I UNIDAD ENZIMOLOGIA Y BIOENERGETICA

ENZIMOLOGIA
INTRODUCCION AL METABOLISMO CELULAR Los seres vivos requerimos energa para desarrollar o cumplir con cada una de nuestras funciones bsicas y para soportar la actividad fsica al que estamos sometidos da a da. Los seres humanos obtenemos nuestro combustible principalmente a partir de carbohidratos, lpidos y protenas de nuestra dieta, sin dejar de considerar a los minerales, agua y vitaminas (Fig. 1.1). Para ellos nuestros alimentos deben ser digeridos y absorbidos, una vez que llegan a la circulacin ingresan a los diversos tejidos y son captadas por las clulas para ser transformadas a travs de una serie de reacciones llamado metabolismo, en la cual se algunos metabolitos se oxidan para producir energa (Catabolismo), generando como productos finales CO2 y agua y en caso de protenas NH3; para que ellos ocurra a plenitud es necesario la presencia de oxgeno. Si en nuestra dieta se excede las necesidades inmediatas del organismo, stas se almacenan (anabolismo) en forma de glucgeno o triglicridos. Por el contrario cuando la ingesta es deficitaria, lo almacenado se degrada para generar energa. Los detalles de estos procesos sern analizados posteriormente Para que nuestros alimentos sean transformados se requiere la presencia de compuestos especiales denominados enzimas ENZIMOLOGIA GENERALIDADES En nuestro organismo, un compuesto se transforma en otro, de diferente naturaleza, entonces decimos que se ha producido una reaccin qumica. Esta transformacin ocurre a una determinada velocidad, dependiendo de varios factores; entre ellos la presencia de un catalizador que modifica la velocidad de una reaccin qumica, en los seres vivos estas se denominan enzimas Las enzimas son generalmente protenas, que actan como catalizadores biolgicos, ya que
Fig. 1.1 Revisin del Metabolismo celular

incrementan la velocidad de la reaccin enzimtica. De manera general se produce bajo la ecuacin: S + E [ES] [EP] E + Ps

[ES]

[EP]

E
Aunque

las enzimas pueden ser modificadas durante la secuencia, retornan a su estado original una vez finalizado la reaccin. Adems, incrementando la velocidad de las reacciones, las enzimas proporcionan un medio para regular la tasa de reacciones en las vas metablicas del organismo

ESTRUCTURA De todas las funciones de las protenas, la catlisis es tal vez la ms importante. En ausencia de catlisis, casi todas las reacciones de los sistemas biolgicos se llevaran a cabo con demasiada lentitud para suministrar productos al ritmo que los requiere un organismo metabolizador. La mayor Parte de nuestras enzimas son de naturaleza proteica, sin embargo se ha demostrado que algunos tipos de RNA tienen elevada actividad cataltica. De la misma manera algunas tienen una actividad particular como anticuerpos con actividad cataltica (abzimas), o las granzimas. A objeto de particularizar la estructura y propiedades enzimticas nos ocuparemos bsicamente de aquellas con naturaleza proteica. Las enzimas son los catalizadores ms eficientes que se conocen: pueden aumentar la velocidad de una reaccin en un factor de hasta 1020 respecto de las reacciones no catalizadas. Las enzimas son altamente especficas, incluso al grado de poder distinguir entre los estereoismeros de un compuesto dado. En muchos casos, las acciones de las enzimas se afinan mediante procesos reguladores. Son tambin, termolbiles y no dializables Algunas enzimas actan tan solo contando con la parte proteica.

se denominan holoenzimas, y la parte proteica apoenzima.

Los cofactores son componentes de bajo peso molecular, usualmente termoestables, orgnicas o inorgnicas; en base a sus caractersticas pueden denominarse: coenzima - si la unin es dbil y pueden separarse con facilidad-, grupo prosttico si su unin es fuerte, de manera covalente, o in metlico si acta bajo esa condicin, tal como Zn2+, Mg2+ o Cu2+. Son ejemplos tpicos de coenzima formas modificadas de vitaminas hidrosolubles, especialmente las del complejo B, tales como NAD, NADP, FAD, u otras de forma no vitamnica como ATP, UDP, Coenzima Q. Entre los grupos prostticos tenemos al grupo Hem, como el de la catalasa. Algunas pertenecen a iones metlicos tales como cobre para lisina oxidasa, o el zinc de la anhidrasa carbnica.

PROPIEDADES GENERALES
SITIO ACTIVO El sustrato se une a una regin especfica de la enzima denominada sitio activo o sitio cataltico (Fig. 1.2)

Fig. 1.2 sitio activo de la enzima

Otras, sin embargo, para funcionar adecuadamente requieren de la presencia de otras molculas no proteicas denominadas cofactores. En este ltimo caso las enzimas

La proximidad y orientacin del sustrato en el sitio activo contribuye a la fuerza cataltica de la enzima. El sitio activo puede incluso contener cofactores, los cuales son metales o compuestos orgnicos no proteicos. Las

interacciones entre el sustrato y grupos reactivos funcionales sobre los residuos de aminocidos cofactores de la enzima promueven el rearreglo electrnico necesario para la reaccin. La mayora de las reacciones catalizadas por enzimas son muy eficientes y transcurren desde 106 hasta 1014 veces ms rpido que la misma reaccin no catalizada. Tpicamente, cada molcula de enzima es capaz de transformar cada segundo de 100 a 1000 molculas de substrato en producto. El nmero de estas molculas transformadas a producto por molcula de enzima en cada segundo, se conoce como el nmero de recambio Caractersticas 1. Tamao. Es relativamente pequeo cuando se compara con el resto de la enzima, ya que est constituido por una regin que contiene pocos aminocidos. 2. Forma. El Sitio activo de una enzima tiene forma tridimensional. Algunos aminocidos interactan ms frecuentemente que otros con el sustrato debido a la carga o caractersticas de sus grupos funcionales libres (amino, carboxilo, hidroxilo, etc.) de la cadena peptdica. 3. Unin. El sustrato se une a las enzimas por fuerzas relativamente dbiles 4. Interaccin. Al interactuar el sitio activo con el sustrato, se forma un complejo compacto que en su espacio intermolecular no cabe ni la molcula de agua. El sitio activo contiene varias zonas polares, que son esenciales para el enlace y la catlisis; asimismo, posee otras regiones no polares, que se comportan como una regin en la que el sustrato interacta con mayor o menor intensidad, segn sus caractersticas. Especificidad. Un sustrato debe tener una forma, tamao y caractersticas de carga para interactuar en el sitio especfico. La enzima hexocinasa tiene como sustrato D-glucosa, que no interacta con la forma L. Emil Fisher propuso la metfora de la cerradura y la llave para hacer la similitud con las caractersticas de estereospecificidad

del sitio de catlisis; sin embargo, trabajos recientes sugieren que el sitio activo de algunas enzimas no es tan rgido, ya que su estructura se modifica al unirse con el sustrato. El sitio activo tiene una forma complementaria sustrato solamente despus de establecido su unin. Este proceso de reconocimiento dinmico se llama inducido.

COMPLEJO ENZIMA-SUSTRATO El efecto cataltico de una enzima siempre es precedido por la formacin de un complejo enzima-sustrato. Caractersticas 1. En algunas ocasiones se ha visualizado directamente con microscopia electrnica transmisin y con cristalografa de rayos X. 2. Al constituirse el complejo enzimasustrato se modifican algunas de las propiedades fsicas de la enzima, es el caso de solubilidad y la estabilidad al calor. 3. Al establecer el complejo, las caractersticas espectroscpicas de muchas enzimas cambian. 4. El complejo puede ser aislado experimentalmente en forma pura en algunos casos. A una concentracin constante de enzima la velocidad de una reaccin se incrementa directamente en proporcin al aumento de la cantidad de sustrato, hasta alcanzar un ptimo. En otras palabras, a una concentracin suficientemente alta de sustratos, los sitios cata1ticos de la enzima se saturan y la reaccin alcanza su velocidad mxima (sta es la prueba general ms antigua de la existencia del complejo enzimasustrato). En contraste, las reacciones no catalizadas no presentan este efecto de saturacin. Por otro lado, la saturacin indica tambin que la enzima presenta un nmero finito de sitios de combinacin con el sustrato. Cuando todos los sitios estn ocupados por sustrato, se puede hablar de saturacin y es posible explicar el tipo de cintica descrito en 1913 por Michaelis y Menten.

En este caso, debe considerarse que slo un sustrato y un producto son libremente interconvertibles. Especificidad Las enzimas son muy especficas por el substrato de la reaccin que catalizan. Interactan con una o muy pocas molculas y catalizan nicamente un tipo de reaccin, por lo que las molculas con las que interactan deben ser muy parecidas, tanto en composicin, como en estructura tridimensional. Se han establecido dos modelos, el de llave-cerradura y acoplamiento o encaje inducido Segn el modelo de llave cerradura existe un encaje perfecto del sustrato a su lugar de accin, la misma que sera rgido como una cerradura (Fig. 1.3). Este modelo, propuesto por Emil Fisher en 1894, establece que durante las reacciones enzimticas, los compuestos se combinan con ciertos sitios especficos de las enzimas para convertirse en productos

cambios conformacionales afectan a toda la enzima dando lugar a la exclusin del agua del sitio activo

Fig. 1.4 Modelo del acoplamiento inducido

MECANISMO ENZIMTICA

DE

ACCIN

Aspectos cinticos y termodinmicos de las reacciones La rapidez de una reaccin y el grado en que se favorece termodinmicamente son dos temas distintos, aunque estn muy relacionados. Esto es verdad para todas las reacciones, intervenga o no un catalizador. La diferencia entre las energas de los reactivos (el estado inicial) y las energas de los productos (el estado final) de una reaccin da el cambio de energa de esa reaccin, expresado como cambio estndar de energa libre ( G).

Energa de activacin

Fig. 1.3. Modelo llave-cerradura

En el ejemplo dado una determinada regin de la protena (radical SH2) se une a la tirosinfosfatasa, que se adapta al sitio activo de la enzima como una llave lo hace a su cerradura Para el modelo del acoplamiento o encaje inducido, propuesto por Koshland en 1959, no existe un sitio de unin totalmente preformado, sino casi todas las enzimas sufren un cambio conformacional, que permiten la ubicacin de los aminocidos en el sitio activo e incrementan el nmero de interacciones en el lugar de unin (Fig. 1.4) Esto ocurre, por ejemplo, durante la unin de la glucosa y glucocinasa o hexocinasa, cuyos

Fig. 1.5 Mecanismo de accin enzimtica

Para sobrepasar la barrera energtica, que existe entre los reactivos y los productos, se debe de proveer a la reaccin, en el inicio de la misma, de la energa necesaria. A esta energa, que se recupera en el transcurso de la reaccin, se le llama Energa de activacin y de ella depende la rapidez de una reaccin bioqumica (Fig. 1.5) Las enzimas, al igual que todos los catalizadores, aceleran las reacciones pero no pueden alterar la constante de equilibrio ni el

cambio de energa libre. La energa de activacin de una reaccin no catalizada es ms alta que la de una reaccin no catalizada: dicho de otro modo, una reaccin no catalizada requiere ms energa para ponerse en marcha. Por ello, su rapidez es ms baja que la de una reaccin catalizada (Fig. 1.6) La mejor forma de mostrar la energa de activacin y su relacin con el cambio de energa libre de una reaccin es con una grfica.

ruptura de H2O2 se ha reducido en presencia de un catalizador de hierro. Curva (c) diagrama de energa para la ruptura de H2O2 catalizada por la enzima catalasa. Esta reaccin tiene el ms bajo requerimiento de energa de activacin. Curva (d), diagrama de energa para la ruptura no cataltica de H2O2 a una temperatura elevada. Las molculas de H2O2 comienzan a reaccionar desde un alto nivel de energa. Si se requiere aumentar la velocidad de la reaccin, se pueden hacer dos cosas: incrementar el nivel de energa promedio de las molculas de H2O2 mediante un aumento en a temperatura: o bien, aadir un catalizador, La velocidad se incrementa en la primera opcin porque aumenta el nmero de colisiones entre las molculas y, por consiguiente, la fraccin de molculas de H2O2 con suficiente energa para vencer la cima (pasando por el estado de transicin). Los requerimientos energticos para la reaccin son iguales para las dos temperaturas No obstante, aumentar la temperatura no es una opcin viable para la mayora de las clulas vivas. La otra alternativa es aadir un catalizador. Al aadir iones frricos (Fe3+) y otros iones metlicos al perxido en solucin, se incrementa unas 30 000 veces su velocidad de degradacin con respecto a la velocidad alcanzada sin el catalizador (compare las (figuras 6.la y 6.lb). Un catalizador funciona disminuyendo a energa de activacin de una reaccin (figura 6.2b, c). El Fe3+ dirige las molculas de H2O2 a travs de distintas vas de descomposicin en donde existe una menor barrera energtica aumentando as la velocidad de reaccin. La posicin de equilibrio de la reaccin anterior no cambia en presencia del catalizador; sin embargo, el equilibrio se alcanza mucho ms rpido porque se degradan ms molculas de H2O2 por unidad de tiempo. Ahora, veamos lo que ocurre en presencia de una enzima, un catalizador biolgico. Cuando se aade la enzima catalasa a la solucin de la velocidad de reaccin es unas 100 000 000 veces ms rpida que sin el catalizador (figura 6.2c). La catalasa es una protena grande (PM = 250000) formada por cuatro subunidades idnticas, cada una asociada a una unidad hemo (protoporfirina con hierro) y se encuentra en casi todos los tipos de clulas

Fig. 1. 6 catalizadas

Reacciones catalizadas y no

En la figura anterior 1a. coordenada X muestra el grado en que se ha efectuado la reaccin, y la coordenada Y, la energa libre de una reaccin idealizada. El perfil de la energa de activacin muestra las etapas intermedias de una reaccin, entre los estados inicial y final. Los perfiles de energa de activacin son indispensables para estudiar los catalizadores. La energa de activacin afecta directamente la rapidez de reaccin, y la presencia de un catalizador acelera la reaccin alterando el mecanismo y abatiendo as la energa de activacin. La elevacin de temperatura de una mezcla de reaccin aumenta la energa con que cuentan los reactivos el estado de transicin. A continuacin describiremos el ejemplo de la catalasa para ilustrar de manera general el mecanismo de accin enzimtica. Las molculas de H2O2 deben alcanzar un nivel de energa equivalente a la energa de activacin para ser transformadas en productos. Curva (a), energa de activacin para la reaccin en ausencia de catalizador. Curva (b), la energa de activacin para la

animal y vegetal. Como todas las enzimas, la catalasa tiene las propiedades de un verdadero catalizador: 1. Aumenta la velocidad de una reaccin al disminuir la barrera de energa de activacin. 2. No se consume ni sufre cambio permanente de su estructura durante el proceso cataltico. 3. No altera la posicin de equilibrio de la reaccin, slo la velocidad a la cual se alcanza dicho equilibrio. 4. Por lo general, acta formando un complejo transitorio con el reactivo, estabilizando as el estado de transicin.

Por suerte, todas las enzimas conocidas se pueden clasificar dentro le seis categoras (tabla 1.1).

PRINCIPIOS ENZIMTICA

DE

CINETICA

NOMENCLATURA Y CLASIFICACION DE LAS ENZIMAS A la fecha se han aislado y estudiado miles de enzimas; y habra mucha confusin si no existiera un sistema de nomenclatura y clasificacin de enzimas. Los nombres ms comunes para las enzimas se forman aadiendo el sufijo -asa, al nombre de los reactivos. As, la enzima tirosinasa cataliza la oxidacin de tirosina. Estos nombres definen el sustrato, pero no describen a la reaccin qumica. Los primeros nombres que se dieron a las enzimas, como catalasa, tripsina y pepsina, son todava menos descriptivos y no dan pista alguna de su funcin o sustrato; para evitar tal confusin, ahora as enzimas tienen nombres oficiales que reflejan las reacciones que catalizan. Cada enzima tiene un nombre oficial internacional terminado en -asa y, se siguen las reglas establecidas por la IUPAC, IUB y IEC. Se divide en clases, subclases de acuerdo a la reaccin que catalizan, asignndole un nombre recomendado, un nombre sistemtico (tipo de reaccin), seguido de un nmero de cuatro dgitos separados por puntos y precedido por las letras EC (Enzyme Commission). Por ejemplo, el cdigo numrico: para la lipasa pancretica es: EC 3.1.1.3 El primer 3 por ser una hidrolasa, primer 1, por hidrolizar un enlace ster, el segundo 1 por ser ster carboxlico, y el segundo 3, porque es el nmero de orden que corresponde a esta lipasa especfica.

La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios proporcionan informacin directa acerca del mecanismo de la reaccin cataltica y de la especificidad de la enzima. La medida se realiza siempre en las condiciones ptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc., y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reaccin observada es la velocidad mxima (V max). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparicin de los productos o la desaparicin de los reactivos. Aunque las enzimas poseen muchas de las caractersticas de los catalizadores orgnicos e inorgnicos tpicos, sus propiedades cinticas, nicas, las sitan en otro grupo de catalizadores. Lo primero que se observ del comportamiento particular de las enzimas, fue el efecto poco comn de la concentracin del sustrato sobre la velocidad de reaccin enzimtica. Para estudiar las velocidades de estas reacciones, se mezclan la enzima y el sustrato en una solucin adecuada amortiguada para mantener un pH constante, y a una temperatura fija. La velocidad inicial (vo) se determina, en los primeros minutos de la reaccin, midiendo ya sea la disminucin de la concentracin del reactivo o el aumento en la concentracin del producto. Si se quiere estudiar el efecto de la concentracin del sustrato, se plantea un experimento como el de la figura 8. Se preparan varios tubos que contienen un amortiguador con cantidades crecientes de sustrato; se les aade a cada tubo una cantidad constante de enzima, se mide la velocidad de la reaccin y, por ltimo, se construye una grfica de la velocidad de reaccin contra la concentracin de sustrato. Con concentraciones relativamente bajas de sustrato, a velocidad inicial de reaccin

aumenta conforme se aade ms sustrato, como cabra esperar; pero con concentraciones ms altas, el aumento en la velocidad es cada vez ms lento hasta el punto en que la velocidad se hace constante sin importar cunto sustrato est presente; esto es, la curva tiene la forma de una hiprbola.
Tabla 1.1 Clasificacin de enzimas
Tipo de reaccin catalizada Transferencia de electrones, casi siempre en forma de iones hidruro o tomos de hidrgeno. usan con frecuencia coenzimas como NAD+, NADP+, FAD+, lipoato Transferencia de grupos funcionales de una molcula a otra. Ruptura de enlaces por hidrlisis. Formacin de dobles enlaces por eliminacin de grupos o adicin de grupos o un doble enlace. Transferencia de grupos dentro de una molcula para dar formas isomricas. Formacin de enlaces C-C, C-S, C-O y CN por condensacin acoplada con la ruptura de ATP.

como un efecto de saturacin de sustrato. Los primeros investigadores que analizaron explicaron la forma de esta curva de velocidad fueron los bioqumicos Leonor Michaelis y Maud Menten Anlisis cuantitativo de la cintica enzimtica: Se basa en los estudios de Michaelis - Menten y de Haldane. Los estudios sistemticos del efecto de la concentracin inicial del sustrato sobre la actividad enzimtica comenzaron a realizarse a finales del siglo XIX. Ya en 1882 se introdujo el concepto del complejo enzimasustrato como intermediario del proceso de catlisis enzimtica. En 1913, Leonor Michaelis y Maud Menten desarrollaron esta teora y propusieron una ecuacin matemtica de velocidad que explica el comportamiento cintico de los enzimas. Ellos propusieron que las molculas de enzima, E y las molculas de sustrato, S, se combinan en forma reversible y por etapas para formar un complejo ES:

CLASE 1 Oxidorredutasas

Ejemplo

Succinato deshidrogenasa

Citocromo oxidasa

2 Transferasas

Glucocinasa

k1

k3

3 Hidrolasas 4 Liasas

E+S
lactasa

ES
k2

E+P
k4

Aldolasa

Citrato liasa

5 Isomerasas

Fosfotriosa isomerasa epimerasa

6 Ligasas

Piruvato carboxilasa

Los trminos k1, k2, k3 y k4 definen las constantes de velocidad de las etapas individuales. El complejo ES tiene dos posibles destinos: revertirse, liberando la enzima y el sustrato, o proceder por medio de una reaccin reversible para formar la enzima libre y un producto, P. la reaccin anterior es la mnima reaccin secuencial necesaria para explicar la accin enzimtica. Se ha propuesto una versin ms complicada de la reaccin, la cual muestra un complejo enzima-producto, pero requiere de un anlisis matemtico ms complicado y no mejora sustancialmente nuestra comprensin de la funcin enzimtica: E+S ES EP E+P

La velocidad constante se define como la velocidad mxima o Vmx, Este comportamiento cataltico que se observa en la mayora de las enzimas, se puede describir

La ecuacin bsica desarrollada por Michaelis y Menten para explicar la reaccin catalizada por una enzima es:

Vmx [S] vo = K M [S]

donde: vo = velocidad inicial dada por la concentracin de sustrato [S] Vmx = velocidad mxima KM = constante de Michaelis Michaelis y Menten hicieron varias suposiciones para simplificar su ecuacin. Decidieron no considerar la reaccin que revierte el producto P y la enzima libre al complejo ES (definida por k4 en la reaccin secuencial). Esta reaccin se vuelve significativa slo cuando se han producido concentraciones relativamente altas de producto. Cuando los bioqumicos utilizan la ecuacin de Michaelis-Menten en el laboratorio, slo miden las velocidades iniciales, cuando la reaccin representada por k4 es muy, muy lenta (por lo regular durante los primeros minutos). Otra suposicin necesaria para desarrollar esta ecuacin es que el complejo ES es un intermediario en estado estacionario; es decir, despus de mezclar E y S, se forma rpidamente una cierta cantidad del complejo ES y su concentracin permanece relativamente constante porque se produce con la misma velocidad con la que se degrada. Otras dos constantes importantes de la ecuacin de Michaelis-Menten, KM y Vmx, merecen una descripcin ms amplia. La constante de Michaelis, KM, se expresa en trminos matemticos como una combinacin de constantes de velocidad Expresado con palabras, KM equivale a la concentracin de sustrato que produce una velocidad inicial de Vmx. Los valores de KM de las enzimas van desde 10-1 M hasta valores tan pequeos como 10-8 M. Para las enzimas que emplean ms de un sustrato, existe un valor de KM que define a cada una de ellas. Bajo ciertas condiciones de KM es una medida de la afinidad entre E y S. Cuando KM es relativamente grande (10-1 a 10-3 M), k2, la constante de velocidad de disociacin de ES, tambin lo es, y por lo tanto, el complejo ES se mantiene muy dbilmente unido. Por el contrario, un valor pequeo de KM (de menos

de 10-3 M) representa una alta afinidad entre E y S (se forma un complejo fuerte). Ya se mencion que Vmx es la velocidad mxima de una reaccin catalizada por una enzima para un valor dado de [E]. Este trmino, que se puede medir de manera experimental, es una constante importante muy til para caracterizar una enzima y optimizar las condiciones de reaccin. Pero lo ms relevante es que conociendo el valor de Vmx podemos calcular otra constante: el nmero de recambio k3 de una enzima. El nmero de recambio es el nmero de moles (o molculas) de sustrato transformado en producto por moles (o molcula) de enzima en un tiempo determinado, usualmente un segundo. Las constantes KM, Vmx y k3 nos dan mucha informacin acerca de una reaccin catalizada por una enzima, de ah que sea importante obtenerlas de manera experimental. En la mayora de los mtodos se utiliza el anlisis grfico de los datos experimentales. La curva de Michaelis-Menten se puede utilizar para estimar Vmx y KM, sin embargo, es difcil medir con precisin el valor de V mx porque se necesitan alcanzar niveles altos de sustrato, que no son fciles de realizar experimentalmente. Por esta razn, Vmx, se determina casi siempre de la grfica de Michaelis-Menten y el valor de KM como la concentracin de sustrato que produce una velocidad inicial de Vmx. En resumen, en este modelo la enzima se combina reversiblemente con su substrato para formar el complejo enzima-sustrato (ES) que subsecuentemente se rompe para formar el producto, hecho que regenera a la enzima. Luego de una serie de anlisis, la representacin grfica de la ecuacin de Michaelis-Menten (v0 frente a [S]0) es una hiprbola (Fig. 1.9). La Vmax corresponde al valor mximo al que tiende la curva experimental, y la KM corresponde a la concentracin de sustrato a la cual la velocidad de la reaccin es la mitad de la Vmax

Fig. 1.10. Representacin de la Ecuacin de Lineweaver-Burk

Fig. 1.9. Grafica de la Ecuacin de MichaelisMenten

De esta forma, a partir de los datos experimentales se puede calcular grficamente, los valores de Km y Vmax de un enzima para diversos sustratos, e incluso con ello calcular el valor de la actividad enzimtica, empleando las unidades correspondientes. Unidades de actividad enzimtica La unidad de actividad enzimtica (U, UAE) ms ampliamente usada se define como la cantidad que causa la transformacin de 1.0 mol de substrato por minuto, a 25C, en condiciones ptimas. La actividad especfica es el nmero de unidades de enzima por miligramo de protena (U/mg prot) o por mililitro de disolucin (U/ml). Esto es una medida de la pureza de una enzima, se incrementa durante el proceso de purificacin alcanzando el valor mximo cuando la enzima est en estado puro. La actividad molar o molecular o nmero de recambio es el nmero de molculas de substrato transformadas por minuto por una sola molcula de enzima, cuando la enzima es el factor limitante de la velocidad. Para el clculo se utiliza la Vmax y el peso molecular de la enzima. La Comisin de Enzimas de la Unin Internacional de Bioqumica ha recomendado que la actividad enzimtica sea expresada en unidades de mol/segundo, en vez de moles/ min, para adecuarse a las constantes de velocidad usadas en cintica qumica, y seguir al Sistema Internacional de Unidades, proponindose a la nueva unidad, Katal (Kat), definido como la cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato por segundo. Como 1 mol son 106 moles y 1 minuto son 60 segundos, resulta que 1 katal equivale a 60 x 106 U. Esta unidad es muy grande, de forma que se utilizan frecuentemente los submltiplos como el microkatal (kat, 10-6 kat), el nanokatal (nkat, 10-9 kat), o picoKatales (Prat, 10-12 kat).

Ecuacin de Lineweaver-Burk En 1934, Hans Lineweaver y Dean Burk describieron un mtodo para expresar la ecuacin de Michaelis-Menten en una forma ms manejable para el anlisis grfico, puesto que el de Michaelis y Menten dificultaba la obtencin grfica de Km y Vmax, por lo que es ms simple utilizar la representacin doble recproca (1/v0 frente a 1/[S]0), o representacin de Lineweaver-Burk, la misma que permite el trazo de los datos experimentales en forma de una lnea recta (Fig. 1.10).

1 vo

KM 1 . Vmx [S]

1 Vmx

Una grfica de 1/vo contra 1/[S] produce una lnea recta con pendiente de KM/Vmx y con intersecciones 1/Vmx en las ordenas y -1/KM en las abscisas. La grfica de LineweaverBurk es valiosa porque permite evaluar la inhibicin de las reacciones enzimticas.

ALGUNOS CONTROLAN CATALITICA

FACTORES QUE LA ACTIVIDAD

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Hasta ahora, slo hemos revisado la influencia del sustrato (S} sobre la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. La actividad enzimtica est influenciada adems por una serie de factores externos e internos, sean stos fsicos, qumicos y biolgicos que afectan la actividad enzimtica, entre ellos tenemos: por factores experimentales como la concentracin de enzima, el pH de la solucin de reaccin y la temperatura, as como actividad de productos e inhibidores. Es fcil predecir el efecto que tendra aadir ms enzima, ya que al ser sta el catalizador, la velocidad inicial de reaccin debe ser mayor cuanto mayor sea la concentracin de enzima (Fig. 1.11); pero siempre y cuando haya suficiente sustrato. Las enzimas tambin son sensibles a los cambios ambientales. La mayora de ellas tienen un pH ptimo para lograr su eficiencia mxima; ste vara de una enzima a otra, pero por lo general se encuentra entre pH de 6-8. La dependencia de pH se debe a la participacin de los residuos de aminocidos cargados que tiene la enzima o a los sustratos, cuyas estructuras inicas cambian segn vare el pH (Fig. 1.12)

De esta manera, cuando los valores de pH se incrementan o disminuyen de los rangos considerados ptimos para cada enzima, la actividad enzimtica siempre disminuye, debido a que las variaciones de pH afectan el carcter inico de los grupos funcionales de la enzima alterando su conformacin o desnaturalizando a las enzimas al variar a una acidez o basicidad relativa De la misma manera, la ttemperatura, de manera experimental juega un rol muy importante en la cintica enzimtica, aunque en el organismo del ser humano dado nuestros mecanismos de control, la temperatura prcticamente se mantiene en rangos ideales, dado nuestra homeostasis. De manera general, a incrementarse esta variable, la actividad enzimtica tambin lo hace pero hasta cierto lmite, puesto que a temperaturas superiores a las ptimas las enzimas se desnaturalizan y por ende la actividad enzimtica disminuye (Fig. 1.13); de la misma manera, al disminuir la temperatura, la actividad enzimtica disminuye, en ello se sustenta la criogenia.

Fig. 1.11 Efecto de la Concentracin de enzima

Fig. 1.13. Efecto de la T sobre la actividad enzimtica

OBSERVACION: Para la mayora de las enzimas, la cada en la velocidad comienza en un intervalo de temperatura de 50 a 60 c. Asimismo, los iones metlicos y cofactores orgnicos (coenzimas) influyen en la accin de muchas enzimas. Aunque muchas enzimas exhiben la cintica caracterstica de Michaelis-Menten (curvas hiperblicas de velocidad), otras siguen una cintica distinta. Las enzimas alostricas son un grupo grande de enzimas con un comportamiento cintico particular.

Fig. 1.12 Efecto del pH sobre la actividad enzimtica

11

Adems de actuar como catalizadores en las clulas, estas enzimas son responsables de regular la velocidad total de los procesos metablicos. Las enzimas alostricas o reguladoras son algo diferentes de las enzimas no reguladoras. En general, son de mayor peso molecular y se forman, de dos o ms subunidades; su actividad depende de varios factores, algunos son los mismos que influyen en las enzimas no reguladoras: [S], [E], temperatura, pH, cofactores, etc., adems, muestran unin cooperativa del sustrato y/o unen otro tipo de molcula llamada modulador o efector. La unin de un modulador puede potenciar o disminuir la actividad de las enzimas reguladoras.

transferencia reversible de electrones entre iones metlicos y el sustrato Por lo general, los requerimientos de iones metlicos de una enzima son especficos, la actividad enzimtica es baja o nula cuando el in metlico especfico para la enzima metaloenzima) no se encuentra presente o se sustituye por otro. Alrededor de 30% de las enzimas conocidas requieren de un in metlico. Las metaloenzimas utilizan una o varias de las estrategias recin descritas para llevar a cabo a unin del sustrato y la accin cataltica. Catlisis covalente Este proceso sucede cuando un grupo funcional nucleoflico (rico en electrones) de una enzima reacciona con el sustrato formando un enlace covalente, dando lugar a un intermediario transitorio, particularmente reactivo. La catlisis covalente se observa en las serina proteasas, un grupo de enzimas, entre las que figura la quimotripsina, que cataliza la ruptura de enlaces en los sustratos peptdicos. ACTIVACION E INHIBICION Algunas enzimas, gracias a la accin de algunas molculas incrementan su actividad metablica (activacin), mientras otras disminuyen su actividad (inhibicin). Estos dos trminos deben diferenciarse de induccin y represin, cuyo efecto es semejante a activacin y represin respectivamente, con la diferencia que acta sobre la concentracin de la enzima. Por ejemplo: Activacin por ion (tabla 1.2, Fig. 1.14) - Directamente en la reaccin por formacin de complejos con coenzima o cosustrato. Ejem. Fe FMN, ATP-Mg - Parte de enzima, y acta, ya sea como estabilizador de la conformacin activa, o directamente en el sitio activo (Mn en isocitrato DHG; Zn o Cu en carboxipeptidasa)

Catlisis general cido-base Muchas de las reacciones donde se transfieren protones, incluidas la hidrlisis de steres y amidas, son catalizadas por cidos y bases. Los grupos funcionales del sitio activo de la enzima pueden actuar como cidos (NH3+; COOH) o como bases (NH2; COO-), y ayudar en las reacciones de transferencia de protones, facilitando la ruptura del enlace. Los grupos funcionales cidos y bsicos de la enzima se orientan hacia el sitio activo, de tal forma que favorecen sus interacciones con el sustrato unido. Catlisis mediada por iones metlicos Los iones metlicos asociados a la enzima o a las molculas de sustrato a menudo participan en la catlisis. Los iones de metales alcalinos (Na+, K+) y los metales de transicin (Mg2+, Mn2+, Cu2+, Zn2+, F2+, Fe3+, Ni2+, y otros) ayudan en las reacciones enzimticas lo menos de tres maneras: 1. Por medio de enlaces covalentes coordinados fijan al sustrato para que quede orientado apropiadamente en esta forma el sustrato se puede unir al sitio activo de la enzima con una geometra muy especfica. 2. Favorecen una reaccin al polarizar el enlace que va a ser escindido o estabilizando un intermediario cargado negativamente. 3. Participan en reacciones biolgicas de oxidacin-reduccin mediante la

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Tabla 1.2 algunos activadores metlicos

Elemento Enzima Activada Zn++ Mg++ Mn Mo
++

Deshidrogenasas, anhidrasa carbnica, ARN y ADN polimerasas. Fosfohidrolasas, RUBISCO, fosfotransferasas, fosfatasas. Arginasas, peptidasas, quinasas. Nitratorreductasa, nitrogenasa.

venenos y diversos medicamentos que alivian el dolor, la inflamacin, las infecciones, el cncer, debido a su capacidad de corregir el funcionamiento de las protenas celulares, a travs de una enzima especfica.

Fe2+, Fe3+ Citocromos, catalasas, ferredoxina, peroxidasas, nitritoreductasa. Cu2+ Ca2+ K

+

Citocromo oxidasa, tirosinasa, cido ascrbico oxidasa, plastocianina 1,3 b glucan sintetasa, calmodulina. Piruvato fosfoquinasa, ATPasa.

Tal vez sorprenda que los bioqumicos se interesen en compuestos que disminuyen la actividad enzimtica; sin embargo, de los estudios sobre inhibicin enzimtica se puede obtener informacin muy valiosa. Los procesos donde se coordinan las miles de reacciones que suceden en una clula se pueden controlar porque las rutas metablicas son reguladas por la presencia de agentes naturales que inhiben a las enzimas. Muchos frmacos y toxinas ejercen sus efectos a travs de la inhibicin enzimtica. Al estudiar la accin de inhibidores especficos, se pueden establecer los mecanismos de reaccin enzimtica, incluyendo el papel que juegan determinados residuos de aminocidos.

Fig.1. 14

Inhibidores reversibles e irreversibles De acuerdo con su grado de interaccin con las enzimas, se han establecido dos clases grandes de inhibidores: reversibles e irreversibles. Un inhibidor irreversible forma enlaces covalentes o no covalentes muy fuertes con la enzima. El lugar donde ataca el inhibidor es en un grupo funcional aminoacdico de la enzima, que participa en la unin del sustrato normal o en la accin cataltica; en consecuencia, la enzima queda inactiva de manera permanente. El efecto de los gases nerviosos sobre la enzima acetilcolinesterasa (ACE) es un buen ejemplo de inhibicin irreversible. El compuesto fluorofosfato de diisopropilo (DIFP) reacciona con el residuo de serina del sitio activo de la ACE. Dado que el grupo hidroxilo de la serina es esencial para la actividad normal de la enzima, su forma qumicamente modificada no puede desempear la funcin normal: catalizar la hidrlisis del neurotransmisor acetilcolina.

Inhibicin enzimtica Hasta aqu slo se ha considerado la interaccin de enzimas con sus sustratos. En las clulas y los tejidos las enzimas tambin encuentran otros compuestos qumicos como: los productos de reaccin, anlogos de sustratos, toxinas, frmacos, complejos metlicos y otros compuestos bioqumicos; muchos de los cuales tendrn un efecto inhibitorio sobre la accin enzimtica. De manera general, inhibicin es la disminucin de la actividad enzimtica, entendiendo a un inhibidor como cualquier molcula capaz de disminuir la velocidad de una reaccin sin desnaturalizar a la enzima, debido a que tienen la capacidad de unirse a las enzimas, impidiendo la formacin del complejo ES. Esta inhibicin puede ocurrir de manera natural puesto que forma parte de los procesos de regulacin, o de manera artificial con el desarrollo de antibiticos, insecticidas,

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Las personas expuestas al DIFP degradan la acetilcolina de las uniones nerviosas a velocidades considerablemente reducidas, provocando un disparo continuo de impulsos nerviosos. Los residuos de serina, cistena e histidina son particularmente susceptibles a las modificaciones qumicas por los inhibidores irreversibles. Estos inhibidores tambin pueden tener efectos positivos. La aspirina cido acetilsaliclico) acta como analgsico y antiinflamatorio al bloquear la sntesis de prostaglandinas que producen dolor. La aspirina modifica covalentemente e inactiva de esta forma a ciclo oxigenasa y la prostaglandina sintetasa, la enzima que cataliza el primer paso de la sntesis de prostaglandinas. Inhibidores Suicidas: son inhibidores de sitio activo que ejercen reaccin parcial y forman inhibidores irreversibles, por ejemplo la penicilina, para poder actuar es convertida a un compuesto que no puede disociarse del glicopeptidil transpeptidasa una de las enzimas responsables de la sntesis de la pared bacteriana, por lo tanto al no poseer pared (protoplasto) se lisan con gran facilidad. Muchos investigadores a este grupo de inhibicin lo incluyen dentro de las irreversibles Los inhibidores reversibles son compuestos que se pueden disociar fcilmente de la enzima y slo la inactivan cuando estn unidos. El complejo EI se mantiene unido por interacciones dbiles no covalentes, como sucede en el complejo ES. Los inhibidores reversibles se clasifican en tres tipos comunes: competitivos, incompetitivos, no competitivos. Los inhibidores competitivos (Fig. 1.15) tienen una estructura semejante a la del sustrato normal y tambin se unen en el sitio activo de la enzima (fig. 1.16). La unin del sustrato y del inhibidor competitivo en el sitio activo de la enzima es un proceso mutuamente excluyente: cuando el inhibidor est unido, el sustrato no puede unirse y viceversa. El esquema cintico de la inhibicin competitiva es el siguiente:

E+S + I

ES

E + P

EI La magnitud de la inhibicin depende de la proporcin de concentracin de sustrato y de inhibidor, as como de la afinidad de cada uno por la enzima. Una concentracin muy alta de sustrato atena el efecto del inhibidor competitivo, a menos que ste tenga ms afinidad por la enzima que el sustrajo. La molcula del inhibidor no puede ser transformada en producto porque no tiene los grupos funcionales sobre los que acta normalmente la enzima. No obstante, si el inhibidor es capaz de unirse al sitio activo, debe tener alguna similitud estructural con el sustrato normal. Un ejemplo claro del proceso de inhibicin competitiva es la inhibicin por malonato, oxalato y pirofosfato de la enzima succinato deshidrogenasa, una enzima del ciclo del cido ctrico. Estas tres pequeas molculas tienen estructura y carga semejantes a las del succinato, el sustrato normal, pero no pueden ser deshidrogenadas por la enzima.

Algunos de los mejores inhibidores competitivos que se han descubierto son los anlogos de estado de transicin: compuestos que se disean tomando como modelo las estructuras de los posibles estados de transicin. De hecho, el sitio activo de la enzima es ms complementario con el estado de transicin que con los reactivos o productos de la reaccin. De aqu se desprende que una molcula diseada a semejanza del estado de transicin predicho deber unirse en forma muy selectiva con el sitio activo y ser un potente inhibidor competitivo. Actualmente. muchas compaas farmacuticas utilizan esta estrategia para disear frmacos potenciales. Un ejemplo bioqumico clsico es el de la succinato deshidrogenasa por el malonato, un compuesto semejante al sustrato clsico succinato. Entre los frmacos con esta accin podemos citar a la sulfas, que estructuralmente se parecen a PABA, precursor para la sntesis del cido flico bacteriano, coenzima importante para la sntesis de cidos nucleicos. As mismo los

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antihipertensores captopril, enalapril, que inhiben a la ECA, el fluorouracilo para tratar el cncer. +I 1/Vmax sin I

grupo sulfhidrilo de un residuo de cistena, y un in metlico tal como: Ag+, Hg2+ o Pb2+.

+I
1/Vmax

sin I

1/Km Fig. 1.16 Inhibicin competitiva

[S]

1/km
Fig. 1.17 Inhibicin no competitiva

[S]

En la inhibicin no competitiva (Fig. 1.17), reversible, el inhibidor no se une directamente al sitio activo, sino en un lugar contiguo, sin embargo altera su conformacin perdiendo su actividad cataltica, o puede ser anlogo del sustrato pero no pude ser desplazado por concentraciones elevadas de la misma. Por ejemplo la iodoacetamida, acta sobre enzimas que tienen grupos sulfhidrilo, la peroxidasa y catalasa, contienen Fe como grupo prosttico y son inhibidas por compuestos que forman complejos con este metal, como por ejemplo el cianuro; los iones fluoruro y oxalato inhiben a las enzimas que requieren Ca o Mg. En el siguiente esquema cintico se representa la inhibicin no competitiva: E+S + I EI + S ES + I EIS E + P

El inhibidor Acompetitivo (Fig. 1.18) es semejante al no competitivo, se une en un sitio distinto del sitio activo. Sin embargo, el inhibidor acompetitivo slo se une con el complejo ES: E+S ES + I ESI Como el inhibidor slo se combina con el complejo ES y no con la enzima libre, nica mente influir sobre la actividad enzimtica cuando las concentraciones del sustrato. y por tanto del complejo ES, sean altas. Los tres tipos de inhibicin reversible se pueden distinguir realizado una serie de experimentos convenientes en el laboratorio: para los cuales se utilizan distintas concentraciones de sustrato (como en los experimentos diseados para determinar KM y Vmx) en presencia de cantidades fijas de enzima y de inhibidor. Se analizan los datos de velocidad en una grafica de Lineweaver-Burk, a fin de determinar si el inhibidor es competitivo, no competitivo o incompetitivo. La familia de lneas obtenidas para cada tipo de inhibicin se muestra en la figura. En la inhibicin competitiva, Vmx no cambia al aadir el inhibidor de modo que las lneas se cruzan en el eje I/vo (figura). En la inhibicin no competitiva, la familia de lneas tiene una interseccin comn sobre el eje I/[S] (el valor E + P

En este tipo de inhibicin, el sustrato se puede unir simultneamente con la molcula de enzima. Es claro que las dos molculas deben unirse en lugares distintos de la enzima. La cercana del inhibidor no debe ser la unin del sustrato pero si interfiere con la funcin cataltica de la enzima. El verdadero mecanismo de accin del inhibidor va a depender del tipo de enzima. Un tipo ms frecuente de inhibicin no competitiva es la reaccin entre el grupo funcional de una enzima, por ejemplo, un

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de KM no cambia, figura). En la inhibicin competitiva se obtienen lneas paralelas y cambian tanto Vmx y KM (figura).
1/Vmax

2) Heterotrpicas: La inhibicin o estimulacin es causada por sustancias de origen natural que no sea el sustrato. 3) Mixtas: muestran ambas caractersticas

+I sin I

1/km
Fig. 1.18. Inhibicin acompetitiva

[S]

En la tabla 1.3 se resumen los cambios cinticos experimentales para los tres tipos de inhibicin reversible. Tabla 1.3. Caractersticas cinticas de la inhibicin reversible
Efecto cintico sobre la reaccin inhibida a Tipo de KM inhibicin Competitiva No competitiva Acompetitiva mayor inalterada mayor inalterada menor menor Aumenta Aumenta inalterada Vmx KM/ Vmx

Fig. 1.19. Modulacin alostrica

La curva que se grafica con concentracin de sustrato es sigmoidal, la misma indica que la unin de las primeras molculas de sustrato mejora la unin de las primeras molculas posteriores. Las miles de reacciones del metabolismo celular se agrupan en secuencia, y cada una tiene una determinada funcin de sntesis o de degradacin. Por ejemplo, las reacciones de la gluclisis catalizadas por diez enzimas transforman la glucosa en piruvato. El comportamiento de la mayora de las enzimas del metabolismo puede explicarse con la cintica de Michaelis-Menten. Esto es, las curvas de velocidad (vo contra [S]) son hiprbolas y las constantes KM, Vmx y k3 de cada una, se pueden medir experimentalmente. En una secuencia metablica por lo menos un paso es catalizado por una enzima reguladora que controla la velocidad de toda la secuencia. La (s) enzima (s) reguladora (s) pueden ser influenciadas por: (1) la concentracin del o los producto (s) final (es) de la secuencia metablica, (2) la concentracin inicial del sustrato y (3) del intermediario formado en la secuencia, (4) por algunos factores externos como una hormona, o (5) quizs por todos los factores mencionados. En muchas secuencias metablicas, la primera enzima es la principal

OTRAS FORMAS DE MODULACION ALOSTERICA (Fig. 1.19): participacin de co-sustratos con rol central en el metabolismo (efectores, modificadores o moduladores), tales como Acetil CoA, ATP, AMP. Ejem. Para PFK ATP (-); AMP (+), existiendo un lugar especial para su localizacin llamado sitio alostrico. Estos metabolitos pueden inhibir o activar la actividad enzimtica. Su representacin esquemtica no sigue el modelo de Michaelis-Menten. De estas se pueden distinguir tres clases: 1) Homotrpicas: cuando el sustrato puede actuar como efector sobre la rapidez de la reaccin enzimtica, por lo general, incrementndola.

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enzima de control y est influenciada por la concentracin del material inicial (A), o del producto final (P), o por ambos. Las enzimas reguladoras son de varios tipos y se clasifican por su modo de accin. De ellas, las enzimas alostricas, son modificadas por la unin reversible no covalente de una molcula de seal (Fig. 1.20). A B C D F P En lo anterior se aprecia una secuencia hipottica de reacciones que forman parte en una ruta metablica. La biomolcula A es convertida al producto final, P, a travs de varios intermediarios (B, C, D y F). Las enzimas se representan como E1, E2, etc. Efectores positivos y negativos Las biomolculas que influyen en la accin de una enzima alostrica se conocen como efectores o moduladores. Estos pueden actuar como estimulantes (efectos positivos) o inhibidores (efectores negativos) de la enzima. Por ejemplo, una alta concentracin de A y una baja concentracin de P, en la figura, son indicadores de que la secuencia metablica procedera hacia la formacin de P. En este caso, A puede actuar como efector positivo y sustrato. Cuando el producto P alcanza un cierto nivel deseado, puede actuar como inhibidor (efector negativo). Este modo de regulacin es una forma muy lgica y prctica de controlar la velocidad de sntesis de P. con una regulacin precisa, se producir la cantidad adecuada de P sin que se agote por completo A. En los primeros estudios detallados del comportamiento de las enzimas alostricas, se observ que la mayora no exhiben curvas de velocidad hiperblicas; es decir, no siguen la cintica tpica de Michaelis-Menten y la inhibicin no puede ser descrita con las grficas tradicionales de Lineweaver-Burk. Las curvas de velocidad de vo contra [S] para las enzimas alostricas son sigmoideas (figura). La presencia de un efector positivo o negativo tambin da lugar a una curva sigmoidea, pero con una velocidad incrementada o inhibida respectivamente. Como las enzimas alostricas no siguen una cintica de Michaelis-Menten, no es posible
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definir KM de la forma usual. En lugar de ello, la concentracin de sustrato que produce una vo y de Vmx se representa con el trmino [S]0.5. Las molculas erectoras actan mediante la unin no covalente, reversible con una regin de la enzima. Todas las enzimas alostricas hasta ahora estudiadas son mucho ms grandes y complejas que las no alostricas y poseen dos o ms subunidades; p.e. son oligomricas. Adems de de los sitios activos (sitios catalticos) para la reaccin, las enzimas alostricas tienen sitios reguladores para unir efectores especificas. El principio general que sustenta el concepto de alosterismo consiste en que la unin o el evento cataltico que ocurre en un sitio, influye en la unin o catlisis efectuada en otro sitio. Los mensajes se transmiten de un sitio a otro mediante cambios conformacionales de la estructura proteica. El trmino alostrico se puede traducir como otras formas. La unin de molculas efectoras cambia a conformacin de la protena en modo tal que se comunica dicha unin a las dems subunidades. En las enzimas alostricas se transmiten mensajes. a travs de cambios conformacionales, entre los sitios de unin que estn en distintos planos CONTROL POR RETROALIMENTACIN o FEED BACK (Fig. 1.21) Las enzimas reguladoras con comportamiento alostrico controlan varias vas en su forma ms simple, el que se conoce como retroinhibicin o inhibicin por producto final. Se ha encontrado que estas enzimas alostricas se localizan en o cerca del comienzo de una va enzimtica y que son inhibidas o estimuladas por el producto final de esa va. COVALENTE (Fig. 1.22) fosforilacin o desfosforilacin Estado de

Algunas enzimas se regulan por la interconversin reversible entre sus formas activa e inactiva, producidas por modificaciones covalentes, dando lugar a un estado de fosforilacin y desfosforilacin, a travs de cinasas y fosfatasas respectivamente, ya que estas enzimas poseen

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residuos especficos que le permiten estos cambios.

algunos ejemplos de molculas grandes, tales como protenas y cidos nucleicos, que sirven de sustratos. Como cabra esperar, las enzimas que catalizan los cambios qumicos de otras enzimas, tambin estn sujetas a un estricto control de regulacin.

Fig. 1.22 Modulacin por covalencia

Fig. 1.21 Inhibicin por Feed back

La actividad cataltica de estas enzimas se altera por cambios covalentes reversibles en las cadenas laterales de determinados aminocidos de la enzima. Las alteraciones qumicas ms comunes que cambian la actividad de una enzima son: 1. Fosforilacin de los grupos hidroxilo de serina, treonina o tirosina. 2. Acoplamiento de un adenosin monofosfato a un grupo hidroxilo semejante. 3. Reduccin de puentes disulfuro de cistena. Otras enzimas sirven de catalizadores para los cambios qumicos de los residuos de aminocidos. En algunos casos, el acoplamiento de un grupo qumico u otra modificacin qumica en determinados residuos de aminocidos transforma una enzima activa en su forma inactiva; en otros casos, da lugar a la activacin de una enzima inactiva Este proceso de regulacin pareciera bastante extrao porque la enzima que es alterada covalentemente es en realidad un sustrato de otra enzima que cataliza la reaccin de modificacin. Aunque la mayora de los sustratos para las enzimas son molculas pequeas, tambin encontraremos

El control de la enzima reguladora, glucgeno fosforilasa, es un ejemplo excelente de una modificacin covalente. Como vamos a estudiar ms adelante, esta enzima cataliza una reaccin importante, que convierte el carbohidrato almacenado (glucgeno) en glucosa, una forma que es degradada fcilmente para obtener energa. Un residuo especfico de serina de cada uno de los dos dmeros idnticos de la enzima es fosforilado en una reaccin catalizada por la enzima fosforilasa cinasa, para asegurar la mxima actividad de la glucgeno fosforilasa: Fosforilasa + 2ATP | | OH OH Forma menos activa fosforilasa + 2ADP | | OP OP forma ms activa
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Un grupo fosforilo ( PO 3 ) es transferido desde el ATP hacia cada uno de los grupos hidroxilo de serina de la glucgeno fosforilasa. Otra enzima, la fosforilasa fosfatasa, cataliza la eliminacin por hidrlisis de los grupos fosfato, Pi. La regulacin de la glucgeno sintasa es justamente lo opuesto de la glucgeno fosforilasa. La enzima glutamina sintetasa tambin experimenta una reaccin similar de modificacin covalente. Esta enzima bacteriana desempea una funcin importante en el metabolismo del nitrgeno. El grupo AMP (adenosin monofosfato) es transferido desde el ATP al grupo hidroxilo de un residuo especfico de tirosina de la glutamina sintetasa, liberando pirofosfato, PPi, como

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producto. La forma adenilada de la enzima es inactiva. enzima + ATP enzima + PPi | | OH OH AMP Forma activa forma inactiva

Tabla 1.4 Enzimas digestivas (peptidasas) que existen como zimgenos

Forma de Enzima activa zimgeno o -Quimotripsina Pepsina Quimiotripsingeno Pepsingeno Tripsingeno Procarboxipetidasa Proelastasa del zimgeno Pncreas Estmago Pncreas Pncreas Pncreas Lugar de sntesis

Activacin por ruptura proteoltica (Protelisis selectiva) Algunas enzimas son sintetizadas inicialmente en forma inactiva y deben pasar por una etapa de modificacin covalente para adquirir una actividad enzimtica completa. El precursor inactivo, llamado zimgeno, experimenta una ruptura en uno o varios enlaces peptdicos especficos para que se produzca la forma activa de la enzima. La ruptura proteoltica puede parecer, en principio, un tipo de regulacin por modificacin covalente como la que se acaba de describir en la seccin anterior. Sin embargo, la ruptura proteoltica es un proceso irreversible y slo sucede una vez en la vida de una molcula de enzima. En la modificacin covalente, la enzima es transformada en forma reversible por un conjunto de enzimas reguladoras, un proceso que se puede repetir muchas veces con la misma molcula de enzima. Diversos procesos biolgicos importantes son regulados por a ruptura proteoltica. Muchas de las peptidasas digestivas (enzimas que degradan protenas) del estmago y del pncreas, incluidas la quimotripsina, pepsina y carboxipeptidasa, estn reguladas por este mecanismo (tabla 1.4). El proceso de coagulacin de la sangre depende de una serie de etapas de activacin. y cada una se inicia mediante una ruptura proteoltica. Algunas hormonas proteicas, como la insulina, son producidas en forma de zimgeno (proinsulina) se activan por eliminacin proteoltica de un fragmento peptdico. Solo como un ejemplo se va a detallar el mecanismo de activacin de la quimotripsina. Esta enzima colabora en la degradacin de las protenas de la dieta en el intestino delgado, hidrolizando a nivel de los aminocidos: fenilalanina, tirosina y leucina.

Tripsina Carboxipeptidasa Elastasa

Su zimgeno, o quimotripsingeno es sintetizado por el pncreas y secretado en el intestino delgado. El quimotripsingeno es una sola cadena polipeptdica de 245 residuos de aminocido con cinco enlaces disulfuro entrelazados en la cadena. El zimgeno es activado tras la hidrlisis catalizada por la tripsina del enlace peptdico entre la arginina 15 y la isoleucina 16 (figura 1.23).

Fig. 1.23 Activacin de la quimotripsina

El producto. denominada -quimotripsina, es una enzima totalmente activa; sin embargo dura poco tiempo, porque es susceptible al ataque de otras molculas de -quimotripsina. En este proceso de ruptura, se eliminan dos fragmentos de dipptido (Ser-Arg; Thr-Asn), dando origen a la enzima activa quimotripsina. La forma final de esta enzima consta de tres cadenas polipeptdicas unidas por dos enlaces disulfuro. Los procesos de ruptura especfica esquematizados en la figura dan lugar a una serie de cambios conformacionales en la estructura terciaria. Estos cambios dejan al descubierto residuos de aminocidos de los sitios activos de la quimotripsina y -quimotripsina que estaban ocultos en la forma del zimgeno

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La coagulacin de la sangre tambin requiere una serie de activaciones proteolticas en las que interviene varias protenas, en especial las conversiones de protrombina en trombina y de fibringeno en fibrina. En el ltimo paso de la formacin de cogulos, que es el mejor caracterizado, la protena soluble fibringeno se convierte en la protena insoluble fibrina como resultado de la hidrlisis de cuatro enlaces peptdicos.

que la isoenzima H4 tiene mayor afinidad por lactato. El anlisis de de las formas de isoenzima de LDH del suero sanguneo ha sido de gran utilidad en el diagnstico y tratamiento de ciertas enfermedades. En el dao celular provocado por infarto del miocardio (ataque cardiaco) o por hepatitis infecciosa (una enfermedad heptica) o en trastornos del msculo esqueltico, la LDH y otras enzimas se liberan hacia el torrente sanguneo. El tejido daado se refleja en el patrn de isoenzimas de LDH que se encuentra en a sangre. La figura 1.24 muestra un patrn electrofortico de las formas de isoenzima de LDH.

Regulacin por isoenzimas Algunos procesos metablicos estn regulados por enzimas que existen en diferentes formas moleculares, llamadas isoenzimas o isozimas, que tienen secuencias de aminocidos semejantes pero no idnticas. Todas las formas presentan la misma actividad enzimtica es decir catalizan la misma reaccin bioqumica, pero pueden diferenciarse por tener distintas propiedades cinticas (diferente KM y Vrnx) reguladoras (diferentes efectores); preferencias por las coenzimas, e incluso por su distribucin celular. La enzima mejor conocida y una de las primeras que se encontraron en formas de isoenzimas, es la lactato deshidrogenasa (LDH), la cual cataliza una reaccin clave en el metabolismo muscular; la conversin reversible de piruvato a lactato. La LDH es un tetrmero que consta de dos tipos posibles de subunidades, M y H. Las dos cadenas polipeptdicas, que se forman de dos genes distintos, se asemejan en su secuencia de aminocidos, pero se pueden separar mediante electroforesis. La forma M4 de LDH es la que predomina en el msculo esqueltico. Por el contrario, la LDH de msculo cardiaco tiene la frmula de subunidad, H4. Otros tejidos como el hgado tienen una mezcla de cinco posibles formas incluyendo hbridos (M4, M3H, M2H2, MH3, H4). No se conoce bien la razn por la que existen isoenzimas de LDH y de otras enzimas; sin embargo, se ha observado que las distintas formas de LDH de otras enzimas muestran propiedades cinticas y reguladoras excepcionalmente distintas. Por ejemplo, la isoenzima M4 de LDH tiene mayor afinidad por el piruvato que las otras formas, mientras

Figura 1.24 Electroforesis de las formas isozmicas de lactato deshidrogenasa (LDH.

Mutagnesis de lugar dirigida catalticas Hasta 981, se supona que la catlisis de las reacciones bioqumicas se limitaba a las protenas que se encontraban en forma natural. Desde entonces, se han hecho importantes descubrimientos que han abierto nuevas fronteras en la catlisis biolgica: 1. Empleando una tcnica denominada mutagnesis de lugar dirigida, los cientficos pueden modificar la secuencia de aminocidos de enzimas conocidas y de otras protenas para cambiar su actividad, especificidad e incluso su conformacin. De hecho, ahora es posible crear protenas de prcticamente cualquier composicin y secuencia de aminocidos. 2. Utilizando anlogos del estado de transicin como antgenos, se han preparado anticuerpos proteicos que funcionan como catalizadores biolgicos; de ah que se les conoce como anticuerpos catalticos.

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El diseo de nuevos catalizadores proteicos ha llevado al desarrollo de nuevos tipos de catalizadores para la industria biotecnolgica, la medicina y la investigacin bsica. Mutagnesis de lugar dirigida Cuando se estudia la estructura y actividad de una enzima, resulta muy valioso poder sustituir un residuo de aminocido por otro o modificar la estructura de un aminocido ya existente. Por ejemplo, si uno supone que la cadena lateral hidroxilo de un residuo especfico de serina es necesaria para la actividad cataltica de una enzima, se puede remplazar esa serina por un residuo de alanina. Posteriormente se analiza la actividad cataltica de la protena modificada. Ahora los cientficos han desarrollado vanas estrategias para alterar la secuencia de las protenas. En la actualidad se cuenta con tcnicas donde se utilizan los nuevos procedimientos de DNA recombinante para alterar los genes en cualquier lugar del DNA. Con el empleo de enzimas que catalizan su ruptura, la sntesis del nuevo DNA y la replicacin de sus hebras, es posible modificar el mensaje de un gen particular para cambiar la secuencia de aminocidos expresada en el producto proteico final. El gen modificado, preparado por sntesis qumica o biolgica se introduce en una clula husped, donde es donado y expresado para producir la protena alterada en cantidad suficiente para estudios posteriores. Se pueden sintetizar genes que produzcan protenas de prcticamente cualquier secuencia de aminocidos. Esto permite disear protenas por ingeniera con nuevas propiedades estructurales catalticas. Anticuerpos catalticos (Abzimas) Los anticuerpos proteicos de la sangre (inmunoglobulinas) funcionan como molculas de proteccin al unir fuertemente y neutralizar las sustancias extraas que pueden daar a las clulas y a los organismos. Los anticuerpos se producen en la sangre de los animales superiores como respuesta a la invasin de molculas extraas llamadas antgenos. Hace muchos aos, Linus Pauling postul que la diferencia fundamental entre las enzimas y los anticuerpos estriba en que las enzimas unen selectivamente a las molculas de sustrato en el estado de

transicin de una reaccin, mientras que los anticuerpos unen especficamente molculas semejantes a los antgenos en su estado basal. En consecuencia, es posible producir un anticuerpo con la actividad cataltica del tipo de las enzimas, utilizando un anlogo del estado de transicin como antgeno? Si as fuera, esto ofrecera la oportunidad de generar anticuerpos que no slo unan molculas, sino que tambin sirvan como catalizadores muy selectivos de las reacciones qumicas que se quieran. El estudio de anticuerpos catalticos (Abzimas) en su totalidad ha aumentado sumamente la conversin actual de los mecanismos de la catlisis de la enzima y representa otro paso adelante en las tentativas de crear las enzimas biolgicas artificiales dirigidas. El primer anticuerpo comercializado como abzima ha sido una con actividad de aldolasa desarrollada en el Grupo Lerner, U.S.A. Sin embargo, el uso masivo de ellas an est en sus primeros pasos. La aldolasa del Grupo Lerner es utilizada para la sntesis del Epothilone A, un nuevo compuesto anticanceroso. Otra manera de utilizar las abzimas ha sido propuesta por diferentes laboratorios, utilizando las propiedades hidrolticas, de las abzimas para activar prodrogas. Quizs el uso ms emocionante de la tecnologa de las abzimas es incidir de manera especfica sobre las clulas cancergenas para generar su destruccin Las clulas del cncer contienen los determinantes nicos, llamados los antgenos de la clula del tumor, ausentes en clulas normales. Utilizando los anticuerpos que unen especficamente estos antgenos de la clula del tumor, las drogas del cncer se pueden dirigir directamente al tumor. En la caja de abzimas, los cientficos han previsto anticuerpos con dos sitios obligatorios del antgeno distinto: Un sitio ata con alta afinidad a un antgeno de la clula del tumor, mientras que el segundo sitio cataliza la hendidura de un prodroga, ste es un precursor no txico de una droga citotxica. Primero, el anticuerpo se administra a los pacientes, y ata las clulas del tumor con alta

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afinidad. En segundo lugar, el prodroga se introduce en la circulacin sangunea pero solamente se activa en la vecindad del anticuerpo apuntado. Por esta tcnica, los tumores son destruidos selectivamente mientras que las clulas sanas se ahorran del txico afectan drogas del cncer. De las misma manera, otras posibles aplicaciones de las abzimas contra virus. Los primeros estudios indican que pueden inactivarlos; por ejemplo, se han aislado las abzimas que hienden las protenas virales de la capa del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Los investigadores tambin han desarrollado los abzimas que catalizan la destruccin especfica de genes virales. Quizs en el futuro, tendremos las herramientas para tratar una variedad amplia de enfermedades con el uso de la tecnologa cataltica del anticuerpo. RNA cataltico (ribozimas) Hasta 1981, los estudiantes de bioqumica lean en sus libros de texto y escuchaban en las clases que todas las enzimas son protenas. El estudio de los catalizadores biolgicos se volvi muy intenso en la segunda mitad del siglo XIX por las investigaciones que se hacan sobre el metabolismo de los azcares. En esa poca a los catalizadores se les llamaba fermentos y se desconoca su naturaleza qumica. En la dcada de los veinte (1920) se purific y cristaliz la primera enzima, la ureasa. El anlisis qumico que sta se compona principalmente de protena. Desde esa poca hasta 1981 todas las enzimas purificadas y analizadas fueron protenas. Para entonces, la idea de que todas las enzimas eran protenas se volvi un dogma bioqumico. El descubrimiento de molculas de RNA que actuaban como enzimas fue realizado por dos distintos grupos de investigacin entre 1981 y 1982, as comenz una revolucin de la bioqumica. Muchos bioqumicos se mostraron escpticos cuando se anunciaron por primera vez los resultados de la investigacin sobre el RNA cataltico. Sin embargo, como a evidencia experimental que sustentaba la existencia de las enzimas de RNA se acumulaba y se iban descubriendo

diversos tipos en diferentes organismos, an el ms incrdulo qued convencido de su existencia. El verdadero significado del descubrimiento de que ciertas formas de RNA pueden servir como catalizadores biolgicos, fue reconocido al otorgarse el Premio Nbel de Qumica de 1989 a los autores del descubrimiento de estos catalizadores nicos. Sidney Altman (de la Universidad de Yale) y Thomas Cech (de la Universidad de Colorado-Boulder). El trmino ribozima se utiliza ahora para describir las enzimas de RNA. Las ribozimas presentan una gran especificidad de sustrato, esta es la caracterstica en que se fundamenta la idea de que las ribozimas pueden ser utilizadas como supresores gnicos especficos y servir de base para el desarrollo de nuevos agentes teraputicos. Las ribozimas actuaran bloqueando la transmisin de informacin gentica a nivel del RNA mediante la destruccin de genomas RNA (virus RNA) o de ARN m. y por lo tanto tienen un potencial enorme como terapia para el control de genes. Se han generado hasta hoy, bajo el procedimiento del ADN recombinante ms de 100 ribozimas nuevas, con perfiles catalticos distintos de los que se encuentran en molculas naturales. Se estn empleando como potenciales agentes teraputicos en una amplia variedad de enfermedades, que incluyen infecciones virales, cncer, diabetes, enfermedades cardiovasculares y osteoporosis. Ribonucleasa P El primer indicio del RNA cataltico viene de los estudios de la enzima ribonucleasa P, a cual se encuentra en todos los organismos. Los sustratos para la enzima son una serie de molculas precursoras de tRNA inactivo. Para preparar el tRNA funcional, maduro, se elimina un fragmento del ribonucletido por ruptura hidroltica del enlace fosfodister, dejando la conocida estructura de hoja de trbol del tRNA para seleccionar y activar aminocidos para la sntesis proteica. La ribonucleasa P puede reconocer y romper por lo menos 60 precursores distintos de tRNA.

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El componente de RNA acta como una verdadera enzima: sigue la cintica de Michaelis-Menten, slo se necesita en pequeas cantidades, permanece con su estructura terciaria para ser activa y no modifica dicha estructura en el proceso de reaccin. Granzimas Pertenecen a una familia de proteasas-serina estructuralmente relacionadas a la quimotripsina y todas muestran actividad cataltica por una triada His-Asp-Ser en su sitio cataltico. Son clave del inicio de muchos procesos de apoptosis que ocurren en clulas blanco marcadas para ser destruidas por las clulas citotxicas. Son producidas como zimgenos, y se activan por accin de catepsinas C, tambin conocidas como dipeptidil peptidasa I, una proteasa. Existen por lo menos 12 granzimas conocidas, cinco de stas: A, B, H, K y M han sido descritas en humanos, de ellas las granzimas A y B son las ms estudiadas.

APLICACIONES DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA EN EL CAMPO BIOMEDICO La accin de las enzimas no se limita a la catlisis de las reacciones metablicas dentro de las clulas biolgicas. Por sus caractersticas de especificidad y eficacia, las enzimas resultan idneas para utilizarse en algunos tratamientos clnicos, en el procesamiento de alimentos, en la limpieza de depsitos de desecho contaminados con qumicos, e incluso en la manufactura de ropa. La industria de la biotecnologa ha desarrollado varias enzimas con fines teraputicos. Recientemente se ha recomendado utilizar la enzima desoxirribonucleasa (DNasa) para el tratamiento de los pacientes con fibrosis qustica. Uno de los principales problemas clnicos que se presentan en los nacientes con la FQ es la produccin de grandes volmenes de moco sumamente viscoso en los pulmones y vas respiratorias. Esto induce falta respiratoria con bastante frecuencia y es la causa ms comn de muerte en este tipo de pacientes. El moco contiene bacterias que provocan infecciones pulmonares crnicas y la DNasa ayuda a disminuir la viscosidad del moco. Las enzimas tienen diversas aplicaciones en el campo biomdico, por ejemplo como auxiliar de diagnstico o pronstico de enfermedades, como tratamiento, como reactivo de laboratorio, entre otros. Ello debido a que tienen alta especificidad y eficacia cataltica, caractersticas muy apreciadas en su aplicacin como agentes teraputicos, o diagnstico. Sin embargo, requieren de un alto grado de pureza, alta estabilidad a las condiciones de temperatura y pH fisiolgicos, as como una baja antigenicidad y accesibilidad al sitio corporal de destino Al analizar este tipo de aplicaciones, es conveniente diferenciar entre aquellas convencionales de administracin oral o tpica, de aquellas sofisticadas en las cuales se pretende utilizar la enzima para suplir una deficiencia metablica congnita, resolver un trastorno funcional o atacar selectivamente clulas malignas. Su uso clnico en pacientes

ENZIMAS PLASMATICAS Las enzimas que se encuentran en el plasma se dividen en dos grupos principales: 1. Enzimas plasmticas especficas: El plasma es su sitio normal de actividad y ubicacin y aqu sus concentraciones son mayores que en los sitios de sntesis, por ejemplo, hgado, protenas de coagulacin, seudocolinoesterasa etc. 2. Enzimas plasmticas n o especficas: Se caracterizan porque su funcin no ocurre en este lquido corporal. Se dividen en: Enzimas de secrecin. Provienen de glndulas exocrinas, como el pncreas. Enzimas del metabolismo intermedio: Su concentracin en suero es muy elevada debido a un dao celular o necrosis, lo cual propicia la fuga de una fraccin de estas enzimas hacia el plasma u otros lquidos corporales.

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es muy reducido a la espera abundante informacin sobre colaterales en los animales de permitan cumplir las estrictas seguridad exigidas.

de recoger los efectos prueba, que normas de

El uso teraputico no es reciente. Se comercializ antes de la primera guerra mundial: Takadiastasa, producido por la fermentacin en estado slido de Aspergillus oryzae (hongo) como ayuda digestivo. Las convencionales son principalmente hidrolasas de origen animal o vegetal En aos recientes la aplicacin teraputica de las enzimas ha cobrado un nuevo impulso como consecuencia de la posibilidad tecnolgica de desarrollar sistemas enzimticos de aplicacin extra o intracorporea. Aunque ltimamente con el uso de la tecnologa del DNArec se estn obteniendo logros muy importantes, ya que se puede clonar genes humanos productores de enzimas en bacterias, principalmente E. coli. Podemos destacar las siguientes: 1. Tratamiento de deficiencias metablicas congnitas: catalasa, para el tratamiento de acatalasemia; fenilalanina hidroxilasa y fenilalanina amoniaco liasa, para tratamiento de fenilcetonuria, Galactosa, 1- P uridil transferasa, para el tratamiento de la galactosemia 2. Eliminacin de metabolitos txicos por malfuncionamiento de rganos: ureasa y uricasa, para eliminar urea y cido rico por mal funcionamiento renal; UDP glucoronil transferasa y bilirrubina oxidasa para la remocin de bilirrubina en casos de ictericia derivados de malfuncionamiento o inmadurez heptica; anhidrasa carbnica y catalasa en intercambio gaseoso de O2 y CO2 en respiradores artificiales 3. Eliminacin selectiva de nutrientes especficos de clulas malignas: asparaginasa y glutaminasa en la eliminacin de L-asparagina y Lglutamina en el tratamiento de leucemia; carboxipeptidasa G1 y fenilalanina amoniaco liasa en la eliminacin de cido flico; fenilalanina y tirosina en el control del crecimiento de tumores.

Dificultades de uso:: inestabilidad en las condiciones de uso, susceptibilidad a la accin de proteasas, respuestas inmunolgicas del paciente Alternativas: inmovilizacin de enzimas a soportes slidos o confinamiento a fibras o cpsulas artificiales o biolgicas

APLICACIONES EXTRACORPOREAS El torrente sanguneo del paciente es derivado (derivacin arterio-venoso) hacia un circuito externo a travs de un reactor enzimtico, en el que se logra el efecto deseado. Este tipo de aplicacin es adecuado para la remocin selectiva de metabolitos txicos y nutrientes de clulas malignas. Ejemplo: eliminacin de urea mediante ureasa inmovilizada (rin artificial enzimtico), eliminacin de asparagina mediante asparaginasa inmovilizada

APLICACIONES INTRACORPOREAS Es la que presenta mayores problemas dados el pH y temperatura desfavorables, y por respuesta inmunolgica del paciente y accin de proteasas endgenas. Puede hacerse a nivel subcutaneo, intramuscular, gastrointestinal, intraperitoneal, intravenoso o intraarterial. Es esencial la biocompatibilidad de los materiales empleados, a fin de evitar la aguda respuesta inmunolgica ENZIMAS COMO VALOR DIAGNOSTICO Est comprobado que la medida de la actividad de ciertas enzimas en el plasma tiene valor diagnstico o pronstico en varias enfermedades. Se debe diferenciar las enzimas intracelulares de las extracelulares, y de los que accidentalmente se han vertido al medio extracelular, por alteracin de las clulas que habitualmente los contienen. Debe conocerse tambin la estructura qumica y el comportamiento fsico de las enzimas. COMO REACTIVOS DE ANALISIS Como auxiliares de anlisis son mucho ms especficos que los reactivos qumicos. Ejem. Para medir el nivel de glucemia y glucosuria, se emplea glucosa oxidasa y peroxidasa.

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Dado la importancia del dosaje de enzimas como marcadores de rganos o tejidos y para el diagnstico de enfermedades, se describirn algunas de ellas en base a ejemplos concretos y muy frecuentes en la vida cotidiana del mdico.

frecuencia, en corazn, hgado, msculo esqueltico y rin. Cataliza la transferencia de un grupo amino de un aminocido Lglutamato o L-aspartato a cetocidos, cetoglutarato y oxaloacetato. El fosfato de pirodoxal en forma de coenzima forma parte del ciclo activo de la enzima. Gamma-Gutamiltransferasa (GGT). Su sinnimo es -glutamiltranspeptidasa (GGTP). Se distribuye en orden creciente de frecuencia, en riones, pncreas e hgado y cataliza la transferencia de un grupo glutamilo o un aminocido o pptido. Esta enzima forma parte del ciclo del glutatin. Se conocen diferentes isoenzimas. 5-Nucleotidasa (5-NT). Es una fosfatasa que cataliza la hidrlisis de los cinco monofosfatos de ribonucletidos y 5desoxinuclesidos y se encuentra asociada con la membrana celular de los hepatocitos. Su actividad enzimtica se incrementa en las alteraciones hepatobiliares, ya que las sales biliares favorecen la liberacin de clulas hepticas. Marcadores pancreticos Endocrinos Un marcador por excelencia es glutamato descarboxilasa (GAD), involucrado en casos de autoinmunidad que desencadenan diabetes mellitus tipo 1. Exocrinos El diagnstico diferencial entre pancreatitis aguda y otros trastornos intraabdominales con sntomas similares se lleva a cabo con las mediciones de la actividad enzimtica de amilasa srica, o urinaria, o ambas, y de lipasa y tripsina. A continuacin se describen caractersticas de estas enzimas. algunas

DIAGNSTICO DE ENFERMEDADES MEDIANTE LA CUANTIFICACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA EN SUERO Marcadores hepticos Cuando existe dao hepatocelular, con o sin necrosis u obstruccin biliar, se liberan enzimas intracelulares hacia la corriente sangunea, lo que facilita la deteccin de enzimas de origen heptico en suero. Las enzimas que se pueden detectar son las siguientes: 1. Alanina aminotransferasa (ALT, GPT) 2. Aspartato aminotransferasa (AST, GOT) 3. Lactado deshidrogenasa (LDH) 4. -Glutamiltransferasa ( GT) 5. Fosfatasa alcalina (ALP) 6. Glutatin sulfurotransferasa (GS) La cuantificacin de la actividad enzimtica heptica, junto con la concentracin de bilirrubinas y albmina permiten una mayor valoracin del funcionamiento heptico. Un incremento significativo de la actividad enzimtica de transferasas se observa en las alteraciones de la clula heptica, as como en la colestasis y en la cirrosis. A continuacin se presentan algunas caractersticas de los marcadores hepticos: Alanina aminotransferasa (ALT). Su sinnimo, transaminasa glutmico-pirvica (TGP); se distribuye en orden decreciente de frecuencia, en hgado, rin, corazn, msculo esqueltico y catalasa la transferencia de un grupo amino de la Lalanina o la L-glutamato o los correspondientes cetocidos, cetoglutarato y piruvato. Aspartato aminotransferasa (AST). Su sinnimo, transaminasa glutmicooxaloactica (TGO), se ubica en la mitocondria y en el citoplasma, y se distribuye, en orden decreciente de

Amilasa. Se conoce un mnimo de siete isoenzimas distribuidas en saliva, jugo pancretico, leche humana y suero. La medicin de su actividad es de gran importancia para el diagnstico de pancreatitis aguda; sin embargo, sta es de mayor utilidad si se cuantifica simultneamente la actividad de la lipasa.

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Lipasa. Su sinnimo es: triacilglicerol acilhidrolasa. Se ha demostrado su presencia en el pncreas y posiblemente se encuentre en el rin. Tambin la deteccin de la lipasa es de gran utilidad diagnstica en casos de pancreatitis, comparada con la de amilasa. Al igual que la amilasa, la concentracin de la lipasa se incrementa en la circulacin de pacientes con insuficiencia renal. Tripsina. Se detectan concentraciones altas de esta enzima en pancreatitis aguda y en 50% de los casos de carcinoma pancretico, y las cifras estn disminuidas en pancreatitis crnica por insuficiencia exocrina. Marcadores cardiacos Un avance muy importante de la enzimologa es el uso de enzimas como marcadores para la deteccin inmediata de un infarto de miocardio. En el decenio de 1960, para este fin se utilizaba la cuantificacin de la actividad enzimtica de la deshidrogenasa lctica, aspartato aminotransferasa (AST) y creatinfosfocinasa (CK). En el decenio de 1970 se obtuvo una mayor especificidad de los marcadores al separar por medio de electroforesis las isoenzimas de la creatinfosfocinasa. En el decenio de 1990 se inici el uso de anticuerpos monoclonales para identificar de manera rpida y especfica la creatinfosfocinasa del miocardio y cuantificar protenas especficas, como mioglobina y troponina, que son marcadores muy especficos de dao miocrdico. A continuacin se presenta algunas caractersticas de los marcadores cardiacos. Creatinfosfocinasa (CK). Se conocen tres isoenzimas, CK-BB, CK-MB, CK-MM; stas se ubican en el citoplasma y mitocondrias; catalizan la formacin del trifosfato de adenosina (ATP) y la fosforilacin reversible de creatina con ATP. Se sugiere que su cuantificacin se lleve a cabo antes del ejercicio, ya que la actividad de CK aumenta. La enzima CK es dimrica; cada una de sus subunidades se denomin M y B, y existen tres variedades de esta enzima: CK-MM, CKMB y CK-BB. La fraccin musculoesqueltica de creatin-fosfocinasa (CK-MM) se encuentra fundamentalmente en

el msculo esqueltico; la fraccin miocrdica de creatinfosfocinasa (CK-MB), en el msculo cardiaco, y la fraccin enceflica e intestinal de creatinfosfocinasa (CK-BB), en cerebro e intestino, como sus nombres lo indican. En las primeras 4 horas de dolor precordial, la cuantificacin de CK-MB es la prueba de eleccin y se pueden tomar muestras de suero cada dos o cuatro horas. Otra ventaja adicional de medir la CK-MB es la de detectar un reinfarto, ya que su actividad enzimtica retorna a sus valores de referencia a las 36 horas. Deshidrogenasa lctica (LAD o LDH). Se encuentra en concentraciones importantes en hgado, msculo esqueltico, msculo cardiaco, eritrocitos, suero, rin y cerebro. Cataliza la reaccin de deshidrogenacin del lactato para convertirlo en piruvato. Esta enzima se encuentra en el citoplasma de las clulas somtica y se compone de cuatro cadenas polipeptdicas. La subunidad de tipo H predomina en tejidos aerbicos como msculo cardiaco, y la subunidad M, en tejidos anaerbicos, como msculo esqueltico e hgado, lo cual hace necesario medir las concentraciones de isoenzimas por electroforesis o inmunoprecipitacin para discriminar el origen de la enzima. Esta enzima es un tetrmero compuesto dos pares de diferentes subunidades: 1) H (abreviatura en ingls de corazn), y 2) M (abreviatura en ingls de msculo). Por las combinaciones presentes se encuentran cinco isoformas de la enzima o isoenzimas: LDH-1, que est en grandes concentraciones en corazn, corteza suprarrenal y eritrocitos; LDH-2, LDH-3 LDH-4, que se ubican en las glndulas endocrinas, pulmones, ganglios linfticos y plaquetas, y LDH-5, que se halla en concentraciones elevadas en hgado y msculo. La cuantificacin de la isoenzima deshidrogenasa lctica es importante en quienes no se sospecha la presencia de infarto de miocardio en las primeras 24 horas. Pese a no ser especficamente enzimas, dado su importancia y sensibilidad se considera en corazn a:

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Mioglobina y troponina. La mioglobina es una protena intracelular que se encuentra en grandes cantidades en el msculo cardiaco. Se libera a la circulacin sangunea en las primeras seis horas de dolor precordial. La troponina IT slo se presentan en suero cuando existe necrosis cardiaca; sin embargo, la concentracin de stas permanece elevada de 3 a 14 das. Actualmente, la mioglobina y troponina se identifican por anticuerpos monoclonales. La troponina (TN) es una molcula esfrica constituida por tres subunidades diferentes, las cuales se denominan de acuerdo con su funcin: 1) TNT, que es la unidad que se une a tropomiosina; 2) TN-I, que es la unidad inhibidora (TN-I); y 3) TN-C, que es la unidad que se une al calcio. Marcadores musculares Creatinfosfocinasa. Diversas enzimas sirven para valorar afecciones musculares; la CK srica es ms especfica y sensible que la AST y la LDH, y ms predictiva que la aldolasa. Se observa un incremento de la actividad de estas enzimas en la poliomielitis, las distrofias musculares, las distrofias miotnicas y algunos trastornos metablicos. Estas afecciones musculoesquelticas causan un dao directo al msculo y, en consecuencia, las enzimas pasan al suero. Aldolasa. Pertenece a las liasas. Es una enzima importante en la va de EmbdenMeyerhof del metabolismo de la glucosa. Su principal funcin es romper el enlace fructosa-1,6--bifosfato para formar fosfato de hidroxiacetona y gliceraldehdo-3-fosfato. Se distribuye, en orden decreciente de frecuencia, en msculo esqueltico, hgado y cerebro. Marcadores seos En diferentes padecimientos seos es importante conocer las reacciones enzimticas caractersticas para valorar la funcin de los osteoblastos y de los osteoclastos. Fosfatasa alcalina (ALP). Se produce en placenta, hgado, hueso y bazo, La actividad primaria de la ALP refleja cambios en la funcin sea y heptica. Es probable que los incrementos de la concentracin de ALP se deban a una gran actividad de los osteoblastos, como en la enfermedad de Paget. Otras alteraciones seas

que aumentan los valores de ALP son osteoporosis, raquitismo y osteomalacia por deficiencia de vitamina D, y metstasis seas por enfermedades malignas de prstata, pulmn o glndula mamaria. Marcadores prostticos La hipertrofia prosttica benigna es una de las enfermedades ms frecuentes en los varones mayores de 50 aos, lo cual hace necesario contar con mtodos para identificar enfermedades prostticas. Fosfatasa cida (ACP). Se distribuye en prstata, eritrocitos, plaquetas, hgado, bazo, rin y mdula sea. La ACP se usa para mediciones medicolegales del lquido seminal en la vagina despus del coito. Los valores de la actividad de ACP srica siempre son anormales en los estadios finales de carcinoma prosttico metastsico. Isoenzimas de fosfatasa cida. La isoenzima 2 separada por electroforesis tambin se conoce como PAP y slo se encuentra en la circulacin en el carcinoma prosttico. Enzima especfica de la prstata (PSA). Su sinnimo es antgeno especfico de prstata circulante. Es una proteasa de la familia de las calicrenas, con un peso molecular de 34 000 Da. Se produce por la prstata y se secreta al plasma seminal. La PSA se encuentra en pequeas cantidades en in dividuos normales y la actividad de sta aumenta en la hipertrofia prosttica y en el adenocarcinoma de prstata. Actualmente se identifica por medio de anticuerpos monoclonales, tanto la fraccin libre de PSA como la fraccin de PSA ligada antiquimiotripsina. Los individuos con cncer de prstata presentan menos fraccin libre de antgeno prosttico y ste se puede cuantificar mediante el mtodo de ensayo inmunoadsorbente enzimtico (ELISA). El lmite superior normal de la actividad de PSA en suero es de hasta 6.5 ng/ml. Inhibicin de enzimas en el tratamiento del SIDA Una estrategia clave en el tratamiento del sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) ha sido el desarrollo de inhibidores especficos que bloquean selectivamente la accin de enzimas exclusivas del virus de inmunodeficiencia humana (VIH), que causa

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el SIDA. Muchos laboratorios estn explorando este enfoque de desarrollo de agentes teraputicos. Una de las enzimas ms importantes que se han escogido como blancos en la VIH proteasa, una enzima indispensable para la produccin de nuevas partculas de virus en las clulas infectadas. La VIH proteasa slo se encuentra en este virus, y cataliza el procesamiento de protenas virales en la clula infectada. Sin estas protenas, no es posible liberar partculas viables de virus para diseminar la infeccin. La estructura de la VIH proteasa, incluido su sitio activo, se determin mediante cristalografa de rayos X. Con esta estructura en mente, los cientficos han diseado y sintetizado compuestos que se unen al sitio activo. Se mejor el diseo del medicamento obteniendo las estructuras de una serie de inhibidores que se unen al sitio activo de la VIH proteasa. Dichas estructuras tambin se determinaron por cristalografa de rayos X. En ltima instancia, el proceso llev a varios compuestos que han comercializado diferentes compaas farmacuticas. Estos inhibidores de VIH proteasa incluyen saquinavir de Hoffman-LaRoche, ritonavir de Abbot, indinavir de Merck, viracept de Agouron Pharmaceuticals y amprenavir de Vertex Pharmaceuticals. (Estas compaas mantienen pginas base muy informativa en la World Wide Web). Los tratamientos del SIDA son ms eficaces cuando se usa una combinacin de terapias medicamentosas, y los inhibidores de la VIH proteasa desempean un papel importante. Se obtienen resultados especialmente prometedores (como un abatimiento de los niveles de virus en el torrente sanguneo) cuando los inhibidores de VIH proteasa forman parte de terapias medicamentosas para el SIDA.

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PROBLEMAS DE ESTUDIO 1. Defina los siguientes trminos con 25 palabras o menos.

a. Vitamina b. Niacina c. Coenzima d. Grupo prosttico e. Micronutriente f. Efector negativo g. Sitio regulador h. Cooperatividad i. Isoenzimas j. Modificacin covalente k. Zimgeno l. Mutagnesis de lugar dirigida m. Anticuerpos catalticos n. Ribozima o. [S]0.5

2. Por qu es lgico que el primer paso de una serie de reacciones metablicas sea el principal paso de regulacin? 3. Explique Por qu razn la ruptura proteoltica no se considera como una forma de modificacin covalente? 4. Por qu las enzimas proteolticas producidas en el pncreas y estmago deben ser sintetizadas en forma inactiva? 5. Un individuo que tena el dolor en el pecho, fue a la sala de emergencias del hospital de la zona para que le dieran tratamiento. El anlisis de la sangre del paciente mostr niveles elevados de la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) con predominancia de la isoenzima H4. Sugiera una posible causa que explique los niveles elevados de LDH. Explique los posibles procesos bioqumicos que sustentan el diagnstico que usted propone. 6. Compare y contraste las caractersticas de los cuatro tipos de regulacin enzimtica descritos en este captulo: alosterismo, modificacin covalente, ruptura proteoltica e isoenzimas.

7. La accin cataltica de una enzima sucede con el sustrato unido en el sitio activo. Cmo puede alterarse la actividad cataltica del sitio activo, por la unin de otro tipo de compuesto en un punto distante de dicho sitio activo? 8. Cules de los siguientes enunciados son ciertos para las isoenzimas? a. Catalizan las mismas reacciones qumicas. b. Tienen la misma estructura cuaternaria. c. Se distribuyen por igual en los rganos y tejidos. d. Tienen el mismo nombre y nmero de clasificacin enzimtica. 9. Cul es el papel del componente de RNA en el sistema de la enzima ribonucleasa? 10. Qu diferencias existen entre los trminos coenzima y grupo prosttico? 11. Abajo se muestra la ruta de la sntesis de colesterol en los animales. Slo se muestran algunos de los numerosos intermediarios y enzimas. Utilizando los principios de la regulacin enzimtica, responda: Cul reaccin es el paso determinante de la velocidad de esta ruta? Esperara que la enzima fuera reguladora en ese punto?
HMGCoA
3 1

mevalonato
4

intermedarios de isopreno

Escualeno

Lanosterol

Colesterol

12. Relacione cada una de las vitaminas incluidas en la primera columna de la tabla con su coenzima respectiva que se encuentra en la lista de la segunda columna.
Vitamina Riboflavina B2) Vitamina B6 Niacina cido flico Vitamina B1 (vitamina Coenzima relacionada Fosfato de piridoxal NAD+ FAD Coenzima A Tetrahidrofolato Pirofosfato de tiamina Biotina

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BIOENERGETICA
GENERALIDADES
Las clulas y seres vivos en general requieren de energa para efectuar trabajo para vivir, crecer, y reproducirse. Para ellos tienen la capacidad de captar energa de diversas fuentes y canalizarlo para desarrollar trabajo, constituyndose en una de las propiedades fundamentales de los seres vivos, en todos los niveles de la escala evolutiva. Los organismos llevan a cabo una serie de transducciones energticas, conversiones de una forma a otra de energa, usando para ello la energa qumica como combustible para la sntesis de molculas complejas (macromolculas) a partir de molculas simples. Esta serie de reacciones que se producen en los seres vivos la denominamos metabolismo. En el metabolismo se involucran miles de coordinadas, complejas, eficientes e integradas reacciones qumicas, ordenadas en las llamadas vas metablicas, secuenciadas e intricadas rutas- controladas por enzimas. De manera general al metabolismo (Fig. 1.25) se le divide en anabolismo y catabolismo. Rutas catablicas: liberan energa almacenada en molculas complejas, a travs de la ruptura o degradacin de estas molculas en sus componentes ms simples. Rutas anablicas: requieren energa para unir molculas simples y sintetizar macromolculas ordenadas estructural y fisiolgicamente. El acoplamiento de las rutas catablicas y anablicas es la energa Para qu se usa la energa en las clulas vivientes 1. Biosntesis de protenas y cidos nucleicos 2. Fosforilacin de protenas catalizada por cinasas, para provocar cambios de conformacin 3. Superenrrollamiento del DNA 4. Conversin de azcares simples en fosfatos de azcar y NDP-azcares, y de cidos grasos en tiosteres 5. Funcionamiento de los sistemas de transporte activo Todos los seres vivos estamos constituidos por miles de compuestos orgnicos diferentes, que abarcan desde molculas relativamente

METABOLISMO CELULAR METABOLISMO: CAMBIOS EN LA ENERGIA LIBRE CELULAR RESPIRACION G CO2 + H2O Reacciones Catablicas ENTALPIA -H EXOTERMICA ENTROPIA + S EXERGONICA ATP SINTESIS Monmeros Macromolculas Reacciones anablicas ENTALPIA + H ENDOTERMICA ENTROPIA - S ENDERGONICA

-G

+ G

Fig. 1.25 Resumen de Metabolismo

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simples como monosacridos, aminocidos, cidos grasos, vitaminas y otros, hasta macromolculas muy complejas como polisacridos, protenas, cidos nucleicos. Estos a su vez pueden organizarse en agregados macromoleculares extremadamente complejos como los ribosomas, complejos multienzimticos, nucleosomas y muchos otros. Todas estas molculas tienen en particular el de estar constituidas por los mismos elementos que conforman la materia inerte, y al igual que ellos estn regidos por los mismos principios y leyes de la fsica y la qumica, como las de la termodinmica. Lo anterior se basa en que todo organismo puede ser considerado como un sistema fisicoqumico, entendindolo como parte del universo con la cual nos relacionamos. En el caso de los seres vivos somos un sistema abierto puesto que hay intercambio de materia (nutrientes, productos finales o de excrecin) y energa (calor) con nuestro entorno. Estas interrelaciones son estudiadas por la Termodinmica, y de manera particular para los seres vivos estn involucradas la 1ra y 2da Ley. Conceptos Termodinmicos Un sistema posee un contenido energtico que comprende un sinnmero de formas de energa y a la suma de todas se conoce como energa interna (E) del sistema. En fsica se dice que energa es todo aquel capaz be producir trabajo. Sin embargo, de todo ese contenido energtico de un sistema, slo una porcin est disponible para realizar trabajo y es la energa til a esa porcin de a energa total se le conoce como energa libre (F o G) o de Gibbs. Un sistema es un conjunto de cuerpos que contienen materia y energa, cuyo estado se define en trminos de presin, temperatura y composicin. El contenido total de energa de un sistema antes de que ocurra un proceso se designa como estado inicial. y el contenido de energa del sistema despus de ocurrido el proceso que interesa estudiar se conoce cono estado final. Medir los cambios de energa que ocurren durante un determinado proceso puede resultar difcil, pero resulta ms fcil y preciso determinar el contenido energtico del sistema en el estado inicial y en el estado final

y calcular el cambio, que se acostumbra simbolizar con la letra griega delta mayscula ( ). Si presin y temperatura son constantes, los cambios de energa se relacionan nicamente con composicin del sistema. Existen varios tipos de sistemas: se define como sistema aislado aquel que no intercambia materia y energa con su medio. Sistema cerrado es aquel que intercambia energa pero no materia, y se denomina sistema abierto al que intercambia materia y energa con su entorno. Los sistemas biolgicos se presentan como sistemas abiertos, isotrmicos (igual temperatura) e isobricos (igual presin). Un sistema biolgico puede ser una clula, un organismo, una colonia o hasta el mundo entero. El comportamiento de un sistema, biolgico o inorgnico, se rige por leyes o principios establecidos por una rama de la fisicoqumica que estudia los fenmenos energticos de los sistemas, la termodinmica. La aplicacin de las leyes de la termodinmica a los seres vivos resulta de extraordinaria utilidad si se considera que los procesos bioqumicos son reacciones qumicas que deben ajustarse en todo a las leyes que rigen el comportamiento de los procesos termodinmicos. La primera ley de la termodinmica establece que la energa total de un sistema, ms la de su entorno permanece constante. A esta ley se le conoce tambin como Ley de la conservacin de la energa, que significa que: la energa no se crea ni se destruye, slo se transforma. Sin embargo, dentro de ese sistema total, la energa puede transformarse de una a otra forma; por ejemplo, la energa elctrica puede transformarse en energa trmica, energa radiante o energa mecnica. La forma de energa ms usual es el calor (Q); puede afirmarse que casi todos los eventos fsicos o qumicos que ocurren en a naturaleza, absorben o desprenden calor al efectuarse, es decir, son procesos exotrmicos o endotrmicos. Imaginemos un sistema aislado, al cual se le administra una determinada cantidad de calor (Q), lo cual puede provocar un cambio en la

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energa interna del sistema ( E) o un trabajo que realiza el sistema. Q es la cantidad de calor que se absorbe o se libera en un proceso a presin constante y se denomina entalpa (H). Los cambios de entalpa se representan por H, por lo que la primera ley de la termodinmica se puede representar as: E= H-P V o H= E+P V

cuanto ms ordenado y estructurado es un sistema, ms pequea ser su entropa. Finalmente, la tercera ley de la termodinmica establece que un cristal perfecto en el cero absoluto tiene entropa. Ciclo de la Energa en los Seres Vivos La realizacin de todas y cada una de las funciones celulares requiere energa. Los organismos auttrofos, utilizan la energa de la luz solar, y a partir de CO2 y H2O sintetizan molculas del tipo de los carbohidratos y oxgeno. El proceso por el cual se transforma la energa radiante del sol y se captura en forma de energa qumica en la glucosa, se denomina fotosntesis. Otro tipo de organismos, los heterotrficos, mediante la respiracin, que requiere oxgeno, utilizan a energa qumica acumulada en los alimentos durante el proceso de la nutricin y liberan CO2 y H2O al ambiente, con los cuales los auttrofos vuelven a generar alimento qumico y repetir el ciclo Algunos procesos vitales como la sntesis de macromolculas, la conduccin de impulsos nerviosos, la contraccin muscular y el transporte activo, requieren energa para llevarse a cabo. Las reacciones metablicas involucradas en los procesos de sntesis se denomina rutas o vas anablicas o anabolismo son reacciones que requieren energa y se denominan endergnicas. Para que estas reacciones ocurran, se deben acoplar a otro tipo de rea que liberan energa (exergnicas). Las reacciones metablicas que producen energa se denominan catablicas. En estas reacciones se convierten las molculas complejas, como: carbohidratos o grasas, en molculas ms pequeas (CO2 y H2O en ltimo trmino). Al ocurrir este tipo de reacciones se ibera a energa almacenada y se consume oxgeno. Estas reacciones transcurren con cambio de energa libre negativo son espontneas e irreversibles y, por tanto, exergnicas. En la prctica, un proceso endergnico no puede ocurrir en forma independiente, debe formar parte de un sistema acoplado exergnico-endergnico cuyo cambio global

donde H es el cambio de entalpa o cantidad de calor absorbido o liberado por el sistema, cuando a presin constante realiza un trabajo. Si en estas condiciones se libera calor al medio, H es negativo y se dice que la reaccin es exotrmica. Si en la reaccin se absorbe calor del exterior, H es positivo y el proceso es endotrmico. La primera ley de la termodinmica no dice nada acerca de la direccin de flujo de energa en un proceso y es necesario establecer una segunda ley que utiliza otro concepto, la entropa (S). La segunda ley de la termodinmica establece que si un proceso ocurre espontneamente, la entropa total del sistema debe aumentar. Dicho de otra manera, en un sistema cerrado las nicas reacciones espontneas son aquellas que tienden al equilibrio y a un aumento de entropa o desorden. Esta segunda ley se basa en observaciones experimentales como son el flujo de calor unidireccional desde la temperatura ms elevada a otra menor. Supongamos que se coloca un trozo de metal fro junto a uno caliente: en un sistema aislado se observar que la temperatura del objeto caliente baja y la del fro sube. Este flujo de energa es espontneo y slo se detiene cuando T1 = T2. Cuando un sistema alcanza el equilibrio, ya no se produce ningn cambio energtico. A diferencia de la entalpa, la entropa es una funcin matemtica que no tiene anlogo fsico sencillo y su significado es ms bien abstracto. La termodinmica establece que la entropa es una medida de la distribucin al azar de la energa o una medida del desorden. Cuanto ms catico o desordenado es un sistema, ms grande es su entropa;

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debe ser exergnico. El conjunto de procesos exergnicos (catablicos) y endergnicos (anablicos) constituye lo que se conoce como metabolismo. Un ejemplo clsico de acoplamiento energtico es la fosforilacin de la glucosa: Glucosa + H3PO4
F = +3.2 Kcal/Vmol

El intercambio de materia y energa dentro del propio organismo y con su entorno La transmisin de informacin gentica, tanto de unos a otros compartimentos de la propia clula, y de una clula a su progenie

Glucosa-6-fosfato + H2O El intercambio de materia y energa se inicia con el aporte de material exgeno, es decir la ingesta de alimentos, las mismas deben ser digeridas hasta sus monmeros, absorberse e incorporarse a las diversas clulas. Estos monmeros pueden seguir la va de la degradacin oxidativa o catabolismo (Fig. 1.27) hasta CO2, agua, amoniaco que se convierte a urea-, con produccin de energa (ATP, calor) o la biosntesis de nuevo material celular o anabolismo (Fig. 1.28) para almacenamiento o reposicin de molculas usadas, para ello consumen energa en forma de ATP, lo cual explica la eficiente conservacin y utilizacin de la energa qumica metablica y el flujo adecuado de intermediarios metablicos a travs de las diversas rutas bioqumicas; es decir se cumple el principio de acoplamiento que establece que una reaccin favorable desde el punto de vista energtico est ligada a la formacin de producto (s) que de otra forma sera desfavorable.

La reaccin no es viable termodinmicamente en la direccin propuesta. Sin embargo, acoplada a la hidrlisis de ATP: ATP + H2O ADP + Pi
F = -7.3 Kcal/mol

La hidrlisis del ATP confiere a la reaccin global un cambio exergnico que le permite transcurrir en la direccin propuesta:
Glucosa + H3PO4 Glucosa-6-P + H2O ATP + H2O ADP + H3PO4 : Glucosa + ATP Glucosa-6-P+ADP F=+3.2 kcal/mol F=-7.3 Kcal/mol F= -4.1 Kcal/mol

En los sistemas biolgicos, muchas reacciones exergnicas-endergnicas estn acopladas de esta manera, es decir, con un intermediario comn obligado. El principal compuesto intermediario o portador de alta energa en la clula viva es el ATP (Fig. 1.26).

Fig. 1.26 Ciclo del ATP

A continuacin describiremos las reacciones que dan lugar a la formacin de este importante intermediario. En el humano, en el metabolismo podemos distinguir dos grandes aspectos:

Fig. 1.27 Catabolismo

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forma un espacio intermembranoso, o tambin cmara externa, mientras que por debajo de la membrana interna ubicamos a la cmara interna llena de un material denominado matriz mitocondrial. En las crestas se localizan las enzimas responsables de la cadena respiratoria y la fosforilacin oxidativa, y en la matriz casi todas las enzimas que participan en el ciclo de Krebs.

Fig. 1.28 Anabolismo

Para que se cumplan los procesos energticos, tiene suma importancia las mitocondrias. Las mitocondrias (Fig. 1.29) son organelos fundamentales para la respiracin celular en todo organismo eucarionte, se encuentran dispersas en el citoplasma y tienen como caracterstica el de poseer su propio DNA. Al microscopio electrnico se aprecia como estructuras cilndricas, rodeada por una membrana mitocondrial externa, la cual est en contacto con el medio citoplasmtico o citosol, se caracteriza por ser permeable a iones y molculas de pequeo tamao. Esta permeabilidad se debe a la existencia de poros o canales formados por una protena transmembrana llamada porina. Por debajo de la membrana externa, se encuentra la membrana mitocondrial interna (Fig. 1.30), con una permeabilidad muy selectiva, slo puede ser atravesada libremente por el agua, el O2, el CO2, el NH3 y algunos monocarboxilatos; que emite pliegues hacia el interior formando invaginaciones denominadas crestas, las cuales son ms abundantes en mitocondrias de clulas con intensa actividad respiratoria. Estas crestas, en la cara interna, presentan un gran nmero de formaciones esferoidales (partculas submitocondriales) que, implantadas en un corto tallo, hacen saliencia hacia la matriz. Entre las dos membranas mitocondriales se

Fig. 1.29 Esquema de una mitocondria

Fig. 1.30. Esquema de la membrana mitocondrial

El genoma mitocondrial es el ms compacto y eficiente que se conoce. Para sintetizar sus protenas dispone de sus propios ribosomas, capaces de descifran un cdigo gentico diferente en algunos codones al cdigo universal. La accin de este genoma se coordina estrechamente, con la del ncleo de la clula. El genoma de la mitocondria existe en mltiple copias, cuyo nmero vara en distintos momentos de la vida de la organela, o segn el tipo de clula, pero su estructura es la misma. Por ejemplo el huevo o cigoto humano contiene unos 100 000; las clulas diferenciadas, por su parte, de acuerdo a sus necesidades energticas requieran en cada momento. Entre las ms necesitadas estn las neuronas as como las clulas del corazn y

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los msculos. Sus mutaciones son muy frecuentes debido entre otros factores a que las mitocondrias no han evolucionado suficientes mecanismos de reparacin de su ADN. Estas mutaciones desfavorables causan muchos problemas en la que se incluyen la encefalomiopatas, distrofias y otros, con gravedad proporcional a la edad del organismo. El ADN mitocondrial est constituido por dos hebras circulares: H (heavy) y L (light) y todo lo que afecte la produccin de energa tiene consecuencias negativas sobre la vida de la clula, de manera particular se ha demostrado que las mitocondrias tienen una funcin directriz en la apoptosis celular.

primeros casos, el carbono y el hidrgeno de los combustibles se combinarn con el oxgeno del aire para formar CO2 y H2O y desprender energa calrica. En el ltimo ejemplo, el hierro al combinarse con el oxgeno formar xido de hierro. El factor comn a estos dos procesos oxidativos es la participacin de oxigeno. En la clula, la oxidacin de la glucosa hasta CO2 y H2O con liberacin de energa se realiza en etapas, algunas de las cuales transcurren sin la participacin de oxgeno. Por ejemplo, la transformacin del lactato en piruvato: COO| CH-OH | CH3 Lactato COO| C=O + 2H | CH3 Piruvato

Justamente,

mitocondrias las organelas en las cuales tiene lugar la transferencia ordenada de electrones y la captacin de la energa que ese flujo de electrones produce; y dado su importancia se han ideado procedimientos para separar ambas membranas mitocondriales y estudiar la localizacin de sus componentes. Con ello, se ha determinado que hay varias enzimas ubicadas en la membrana externa y en el espacio intermembrana. En la masa gelatinosa de la matriz se encuentra un gran nmero de enzimas integrantes de importantes vas metablicas. En la membrana interna existen, incluidas en la doble capa lipdica, muchas protenas que le confieren gran importancia funcional. En ella se encuentran los componentes de la cadena respiratoria, las estructuras y enzimas responsables de la captacin de energa y sntesis de ATP y los distintos sistemas de transporte de sustancias a travs de la membrana. Antes de describir las rutas bioqumicas involucradas en la obtencin de energa, revisaremos algunos conceptos bsicos, necesarios para entender mejor dichos procesos. REACCIONES CIN DE OXIDORREDUC-

son

las

Deshidrogenasa lctica

En esta reaccin de oxidacin se pierden hidrgenos. Muchas reacciones de oxidacin que ocurren en el metabolismo se realizan por prdidas de hidrgenos o deshidrogenacin. Ya sea que el mecanismo de oxidacin ocurra con ganancia de oxgeno o con prdida de H+, en ambos procesos se implica la prdida de electrones. As, una reaccin de oxidacin puede ocurrir por cualquiera de estos tres mecanismos: a) Ganancia de oxgeno: 4Fe + 3O2 2Fe2O3 C3H8 + 5O2 3CO2 + 4H2O b) Prdida de hidrgeno: Lactato Piruvato + 2H NADH+ H+ NAD+ + 2H c) Prdida de electrones: Fe++ (ferroso) Fe+++ (frrico) + 2eFeo (metlico) Fe++ (ferroso) + 2eEl fenmeno contrario se denomina reduccin. Este puede ocurrir por prdida de oxigeno, ganancia de hidrgeno o ganancia de electrones. En toda reaccin qumica, los hidrgenos o electrones que una molcula pierde, otra molcula los debe ganar. Es decir,

Conceptos de Oxidacin y Reduccin En la vida diaria se encuentran varios ejemplos de oxidacin, como la combustin del gas usado en las cocinas, estufas, la lea que se quema en las chimeneas o la oxidacin del hierro dejado a la intemperie. En los

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una se oxida y la otra se reduce; a la reaccin global, se llama reaccin de oxidorreduccin. Potencial de Oxidorreduccin La facilidad con la que un donador de electrones (agente reductor) cede sus electrones a un aceptor electrnico (agente oxidante) se expresa como potencial de oxidorreduccin (potencial redox) del sistema. El potencial redox de un par de oxidorreduccin se determina (en voltios) comparndolo con una hemipila patrn de referencia. El potencial del electrodo de referencia se sita por convencin en 0.0V a un pH de 0.0, a concentracin 1M y 25C; sin embargo, cuando se corrige este potencial para un pH de 7.0, el potencial de referencia es -0.42V. Este potencial se conoce como potencial redox estndar (E). En la Tabla 1.5, se indican los potenciales redox estndar de inters especial en bioqumica. Esta lista permite predecir la direccin del flujo de electrones de un par redox a otro. Los electrones fluirn de la reaccin E fuertemente negativa a la reaccin con E ms positivo. Tabla 1.5. Potenciales redox estndar de diversas reacciones bioqumicas
Sistema O2 + 2 H+ /H2O Citocromo a Fe+3/Fe+2 Citocromo c Fe+3/Fe+2 Citocrorno c1 Fe+3/Fe+2 Coenzima Q + 2H+/CoQH2 Citocrorno b Fe+3/Fe+2 Mitocondrial Fumarato +2H+/succinato Citocromo b Fe+3/Fe+2 Microsomal Oxalacetato + 2H+/malato Piruvato + 2H+/lactato 2 2 -0.166 -0.185 2 1 +0.03 +0.02 n 2 1 1 1 2 1 E voltios +0.82 +0.29 +0.25 +0.22 +0.10 +0.08

Acetaldehido + 2H+/etanol FAD+2H+/FADH2 NAD+ + 2H+/NADH + H+ NAD+ + 2H+/NADPH + H+ 2H+/H2 Ferrodoxina Fe+3/Fe+2 Acetato + 2H+/acetaldehido Cetoglutarato + 2H+/succinato + CO2 Piruvato +2H+/acetato + CO2

2 2 2 2 2 1 2 2 2

-0.197 -0.219 -0.320 -0.320 -0.421 -0.430 -0.60 -0.70 -0.70

Nmero de Oxidacin En las reacciones de oxidorreduccin se maneja a menudo el concepto de nmero de oxidacin que se defina como el nmero de electrones que se transfieren en una reaccin de oxidorreduccin. Respiracin celular Lo que se entiende por respiracin, antes de conocer las bases bioqumicas de los procesos oxidativos, se refiere realmente al transporte de oxgeno desde el ambiente a la clula y, dentro de sta, a la mitocondria. Es aqu donde se realiza la verdadera respiracin o respiracin celular. El proceso consiste en la transferencia de sustratos reducidos que cedern, primero sus hidrgenos, y luego los electrones hasta el oxgeno como aceptor final.

CICLO DE KREBS (ACIDO CICTRICO, O ACIDOS TRICARBOXILICOS) El Ciclo de Krebs comprende una serie de reacciones encargadas de la oxidacin de Acetil CoA (Fig. 1.31) un producto comn de la degradacin de la glucosa, cidos grasos, aminocidos cetognicos, y aminocidos glucognicos que se convierten a intermediarios del Ciclo de Krebs, hasta CO2 y H20, con la produccin de NADH+ + H+ y FADH2, las que se acoplan con la cadena transportadora de electrones y luego la

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fosforilacin oxidativa responsable de la produccin de ATP en el organismo. El ciclo del cido ctrico, es considerado el ncleo del metabolismo, puesto que acta como va central que integra el flujo metablico del carbono entre las diversas biomolculas, establecindose procesos catablicos y anablicos, como la gluconeognesis, lipognesis, transaminacin, desaminacin, es decir es un proceso anfiblico. Estas reacciones se llevan a cabo en casi todos los tejidos, pero es el tejido heptico el nico donde ocurren todas Los estudios del ciclo se inician a principios de los 30s al demostrarse que al agregar succinato, fumarato y malato a msculos machacados se incrementaba la velocidad de consumo de Oxgeno. El oxaloacetato se incorpor a la lista de cidos dicarboxlicos cuando se descubri que se poda formar en condiciones aerbicas a partir del piruvato. En 1935 A. Szent-Gyrgyi propuso que ciertos pares de cidos dicarboxlicos eran interconvertidos por la accin de deshidrogenasas y que este proceso estaba relacionado con la respiracin. El cido ctrico fue descubierto en 1784 por Carl Wilhelm Scheele en el jugo de limn, y recin en 1937 se pudo demostrar su participacin en el metabolismo. Carl Martius y Franz Knoop mostraron que el cido ctrico es convertido en -cetoglutarato a travs del isocitrato, as como el -cetoglutarato puede ser oxidado a succinato. La formacin del citrato era la pieza faltante para poder armar completamente la secuencia, hecho que sucedi en 1937 por Sir Hans Krebs y W.A. Jonson, quienes demostraron que el citrato es derivado del piruvato y del oxaloacetato completando lo que se conoce como el ciclo del cido ctrico. Por estos aportes, en 1953 Krebs gan el premio Nbel. Sin embargo, fue necesario de una dcada para demostrar que el Acetil CoA, derivado del piruvato, es la fuente intermediaria de los fragmentos de dos Carbonos que se combinan con el oxaloacetato para formar citrato. En 1948 E.P. Kennedy y A. Lenhinger descubrieron que en mitocondrias aisladas de homogenados de hgado de rata, se llevaban a

cabo la oxidacin del piruvato y de todos los intermediarios del ciclo de Krebs con gasto de O2, por lo que se generaliz que contenan todas las enzimas necesarias para catalizar las reacciones del ciclo y del transporte energtico. La mayor parte de las enzimas que participan en el ciclo de Krebs se encuentran en la matriz mitocondrial, excepto succinato deshidrogenasa que est adherida a la membrana interna. En algunos tejidos, en el citosol, se encuentran la aconitasa (hidrolasa), isocitrato deshidrogenasa (NADP+ dependiente), la fumarasa y la malato deshidrogenasa.

Fig.1.31. Visin General del Ciclo de Krebs

(Reproducido con Modificaciones de Bioqumica de Harper. Murria et al. 16 Ed)

REACCIONES DEL CICLO, ENZIMAS Y COENZIMAS Los componentes del ciclo se encuentran en todos los tejidos en las mitocondrias, aunque algunas enzimas y metabolitos tambin se encuentran en el citosol (extramitocondrial).

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Dentro de las mitocondrias, las enzimas se localizan en la membrana interna y en la matriz mitocondrial, y prximas a las de la cadena respiratoria. Esta proximidad facilita el adecuado acoplamiento de ambos procesos. La conexin de la gluclisis (ltima etapa de la degradacin de la glucosa) con el ciclo de Krebs consiste en la descarboxilacin oxidativa del piruvato a acetil-CoA. Esta transformacin es catalizada por un complejo multienzimtico llamado piruvato deshidrogenasa. El complejo piruvato deshidrogenasa (Fig. 1.32) posee tres actividades enzimticas: piruvato descarboxilasa (con pirofosfato de tiamina), dihidrolipoil transacetilasa (con cido lipoico y coenzima A) y dihidrolipoil deshidrogenasa con (FAD+ y NAD+). La reaccin global es esencialmente irreversible.

Fig. 1.33. Reacciones del Ciclo de Krebs

ENZIMAS 1. Citrato sintasa, 2. aconitasa, 3. isocitrato DHG 4. KG DHG 5. Succinil CoA sintetasa 6. Succinato deshidrogenasa, 7. fumarasa 8 malato deshidrogenasa

El citrato es convertido en isocitrato por medio de la enzima aconitasa (aconitato hidratasa). La reaccin tiene lugar en dos pasos: deshidratacin hasta cis-aconitato (el cual permanece unido a la enzima) y rehidratacin hasta isocitrato; hay 90% de citrato, 3% de cis-aconitato y 7% de isocitrato, por lo que se encuentra desplazada hacia la formacin de citrato. Sin embargo, el consumo de isocitrato y la produccin continua de citrato in vivo, por ley de accin de masas, hace que la reaccin est desplazada hacia la isomerizacin citrato isocitrato. El isococitrato es oxidado por deshidrogenacin, en una reaccin catalizada por la isocitrato deshidrogenasa. La enzima requiere NAD+ y Mg++. La reaccin se lleva a cabo en dos pasos: una deshidrogenacin en a que se forma oxalosuccinato, el cual permanece unido a la enzima, y luego se descarboxilasa -cetoglutarato. En esta reaccin irreversible se produce CO2 y el primer NADH + H+ del ciclo. El citosol posee tambin isocitrato deshidrogenasa pero requiere NADP+ como coenzima, a diferencia de la del ciclo, que requiere NAD+. La conversin de -cetoglutarato (o 2-oxoglutarato) en succinil-CoA es catalizada por un complejo multienzimtico -cetoglutarato deshidrogenasa, cuya accin es anloga a la piruvato deshidrogenasa y utiliza los mismos cofactores: pirofosfato de tiamina (TPP) cido lipoico, NAD+, FAD y coenzima A. La reaccin es prcticamente irreversible y en ella se forma el segundo CO2, que proviene

Fig. 1.32. Reaccin de la piruvato deshidrogenasa.

La acetil-CoA puede provenir tambin de la -oxidacin de los cidos grasos y de algunos aminocidos. La siguiente reaccin, propiamente la inicial del ciclo, es la condensacin de la acetil-CoA con oxalacetato (Fig. 1.33) catalizado por la citrato sintasa. La reaccin supone la hidrlisis del enlace tioster de la acetil-CoA, lo que implica la liberacin de energa en forma de calor, haciendo el proceso prcticamente irreversible.

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de oxalacetato. Para que la acetil-CoA convierta en CO2, su radical acetato, el ciclo ha de dar dos vueltas, El ciclo contina por accin de la succinato tiocinasa (o succinil-CoA sintetasa, por la reaccin en sentido inverso) que convierte la succinil CoA en succinato con la transferencia del enlace de alta energa a la fosforilacin de GDP que pasa a GTP (o de IDP que pasa a ITP). Ambos nucletidos pueden ser utilizados para la formacin de ATP por accin de un nuclesido difosfato cinasa o fosfocinasa. Este as el nico sitio del ciclo en que se genera ATP a nivel del sustrato. Una reaccin alternativa en tejidos extrahepticos es a conversin de succinil-CoA en succinato catalizada por la succinil CoA transferasa (o tioforasa) acoplada a la conversin de acetoacetato en acetoacetil-CoA. Esta es una reaccin que permite la incorporacin de cuerpos cetnicos al ciclo de Krebs. Por accin de la succinato deshidrogenasa, el succinato es deshidrogenado a fumarato, pero esta enzima utiliza FAD+ como grupo prosttico, el cual en estado reducido (FADH2) constituye una fuente directa de electrones para la cadena respiratoria a nivel de la coenzima Q. Esta es la nica enzima del ciclo integrada a la membrana mitocondrial interna, directamente ligada a la cadena respiratoria. Se renen as, anatmica y fisiolgicamente, el ciclo de Krebs, el transporte de electrones y la fosforilacin oxidativa. El fumarato presenta luego una serie de cambios para regenerar el oxalacetato que comprende una hidratacin catalizada por la fumarasa (fumarato hidratasa) para formar Lmalato, el cual luego se oxida a oxalacetato por medio de la deshidrogenasa mlica y el NAD+ como coenzima.

para formar grasa, mientras que los aminocidos que llegan pueden abandonarlo para formar carbohidratos. Slo una va parece cerrada; la que conduce de grasas a carbohidratos. En la figura muestran las interconversiones ms comunes de los intermediarios del ciclo.

Fig. 1.34. Papel anfiblico del ciclo de Krebs.

En la figura puede observarse cmo se sintetizan cidos grasos a partir de citrato que sale de la mitocondria, as como la sntesis del grupo hemo proveniente de succinil-CoA. El oxalacetato es el intermediario que mayor demanda muestra para mantener el ciclo. Aunque en realidad con slo una pequea cantidad de oxalacetato se forman grandes cantidades de citrato para el ciclo, por lo que se considera que desempea un papel cataltico, la verdad es que si se incrementan las demandas de oxalacetato para formar otros compuestos como el aminocido aspartato, o bien fosfoenolpiruvato para la gluconeognesis, entonces se requerirn vas metablicas que aseguren la disponibilidad de oxalacetato para mantener el flujo de metabolitos del ciclo. A esas reacciones auxiliares se les denomina anaplerticas, y son las catalizadas por piruvato carboxilasa y por la enzima mlica (Fig. 1.35) La piruvato carboxilasa es una enzima de la gluconeognesis que cataliza a carboxilacin de piruvato a oxalacetato:

PAPEL ANFIBLICO DEL CICLO DE KREBS. PROCESOS ANAPLERTICOS Una va metablica es anfiblica cuando puede funcionar tanto en sentido catablico como en sentido anablico (Fig. 1.34). Desde este punto de vista el ciclo de Krebs puede considerarse como una verdadera glorieta bioqumica ya que material que llega de fuentes hidrocarbonadas puede abandonarlo

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de metabolitos del ciclo en aminocidos para biosntesis de protenas

Fig. 1.35. Vas anaplerticas y formacin de cido gama-aminobutrico (GABA) en el ciclo de Krebs.

La otra reaccin anaplertica es catalizada por una deshidrogenasa dependiente de NADP+, llamada enzima mlica. Esta enzima produce la carboxilacin y reduccin del piruvato, transformndolo en malato (Fig. 1.36)

Fig. 1.37. Rutas de entrada de los aminocidos en el ciclo de Krebs. Reproducida con autorizacin de J.M. Orten y O. W Neuhaus, Human Biochemistry, 10 edicin, C.V. Mosby. Co., St. Louis, 1982, p. 344.

Desaminacin oxidativa y formacin de GABA En condiciones normales, existe en las neuronas inhibidoras del cerebro una va colateral del ciclo de Krebs en la que se forma un neurotransmisor inhibidor derivado de un intermediario del ciclo; se trata del cido aminobutrico (GABA) formado por desaminacin oxidativa del cido glutmico, proveniente a su vez del -cetoglutarato por transaminacin. Al faltar o estar disminuida la actividad de la piruvato deshidrogenasa, que alimenta al ciclo de Krebs con acetil-CoA, o la piruvato carboxilasa, que cataliza la principal reaccin anaplertica, se presenta la acidosis pirvica congnita. Este padecimiento se acompaa de convulsiones al faltar el GABA inhibidor con predominio del neurotransmisor excitador: cido glutmico. Participacin de lpidos en el ciclo

Fig. 1.36. Enzima mlica

Posteriormente, el malato se transforma en oxalacetato por la malato deshidrogenasa del ciclo. De estas dos reacciones anaplerticas, la ms importante es la catalizada por la piruvato carboxilasa, cuya actividad aumenta en situaciones que depletan el oxalacetato como el ejercicio, el ayuno y la diabetes. La actividad de la enzima vara en forma inversa, disminuyendo en la diabetes y aumentando por administracin de insulina. Incorporacin de aminocidos al ciclo Dentro de las funciones catablicas del ciclo de Krebs se encuentra la incorporacin de aminocidos con fines energticos; o bien con fines anablicos (Fig. 1.37), la transformacin

Existen dos vas de entrada de material lipdico al ciclo de Krebs con fines degradativos: a travs del glicerol o a travs de cidos grasos, provenientes ambos de

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triglicridos. Por otro lado, del ciclo salen intermediados al citosol que permiten la sntesis de cidos grasos, la cual es extramitocondrial. En virtud de que la sntesis de grasas es extra. mitocondrial, necesitan transportarse al citosol indirectamente los precursores (acetil-CoA), ya que la membrana mitocondrial es impermeable a derivados de CoA. El citrato formado intramitocondrialmente sale al citosol donde es transformado en oxalacelato y acetil-CoA por accin de la ATP-citrato liasa extramitocondrial (Fig. 1.38): La acetil-CoA es la precursora de la biosntesis extramitocondrial de los cidos grasos Incorporacin gliceraldehdo de glicerol va
Fig. 1.39. Incorporacin del glicerol al ciclo glucoltico y luego al ciclo de Krebs.

El glicerol proveniente de triacilgliceroles puede entrar al ciclo de Krebs transformndose en gliceraldehdo-3-fosfato por medio de la accin concertada de tres enzimas: glicerolcinasa, glicerol-3-fosfafo deshidrogenasa y fosfotriosa isomerasa (Fig. 1.39) Incorporacin de cidos grasos va acetilCoA Los cidos grasos provenientes de triglicridos son degradados intramitocondrialmente hasta acetil-CoA en un proceso conocido como -oxidacin.

CADENA RESPIRATORIA Toda la energa til liberada durante la oxidacin de los nutrimentos energticos se aprovecha en las mitocondrias bajo la forma de equivalentes reductores (hidrgeno o electrones). El ms importante de los sistemas de oxidorreduccin en las clulas es la cadena respiratoria que es un sistema de transferencia de hidrgenos y electrones catalizada por protenas enzimticas ordenadas en forma secuencial en la membrana mitocondrial interna. Los equivalentes reductores son extrados de los sustratos en el ciclo de Krebs o la -oxidacin de cidos grasos y transportados a travs de la cadena de transporte electrnico hasta el ltimo aceptor de electrones, el oxgeno molecular, para formar agua. Destacaremos el rol de algunos grupos enzimticos y sus coenzimas.

Fig. 1.38. Participacin del ciclo de Krebs en la sntesis de cidos grasos a partir de la glucosa. deshidrogenasa.

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Deshidrogenasas Se puede considerar el descubrimiento de las deshidrogenasas realizado por Thunberg a principios de siglo, como el inicio de lo que hoy se conoce como cadena respiratoria. Thunberg descubre la accin de enzimas deshidrogenasas capaces de catalizar la oxidacin de ciertos sustratos en ausencia absoluta de oxigeno, utilizando azul de metileno como aceptor de hidrgeno, el cual al reducirse se decolora transformndose en leucobase. Las deshidrogenasas pertenecen al grupo de enzimas llamadas oxidorreductasas.

membrana interna de la mitocondria y puede actuar como un portador mvil de electrones. La ubiquinona acepta hidrgenos y se reduce a dihidroquinona (CoQH2). En la siguiente etapa al reoxidarse cede dos electrones al sistema de citocromos y quedan dos protones libres en el medio. Los equivalentes de reduccin (hidrgeno) se extraen de los sustratos en el ciclo de Kebs, oxidacin de cidos grasos o indirectamente de la gluclisis y se dirigen secuencialmente, de acuerdo con su potencial redox, a los diferentes eslabones de la cadena respiratoria.

Coenzimas de oxidorreduccin Algunas deshidrogenasas poseen como coenzimas a derivados de la vitamina nicotinamida, como por ejemplo el nicotinamida adenina nucletido (NAD+). Coenzima de deshidrogenasas es el NADP-, cuya estructura es muy parecida al NAD+ con un fosfato ms en la ribosa adenlica. Muchas deshidrogenasas utilizan coenzimas de la vitamina B2 (riboflavina) como son el flavn mononucletido (FMN) y el flavnadenin-dinuclotido (FAD). La coenzima Q (CoQ), tambin llamada ubiquinona por su estructura qumica y ubicuidad, no pertenece al grupo de los dinucletidos, tiene una estructura isoprenoide muy semejante a las vitaminas K y E. La CoQ sirve como transportador mvil, que opera con deshidrogenasas ligadas a flavina como la NADH deshidrogenasas. La coenzima Q es el nico eslabn de la cadena respiratoria no unido a protenas. Debido a su carcter hidrofbico (estructura isoprenoide) se puede alojar en la zona hidrofbica de la bicapa lipdica de la

Los equivalentes de reduccin se introducen en la cadena respiratoria a nivel del NAD+ o CoQ a partir de las reacciones de las deshidrogenasas ligadas a NAD+ o FAD. Este sistema de transporte est dispuesto de tal manera que los miembros reducidos de los pares redox se oxidan por el miembro oxidado del siguiente componente del sistema (Fig. 1.40).
Fig. 1.40. Transporte de hidrgeno

Donadores de hidrgenos Los equivalentes reducidos (hidrgenos) provenientes de sustratos del ciclo de Krebs, -oxidacin y otras vas metablicas son catalizados por deshidrogenasas especificas y llegan a la cadena transportadora de hidrgenos a diferentes niveles. CITOCROMOS Paralelamente al descubrimiento de las deshidrogenasas por Thunberg, Warburg descubre que el cianuro, sustancia a la que son insensibles las deshidrogenasas, inhibe la respiracin a bajas concentraciones. A la

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enzima por cianuro, Warburg la denomina antirespiratoria. Los citocromos con Fe de las hemoprotenas que contienen hierro, a diferencia del grupo hemo de la hemoglobina en la que el hierro del hemo permanece en estado ferroso (Fe++), el hierro del grupo hemo de los citocromos est alternadamente oxidado (Fe3+) o reducido (Fe2+) en la transferencia de electrones hacia el aceptor ms vido de ellos, el oxgeno. Los citocromos de las mitocondrias se designaron como a, b y c, tomando como base la banda a de su espectro de absorcin y al tipo de grupo hemo. Transporte de electrones En las reacciones de transferencia del NADH a la coenzima Q se transportan dos hidrgenos (dos protones y dos electrones). Al llegar a la CoQH2, se continan transportando dos electrones por los citocromos, pero un par de protones (H+) se liberan al espacio intermembrananoso, el cual se acidifica. El transporte de electrones, se inicia al ser captados por el citocromo b; el hierro del grupo hemo oxidado (Fe3+), al aceptar un electrn (e-) se transforma en hierro reducido (Fe2+). Nivel de energa de las reacciones Durante la transferencia de hidrgenos y electrones desde el par NADH/NAD+ a la molcula de oxigeno se produce un descenso de potencial redox de 1.14V que, de acuerdo con la ecuacin de Nerst, produce un cambio de energa libre de 52.6 Kcal por mol. Esta cada de potencial tiene lugar en etapas a medida que los hidrgenos o electrones pasan por los distintos eslabones de la cadena. En todas las reacciones de la cadena se produce liberacin de energa, pero slo en tres de ellas existe un sistema fosforilante acoplado que permite la sntesis de ATP; el resto de la energa liberada en las otras reacciones se pierde en forma de calor (energa no til) que, sin embargo, mantiene la temperatura corporal de los organismos homeotrmicos (mamferos) en forma casi constante (36.5C).

Ultimo aceptor de electrones: oxgeno El oxgeno es uno de los elementos de mayor electronegatividad en la tabla peridica. Esto significa que es el elemento ms vido de electrones, y en la cadena transportadora de electrones mitocondrial determina el flujo electrnico. Finalmente llegan al oxgeno dos electrones que completarn su orbital con ocho, pero lo dejan con carga elctrica negativa. O2 + 2e O2

Los dos protones (hidrogeniones, H+) producidos al ceder a CoQH2 los dos electrones de cada hidrgeno al cit b, son captados por el oxgeno inico ( O 2 ) y forma una molcula de agua: O 2 2 + 2H+ H2O

La importancia que tiene el oxigeno como agente que determina el flujo de electrones y con ello la liberacin de energa para formar ATP, se demuestra cuando un tejido sufre la falta de oxgeno (hipoxia tisular) como en el infarto de miocardio, o cuando un tejido como el msculo esqueltico demanda mayores cantidades de oxgeno durante el ejercicio intenso. El O 2 (radical superxido) es un producto aberrante de la cadena respiratoria. El 5% del O2 se transforma en O 2 , porcentaje que aumenta con la edad.
Superxido

2 O 2 + 2H+ dismutasa H2O2 + O2 La enzima superxido dismutasa, que transforma el radical superxido en H2O2, se encuentra en las mitocondrias de todas las clulas aerobias. La catalasa, que degrada posteriormente el perxido de hidrgeno (H2O2) en H2O y O2, constituye 40% de las protenas de los peroxisomas. Los nios pretrmino o prematuros no tienen an desarrolladas las superxido dismutasas (metaloenzimas que contienen Se) y cuando son tratados con concentraciones excesivamente altas de oxgeno puro (que

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produce O 2 ) pueden presentar una retinopata bilateral, caracterizado por dilatacin, proliferacin y tortuosidad vasculares, edema y desprendimiento de retina, microftalmia y en ocasiones ceguera. Oxidacin extramitocondrial Existe otro tipo de transporte electrnico que se encuentra en el sistema retculo endoplsmico o en la fraccin microsomal del hgado, si como en tejido esteroidognico como la corteza suprarrenal, testculo, ovario y placenta. Este sistema de transporte electrnico utiliza NADPH+ como fuente de equivalentes de reduccin y un citocromo exclusivo de este sistema que no se encuentra en la mitocondria, el citocromo P450, llamado as porque la forma reducida tiene una banda de absorcin a 450 nm, y es til por ejemplo en la oxidacin extramitocondrial de medicamentos
Medicamento-H + O2 + cit P450 Fe++ + NADPH

Lipmann introdujo el concepto de enlace de alta energa ( ) y de enlace fosfato de alta energa ( P) y con ello se apreci con claridad el papel de estos compuestos en bioenergtica. De hecho, la conservacin y transferencia de la energa celular se lleva a cabo gracias a la transferencia de grupos fosfatos. Los compuestos ms ricos en energa ceden su energa al ADP y lo transforman en ATP, el cual a su vez la distribuye donde la requieren las necesidades celulares. Por consiguiente, el ATP es la figura central en el sistema de transferencia de energa en la clula, y con toda razn se le considera la moneda energtica celular. Esto se ilustra en la Tabla 1.6, donde el ATP ocupa una posicin intermedia entre los fosfatos y otros compuestos con alta energa y los fosfatos de baja energa.
Tabla 1.6. Energa libre estndar de hidrlisis de algunos compuestos ricos en energa - F - F Compuesto (Kcal/mol) (KJ/mol) Fosfoenolpiravato Carbamil fosfato 14.8 12.3 11.8 10.3 10.0 7.7 7.3 6.0 5.0 3.8 3.4 3.3 2.2 61.9 51.4 49.3 43.1 41.8 32.2 30.5 25.1 20.9 15.9 14.2 13.8 9.2

Medicamento-OH + H2O + cit P450 Fe+++ + NADP+

1,3-bisfosfoglicerato Fosfocreatina

Esta cadena de transporte electrnica no es fosforilante puesto que no se sintetiza ATP. El fin de este sistema es la hidroxilacin de ciertos metabolitos o frmacos (como fenobarbifal, aminopirina, morfina y otros) esteroides o esteroles, cidos grasos, hidrocarburos policclicos y algunos aminocidos. Este sistema permite la hidroxilacin del colecalciferol (vitamina D3) a las formas activas 24,25 dihidroxicolecalciterol y 1,25 dihidroxicolecalci-ferol. FOSFORILACION OXIDATIVA (FORMACIN DE ATP) Se ha mencionado anteriormente, que la energa contenida en los equivalentes de reduccin (hidrogenes) ha sido liberada para ser finalmente almacenada en forma de compuestos ricos en energa. Estos compuestos son las sustancias clave del metabolismo energtico celular.

S-adenosil-metionina Acil-CoA ATP Pirofosfato Glucosa-1-fosfato Fructosa-6-fosfato AMP Glucosa-6-fosfato Glicerol-3-fosfato

La clula cuenta con dos mecanismos generadores de ATP que son: a) a partir de compuestos con un contenido de energa mayor que el ATP, denominado fosforilacin a nivel del sustrato y b) la fosforilacin oxidativa acoplada a la cadena respiratoria.

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A NIVEL DE SUSTRATO Intermediarios ricos en energa de la ruta glucoltica como el 1,3-difosfoglicerato (1,3DPG) y el fosfoenolpiruvato (PEP) pueden transferir su fosfato de alta energa al ADP en reacciones catalizadas por la fosfogliceratocinasa y piruvatocinasa, respectivamente. Los F de estas dos reacciones son -11.8 y -14.8 Kcal/mol, respectivamente, y. por tanto, la transferencia del fosfato es termodinmicamente posible y da como resultado la sntesis de ATP. Sustancias como la fosfocreatina y fosfoarginina (llamadas tradicionalmente fosfgenos) sirven como almacn de energa en el msculo. En condiciones fisiolgicas, la reaccin de la creatinfosfocinasa permite que las concentraciones de ATP se mantengan constantes en el msculo, aunque se utilice en forma continua. En el ciclo de Krebs se lleva a cabo una reaccin catalizada por la succinatotiocinasa, en la que se forma a nivel de sustrato un ATP a partir de GTP. En esta reaccin el compuesto de alta energa no es un fosfato sino un derivado de la coenzima A, succinilCoA. Por fosforilacin oxidativa se entiende la fosforilacin del ADP para dar ATP utilizando la energa liberada en la oxidacin de las coenzimas de la cadena respiratoria. Los sitios de fosforilacin son aquellos lugares de la cadena respiratoria, donde el F es suficiente para permitir la sntesis de ATP acoplada al transporte electrnico. Las ferroprotenas no hmicas pertenecientes a las ferrosulfoprotenas: unas estn asociadas a la NADH deshidrogenasa, otras a la succinato deshidrogenasa y, finalmente, a los citocromos b y c. La importancia de las ferrosulfoprotenas en la cadena respiratoria se debe a que coinciden con los sitios de fosforilacin I y II. Tambin se han descubierto dos especies diferentes de citocromo (b y c que difieren en su potencial redox. Para comprender ms acerca del comportamiento de la fosforilacin oxidativa con la cadena respiratoria es necesario

conocer la disposicin espacial de los componentes de la cadena (Fig. 1.41)

Fig. 1.41. Complejos de Green (I, III y IV) de la cadena respiratoria. FeS = ferrosulfoprotenas

En la figura se ilustran los complejos formados por coenzimas de oxidorreduccin y citocromos denominados complejos de Green. Se muestran tambin los sitios donde se encuentra acoplada la fosforilacin con los complejos de la cadena. La razn fsforo/oxgeno indica las molculas de ATP sintetizadas por tomo de oxgeno consumido. En este sentido, la razn fsforo/oxigeno es igual a tres para el caso de los sustratos que utilizan NAD+ a dos para el caso de los sustratos FAD y a uno para el caso del ascorbato. As, tenemos que los sitios de fosforilacin estn situados como sigue:
Sitio 1: Entre la flavoprotena 1 (FMN) y la CoQ Sitio 2: Entre el cit b y el cit c 1 Sitio 3: Entre el cit a.a3 y el oxgeno

La membrana interna posee numerosas estructuras esfricas orientados hacia el interior, unidas a la membrana por un pedculo. Estas estructuras, se denominaron en un principio partculas elementales y hoy, ms comnmente unidades

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fosforilantes, esferas o partculas mitocondriales. Se ha establecido que estas partculas estn relacionadas con los sitios de fosforilacin (Fig. 1.42)

de las cargas positivas y negativas en los diferentes compartimientos, se puede establecer un gradiente electroqumico de protones a travs de la membrana mitocondrial interna durante el transporte electrnico. Los postulados de la teora quimiosmtica de Mitchell (Fig. 1.42), son los siguientes: 1. La membrana mitocondrial interna es impermeable a los protones. 2. La cadena respiratoria est situada asimtricamente en la estructura de la membrana, lo que favorece la expulsin de protones. 3. La sntesis de ATP se realiza en las partculas submitocondriales que funcionan como una ATP sintetasa (ATPasa). Es tas partculas estn dispuestas asimtricamente y se activan por el retorno de protones al interior de la mitocondria del espacio intermembrananoso. 4. Existencia de un sistema de difusin (probablemente H+/K+) que tiene por objeto disipar el gradiente de pH, sin eliminar el potencial de membrana.

Fig. 1.42. Partculas mitocondriales

elementales

esferas

Al conjunto acoplado que se encuentra dispuesto en un orden funcional dentro de la membrana interna se le conoce como unidad respiratoria. Es conveniente conservar en mente este esquema que permite explicar algunas de las teoras propuestas para la fosforilacin. Hasta el momento se han enunciado tres hiptesis que intentan explicar cmo la energa originada en el transporte de equivalentes reducidos y electrones puede ser traducida en energa utilizable en forma de ATP. Estas hiptesis son las siguientes: Hiptesis qumica. (Slater, l953). Postula Slater que la fosforilacin se lleva a cabo de una manera similar a la que ocurre a nivel del sustrato en la gluclisis. Esta teora postula la existencia de un intermediario qumico muy inestable con un potencial energtico que actuara como intermediario entre la cadena respiratoria y la sntesis de ATP. Teora quimiosmtica. Esta hiptesis, propuesta originalmente por Peter Mitchell en 1961 y modificada por l mismo en 1981 y luego por Lehninger (1984) es actualmente la ms aceptada y la que tiene ms apoyo experimental. La hiptesis del acoplamiento quimiosmtico de Mitchell compara los sistemas generadores de energa de la membrana mitocondrial con una batera electroqumica comn; de la misma manera que la energa se puede almacenar en bateras debido a la separacin

Fig. 1.42. Hiptesis del acoplamiento quimiosmtico

Segn la hiptesis de Mitchell, no existen sitios de fosforilacin propiamente dichos, sino que la sntesis de ATP tiene lugar siempre que exista un gradiente protnico (fuerza protomotriz).

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La hiptesis ha recibido gran apoyo experimental: 1. La adicin de protones (cido) al medio externo de las mitocondrias conduce a la generacin de ATP. 2. La cadena respiratoria contiene sus componentes organizados lateralmente (asimetra transversal) como los requiere la teora. 3. El cociente fsforo/hidrogenin de la ATPasa (ATP sintetasa ms propiamente) es 1:2, y los cocientes hidrgeno/oxigeno para la oxidacin del succinato y del hdroxibutirato son 4 y 6, respectivamente, en concordancia con las proporciones fsforo/oxigeno esperadas de 2 y 3.

membrana mitocondrial que acta como canal protnico. Entre ambas porciones y la membrana se encuentra un factor (F que recibe el nombre de OSCP (oligomycinsensitivityconferingprotein), imprescindible para la accin de la oligomicina, y que es un verdadero cancerbero protnico, puesto que de ste depende el transporte de protones (Fig. 1.43).

En resumen, de acuerdo a la Teora Quimiosmtica de Mitchell, la energa potencial acumulada como un gradiente de protones, denominada Fuerza Protomotriz ,y dado que la membrana es bsicamente impermeable a los protones, el gradiente se mantiene por una constante reentrada de los mismos, y considerando que la ATP sintetasa contiene el nico canal para la entrada del protn, se produce la siguiente reaccin: ADP + Pi > ATP, que acoplada a la formacin de agua se le llama Fosforilacin Oxidativa, pero para que ello ocurra debe acoplarse a la reaccin en la cual se forma el agua, porque de lo contrario dado los G sera imposible que esta reaccin se realice 2H + 2 e- + O2 H2O G o = -56.7 kcal/mol (reaccin exergnica) ADP + Pi ATP + H2O G o = + 7.3 kcal/mol (reaccin endergnica) Por otra parte, gran parte de los conocimientos actuales sobre la ATPasa (ATP sintetasa) se deben al grupo de Racker. La fraccin purificada de ATPasa est constituida por esferas de unos 90 procedentes de las unidades fosforilantes. Consta de una porcin hidrosoluble denominada F (subunidades 3 3 ) que contiene el centro activo y una porcin hidrofbica denominada F enterrada en la

Fig. 1.43 Estructura del ATP sintetasa mitocondrial

Formacin de productos de reduccin parcial del oxgeno

La etapa final de la cadena respiratoria es la reduccin de una molcula de oxgeno por la cesin de cuatro electrones (O2-)2. El problema de la convergencia simultnea de cuatro electrones a este punto terminal es de gran importancia, pues si la reduccin del oxgeno no es completa se forman productos txicos, con accin deletrea sobre molculas constituyentes de las clulas. Esos productos txicos son el perxido de hidrgeno (H2O2) y los radicales libres superxido (O2-) e hidroxilo (OH-). El perxido de hidrgeno y el anin superxido se forman en reacciones que normalmente ocurren en el organismo. El anin superxido es el resultado de la reduccin incompleta del oxgeno (una molcula de O2 adquiere un electrn); los radicales hidroxilo se generan por interaccin del perxido de hidrgeno con el anin superxido: H2O2 + O2O2 + OH- + HO-

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Los radicales hidroxilo son mucho ms reactivos que el perxido de hidrgeno y el anin superxido y, por lo tanto, son ms txicos. Se cree que la toxicidad de O2 y el H2O2 se debe a su capacidad de generar radicales hidroxilo. Los efectos nocivos de estos radicales se ejercen sobre diferentes componentes de las clulas, como ADN, protenas, lpidos y diversas enzimas: Producen ruptura de ADN y modificaciones qumicas de sus bases nitrogenadas Oxidan grupos sulfhidrilos de protenas (se forman enlaces S-S), alterando la estructura de la molcula Atacan cidos grasos insaturados de lpidos componentes de membranas (formacin de perxidos). Todo esto causa, adems de cambios conformacionales, disminucin de la hidrofobicidad de las cadenas hidrocarbonadas y desestabiliza las membranas celulares. Por otra parte, los hidroperxidos formados actan como inhibidores de ciertas enzimas. El pulmn y el cerebro son particularmente sensibles a estos agentes oxidantes. Respirar concentraciones elevadas de oxgeno durante un tiempo prolongado favorece la formacin de H2O2, O2 y OH- y causa alteraciones a veces muy graves en el sistema nervioso y el pulmn. La accin bactericida de los fagotitos (leucocitos, neutrfilos, eosinfilos, monocitos y macrfagos) es en parte dependiente de la produccin de anin superxido y perxido de hidrgeno en las vacuolas fagocticas. Distintos grmenes y otros agentes extraos pueden desencadenar una respuesta inflamatoria en el organismo atacado, que moviliza fagotitos hacia el lugar de la injuria. A veces, la exagerada produccin de radicales libres en el lugar de la inflamacin puede afectar clulas del propio individuo. En procesos inflamatorios, algunos de causa autoinmune, los radicales libres son la causa de dao tisular. Estos agentes tambin han sido implicados como factor de envejecimiento.

Dada la toxicidad del perxido de hidrgeno y de los radicales superxido e hidroxilo, el organismo dispone de mecanismos eficaces de proteccin. En condiciones normales, a las tensiones de O2 del aire atmosfrico, las concentraciones de estos agentes txicos se mantienen en niveles muy bajos. Los principales medios de defensa son: a) Los aniones superxido son eliminados en una reaccin catalizada por una enzima extraordinariamente activa, distribuida en todos los tejidos, la superxido dismutasa. En la reaccin participan dos aniones superxido y dos protones: O2- + O2- + 2H+ H2O2 + O2

La cesin de un electrn de un anin superxido a otro corresponde a las llamadas reacciones de disimulacin. Se forma perxido de hidrgeno, que tambin es un producto txico y debe ser eliminado. La superxido dismutasa presenta dos isozimas; una de ellas contiene Zn y Cu y se encuentra en citosol; la otra Mn y se localiza en mitocondrias del hgado. b) La descomposicin del perxido de hidrgeno es catalizada por la catalasa, hemoprotena existente en casi todas las clulas, particularmente en el hgado, rin, mdula y glbulos rojos. Tiene gran actividad y cataliza la reaccin. 2H2O2 2H2O + O2

La catalasa se encuentra en los peroxisomas, pequeas organelas que, adems de catalasa, contienen oxidasas productoras de perxido de hidrgeno. Se han descrito casos de personas con muy baja actividad de catalasa en sus tejidos; se trata de un defecto gentico llamado acatalasemia. Curiosamente, esta deficiencia no produce trastornos importantes. Es probable que otras enzimas compensen la falta de catalasa. c) Existe una enzima. Llamada glutatin peroxidasa, que cataliza la reduccin de hidroperxidos orgnicos y de perxido de hidrgeno en reacciones en las que participa el glutatin (GSH):

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ROOH + 2GSH H2O2 + 2GSH

GSSG + ROH + H2O GSSG + 2H2O

La glutatin peroxidasa est localizada en el citosol y las mitocondrias, pero no en los peroxisomas. Esta enzima ayuda a mantener muy baja la concentracin de perxido de hidrgeno en los tejidos: convierte cidos grasos perxidos en derivados hidroxilados y tambin puede revertir la oxidacin de grupos sulfhidrilos. El glutatin oxidado es reducido por accin de la glutatin reductasa, enzima que utiliza NADPH como dador de equivalentes de reduccin: GSSG + NADPH + H+ GSH + NADP+

de Sen la lista y c aceptor de energa proveniente de los que estn por encima. As, un ciclo ATP/ADP conecta estos procesos que generan a las reacciones que la utilizan (Fig. 1.44).

Existen otras peroxidasas que contribuyen a la eliminacin de perxido de hidrgeno. Son hemoprotenas muy comunes en vegetales que tambin se encuentran en los leucocitos y en la leche. Catalizan la reaccin: H2O2 + AH2 2H2O + A AH2 representa a distintos sustratos donantes de hidrgenos que pueden ser utilizados por la peroxidasas. En el caso de la glutatin peroxidasa, los H son provistos por el glutatin reducido. La enzima de granulocitos neutrfilos puede emplear NADPH como dador de hidrgeno. d) Una importante funcin protectora in vivo contra los radicales libres es ejercida por compuestos naturales como el tocoferol o vitamina E, los -carotenos o provitaminas A y el cido ascrbico o vitamina C; son provistos por la alimentacin normal y ejercen accin antioxidante. En el plasma sanguneo, los principales agentes antioxidantes son la bilirrubina, pigmento derivado del hemo, y los uratos, producto de la degradacin de bases pricas. Utilizacin de ATP Como consecuencia de la posicin intermedia del ATP, ste puede actuar como donador de fosfato a los compuestos que estn por debajo

Fig. 1.44. Relacin entre la produccin la utilizacin de energa.

INHIBIDORES Y DESACOPLANTES Gran parte de los conocimientos que se tienen sobre la cadena respiratoria han sido obtenidos por el uso de inhibidores. Los inhibidores son compuestos qumicos capaces de inhibir especficamente el flujo electrnico en tres puntos diferentes de la cadena (Fig. 45). El primero de ellos es inhibido por barbitricos como el amital el veneno rotenona y antibitico piercidina. El segundo sitio entre el citocromo b y el c, es inhibido por el dimercaptopropanol (dimercaprol o BAL). EL antibitico antimicina A inhibe la reaccin entre la coenzima Q y el citocromo b. los venenos clsicos, cianuro (CN), monxido de carbono (CO), cido sulfhdrico (H2S) y cido hidrazoico (HN3) inhiben a la citocromo oxidasa (cit aa3). Segn el teorema de Chance, en presencia de un inhibidor los intermediarios de la cadena situados por encima (en electronegatividad) del punto de inhibicin estarn muy reducidos, mientras que los situados debajo del punto de bloqueo aparecern muy oxidados.

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Fig. 1.45. Sitios de inhibicin en la cadena respiratoria

Otro grupo de compuestos llamados desacoplantes o desacopladores impiden la sntesis de ATP pero permiten el flujo de electrones por la cadena respiratoria. En efecto, existen sustancias naturales, tales como el dicumarol y las hormonas tiroideas, y algunos sintticos como el dinitrofenol (DNP) capaces de desacoplar (desconectar) la respiracin de la fosforilacin. La adicin de estas sustancias a una suspensin mitocondrial provoca un marcado aumento del consumo de oxgeno, sin que exista sntesis de ATP. El efecto desacoplante de la tiroxina ha permitido explicar, por un lado, el efecto de esta hormona sobre el metabolismo basal en el hipertiroidismo y, por otro, su uso, al igual que el dinitrofenol, en el tratamiento de la obesidad. El antibitico oligomicina bloquea completamente la oxidacin y la fosforilacin en mitocondrias intactas. Acta unindose al tallo de la ATPasa, lo que provoca el cierre del canal y por ende, el flujo de protones y la sntesis de ATP. Sin embargo, en presencia de dinitrofenol, la oxidacin procede sin fosforilacin, indicando que la oligomicina no acta en la cadena respiratoria, sino a travs de su unin con la protena OSCP. Intoxicacin por cianuro La ingestin de cianuro de potasio (KCN) produce una rpida inhibicin de la cadena respiratoria a nivel de la citocromo oxidasa. El cianuro se fija al Fe3+ del hemo del cit aa3 e impide que el oxgeno reaccione con ste. Cesan la respiracin mitocondrial y la generacin de energa (ATP) y se produce la muerte rpida por hipoxia tisular, muy especialmente en el sistema nervioso.

El monxido de carbono (CO) e un gas incoloro e inodoro, con gran afinidad por la hemoglobina (200-300 veces ms que el oxgeno) y por el cit a3. Los efectos serios se presentan a dosis bajas de monxido (0.02% a 0.03%) cuando 40% de la hemoglobina se ha transformado en carboxihemoglobina (COHb). Este gas se produce en la combustin incompleta de los hidrocarburos como en la inspiracin del escape de un vehculo de gasolina o un calentador de lea o carbn en espacios cerrados. Los sntomas de intoxicacin incluyen alteraciones visuales, cefalea, taquicardia, taquipnea y finalmente coma y muerte. La piel muestra coloracin rojo cereza, sobra todo en los labios por COHb.

REGULACIN DE LA RESPIRACION CELULAR La proximidad intracelular fsica y funcional del ciclo del cido ctrico y la cadena respiratoria determinan que la actividad de uno dependa de la otra y viceversa, A su vez, ambas vas metablicas estn reguladas por las concentraciones relativas de ATP/ADP y NADH/NAD+. El rendimiento del ciclo corresponde al nmero de equivalentes reducidos y al ATP formado:
3 NADH x 3 ATP (fosforilacin oxidativa) = 9 ATP 1 FADH x 2 ATP (fosforilacin oxidativa) = 2 ATP 1 GTP x 1 ATP (nivel del sustrato) = 1 ATP Total = 12 ATP

A esta cantidad habra que agregar 3 ATP ms en caso de considerar la formacin de acetil-CoA, a partir de piruvato donde se forma 1 NADH intramitocondrial. Es evidente que la acumulacin excesiva de compuestos de alta energa (ATP y NADH) inhiban ciertas reacciones del ciclo, y la acumulacin de ADP y NAD determinan la estimulacin de ciertas enzimas. De modo general, el ciclo no puede funcionar ms rpidamente que o que le permite la utilizacin del ATP generado. Efecto de la concentracin de ATP/ADP La regulacin del ciclo ocurre a nivel de algunas enzimas. Por ejemplo, la isocitrato

Intoxicacin por monxido de carbono

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deshidrogenasa es activada por ADP e inhibida por ATP, y la KM de la citrato sintetasa para la acetil-CoA es aumentada por el ATP. Adems, el ATP y las acil-CoA de cadena larga son inhibidores alostricos de la citrato sintetasa. En resumen, un aumento de la relacin ATP/ADP inhibe la actividad del ciclo de Krebs. En la cadena respiratoria, la fosforilacin del ADP es tambin dependiente de esa relacin. Control a nivel de la relacin NAD+/NADH Una disminucin de la cadena respiratoria disminuye la regeneracin de NAD, lo que inhibe las reacciones de la isocitrato deshidrogenasa, -cetoglutarato deshidrogenasa, al acumularse la coenzima NADH reducida comn a estas deshidrogenasas. La activacin alostrica de la isocitrato deshidrogenasa mitocondrial por el ADP es contrarrestada por el NADH y el ATP. La succinato deshidrogenasa es inhibida por el oxalacetato, y la disponibilidad de oxalacetato es controlada por la malato deshidrogenasa y, en ltima instancia, por el cociente NAD+/NADH.

Se han encontrado dos tipos de regulacin del complejo de la piruvato deshidrogenasa. El primero se realiza por inhibicin competitiva por parte de la acetil-CoA y el NADH; de esta manera, cuando el aporte de acetil-CoA es suficiente a expensas de los cidos grasos, la enzima es inhibida, evitando as el desperdicio innecesario de piruvato derivado de la glucosa. El segundo tipo de regulacin se lleva a cabo por la existencia de dos formas interconvertibles de la piruvato deshidrogenasa: una fosforilada, o forma inactiva, y la otra desfosforilada, la forma activa. La existencia de una u otra es catalizada por dos enzimas: la piruvato deshidrogenasa cinasa, que requiere ATP, y la piruvato deshidrogenasa fosfatasa. De hecho, ambas enzimas forman parte del complejo, asociadas a la dihidrolipoil transacetilasa (Fig. 1.46). La principal funcin reguladora es ejercida por la cinasa, que al fosforilar a piruvato deshidrogenasa con hidrlisis de ATP la convierte en su forma inactiva: esto ocurre cuando hay exceso de ATP en la clula. Cabe destacar el papel estimulador que ejercen sobre la cinasa la acetil-CoA y el NADH, y el papel inhibidor del piruvato y el ADP. Por el contrario, si baja el ATP celular, la fosfatasa remueve un fosfato a la piruvato deshidrogenasa y la reactiva. La fosfatasa es inhibida por exceso de NADH: esta inhibicin es revertida por el NAD+. La actividad del complejo piruvato deshidrogenasa tambin es regulada por algunas hormonas. Entre ellas, cabe destacar la insulina, que incrementa la forma activa (desfosforilada) en tejido adiposo; las catecolaminas como la adrenalina pueden activar la piruvato deshidrogenasa en el tejido cardiaco. Estos efectos hormonales no estn mediados por cambios en los niveles de AMPc tisulares ya que la cinasa y la fosfatasa son insensibles a ste (Fig. 1.47). Nios con deficiencia de algunas de las subunidades reguladoras del complejo piruvato deshidrogenasa presentan en suero cifras elevadas de piruvato y alanina, lo cual les causa acidosis lctica crnica. Estos nios muestran, adems, graves trastornos

Control a nivel deshidrogenasa

de

la

piruvato

El piruvato ocupa una posicin clave en el metabolismo, ya que puede ser reconvertido en glucosa, reducido a lactato, transaminado para formar alanina, o finalmente ser descarboxilado oxidativamente hasta acetilCoA. Es, por lo tanto, importante el control de su metabolismo a nivel de esta enzima, la piruvato deshidrogenasa, que determina su entrada al ciclo. La mayor parte del piruvato se oxida a acetilCoA, pero una cierta cantidad se convierte en oxalacetato (proceso anaplertico), permitiendo que la acetil-CoA se combine con este ltimo para que el ciclo de Krebs funcione adecuadamente. As, la acetil-CoA proveniente de los cidos grasos o de ciertos aminocidos (cetognicos), no puede entrar al ciclo a menos que est ya presente el oxalacetato proveniente de la carboxilacin del piruvato.

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neurolgicos como ataxia (de Friedrich) y convulsiones, que en la mayora de los casos pueden conducir a un desenlace fatal. El tratamiento consiste en dar una dieta alta en lpidos y megadosis de tiamina.

Fig.

1.46. Reaccin del complejo piruvato deshidrogenasa. E1 = piruvato deshidrogenasa; E2 = dihidrolipoato acetiltransferasa: E3 = dihidrolipoato deshidrogenasa. Se indica en negritas el destino de los carbonos del piruvato en acetil-CoA.

Fig. 1.47. Regulacin hormonal, alostrica y por producto de la piruvato deshidrogenasa PDH. La actividad cinasa fosfatasa forman parte del complejo PDH.

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ENZIMOLOGIA Y BIOENERGETICA CASOS CLNICOS CON APLICACIN BIOQUMICA CASO CLINICO 1 Paciente varn de 45 aos, bebedor de diversos licores desde los 20 aos a consecuencia de una decepcin amorosa. Manifiesta que desde hace unos dos meses presenta dolor tipo ardor en el epigrastrio, pero cada vez que l ingiere alimentos su dolor disminuye. Hace un da acudi a una fiesta familiar donde ingiri abundante comida y alcohol, intensificndose su dolor a nivel de epigastrio y mesogastrio con irradiacin hacia la espalda, y mostr vmitos biliosos por lo que es conducido al hospital Los exmenes de laboratorio revelaron leucocitosis, hiperglicemia, amilasa srica de 650 U/L y la lipasa srica en 110 U/L. Cuestrionario

de hipoxia neonatal prolongada con cianosis. Las niveles de biotina en plasma se encontraron en el lmite inferior de lo normal (261.5 pg/ml; normal 500200). Nunca ha tenido manifestaciones clnicas ni qumicas de acidosis metablica ni cetosis. Estudios metablicos demostraron elevacin anormal, en plasma y orina, de alanina y cidos pirvico y lctico. Las anormalidades bioqumicas se corrigieron con dosis altas de biotina, pero no de tiamina. Cuestionario: 1. Explique bioquimicamente los signos y sntomas principales 2. De qu deficiencia enzimtica se trata? 3. Cmo explicara las convulsiones observadas en este caso? 4. A qu atribuira el dao neurolgico?

CASO CLINICO 3:. Un recin nacido naci a trmino despus de una gestacin y un parto normales. A los dos meses de edad fue trasladado al hospital porque no ganaba peso y era hipotnico. Una muestra de sangre revel que el lactato sanguneo, el piruvato y la alanina estaban muy elevados, Se intent tratamiento con tiamina, lo cual redujo el valor de lactato en el plasma. Sin embargo, a los cinco meses de edad se increment el lactato, por lo que tuvo que aumentarse la dosis de tiamina. El complejo PDH de los extractos de clulas linfoblastoides tena una actividad muy reducida y mostraba afinidad por el TPP (pirofosfato de tiamina). Cuestionario 1. Explique bioquimicamente los signos y sntomas principales determinados 2. Esquematice las vias metablicas involucradas en el caso, explicitando sus enzimas y formas de regulacin 3. Explique la importancia de la PDH para la obtencin de energa 4. Relacione el caso con el ciclo de Krebs, cadena respiratoria y fosforilacin oxidativa
Caso adaptado de Bioqumica: casos y texto, de Montgomery, Conway, Spector y Chappell, 6 edicin, Harcourt Brace editores. 1998 p. 167

1. Explique la importancia de las enzimas en el metabolismo 2. Explique las funciones de la amilasa y la lipasa sricas, y su importancia mdica 3. Defina isozimas y determine la importancia que tendra para este paciente que se pudieran determinar las isozimas de la amilasa y la lipasa sricas. 4. Analize la probable relacin entre la ingesta de alcohol y los signos y sntomas observados.

CLINICO N 2 Paciente femenino de 4 aos de edad con retraso somtico y psicomotor profundo con problemas de deglucin, tetraparesia espstica, convulsiones tnicas con frecuencia de varias crisis al da y atrofia cortical y subcortical (microcefalial). Hay antecedentes

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