen si se sospecha una Etiologa tuberculosa), y uno lquido como es el caldo de tioglicolato que tiene funciones de enriquecer el crecimiento de anaerobios estrictos y facultativos. A las 24 horas de incubacin a 35 C se efectuaran las oportunas resiembras en medios slidos. VENTAJAS Este examen es el que nos permite en poco tiempo y con una simple observacin obtener una orientacin diagnstica DESVENTAJAS La de contar con todo el material requerido. como por ejemplo: un medio de transporte. INTERPRETACION DE RESULTADOS: OBSERVACION DE LAS COLONIAS:.Colonias gamma hemolticas de 4,5 mm. Blancas, opacas de bordes rizados en agar sangre (Bacillus antracis). Colonias gamma hemolticas de 1 a 2 mm. En agar sangre (streptococos no hemolticos)) Colonias gamma hemolticas pequeas transparentes, relucientes de margen ondulado en agar sangre (yersinia pestis) Colonias puntiformes (24 horas) En el medio de Francis (Francisella talurensis) Colonias rugosas plidas (Aspecto cerebroide) en agar de LowesteinJensen (Mycobacterium tuberculosis)

AUTOR:DR CARLOS MOSQUERA 28

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MUESTRAS ESPECIALES PARA EL DIAGNOSTICO BACTERIOLOGICO

INTRODUCCION:
El establecimiento del diagnstico en las enfermedades infecciosas dependen en gran parte de la seleccin de la muestra, del tiempo en que se colecta y del cuidado que en ello se pone. Estos factores son con frecuencia de importancia para el xito en el diagnstico etiolgico de las enfermedades infecciosas. OBJETIVOS: Al finalizar la clase el alumno estar en capacidad de: 1.- Demostrar como se toman correctamente las muestras para su estudio bacteriolgico. 2.- Identificar las caractersticas morfolgicas de las Bacterias. Predecir cmo y cundo solicitar un examen para su estudio bacteriano. 3.- Demostrar la accin patgena de las Bacterias sobre el organismo. 4.- Explicar las condiciones de como preservar y enviar las muestras para su estudio bacteriolgico. LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO (LCR). Los principales agentes etiolgicos que podemos encontrar en un LCR son los siguientes: Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Estreptococos neumoniae, Estafilococos ureas, Enterobacterias, Mycobacterium tuberculosis. MATERIALES: Se requiere el siguiente material: - Tubos de ensayo estriles. - Equipo para puncin lumbar. - Asa de inoculacin. PROCEDIMIENTO: La muestra se obtiene por puncin lumbar previa desinfeccin del rea y debe ser enviada inmediatamente al laboratorio , la muestra no debe ser refrigerada , si ni se la procesa en el momento debe ser incubada o dejada a temperatura ambiente . El LCR para su estudio bacteriolgico se centrifuga a 2500 r.p.m. x 10! con el sedimento obtenido se hace un frotis para teir con Gram que sirve para orientar hacia el tipo de tratamiento a establecer e indica los medios de cultivo a utilizar si se busca bacilo tuberculoso se realiza tincin Ziehl Neelsen y se siembra en medio de Lowenstein Jensen .
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En el caso de Neisseria meningitidis, se siembra en agar Chocolate o Tayer Martin a 35 C en atmsfera de 5 a 10% de CO2, para luego realizar la reaccin bioqumica en agar CTA (Cistena trpticasa) adicionado de los respectivos carbohidratos. LIQUIDO SINOVIAL El estafilococo aureus es el agente etiolgico ms comn de la artritis sptica, sin embargo pueden aislarse otros agentes como el Haemophilus influenzae, Estreptococos viridans, etc. MATERIALES: - Jeringa estril. - Tubo de ensayo estril. PROCEDIMIENTO: La muestra se obtiene por aspiracin con una jeringa estril, la muestra debe ser colocada en frascos para transporte en anaerobios para preservar la viabilidad de los anaerobios. Puede ser til inocular un frasco para hemocultivo con parte de la muestra , sobre todo si el especimen no puede ser llevado inmediatamente al laboratorio. Las muestra muy purulentas se inoculan directamente en diversas placas de agar, incluyendo alguno que permita el desarrollo de microorganismos exigentes como: A. Chocolate, A. Sangre, y en un medio enriquecido como el caldo de thioglicolato. Si se sospecha de tuberculosis se inocular en el medio de Lowenstein Jensen. LIQUIDO ASCITICO La E. coli es la bacteria que se encuentra con mayor frecuencia seguida por el Estreptococo neumoniae y otros Estreptococos del grupo A. Aunque tambin pueden aislarse Enterobacterias, Estafilococos, etc. MATERIALES - Equipo para paracentesis. - Tubos de ensayo estriles. - Asa de Inoculacin. PROCEDIMIENTO La muestra se obtiene por aspiracin percutnea (paracentesis) o en el momento de una ciruga y se enva al laboratorio para examen directo y cultivo. El transporte debe realizarse en un frasco para anaerobiosis, por lo general de 1 - 5 ml de lquido son suficientes para el diagnstico de una peritonitis. Como en todo material que se presume que contiene anaerobios, stas muestras deben ser inoculadas lo ms rpido posible. LIQUIDO PLEURAL
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Las Bacterias que pueden ser aisladas del lquido pleural incluyen aquellas relacionadas con neumonas, como Estreptococos neumoniae, Estafilococos aureus. H. influenzae, Enterobacterias, bacilo tuberculosos y anaerobios. MATERIALES - Tubos de ensayo estriles. - Jeringuilla estril. - Equipo para toraconcentesis. - Asa de inoculacin. PROCEDIMIENTO La muestra se recoge por aspiracin (toraconcentesis) y transportada al laboratorio lo mas pronto posible. Para el aislamiento de la mayora de las Bacterias es suficiente una muestra de 1 - 5 ml, pero cuanto sea mayor el volumen habr mejores probabilidades de aislamiento de algunos patgenos como el Mycobacterium tuberculosis. Las muestras que se reciben en frascos para transportes de anaerobios o jeringas deben ser inoculadas tan pronto como sea posible en los medios de cultivo para aerobios y anaerobios de rutina. Adems deben examinarse frotis teidos con Gram y Ziehl Neelsen LAVADO GASTRICO (HELICOBACTER PYLORI) MATERIALES - Tubos de ensayo estriles. - Asa de inoculacin. - Colorantes para tincin de Gram. PROCEDIMIENTO La muestra se obtendr a travs de endoscopa digestiva para obtener la secrecin gstrica , una vez obtenida la muestra debe ser enviada al laboratorio inmediatamente para poder neutralizar la acidez. De la secrecin se har frotis directo para ser teidos con Gram a fin de identificar bacilos Gram negativos curvos, para posteriormente realizar la prueba de la ureasa. LAVADO BRONQUIAL Las bacterias que con mayor frecuencia podemos encontrar en el lavado bronquial tenemos: Mycobacterium tuberculoso, H. influenzae, Estreptococo neumoniae.

MATERIALES Tubos de ensayo estriles.

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Asa calibrada. Cepillo bronquial PROCEDIMIENTO La muestra se obtiene a travs de un cepillo bronquial protegido por un catter. Se coloca dentro de una cnula doble un cepillo pequeo que recoge 0.01 a 0.001mg de secreciones. El extremo de la cnula exterior se obtura con un tapn de polietilenglicol, una vez que la cnula se ha insertado en el rea apropiada, se empuja la cnula interior que desaloja al tapn a medida que es extrada, luego se extiende el cepillo hacia el exterior de la cnula interna. La muestra obtenida se suspende en 1 ml de caldo agitando en un vortex y luego se inocula en los medios de cultivo usando una asa calibrada de 0.01 ml. TEJIDOS Entre las Bacterias que podemos aislar de material de biopsia o de tejido tenemos: Mycobacterium tuberculoso, Brucella, Listeria monocytogenes. MATERIALES - Frasco plstico con boca ancha y tapa de rosca. - Solucin salina estril. PROCEDIMIENTO Las muestras del tejido deben ser obtenidas luego de una cuidadosa preparacin de la piel, ya que es importante que las biopsias se extraigan en condiciones aspticas. Se recomienda un envase plstico de boca ancha y tapa de rosca. Los microorganismos anaerobios sobrevivirn en los tejidos el tiempo suficiente para ser recuperados luego en el cultivo. Para mantener la humedad de la muestra conviene agregar un pequeo volumen de solucin salina, no usar formol en las muestras para estudio bacteriolgico.

AUTOR: DR JUAN MORENO PINCAY

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TECNICAS DE PREPARACION DEL FROTIS Y SU FIJACION

OBJETIVOS: - Elaborar el frotis. - Reconocer los pasos ordenados para la realizacin de un frotis. - Utilizar adecuadamente el asa de inoculacin. - Aprender a flamear el asa de inoculacin y la lamina portaobjeto. - Usar adecuadamente los dedos de la mano para coger el asa y par a taponar el tubo de ensayo. - Sostener adecuadamente el tubo de ensayo en el momento de tomar la muestra bacteriana. CONTENIDO.Antes de realizar cualquier tipo de tincin bacteriana previamente debemos realizar un frotis . Pero -Qu es un frotis?, No es otra cosa que el extendido de una suspensin bacteriana en una lmina portaobjeto limpia de tal forma que se forme una pelcula uniforme y fina en el tercio medio de la placa. Los frotis preferentemente deben realizarse tomando muestras de cultivos frescos o directamente de los focos infecciosos. El frotis se lo puede realizar con el asa de inoculacin o con un hisopo, para realizar un frotis es necesario que el estudiante tenga conocimientos previos de los materiales utilizados en bacteriologa, este frotis dejara de ser importante sino se contina con el procedimiento de tincin. Es importante recordar que para efectuar un buen frotis este debe quedar del mas fino espesor posible para poder individualizar microscpicamente una clula bacteriana de otra. MATERIALES A UTILIZAR. -Cultivos, caldos y agares - Asa de inoculacin - Hisopos - Mechero - Solucin salina o fisiolgica - Una tubera o gradilla - Papel filtro -Pinza porta lmina- Lmina portaobjeto TECNICA 1.- Limpiar un portaobjeto aplicando la llama a una de las superficies, colocarlo sobre la mesa con el lado tratado hacia arriba.
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2.- Tomar el asa de transferencia o de inoculacin como si fuera un lpiz con el pulgar y el ndice. 3.- Insertar el asa de inoculacin en un ngulo de 60 en la punta de llama del mechero de Bunsen o del alcohol, calentar al rojo toda el asa. 4.- Tomar el tubo de ensayo que contiene solucin salina con la mano libre, quitar el tapn de algodn tapa con los dedos de la mano que sujeta el asa de inocular y que est libre. 5.- Calentar el borde del tubo hacindolo pasar por el cono superior de la llama. 6.- Insertar el asa esterilizada dentro de la solucin salina y extraer 2 o 3 asadas y llevarlas al centro de la lmina porta objeto. 7.- Esterilizar el asa nuevamente y tomar una muestra de colonias bacteriana siguiendo el procedimiento anterior tratando en lo posible coger el tubo de ensayo del fondo. 8.- Llevar las muestras de colonias bacterianas al centro de la lmina donde previamente estaba la solucin salina ,sin olvidar de tapar los tubos de ensayo. 9.- Hacer un extendido con el asa de inoculacin realizando movimientos circulares que abarquen el tercio medio de la placa, dejar que el frotis seque al aire. 10.- Pasar varias veces el frotis por el mechero para fijarlo. 11.- Esterilizar el asa de inoculacin antes y despus de utilizarla. 12.- El frotis tambin se puede fijar con fijador de Schaudinn de 5 minutos a 50C o una hora a temperatura ambiente sin sufrir daos el frotis. El estudiante durante la ejecucin de la tcnica utilizar correctamente los cinco dedos de la mano; el meique y el anular para el tapn, el ndice y pulgar para el asa y el dedo medio de apoyo. VENTAJAS Y DESVENTAJAS La realizacin de un frotis tiene la ventaja de favorecer a las tcnicas de tincin para ellos es importante que el espesor sea lo mas fino posible. Una de las desventajas es que al fijar la placa ciertas protenas plasmticas se coagula y se adhiere al porta objeto. Cuando la fijacin se hace con alcohol metlico; en 2o3 minutos est lista la placa. Cuando se fija con el alcohol es cuando el extendido es generalmente rico en materiales hsticos. La realizacin de un frotis tiene importancia si se realiza la tincin; cuando se observa al microscopio las Bacterias estn muertas ya sea por la fijacin o por los mismos colorantes que se vayan a utilizar.
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Si el medio de cultivo donde se toma la muestra es lquido la extensin que se consigue es fina y homognea, si la muestra es tomada de un medio de cultivo slido la calidad del frotis depender mucho de la habilidad del estudiante al realizar la suspensin y posteriormente el frotis. RESTRICCIONES DEL METODO En realidad la nica restriccin que tiene el mtodo en la clase de prctica de Bacteriologa es cuando se quiere utilizar fijadores como el de Schaudinn o alcohol metlico que no hay en stock de nuestro laboratorio, pero la fijacin la hacemos a fuego lento con el mechero

METODOS FISIOLOGICOS DE IDENTIFICACIONDE LA MOTILIDAD BACTERIANA BACTERIANA

OBJETIVOS: 1.- Discriminar el movimiento bacteriano del Browmiano mediante la observacin microscpica . 2.- Reconocer la motilidad bacteriana producido en un medio de cultivo. 3.- Realizar una suspensin bacteriana . 4.- Ejecutar la tcnica de lmina y laminilla, gota pendiente y en tubo capilar cerrado. CONTENIDO: La motilidad o movilidad bacteriana es una de las propiedades o caractersticas de muchas especies bacterianas de avanzar mediante propulsin por flagelos (filamento, gancho y complejo basal de la compleja estructura de un flagelo). El filamento helicoidal lo tenemos como una hlice, el gancho como una unin , y el cuerpo basal como un cilindro o anillo de un motor. Las Bacterias mtiles se mueven en pequeas carreras interrumpidas sobre periodos de rotacin sobre s mismo. A diferencia del movimiento Browmiano que son movimientos de partculas de polvo suspendida en agua que tiene un movimiento irregular en zig-zag y refleja los impactos recibidos constantemente al chocar las partculas de polvo con las molculas de agua y aire que se mueve constantemente, este movimiento se lo puede comparar como el de migas de pan en una pecera producida por el mordisco de los peces. La motilidad bacteriana es una prueba presuncial de que las Bacterias poseen flagelos aunque no indica nmero ni disposicin de los mismos. Estos movimientos flagelares son en ltigos, circular y en rotacin a un promedio de 40 revoluciones por segundo.

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El examen directo de los organismos vivos (Bacterias) pueden tener gran utilidad para determinar relaciones de tamao, forma, movilidad y reacciones. TIPOS DE MOTILIDAD BACTERIANA Tenemos la que se realiza en fresco para una observacin microscpica y la que se observa en medios de cultivos macroscpicamente. En fresco tenemos tres mtodos: a) El de lamina y laminilla. b) El de gota pendiente. c) En tubo capilar cerrado. En medios de cultivos tenemos: a) En agar Motilidad. b) En agar Mac Conkey. y agar sangre c) En agar Edwars-Ewing. MATERIALES: - 4 Lminas porta objeto excavada. - 4 Lminas porta objeto. - 4 Laminillas cubre objeto. - 1 Recipiente con vaselina . - 1 Recipiente con xilol. - Plastilina . - 1 Tubo de ensayo con solucin salina. - Aplicadores de madera. - Asa y aguja de inoculacin. - 2 Tubos capilares. - Mechero. - Medios de cultivo sembrado y estriles. - Microscopio. TECNICA: OBSERVACION MICROSCOPICA: ENTRE LAMINA Y LAMINILLA.- (entre porta y cubre objeto) Depositar una gota de cultivo lquido, o la suspensin de una colonia en solucin salina o en suero fisiolgico sobre el centro de la lmina porta objeto, colocar una laminilla cubriendo la suspensin, a continuacin observar en el microscopio utilizando objetivos secos de gran aumento como (10X) o (40X). Esta tcnica puede ser utilizada para observacin microscpica de anaerobios siempre y cuando se observe con rapidez la parte central del montaje. GOTA PENDIENTE.36

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Untar una capa dbil de vaselina en los bordes de la concavidad de la lmina excavada, colocar una gota de suspensin bacteriana en el centro de la laminilla cubre objeto, luego invertir cuidadosamente la lmina porta objeto excavada sobre la laminilla de tal modo que en el centro de la concavidad corresponda a l de la gota . Luego observar con objetivo seco el borde de la gota y a continuacin todo el campo. EN TUBO CAPILAR CERRADO.Con sta tcnica podemos observar Bacterias mtiles anaerobias principalmente. Se llena un tubo capilar con una suspensin bacteriana, cerrando inmediatamente los dos extremos con plastilina, luego se observa al microscopio con el objetivo de 40X OBSERVACION MACROSCOPICA MOTILIDAD EN MEDIOS DE CULTIVO: EN AGAR MOTILIDAD.Tcnica.- Se siembra con la aguja de inoculacin en medio de cultivo semislido tanto en picadura como en profundidad, tratando en lo posible que la aguja no penetre mas de 1 cm del fondo del tubo. Incubar por 24 horas a una temperatura de 35 - 37 C, luego se realiza la interpretacin de los resultados. La motilidad es positiva cuando hay crecimiento de Bacterias mtiles lo que permite que el sitio de picadura se ensanche y se deforme y el medio de cultivo se torna turbio. La motilidad es negativa cuando el medio de cultivo est claro y el sitio de la picadura no ha sufrido transformacin. EN AGAR MAC CONKEY, O AGAR SANGRE(FENOMENO DE SWARMING) Tcnica.- Sembramos punteando la parte central del agar Mac Conkey, incubamos por 24 horas a una temperatura de 35 - 37 C. Hacemos la lectura y observamos si ha habido o no crecimiento de Bacterias (Proteus)con gran motilidad en la superficie del medio. Si hay crecimiento bacteriano con estas caractersticas las colonias en la superficie del medio no permanecen compactas y separadas por el contrario el desarrollo bacteriano se difunde rpidamente sobre toda la superficie formando anillos concntricos de dispersin con ondulaciones caractersticas en el medio(fenmeno conocido como el de Swarming).
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VENTAJAS Y DESVENTAJAS VENTAJAS DE LA OBSERVACION EN FRESCO.Se observa la bacteria viva y en movimiento, la forma y posibles alteraciones morfolgicas ocurridas al moverse la bacteria; no se expone a observar deformaciones causadas por la fijacin y los colorantes. DESVENTAJAS DE LA OBSERVACION EN FRESCOS.La rpida desecacin nos impide una observacin prolongada, tambin nos impide ver ciertas estructuras como cpsulas, flagelos esporas que solo es posible observarlos con mtodos de tincin especial. En cuanto a la observacin en medios de cultivo si bien es cierto que podemos observar las distintas reacciones que se producen en el medio lo que nos hace sospechar de acuerdo a las caractersticas que hay motilidad bacteriana tiene la desventaja que no podemos observar directamente la bacteria. RESTRICCIONES DEL METODO En un tubo capilar aunque es un mtodo sencillo de realizar no disponemos de stock en el laboratorio lo mismo que sucede con el medio de Edwars-Ewing probablemente en un futuro no muy lejano estaremos en condiciones de realizar stos mtodos y tcnicas para un mejor conocimiento.

AUTOR JUAN MORENO

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TECNICAS DE COLORACION DE BACTERIAS

OBJETIVOS: Elaborar diferentes tinciones correctamente. Reconocer los pasos ordenados para la realizacin de cualquier mtodo de tincin enseado. Seleccionar una tcnica especfica para la tincin de esporas cpsulas. Identificar Bacterias cido resistentes y no cido resistentes. CONTENIDO: Las Bacterias poseen la propiedad de fijar ciertas sustancias colorantes, de ah que cuando stas se tien podemos observar algunas de las estructuras bacterianas que no se observaban en fresco, como por ejemplo cpsulas, esporas, flagelos, membranas, etc. Hay algunos tipos de colorantes qumicos como: los cidos, bsicos y neutros. Los colorantes cidos tienen carga inica negativa no tien a la clula bacteriana y son usados para impartir el fondo de contraste al frotis, por ejemplo: la eosina. Los colorantes bsicos tienen in de carga positiva y tien las clulas bacterianas uniformemente, por ejemplo: violeta de genciana, azul de metileno. Los colorantes neutros son sales complejas que poseen ambas cargas inicas como el eosinato de azul de metileno. Todo procedimiento de tincin parte de un frotis las sustancias qumicas que se usan para teir Bacterias se la conoce como colorante. Se cree que la bacteria se tie debido a un intercambio inico entre colorantes y elementos activos de la superficie o del interior de la clula bacteriana. Hay algunas hiptesis que sugieren que las Bacterias Gram positivas contienen un complejo protenico ribonucleasa-Mg en su pared y que el mismo forma un complejo insoluble con el cristal violeta yodo que no es decolorado con el alcohol. Otros autores refirindose a la tincin de Gram que es universalmente conocida, sugiere que los organismos Gram positivos tienen un punto isoelctrico (pH) ms bajo y por lo tanto se combina ms firmemente con los colorantes bsicos y, finalmente, otra explicacin ms reciente y quizs la ms acertada se fundamenta en que las paredes de las Bacterias Gram negativas son muy ricas en contenido graso, el mismo que es extrado al ser tratada con alcohol aumentando de sta forma la porosidad de la pared celular y por lo tanto la salida fcil del complejo cristal violeta-yodo. En cambio las Bacterias Gram positivas por la composicin qumica propia de su pared al ser tratada con el alcohol se deshidrata reduciendo por lo tanto la permeabilidad y por ende el complejo cristal violeta-yodo no es extrado.

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Todas las bacterias Gram negativas son constantes en su reaccin: las Gram positivas son variables, dependiendo de algunos factores (Cultivos jvenes, Cultivos viejos, y tcnicas). CLASIFICACION DE LOS METODOS DE TINCION. Se clasifican en simples, compuestos y especiales . Los mtodos de tincin simples son aquellos en los que se utiliza un solo colorante. Mtodos de tincin compuestos son aquellos en los que se utilizan ms de un colorante. Los mtodos de tincin especiales son aquellos donde se utilizan colorantes o reactivos para estudiar ciertas estructuras especficas de las Bacterias como por ejemplo grnulos metacromticos, flagelos, cpsulas, esporas, membranas. METODOS DE TINCION SIMPLE: Tenemos el mtodo de Violeta de Genciana, el de Azul de Metileno, el de Fucsina fenicada bsica, y el Azul de Metileno alcalino de Loeffler. METODOS DE TINCION COMPUESTA: Tenemos el mtodo de Gram, el mtodo de Preston-Morrel, el mtodo de ZiehlNeelsen, el mtodo de Kinyoun, mtodo Albert. METODOS DE TINCIONES ESPECIALES: Mtodo de Wirtz-Conklin, mtodo de Tinta China, mtodo de Hiss, mtodo de tincin de Fontana tribondeau, mtodo de Fleming-modificado, mtodo de Leifson ;rojo congo para leptopiras. MATERIALES - Colorantes. - Lminas porta objetos. - Laminillas cubre objetos. - Medios de cultivos con colonias bacterianas. - Papel filtro. - Vaso de Copln. - Pinza porta lmina. - Asa de inoculacin. - Tubo de ensayo con solucin salina. - Tinta china. - Mechero - Reactivos. - Microscopio. - Tubera. METODO DE VIOLETA DE GENCIANA: TECNICA:
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1.- Realizar un frotis y cubrir la preparacin con violeta de genciana por un minuto, lavar con agua destilada, luego de secar al medio ambiente o con papel filtro y queda lista para ser observada con objetivo de inmersin. Las Bacterias con este mtodo se van a observar en el microscopio de color violeta o morada. METODO DE AZUL DE METILENO: TECNICA: 1.- Realizar un frotis y cubrir la preparacin con azul de metileno durante un minuto, lavar con agua destilada, luego secar al medio ambiente o con papel filtro y queda lista para ser observada con el lente de inmersin. Las Bacterias con ste mtodo se van a observar de color azul. METODO DE FUCSINA FENICADA BASICA: TECNICA: 1.- Realizar un frotis y cubrir la preparacin con fucsina fenicada basica durante un minuto lavar con agua destilada, luego secar al medio ambiente o con papel filtro y queda lista para ser observada con el lente de inmersin. Las Bacterias con ste mtodo se van a observar de color rosado METODO DE AZUL DE METILENO ALCALINO DE LOEFLER: TECNICA: 1.- Realizar un frotis y cubrir la preparacin con azul de metileno alcalino de Loffler durante un minuto, lavar con agua destilada, luego secar al medio ambiente o con papel filtro y queda lista para ser observada con el lente de inmersin. Las Bacterias con ste mtodo se van a teir de color azul, es importante sealar que con ste mtodo se tie bien el bacilo DIFTERICO, las granulaciomnes metacromticas del bacilo se observan en el microscopio de una coloracin azul oscuro y el cuerpo del bacilo en un azul plido. METODO DE GRAM. 1.- Realizar un frotis y cubrir la preparacin con violeta de genciana durante un minuto luego lavar con agua. 2.- Cubrir la preparacin con Licor de Gram que acta como mordiente, durante un minuto, luego lavar con agua. 3.- Decolorar la preparacin con alcohol 70 alcohol cetona hasta eliminar el exceso de violeta genciana, luego lavar. 4.- Cubrir el frotis con fuscina fenicada o safranina; si se usa fuscina fenicada diez segundos es suficiente, si se utiliza safranina de 30 a 60 segundos. Luego lavamos con agua secamos con papel filtro y queda lista para ser observada con el lente de inmersin . Las Bacterias que aparecen teidas de un color MORADO se denominan GRAM POSITIVAS, es decir han captado el colorante de violeta de genciana y no han sido
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decoloradas por el alcohol. Las Bacterias que aparecen teidas de color ROSADO se denominan GRAM NEGATIVAS, es decir que no han fijado el violeta de genciana, siendo decoloradas por el alcohol y en cambio han captado la safranina o la fucsina fenicada dependiendo del colorante que se haya utilizado. METODO DE ZIEHL-NEELSEN: TECNICA: 1.- Realizar un frotis, cubrirlo con papel filtro y luego colocar fucsina. Calentar en el mechero la lmina portaobjeto durante 5 minutos, separndola cada vez que emita vapores, luego lavar con agua. 2.- Decolorar el frotis hasta eliminar el exceso de fuscina fenicada con alcohol cido unos segundos lavar con agua luego. Cubrir elfrotis con azul de metileno un minuto. Lavar con agua, secar con papel filtro y queda listo para observar con el lente de inmersin. Los bacilos tuberculosos y leprosos denominados alcohol-cidoresistente (por resistir la decoloracin con el alcohol y el cido), se tien de color rojo , es decir han captado la fuscina fenicada. Estos bacilos resaltan su coloracin roja sobre el fondo azul oscuro el azul metileno; ambos bacilos aparecen como bastones finos rectos y ligeramente curvos. En conclusin, las Bacterias que se observan de color rojo se denominarn alcohol cidos resistentes y las que se observan de color azul no cido resistentes. METODO DE ALBERT. TECNICA: 1.- Realizar un frotis, cubrir la preparacin con colorante de Albert durante cuatro minutos luego lavar con agua. 2.- Cubrir el frotis con lugol durante dos minutos, luego lavar con agua, secar con papel filtro y queda lista para la observacin con el objetivo de inmersin. Si bien es cierto este mtodo es compuesto por haberse utilizado mas de un colorante no es menos cierto que tambin podran encasillarse dentro de los mtodos de tinciones especiales ya que con este mtodo podemos observar las granulaciones metacromticas del bacilo diftrico las mismas que se observa de una coloracin verde oscura y su cuerpo de una coloracin verde plida. Cuando la bacteria teida no es el diftrico no se observar estas granulaciones y nicamente nos limitaremos a ver las Bacterias teidas de color verde.

METODO DE PRESTON-MORREL.
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TECNICA: 1.- Cubrir la preparacin con oxalato de cristal violeta 30 segundos lavar con yodo lugol durante 30 segundos. 2.- Lavar yodo acetona durante 30 segundos. 3.- Lavar con agua unos segundos. 4.- Cubrir la preparacin con carbolfucsina diluida 30 segundos se lava con agua y se seca queda lista para la observacin con objetivo de inmersin. Este mtodo es una variante de la tincin de Gram, nos da un mejor contraste para la placa de control. TINCION DE KINYOUN. TECNICA: 1.- Extraer y secar la preparacin 2.- Fijar con alcohol metlico de 99 hasta la evaporacin del mismo. 3.- Cubrir la preparacin con la solucin de fucsina y dejar actuar 2 minutos. No es necesario calentar. 4.- Lavar con agua. 5.- Decolorar con la mezcla cido-alcohol hasta que no se desprenda mas colorante. 6.- Lavar con agua. 7.- Cubrir la preparacin con azul de metileno y dejar actuar de 20a 30 segundos. 8.- Lavar con agua. 9.- Secar y observar con el objetivo de inmersin. Los microorganismos cido-alcohol resistentes se colorean de rosa los que no, se observan de color azul.

METODOS DE TINCIONES ESPECIALES

METODO DE WIRTZ CONKLIN: (ESPORAS). TECNICA: 1.- Haga una suspensin de los organismos en 0,25 ml. de agua destilada. 2.- Haga un frotis delgado con esta suspensin y fjelo a la llama. 3.- Cubra el frotis con una solucin acuosa con el 5% de verde malaquita y calientelo hasta emitir vapores de 3 a 6 minutos. 4.- Lave con agua destilada. 5.- Tia con una solucin acuosa al 5% de safranina por 1 minuto 6.- Lave con agua destilada. 7.- Seque y examine. Las esporas se tie de verde, el cuerpo de la bacteria es rosado. METODO DE TINTA CHINA (CAPSULAS). TECNICA: 1.- Realizar un frotis y fijarlo.
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2.-Depositar sobre el frotis seco y fijado una gota de tinta china y extenderlo con laminilla. 3.- Dejar secar. 4.- Colocar safranina durante 1 minuto. 5.- Lavar con agua y observar con el lente inmersin. La cpsula aparece como espacio claro alrededor del cuerpo bacteriano que se tie de rojo plido sobre un fondo negro dado por la tinta china. METODO DE HISS (CAPSULAS): TECNICA: 1.- Mezcle el material a ser teido con igual cantidad de suero. Haga un frotis delgado. 2.- Djelo secar al aire. 3.- Fjelo ya sea a la llama o en formalina comercial diluida al 10% (1:10). 4.- Cubra el frotis con el colorante de Hiss o con solucin acuosa al 1% de cristal violeta hasta emitir vapores por unos pocos segundos. 5.- Lave el colorante con una solucin acuosa al 20% de sulfato de cobre. 6.- Seque al aire y examine. El cuerpo bacteriano,clulas y fondo de la preparacin se tien de prpura. Las cpsulas son incoloras o lavanda plida. TINCION DE PARED CELULAR. 1.- Se utiliza cultivos jvenes de 18 a 20 horas de B. subtilis. 2.- Realizar un frotis grueso, con el frotis hmedo se coloca el cido fosfomolbdico 1% por 4 minutos. 3.- Escurrir el cido fosfomolbdico y agregar verde de metilo 1% por 5 minutos. 4.- Lavar. Este mtodo se fundamenta en que el cido fosfomolbdico hidroliza el citoplasma, pero respeta la pared que aparece de color verde. METODO DE FLEMING MODIFICADO. (ESPORAS): 1.- Carbol fucsina de Ziehl - 5 minutos calentando. 2.- Lavar. 3.- Decolorar con etanol 30 segundos. 4.- Lavar. 5.- Extendido de una gota de tinta china y dejar secar. Es importante reconocer que cuando no se usa mtodos especiales de tincin de esporas y se utiliza el mtodo de Gram las esporas aparecen como un espacio claro no teido y el cuerpo de la bacteria de color violeta. TINCION DE FONTANA TRIBAONDEAU. (FLAGELOS):
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Es una coloracin de impregnacin argntica que permite la observacin de ciertos microorganismos (espiroquetas) o de estructuras muy finas (flagelos). TECNICA: 1.- Extraer y secar a temperatura ambiente. 2.- - Cubrir la preparacin con el fijador y dejar actuar 90 segundos. 3.- Lavar con alcohol etlico de 95. 4.- Cubrir la preparacin con el mordiente, calentando hasta el desprendimiento de vapores y dejar actuar durante 30 segundos. 5.-- Lavar con agua. 6.- Cubrir la preparacin con solucin de nitrato de plata, calentando hasta el desprendimiento de vapores . Mantenerlo de 15 a 20 segundos. 7.-- Lavar con agua. 8.-- Secar a temperatura ambiente y observar con objetivo de inmersin. Las espiroquetas se observan de color castao. TINCION DE LEIFSON: (FLAGELOS): Para realizar la tincin de flagelos se debe partir de un cultivo lquido adecuado de 18 a 24 horas, incubado a temperatura ambiente. REACTIVOS: Preparar tres soluciones por separado. a.- Cloruro sdico: 1,5g. Agua destilada 10ml. b.- Acido tnico 10g. Agua destilada 100ml. c.- Acetato de p-rosanilina 0,9g. p-rosanilina ClH: 0,3 g. Alcohol etlico de 95 : 100ml. Dejar en reposo 12 horas a temperatura ambiente. Tomar volmenes iguales de A, B, C, agitar y dejar 2 horas en reposo. TECNICA: 1.- Sobre 4 ml de cultivo aadir 0,25 ml de formol al 5%. 2.- Dejar reposar 15 minutos. 3.- Aadir agua destilada mezcla y centrifugar retirando el sobrenadante. Repetir 2 veces.. 4.- Resuspender en 1-2 ml. de agua destilada debe quedar suspensin bacteriana ligeramente turbia. 5.- Flamear un portaobjeto limpio y dejar enfriar. 6.- Depositar unas gotas de la suspensin , con asa o pipeta, en un extremo del portaobjetos inclinado, de forma que las gotas se extiendan a lo largo del cristal.
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7.- Dejar secar a temperatura ambiente y no fijar por el calor. 8.- Cubrir la preparacin con 1 ml. de colorante. 9.- Dejar de 5 a 15 minutos hasta que el alcohol se evapore. 10- Una vez formado el precipitado lavar con agua. 11.- Secar a temperatura ambiente y observar con objetivo de inmersin. Los flagelos se tien de color rojo oscuro o azul negro. Adems de este mtodo, tenemos el mtodo de Gray que tambin sirve para teir flagelos. VENTAJAS Y DESVENTAJAS. Las ventajas de los mtodos de tincin escriba en que podemos observar algunas estructuras de las Bacterias que no podan ser observadas en la observacin en fresco, es as como un mtodo universal de Gram podemos determinar rpidamente si una bacteria es Gram positiva o Gram negativa. Con el mtodo de Zielh-Neelsen podamos determinar si una bacteria era cido resistente o no y si queremos ir ms adelante nos hemos dado cuenta que con los mtodos de tinciones especiales podemos observar en el microscopio estructuras como cpsulas, esporas, pared, flagelos grnulos . Las desventajas seran que no observamos a la bacteria viva y que con los colorantes las Bacterias podran sufrir una discreta deformacin de sus estructuras. RESTRICCIONES La mayora de los mtodos de tincin aqu estudiados, ao a ao se han venido realizando en la prctica de bacteriologa. Lo ideal sera que todos los mtodos sean estudiados, pero sto no ha sido posible debido a la carencia de colorantes y reactivos en el departamento de bacteriologa. En otros casos, como en el de la tincin de flagelos que se necesita de un mayor tiempo para la preparacin de la tincin. Pero sto no sera inconveniente si nosotros con antelacin a la prctica llevamos preparado parte del material.

AUTOR:DR GONZALO ZABALA VILLACIS

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MEDIOS DE CULTIVO DE USO FRECUENTE EN BACTERIOLOGIA

OBJETIVO ESPECIFICO DE LA CLASE 1.- Al final de la clase el alumno estar en la capacidad de DISTINGUIR los diferentes medios de cultivos por sus nombres. 2.- Estar en capacidad de EXPLICAR los usos de los medios de cultivo. 3.- Estar en capacidad de SELECCIONAR el medio de cultivo de acuerdo a la especie bacteriana a cultivarse. 4.- Estar en capacidad de VALORAR la importancia de los medios de cultivo y su utilidad en la industria o fabricacin de antibiticos, vacunas, etc. CONCEPTO DE MEDIOS DE CULTIVOS.Se denomina medios de cultivos a las sustancias o mezcla de sustancias que proporcionan en forma asimilable todo los elementos necesarios para que las Bacterias puedan crecer y multiplicarse dando lugar a la formacin de colonias. CONDICIONES O FACTORES QUE DEBEN REUNIR UN MEDIO DE CULTIVO.El desarrollo de una bacteria en un medio de cultivo depende de una serie de factores o condiciones, las principales son: a.-CONTENIDO NUTRITIVO ADECUADO (Composicin).Es decir los elementos indispensables para que las Bacterias puedan desarrollar y multiplicarse. Al respecto las necesidades de las Bacterias son extremadamente variables. Como principales nutrientes se pueden mencionar los siguientes: - FUENTES DE CARBONO.Como los azcares, cido actico,de echo el Carbono es necesario para todas las Bacterias ( ninguna puede multiplicarse desprovista de CO2). - FUENTES DE NITROGENO.Como los nitratos y sales de amonio. - FUENTES DE AZUFRE.Prcticamente todos los microorganismos, utilizan el azufre de los sulfatos, sulfuros y tiosulfatos - FUENTES DE FOSFORO.Todas la Bacterias utilizan el fsforo de los fosfatos. - FUENTES DE OXIGENO E HIDROGENO.Procedentes del agua.- Minerales como Potasio, Magnesio, Calcio, Hierro, Zinc, Cobalto, Cobre,etc.
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Otras sustancias importantes son las denominadas factores de crecimiento que estn constituida por las vitaminas (A, B, C, D,) y principalmente los aminocidos y las bases pricas y pirimidnicas. Son sustancias, que las Bacterias, por s solas son incapaces de sintetizar. b.- pH.Las Bacterias se desarrollan habitualmente a pH prximo a la neutralidad (6.8 a 7.6) salvo excepciones, porque algunas Bacterias pueden crecer a pH muy cidos o muy alcalinos. Para ajustar el pH de los medios se utiliza sobretodo sustancias indicadoras o bien en comparacin con una serie de soluciones patrn de un indicador coloreado c.- PRESION OSMOTICA.Debido a la composicin de la pared celular bacteriana los grmenes se adaptan bien a las variaciones de la presin osmtica, sin embargo in vitro, los medios de cultivo se preparan en condiciones de isotona. d.- EL POTENCIAL REDOX.Est en relacin con el tipo respiratorio de cada bacteria, que puede ser anaerobia estricta, aerobia y anaerobia facultativa, aerobia estricta y microaerfila. e.- LA HIDRATACION.La presencia del agua es indispensable para el crecimiento bacteriano por lo que deber estar presente en los medios de cultivo en cantidades suficientes. f.- LA TEMPERATURA.En caso de las Bacterias los medios de los cultivos se incuba de 35 -37 C. g.- LA ATMOSFERA.Algunas Bacterias, especialmente aerobias y facultativas, necesitan para su ptimo desarrollo la presencia de ciertos ambientes gaseosos. El mas utilizado es el CO2 que varan del 3 - 10% h.- DEBEN SER DISTRIBUIDOS EN RECIPIENTES.Adecuados en los cuales son esterilizados y mantenidos al abrigo de contaminaciones externas tanto antes de sembrados como en lo posterior. PRINCIPALES OBJETIVOS DE UN MEDIO DE CULTIVO a.- Obtener cultivos puros para estudiar las Bacterias y mantenerla viva indefinidamente. Excepto algunas raras excepciones, todo examen bacteriolgico debe terminar con el cultivo del producto a examinar. Efectivamente, este cultivo es a

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menudo necesario para la evidencia de Bacterias (siempre que su nmero sea demasiado pequeo para que podamos descubrirla por el simple examen microscpico). b.- Facilitar el hallazgo, aislamiento y separacin de las distintas especies bacterianas presentes en un producto patolgico. c.- Observar el aspecto de las colonias a simple vista o con pequeos aumentos (lupa) con diagnsticos. d.- Obtener cantidades apreciables de Bacterias para fines industriales, como en la elaboracin de vacunas y autovacunas. e.- Estudiar la fisiologa de la bacteria. f.- Estudiar la toxignesis y las cualidades de las toxinas. g.- Es necesario para los estudios complementarios, como los de sensibilidad de las Bacterias a los distintos antibiticos (antibiogramas). CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Debido a la aparicin de nuevos medios de cultivo, cada da se torna mas difcil encasillarlos dentro de las clasificaciones tradicionales, por lo tanto nos limitaremos a mencionar muy someramente las definiciones que se han dado a ciertos grupos de medios de cultivos. 1.- DE ACUERDO A SU PROCEDENCIA O PREPARACION.a.- MEDIOS NATURALES O EMPIRICOS.Son aquellos que estn constituidos por sustancias o productos naturales ya sea de origen animal o vegetal, es decir que no han sido creados artificialmente por el hombre. Ejemplo: gelatina, huevo, leche, papa, levadura, sueros, lquido asctico, pleural, sinovial, peritoneal. b.- MEDIOS ARTIFICALES.Son aquellos elaborados por el hombre, que contiene qumicas de la naturaleza y proporciones conocidas, junto a productos de origen natural. Actualmente son los mas utilizados. En el comercio existen infinidad de medios de cultivo deshidratados que facilitan en gran manera la labor de los laboratorios de Microbiologa y que garantizan una buena calidad de funcionamiento. 2.-DE ACUERDO A CONSISTENCIA O ESTADO FISICO.a.- MEDIOS LIQUIDOS,como los caldos:Nutritivo,tioglicolato etc. b.- MEDIOS SEMISOLIDOS.49

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Son aquellos que cumplen poca cantidad de agar 5% y que generalmente se utilizan para estudiar la movilidad de los microorganismos o para estudios zimogrficos, o para su conservacin , Ejemplo: agar motilidad, Medio de Flecher, etc. c.- MEDIOS SOLIDOS.Son agares, ejemplo: agar citrato, agar urea, agar bismuto, etc. 3.- DE ACUERDO A SU CALIDAD O SU UTILIZACION.a.- MEDIOS SELECTIVOS O INHIBITORIOS.Son aquellos en los que se desarrolla una especie bacteriana o un grupo de ellas, porque contienen sustancias que inhiben el desarrollo de las dems y que estn presentes en la muestra. La selectividad del medio se consigue por la adicin de sustancias como las sales biliares, que inhiben a las formas cocceas Gram+, o la Azida sdica, que solo permite el crecimiento de los cocos Gram+. Los antibiticos son otras sustancias que transforman los medios de cultivo en selectivos. b.-MEDIOS DIFERENCIALES O DE DIFERENCIACION.Son aquellos que se utilizan para poner de manifiesto a las Bacterias que dan positiva alguna propiedad bioqumica y que estn presentes en la mezcla. Pueden tener indicadores del ph, entre las cuales tenemos el rojo fenol y azul de bromo timol, los cuales confieren al medio de cultivo distintos colores segn la reaccin sea cida o sea alcalina. La mayora de los medios destinados a las reacciones bioqumicas de las Enterobacterias son medios diferenciales. Ejemplo.: agar urea de Christiansen, agar citrato de Simmons, etc. c.- MEDIOS ENRIQUECIDOS.Son aquellos que favorecen el crecimiento de algn tipo de Bacterias que se encuentran en forma minoritaria en una mezcla de varios grupos bacterianos. Son medios bsales a los que se les ha agregado ciertos nutrientes como vitaminas, protenas, sangre desfibrinada. Ejemplo.: agar sangre, agar chocolate, agar Thayer Martn, agar Muller Hinton, etc . d.- MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO.Son aquellos medios de cultivo a los cuales se les ha aadido sustancias inhibitorias, lo que da como resultado medios de cultivo que permiten el desarrollo de Bacterias, pero dentro de un estrecho margen. Ejemplo.: Caldo de Tetrationato, Caldo Selenito, Thayer Martin modificado,etc. e.-MEDIOS DE IDENTIFICACION.50

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Son aquellos que se utilizan para estudiar la accin de un solo tipo de Bacterias frente a un determinado sustrato. Se diferencia de los Medios Diferenciales, en que se siembran con Bacterias pertenecientes a un solo clon. Se utiliza para los estudios de identificacin de las Bacterias. f.- MEDIOS DE CULTIVO BASICOS.Son aquellos medios cuya frmula contiene los nutrientes necesarios para el desarrollo de la mayora de los microorganismos no fastidiosos, entre estos nutrientes tenemos: Infusin de carne, peptona, agua, sal,etc. Ejemplo: Caldo nutritivo, Caldo de peptona, Caldo de triptona de soya, agar nutritivo inclinado, agar nutritivo en base profunda. g.- MEDIOS DE MULTIPLICACION.Son aquellos que poseen una composicin determinada y ptima para el grupo de Bacterias a las que va destinado, y que permitir un mximo de aumento celular bacteriano en un mnimo tiempo. Son medios utilizados en la industria, en la preparacin de vacunas, de antibiticos, etc. h.- MEDIOS DE CONSERVACION.Son aquellos cuya composicin favorecen el mantenimiento de los microorganismos que en l se siembran y que posteriormente se incuban a +2, +4 C. Algunos medios de conservacin incluyen glicerol y se guardan en congelador a -20 C. Estos medios de conservacin han sido prcticamente desplazados por la liofilizacin. Existe una variacin de medios de conservacin que son los MEDIOS DE TRANSPORTE, cuya finalidad es mantener en estado viable, aunque sin produccin ( o mnimamente), microorganismos presentes en una muestra, permitiendo con posterioridad recuperar incluso a los que estn minoritariamente presentes. Actualmente los medios de transporte utilizados son: el medio de Stuart, el de Amies y el medio de Cary-Blair.

PRINCIPALES MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS EN BACTERIOLOGIA. CALDO NUTRITIVO.Son medios de cultivo lquidos constituidos por agua, peptona y extracto de carne. Sirve para el cultivo de microorganismos de escasos requerimientos nutricionales; tales como la E.coli, estafilococos.
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AGARES NUTRITIVOS.Son caldos nutritivos a los que se les ha agregado agar para su solidificacin. Contiene cloruro de sodio. Pueden ser utilizados para el cultivo de microorganismos de escasos requerimientos nutritivos, para pruebas de hemlisis cuando se emplea adicionado de sangre, puede servir para el cultivo y recuento de microorganismos en las aguas, heces u orina y cualquier otro producto. Ejemplo.:Tenemos el agar nutritivo inclinado y el agar nutritivo profundo. AGAR SANGRE.El agar sangre es un medio enriquecido slido que nos permite ver las propiedades hemolticas de ciertas Bacterias tales como Estreptococos, Estafilococos, de diversos materiales. El agar sangre se puede preparar con sangre desfibrinada de conejo o de borrego adicionada a un agar que contenga infusin de carne. Este agar contiene de 5 al 10% de sangre estril. AGAR T.S.I..- (KLIGER MODIFICADO).Es un medio slido diferencial que se recomienda para la identificacin de los bacilos entricos Gram negativos en base a la fermentacin de dextrosa, lactosa y sucrosa, y por la produccin de Sulfuro de Hidrgeno que los utiliza en los coprocultivos. AGAR S. S. .El agar S. S. es un medio diferencial y selectivo utilizado para el aislamiento de Salmonella y Shigellas a partir de heces y otros materiales en que se sospeche su presencia, adems inhibe el desarrollo de todas las Bacterias Gram(+) y algunas Gram (-) no deseables, las mismas que estn inhibidas por el verde brillante de las sales biliares y las elevadas concentraciones de tiosulfato y citrato. AGAR CITRATO de SIMMONS.Es un medio diferencial empleado para la investigacin de la utilizacin del citrato como nica fuente de Carbono, produciendo alcalinidad. Este medio es una modificacin del de Koser, al cual se le ha agregado agar y un indicador del pH azul de bromo timol. Se lo emplea en los test bioqumicos. AGAR UREA DE CHRISTIANSEN.Es un medio slido diferencial empleado para la investigacin de la Bacterias que utilizan urea como nica fuente de Nitrgeno y particularmente para diferenciar algunos miembros de la familia Enterobacteriaceae. Se lo emplea en los test bioqumicos. AGAR MAC CONKEY.52

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Es un medio selectivo y diferencial utilizado para el cultivo de enterobacterias Gram (-) e impide el crecimiento de las bacterias Gram (+) que es inhibida por las sales biliares y por el cristal violeta que contiene. Se lo utiliza preferentemente en los urocultivos y coprocultivos donde abunda la flora Gram (-). AGAR BISMUTO SULFITO.Es un medio de cultivo slido selectivo que sigue especialmente para el aislamiento de Salmonella tifosa a partir de heces, en agua servidas, alimentos, etc. Se recomienda, en particular despus de un enriquecimiento preliminar del espcimen en caldo de tetrationato u otro caldo de enriquecimiento. El efecto selectivo de este medio de basa en su contenido de verde brillante e inhibe ante todo el enriquecimiento de la flora Gram (+) acompaante. CALDO DE THIOGLICOLATO.Es un medio de cultivo lquido que se emplea para la multiplicacin y el aislamiento de Bacterias anaerobias estrictas, facultativas y de grmenes microaerfilos. Tambin se los emplean para los test de esterilidad de ciertos productos biolgicos. CALDO DE TETRATIONATO.Es un medio enriquecido por la adicin de bilis de buey, tambin es selectivo porque se utiliza para el crecimiento de Salmonellas. El verde brillante que entre en su composicin inhibe la flora Gram (+). Se utiliza cuando la muestra es pobre en grmenes tal como sucede en pacientes crnicos, convalecientes o portadores sanos. AGAR MOTILIDAD.Es un medio semislido y se emplea para averiguar la motilidad de las Bacterias. Es un medio diferencial, se lo emplea en los test bioqumicos. AGAR CHOCOLATE.Es un medio slido especial, utilizado para el crecimiento de microorganismos exigentes como las neisserias patgenas (gonococo y meningococo). En este medio pueden efectuarse las siembras del lquido cefalorraqudeo y pus. AGAR TELURITO.Es un medio de cultivo slido selectivo utilizado para la diferenciacin colonial de los tres tipos de bacilos diftrico: Mitis, Gravis e intermedius, a partir de exudados nasales y faringeos. Su contenido en telurito de potasio permite, en primera instancia inhibir el desarrollo de la flora contaminante. MEDIO DE HUEVO o de PAI.53

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Es un medio de cultivo slido selectivo empleado para el crecimiento del bacilo diftrico en general. AGAR CHAPMAN o MANITOL SALADO.Es un medio de cultivo slido selectivo empleado en el aislamiento de estafilococos basado en la tolerancia que poseen a una alta concentracin de cloruro de sodio que al mismo tiempo inhibe el desarrollo de otros microorganismos. MEDIO DE LOWENSTEIN - JENSEN.Es un medio de cultivo slido selectivo empleado universalmente para el cultivo y el aislamiento de micobacterias, en especial M. tuberculosis. Este medio debe conservarse en tubos hermticamente cerrados y en refrigeracin MEDIO DE THAYER MARTIN.Es un medio enriquecido que permite el crecimiento de cepas exigentes de Neisserias. AGUA O CALDO DE PEPTONA.Es un medio lquido diferencial; que se utiliza para el cultivo de enterobacterias para observar la produccin de indol. se lo emplea en las reacciones bioqumicas . CALDO DE SELENITO F.Es un medio de cultivo selectivo recomendado para la deteccin e identificacin de Salmonellas en heces (Coprocultivos), alimentos, productos lcteos y otros materiales de importancia sanitaria. AGAR MULLER - HINTON.Es un medio enriquecido recomendado para el aislamiento y cultivo, en especial de la familia Neisseriaceae. Constituye un excelente medio para el diagnstico precoz de los portadores de microorganismos rinofarngeos. Tambin se lo utiliza para la interpretacin del Test de sensibilidad de las Bacterias o los antibiticos. MEDIO DE LOEFLER.Es un medio altamente nutritivo recomendado universalmente para el cultivo y aislamiento de Corynebacterium diphterieae en exudado rinofarngeos. MEDIO DE BORDET - GENGOU.Es un medio enriquecido con sangre que se utiliza para el diagnstico bacteriolgico de la Tosferina, es decir para el aislamiento de la Bordella pertusis. EUGON AGAR o EXUBERANTE AGAR.54

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Es un medio enriquecido muy adecuado para obtener el desarrollo exuberante de distintas bacterias de difcil crecimiento, como Hemophilus, Neisseria, Pasteurella, Brucella y lactobacilos. Es muy utilizado en bacteriologa alimenticia para el control de las carnes y alimentos. Tambin para la preparacin de antgeno y vacunas. AGAR SENSIBILIDAD.Es un medio de enriquecimiento especial, slido que se envasa en las cajas de Petri y se lo utiliza en las pruebas de sensibilidad in vitro, de las Bacterias a los antibiticos (Antibiogramas). MEDIO DE STONBRINK.Medio recomendado para el aislamiento de especies de Mycobacterium bovis, que no se desarrollan normalmente en Lowenstein - Jensen. MEDIO DE TRANSPORTE DE STUART.El medio de transporte de Stuart, originalmente usado para facilitar el transporte de muestras tomadas con hisopos para cultivar gonococos, puede ser tambin usado para llevar muestra con otros microorganismos de distintos materiales (vas respiratorias, entricos, etc.). Es un medio semislido no nutritivo que contiene glicolato de sodio para suprimir cambios oxidativos y enzimticos de las clulas. Este medio tiene la ventaja de mantener la vitalidad de todos los grmenes aerobios o microaerfilos delicados. AGAR TCBS.- (Agar de Tiosulfato-citrato- bilis y sacarosa).El Agar TCBS es un medio selectivo que se utiliza para el cultivo y aislamiento del Vibrio cholereae y otro vibrio enteropatgeno. Las concentraciones de tiosulfato, citrato y alcalinidad del medio inhiben el crecimiento de otras enterobacterias presentes en las heces. La bilis y el citrato disminuye el desarrollo de Proteus y enterococos favoreciendo el de vibrio. MEDIO DE CLED.- (cisteina- lactosa- electrolito deficiente).El Agar CLED es un medio no inhibidor, que ha sido adoptado universalmente para efectuar recuento de colonias y aislamiento en bacteriologa urinaria ya que permite el desarrollo de todos los patgenos urinarios y previene el desarrollo invasor (swarming) de Proteus sp.

CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS Con los medios de cultivo se deben establecer tres tipos de control antes de considerarlos aptos para utilizar: CONTROL DE ESTERILIDAD.55

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Se efecta incubando algunas placas, escogidas del lote al azar durante 2 das a 35 C y 5 das a temperatura ambiente. El resto de las placas se guarda en refrigerador a 4 C, y solo se utiliza del grupo control muestra ausencia de cualquier tipo de crecimiento despus de los 7 das. CONTROL DE CALIDAD.Se realiza para comprobar que el medio contiene aquellos componentes que le caracterizan. Para las comprobaciones se utilizan por lo menos dos grmenes distintos, uno que crece sobre el medio, o da positiva una determinada prueba, y otro que no crece, o da negativa. CONTROL DE CADUCIDAD.Para ponerlo en prctica es necesario que en el momento del empaque se rotule en algn lugar visible de la placa, la fecha de preparacin, adems el nombre del medio. De esta manera se podr saber en todo momento el tiempo que falta para llegar al lmite de su utilizacin.

Hasta aqu el primer parcial.

REVISADO Y ACTUALIZADO DR EDUARDO CHANCAY L. Jefe de la Ctedra de Bacteriologa Junio/2012

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