3 kegiatan rekayasa genetik

Pemotongan : pemecahan rantai asam nukleat o Endonukleolitik : pemecahan dari tengah. Biasanya pake enzim restriksi (endonuklease) o Eksonukleolitik : pemotongan dari pinggir (ukurannya beda) (jarang dipakai) Macam enzim restriksi : Tipe 1 : terlalu kompleks Tipe 2 : menghasilkan ujung lengket dari dna yang dipotong sehingga mudah disambungkan (sering dipake) Tipe3 : menghasilkan ujung tumpul sehingga susah digabungkan (jarang dipake) Modifikasi : rantai dna ditambah atau dikurangi gennya (setelah dipotong) lalu disambungkan lagi dgn enzim ligase o Menggunakan based on restriction enzim (yg tadi awal) o Oligonucleotid directed mutagenesis Penyambungan : menyambungkan fragmen asam nukleat yg terpisah sehingga menjadi satu.

Apa yang dimaksud dengan :

Sekuensing : proses pembacaan gen yang dibutuhkan menggunakan mesin. o Metode sanger : pembacaan gen dengan pemasukkan gen restriksi ribinukleotida secara acak. Lalu dimasukkin protein buffer ke rantai pertama, lalu terbaca sebagian kecil rantai. Rantai selanjutnya menggunakan protein buffer berbeda Elektroforesis : proses pemisahan dna berdasarkan massa molekul dan panjang molekul dengan menggunakan medan listrik dgn medium gel : Teknik pemurnian plasmid : yg dibutuhkan adalah dnanya, plasmid dari yg dibutuhkan dari organisme, lalu dipake metode plasmid : o Etbr (etilene bromide): menambahkan etbr ke plasmid organisme. Karna plasmid itu sirkuler, jadi etbr susah nempel. Jika ke dna yg linier, etbr yg nempel. Makin banyak etbr yg nempel, massanya makin ringan. Kemudian disentrifugasi, sehingga dna akan keatas, plasmid dibawah. o Penggunaan basa dengan pH 12-12.5 : dna linier bakal terdenaturasi sehingga plasmid akan lebih ringan, lalu disentrifugasi Jika dibutuhkan, plasmid bisa dimodifikasi dengan menggunkan gel filtrasi (jd tanpa pengotor

Proses transformasi : dna yg dipotong dan plasmid disuntikkin ke sel kosong melalui proses elektroforasi atau heat shock. Lalu ditunggu (sel sudah terdapat antibiotik), jadi kalo bakteri tidak mengandung gen tertentu dia akan mati oleh antibiotik tersebut.

PCR
3 komponen penting PCR : DNA template DNA primer (yg kecil) Enzim DNA polimerase

PCR : reaksi penggandaan dna daerah tertentu dari dna template dgn bantuan enzim dna polimerase dan dna primer. PCR terdiri dari 3 tahapan : Denaturasi : dna double helix (dna template) dipanaskan (didenaturasi) supaya terpisah (jd tunggal) dgn suhu kira2 90 derajat. Annealing : suhu diturunkan jadi 40-50 derajat. Tujuannya untuk menempelkan dna primer ke dna template Elongasi : setelah sesuai kode2nya antara dna template dan dna primer, dna primer (yg kecil) akan memanjangkan (mencopy) dirinya mengikuti kode dna template, tetapi dengan kode yang berkebalikan dengan dna template. Kemudian siklus kembali berputar ke denaturasi, jd dna primer yg udah mengcopy dna template kembali terpisah kemudian bersatu dengan dna primer pendek yang lainnya lalu kembali terjadi elongasi sehingga terbentuk dna dengan kode yang sama.

Yg mempengaruhi keberhasilan proses pcr itu ada 6 : Ukuran : ukuran dna primer bisa semakin panjang (bisa lancar mengkomplementerkan dirinya) jika enzim polimerasi yang digunakan punya kemampuan proof reading (pengecekan) Kualitas anneal dna primer (daya tempel) : dna primer mungkin menempel di tempat yang tidak tepat (misal karna dna template terlalu dekat), sehingga untuk membuat dna primer menempel di tempat yang tepat, beberapa yang harus diperhatikan adalah : o Konsentrasi ion mg, semakin tinggi makin bagus o Suhu, semakin tinggi makin bagus o Panjang primer, semakin spesifik/panjang makin bagus Adanya kontaminasi : o Dari lab : misal pipet keiisi aerosol

o Dari eksternal : misal ada jamur atau bakteri (ga steril) Heterogenitas dari sekuens : Dna template bisa menghasilkan heterogenitas (jadi ga sama semua alelnya). Terjadi heterogenitas jika gen : o Emang heterozigot o Diambil dari individu yang berbeda (meningkatkan kemungkinan heterozigot) o Karena dnanya rusak, akibat terjadi oksidasi, deaminasi, crosslink Jumping : saat dna template putus, dna primer yang sedang mengalami elongasi bisa lompat ke dna template lain (yg bukan putusannya) yang memiliki nukleotida yang sama (bisa di ujung atau ditengah) sehingga memungkinkan sekuensing menjadi selesai tapi tidak sempurna, menguntungkan jika sekuensing selesai di tempat yang tepat, tidak menguntungkan jika dna jadi rusak Interpretasi

Metode pcr Rapd : dna primer pendek (10 basa) Rt : primernya RNA, jadi di ubah jadi DNA dulu baru di pcr Hot start cold finish : DNa termodifikasi sehingga dielongasi pada suhu rendah

PR (masukan ke presentasi) 1. 2. 3. Bagaimana membuat primer pada proses pcr? Jelaskan teknik sekuansing metode sanger Jelaskan tata cara penamaan enzim restriksi

Buat presentasi untuk 40 menit (hanya 2 kelompok) 40 menit tanya jawab 20 menit kuis