Preparacin de muestras para Microscopa Electrnica de Transmisin

Inga Caqui, Marvyn William

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERA Facultad de Ciencias, Laboratorio de Microscopia

E-mail: marvyn_16@hotmail.com

Resumen
En el presente informe, describimos lo que se observ y se practic en el laboratorio perteneciente a las tcnicas de preparacin de muestras para el TEM, estas tcnicas abarcaron la preparacin de muestras de una pelcula delgada y de muestras slidas (pulverizadas), a su vez tambin se detalla la preparacin de la membrana sobre la cual depositaremos nuestras muestras ya listas, este ltimo slo como referencia ya que no fue hecha a detalle en este laboratorio, sin embargo lo consideramos de vital importancia.

Abstract
In this report, we describe what is observed and practiced in the laboratory belonging to the techniques of sample preparation for TEM, these techniques included the preparation of thin film samples and solid samples (powder), in turn also detailed the preparation of the membrane on which we deposit our sample sand lists, the latter only as a reference because it was not done in detail in this laboratory, however we consider it of vital importance.

I. Introduccin
Una de las limitaciones del TEM es la preparacin de muestras. Las muestras de TEM tienen que ser transparentes a los electrones de manera que puedan ser transmitidos en una cantidad suficiente y pueda formarse as una imagen de fcil interpretacin.

II. Desarrollo Experimental

A. Materiales:
Parlodion altamente purificado. El parlodion es un polmero a base de celulosa, insoluble en el agua e inflamable, el cual ser el componente principal para la elaboracin de la membrana.
FIG. N2. Lminas de Parafilm.

Rejilla portamuestra de cobre para microscopa electrnica. El portamuestra, para el TEM, es una pequea rejilla de cobre en forma de disco de aproximadamente 3mm de dimetro y muy delgada. La unidad de medida de las rejillas es el mesh, lo cual equivale a:

Por lo general se usan rejillas que estn entre 100 a 300mesh.

FIG.N1. Frasco de parlodion.

Parafilm en lmina. Parafilm es una pelcula semitransparente, autosellante, moldeable, flexible, impermeable, inflamable, de un grosor aproximado de 127m. En microscopa electrnica se le utiliza para tomar rejillas flotantes y pelculas a partir de superficies lquidas.

FIG.N 8. Rejilla portamuestras para el TEM.

Pipeta Pasteur.

Caja Petri.

FIG.N7. Petri.

FIG.N3. Pipetas Pasteur.

Papel filtro o secante.

Bistur para microscopa electrnica.

FIG.N8. Papel secante.

Mortero y piln de gata.

FIG. N4. Bistur para microscopa electrnica.

Pinza fina y pinza mediana para microscopa electrnica.

FIG.N9. Mortero de gata con piln. FIG. N5. Pinza fina para microscopa electrnica.

Una fuente de luz blanca y potente.

Agua destilada.

FIG. N6. Lmpara halgena dicrdica.

FIG.N9. Agua destilada.

B. Preparacin de membranas. Lo primero que debemos hacer es conseguir un lugar apropiado para preparar nuestras muestras, un lugar que en lo posible est libre de polvo y bien iluminado. En este laboratorio NO se hizo la preparacin de las membranas, sin embargo es importante ver cmo es que funciona esta tcnica ya que es la base de la preparacin de nuestras muestras: Se enjuaga una caja petri con agua destilada y se llena de este lquido hasta el 90% de su capacidad aproximadamente. Se coloca la caja bajo la luz blanca y a una distancia tal que se pueda observar el reflejo de la fuente luminosa en la superficie del agua; este procedimiento es de ayuda para distinguir la membrana del portaobjeto. Se diluye parlodio en tiner. Esta ser la base para la membrana. Se limpia con agua destilada y se seca en papel toalla dos portaobjetos nuevos. Con ayuda de una pipeta pasteur se coge un poco de parlodio diluido y se coloca tres gotas sobre la esquina de uno de los portaobjetos. FIG.N10. Proceso de separacin de la

FIG.N12. Rejillas de cobre sobre la membrana

membrana del portaobjetos

Para formar la membrana se coloca el segundo portaobjeto sobre la primera y se presiona de modo que el lquido cubra la mayor cantidad de rea posible. Luego se desliza el segundo portaobjeto sobre la primera hasta que el lquido haya baado toda su superficie. El parlodio diluido se encuentra ahora como una fina pelcula sobre una de las caras del primer portaobjeto.

Luego de unos 3 minutos, la capa de parlodio ha secado. A fin de facilitar la extraccin de esta membrana del portaobjeto, se corta, con ayuda de un bistur, las posibles adhesiones que existan entre el parlodio y los bordes del portaobjeto. Teniendo cuidado de no tocar la membrana formada sobre el portaobjeto, se introduce en la caja petri poco a poco. La membrana empieza a desprenderse del portaobjeto y flota sobre la superficie del agua destilada (el parlodio es insoluble en el agua). El procedimiento dura aproximadamente 5 minutos, y se debe evitar las deformaciones y pliegues en la membrana mientras se desprende del portaobjeto. La membrana es fcil de distinguir con ayuda de la fuente luminosa en la posicin descrita en un prrafo anterior. La membrana se le distingue por los colores que presentaba (interferencia de luz en pelculas delgadas). Mediante el empleo de una fina pinza, se colocan algunas rejillas portamuestras de cobre sobre la membrana de parlodio. Se corta un pedazo de parafilm, del tamao de la membrana de parlodio, y se coloca sobre el conjunto rejillas-membrana de parlodio que flota sobre el agua destilada. Se tiene que tener cuidado de cubrir las rejillas y la membrana con la cara correcta del parafilm, que es la que viene protegida por una lmina de papel.

FIG.N13. FIG.N11. Membrana flotante luego de dejar el

portaobjetos.

Lmina de parafilm sobre la membrana que contiene las rejillas de cobre.

El parafilm se adhiere a la membrana, atrapando a las rejillas en medio de las dos capas. Se retira todo el conjunto, y se le coloca sobre papel toalla a fin de que seque (aproximadamente 15 minutos). Con ayuda de un bistur, se hace 6 cortes (hexgono) tales que los cortes sean tangentes a circunferencia de la rejilla de cobre. Luego, mediante el empleo de una pinza muy fina, se retiran cada una de las rejillas.

Posteriormente, con mucho cuidado, se inserta el bistur y se retira la pelcula del material en estudio de aquella zona. Las partculas del material quedarn suspendidas en la gota de agua. Si la adherencia entre el material y el portaobjeto es muy fuerte, entonces en reemplazo de la gota de agua destilada se usa una gota de cido clorhdrico. Empleando la pipeta pasteur se retira la gota con partculas del material del paso anterior y se le lleva sobre una rejilla con membrana ya preparada en el tem anterior (A). Se espera a que seque el agua/HCl y las partculas del material a analizar estarn listas para llevarse al microscopio electrnico.

FIG.N14. Imagen del conjunto (parafilm,

rejillas y membrana).

La membrana de parlodio es transparente y no se puede saber si se encuentra o no sobre la rejilla. Sin embargo, puede reconocrsele si se ilumina la rejilla con una luz blanca; se notar que se torna iridiscente. sta fue la tcnica usada para reconocer la membrana en la rejilla portamuestra.

FIG.N15. Membrana flotante sobre el agua.

C.

Preparacin de la muestra de una pelcula delgada. Para esto se tiene que contar con una fina pelcula del material a estudiar sobre un portaobjeto. Lo que se hace en primer lugar es escoger una zona adecuada para analizar, luego con la ayuda de una pipeta pasteur limpia, se coloca una gota de agua destilada sobre la zona escogida, en esta parte tendremos que tener cuidado de que la gota no sea muy grande ya que por tensin superficial esta puede ser capaz de sacar la membrana que acompaa la rejilla.

D. Preparacin de muestra slidas (Mtodo de Pulverizacin). Se corta un pequeo pedazo del slido y se le lleva al mortero de gata para molerlo (la molienda puede ser reemplazada por la tcnica de ULTRASON). Luego de realizar la molienda se le adiciona unas gotas de agua destilada, ya que necesitamos que el slido est en solucin acuosa para una mejor manipulacin. Posteriormente se lleva esta suspensin a un tubo de ensayo y se le agrega ms agua destilada hasta llenar la mitad del tubo. La cantidad de agua que se le agrega debe ser tal que el agua no se vea turbia (un poco ms clara que la cerveza). Se espera hasta que las partculas del slido ms pesadas caigan al fondo (separacin por levigacin) y con ayuda de una pipeta pasteur se retira un poco de lquido de la superficie (con las partculas ms pequeas). Lo obtenido en el paso anterior se llev sobre una rejilla con membrana preparada en el tem (A). La muestra est lista para llevarse al microscopio. E. Colocacin de la muestra en el microscopio. EL TEM cuenta con un brazo sobre el cual se pone la rejilla portamuestra, en lo posible se evita hacer contacto con las manos, pues al hacerlo hay riesgo de contaminar la cmara que se encuentra en vaco, entonces en todo momento debemos usar guantes de latex y usar una pinza muy fina, con la cual manipular las muestras, en la FIG. N se muestra el brazo donde se coloca el TEM, el cual descansa sobre un soporte durante el proceso de colocacin de la rejilla.

discusin de soluciones, el primer requisito consiste en poder especificar sus composiciones, esto es, las cantidades relativas de los diversos componentes. B. Iridiscencia La iridiscencia es un fenmeno ptico caracterizado como la propiedad de ciertas superficies en las cuales el tono de la luz vara de acuerdo al ngulo desde el que se observa la superficie, como en las manchas de aceite, las burbujas de jabn, las alas de una mariposa y el lado reproducible del disco lser, ya sea CD o DVD. La iridiscencia es causada por mltiples reflexiones de la luz en mltiples superficies semitransparentes, donde los subsecuentes cambios de fase e interferencia de las reflexiones modulan la luz por la amplificacin o atenuacin de las diferentes frecuencias. C. Franjas de una pelcula en forma de cua. Existen una clase de franjas de interferencia para las cuales su espesor ptico, es el parmetro dominante ms que . Estas se llaman franjas de igual grosor. De la FIG. N , tenemos:

FIG.N16. Porta-muestras del TEM

III. Observaciones y discusin.

Las muestras para el TEM obtenidas por cualquiera de los mtodos tienen que estar completamente secos, debido a que estos entrarn a un vaco, habiendo el peligro de contaminacin. Es preferible evitar hablar durante la preparacin de la membrana, y en caso de que lo hagamos tenemos que usar una mascarilla, de esta forma evitamos que las partculas que se emiten cuando se habla (por ejemplo la saliva) ensucien la membrana, ya que esto traera consecuencias al momento de observar la muestra en el TEM. La preparacin de membranas es un proceso sensillo que se debe hacer con mucho cuidado para no daar la membrana y en un lugar de trabajo apropiado.

La diferencia de fase correspondiente en el punto P es:

IV. Conclusiones.
La preparacin de membranas es un proceso sencillo que se debe hacer con mucho cuidado para no daar la membrana y en un lugar de trabajo apropiado. Tomando en cuenta el cambio de fase de en reflexin en una de las superficies de la pelcula, existen mximos de intensidad en el punto P cuando:

V. Anexos.
A. Definicin de suspensin y solucin. Suspensin: Las suspensiones son mezclas heterogneas formadas por un slido en polvo (soluto) o pequeas partculas no solubles (fase dispersa) que se dispersan en un medio lquido (dispersante o dispersora). Cuando uno de los componentes es agua y los otros son slidos suspendidos en la mezcla, son conocidas como suspensiones mecnicas. Solucin: Una solucin es una mezcla homognea de dos o ms sustancias. La sustancia disuelta se denomina soluto y est presente generalmente en pequea cantidad en comparacin con la sustancia donde se disuelve denominada solvente. En cualquier

FIG.N17. Interferencia en una pelcula en forma de

cua.

Donde es el promedio para los puntos de la fuente los cuales contribuyen a la luz en el punto P. Si ste valor es efectivamente constante, las franjas estn localizadas en los puntos de la pelcula en el cual el espesor ptico es constante, por lo que se les conoce a stas franjas de igual grosor. A incidencia normal, la condicin para una franja oscura llega a ser, con y la longitud de en aire. onda Las franjas de interferencia en la placa representan contornos de la pelcula a intervalos de , lo que nos indica que este principio es muy til para medir diferencias de espesores, cuando stos son del mismo orden de magnitud que la longitud de onda.

FIG.N18. Franjas en una pelcula en forma de cua.

VI. Bibliografa.
[1]. ptica Fsica. Centro de Investigaciones en ptica (CIO). Mxico. [2]. ptica. Eugene, Hecht and Alfred, Zajac. Addison-Wesley Iberoamericana, 1986. [3]. Principles of Optics: Electromagnetic Theory of Propagation Interference and Diffraction of Light. Max Born and Emil Wolf. Pergamon Press, 6th edition, 1980. [4]. La parte de preparacin de membranas fue tomada de la pgina web: http://webdelfisico.blogspot.com/2008/11/preparac in-de-membranas-para-microscopa.html [5]. Para las tcnicas de preparacin de muestras:

http://webdelfisico.blogspot.com/2008/11/resu men-en-este-laboratorio-se-observ-y.html