3.

Morfologa Colonial y Microscpica de los Microorganismos

M. en C. Sandra Ruiloba de Len y Frescas

Departamento de Microbiologa Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas, IPN

3. Morfologa Colonial y Microscpica de los Microorganismos

El desarrollo de colonias sobre superficies slidas permite al microbilogo identificar las bacterias a partir de una poblacin mixta porque las especies forman a menudo colonias caractersticas. En general, el crecimiento celular ms rpido se produce en el extremo de la colonia siendo ms lento en el centro. Esto se debe a gradientes de oxgeno, nutrientes y productos de desecho txicos dentro de la colonia. En el extremo de sta, el oxgeno y los nutrientes son abundantes. El centro de la colonia es, evidentemente ms grueso y por ello el oxgeno y los nutrientes no se difunden tan fcilmente

3.1 Caractersticas coloniales de algunos grupos de bacterias: Colonia Microbiana

Una colonia microbiana est constituida por individuos de la misma especie provenientes de una clula o de un grupo de ellas. Por definicin un buen aislamiento en placa es aquel que nos da colonias aisladas, con una distancia que permita distinguir y describir la morfologa colonial

Descripcin de la Morfologa Colonial

1. Tamao en milmetros 2. Color 3. Forma: puntiforme, circular o irregular 4. Bordes: enteros o irregulares (lbulos, filamentos, aserrados, enrollados etc.) 5. Elevacin: plana o elevada (convexa, pulvinada, umbonada, crateriforme o umbilicada) 6. Superficie: lisa, rugosa o granular 7. Aspecto: hmedo o seco 8. Luz reflejada: brillante o mate 9. Luz transmitida: transparente, transl-cida u opaca 10. Produccin de pigmento 11. Consistencia: dura o suave (butirosa, mucoide o friable)

Cultivo puro
Con la experiencia en la observacin de cultivos, las caractersticas de morfologa colonial constituyen una gua muy til en el reconocimiento de los principales grupos de microorganismos y tambin permite corroborar la pureza de un cultivo o alertar sobre una posible contaminacin. El cultivo puro permite la caracterizacin e identificacin correcta de un microorganismo capaz de causar una infeccin en el hombre los animales o las plantas o bien ser usado en la produccin de vacunas, sueros, antibiticos, hormonas, enzimas, colorantes o en productos de inters en la industria alimentaria como vinos, queso, pan, cerveza

Caractersticas coloniales de los Actinomicetos

Son un grupo de bacterias Gram positivas que poseen en su genoma un alto contenido de Guanina Citosina. El nombre proviene de las races griegas actinos proyecciones radiales y mykes hongo. Las colonias de este grupo bacteriano son en general secas, duras, mate, lisas o muy ornamentadas, hundidas en el medio de cultivo e hidrofbicas. Algunas pueden sintetizar pigmentos que son excretados al medio de cultivo.

Colonias de actinomicetos

Colonias de actinomicetos
Colonias de Steptomyces coelicolor. Las colonias de color rojo son productoras de antibitico.

Caractersticas coloniales de los Micoplasmas

La mayora de los procariotes no pueden sobrevivir sin pared celular pero existe un grupo de bacterias, denominadas micoplasmas, que carecen de pared. Los micoplasmas son protoplastos de vida libre que disponen de membranas citoplasmticas muy resistentes (poseen esteroles) o bien viven en medios protegidos osmticamente. Cuando crecen en agar estos microorganismos tienden a incrustarse en el medio y las colonias adoptan un aspecto caracterstico de huevo frito, debido a la formacin de un ncleo central denso, que penetra en el agar, rodeado de un rea circular de dispersin, de color menos intenso.

Colonias de micoplasmas

Caractersticas coloniales de las Mixobacterias

Mixobacterias o Bacterias deslizantes Las mixobacterias son bacterias Gram negativas y aerobias, caracterizadas por tener movilidad por deslizamiento, tener un ciclo vital complejo con produccin de cuerpos fructferos, y formar mixosporas. En presencia de una fuente de alimento, las mixobacterias migran a lo largo de una superficie slida, alimentndose y dejando tras de s un rastro mucoide. Durante esta fase las clulas suelen constituir un grupo, y se mueven de manera coordinada. Algunas especies se congregan para producir una lmina de clulas que se desplaza de forma rtmica y genera ondas. Cuando se agota su aporte de nutrientes, las mixobacterias se renen y se diferencian en un cuerpo
fructfero,

Colonias de Mixobacterias

Bacterias que producen swarming

Algunas bacterias mviles no forman colonias discretas sino que crecen invadiendo toda la caja de Petri. Este tipo de crecimiento llamado swarming es caracterstico de algunos gneros como Proteus. Las clulas en el extremo de la colonia se mueven mas rpidamente que las que estn en el centro, se mueven en masa una corta distancia alejndose de la colonia y luego experimentan una disminucin de la movilidad, se detienen y se dividen. Como resultado la colonia madura tiene aspecto de discos concntricos, con una alternancia de altas y bajas concentraciones de clulas.

Ejemplos de colonias bacterianas

Diversas colonias bacterianas

Colonias de Bacillus

Morfologa colonial de Serratia marcescens

Colonias fluorescentes de Pseudomonas aeruginosa

Microfotografa de colonias bacterianas

3.2 Morfologa Microscpica de las Bacterias

Morfologa celular A la forma de una clula se le denomina morfologa celular. Las bacterias poseen una considerable variedad en su forma, agrupacin y tamao. La mayora de ellas exhiben tres formas generales: cocos, bacilos y espirilas. Si la clula es esfrica se describe como coco pudiendo haber ligeras variaciones. A las clulas cilndricas se les denomina bacilos y se pueden observar con extremos diversos (rectos, curvos, bulbosos, ahusados, bifurcados etc.). Los cocobacilos son bacilos cortos y regordetes. Los bacilos ligeramente curvos son vibrios. Las bacterias que tienen la forma de un cilindro en forma de espiral rgida se llaman espirilas y las que tienen una forma mas flexible y se asemejan a un resorte se denominan espiroquetas. Tambin es posible observar bacterias triangulares, cuadradas, en forma de estrella de David etc.

Esquema de diversas formas y agrupaciones bacterianas

Esquema de diversas morfologas microscpicas

Morfologa microscpica: esquemas y microfotografas

Morfologa microscpica, esquemas y microfotografas

Microfotografas de diversas formas y agrupaciones bacterianas

Observacin microscpica de diversas formas bacterianas

Ejemplos representativos de espiroquetas

Agrupacin de las bacterias

Agrupaciones en los cocos Las bacterias pueden existir como clulas individuales, pero se asocian tambin en agrupaciones caractersticas que son tiles frecuentemente para identificarlas. Los cocos pueden crecer como clulas aisladas o bien agruparse en pares dando lugar a los diplococos (Neisseria). Cuando las clulas permanecen adheridas despus de dividirse en un plano, se forman largas cadenas de cocos llamadas estreptococos; este modelo se observa en los gneros Streptococcus, Enterococcus y Lactococcus. Las bacterias del gnero Staphylococcus se dividen en planos aleatorios para generar agrupaciones irregulares en forma de racimos de uvas llamadas estafilococos. Las divisiones en dos o tres planos pueden producir grupos simtricos de cocos. Los miembros del gnero Micrococcus se dividen a menudo en dos planos para formar grupos cuadrados de cuatro clulas denominados tetradas. En el gnero Sarcina, los cocos se dividen en tres planos, formando paquetes cbicos de ocho clulas denominados precisamente sarcinas.

Agrupaciones en los cocos

Observaciones microscpicas de cocos en pares (diplococos) y cocos en cadena (estreptococos).

Cocos en tetradas

Agrupacin de las bacterias

Agrupaciones en los bacilos
Aunque muchos bacilos aparecen aislados, pueden permanecer juntos despus de dividirse para formar pares constituyendo los diplobacilos o cadenas de distinta longitud llamados estreptobacilos. Algunos se agrupan formando una especie de valla que se describe como empalizada y otros mas toman agrupaciones irregulares conocidas como letras chinas.

Observacin microscpica de algunos bacilos

Observacin microscpica de diversas formas y agrupaciones bacterianas

Morfologa microscpica de diversas bacterias

Morfologa microscpica del actinomiceto Planomonospora sp.

Morfologa microscpica de Escherichia coli

Morfologa microscpica de Staphylococcus aureus

Morfologa microscpica de Mycoplasma pneumoniae

Morfologa microscpica de Helicobacter pylori

Morfologa microscpica de Bacillus anthracis

Morfologa microscpica de Borrelia burgdorferi agente causal de la enfermedad de Lyme

Morfologa microscpica de Campylobacter jejuni

Observacin microscpica de Mycobacterium tuberculosis causante de la tuberculosis

Morfologa microscpica de diversas bacterias fotosintticas

Morfologa microscpica de diversas bacterias metangenas

Morfologa microscpica de Caulobacter

Morfologa microscpica de algunas halobacterias

Morfologa microscpica de Legionella pneumophila causante de la enfermedad de los legionarios

Morfologa microscpica de Leucothrix spp formando agrupacin en rosetas

Morfologa microscpica de Streptococcus pneumoniae

Morfologa microscpica de diversas bacterias deslizantes

Morfologa microscpica de Neisseria gonorrhoeae

Morfologa microscpica de Spirillum spp

Pleomorfismo
Es muy comn que clulas de la misma especie muestren ligeras variaciones en forma y tamao. Este fenmeno se denomina pleomorfismo y se debe a variaciones individuales en la estructura de la pared celular por diferencias nutricionales o hereditarias. Corynebacterium diphteriae es un bacilo pero en cultivo muestra una amplia variacin en su forma observndose curvo, filamentoso, cocoide etc. El pleomorfismo alcanza su punto extremo con los micoplasmas que no poseen pared celular y muestran por lo tanto una gran versatilidad en su forma

Pleomorfismo en Corynebacterium diphteriae

Este gnero exhibe una gran variedad en formas y tamaos. Adems se agrupa de una manera caracterstica llamada empalizada.

Pleomorfismo en los Micoplasmas

Estas bacterias carecen de pared celular lo que les permite una gran plasticidad de forma. La microfotografa corresponde a Mycoplasma pneumoniae observada con un microscopio de barrido a 62000X y coloreada artificialmente por computadora .

Tamao de las bacterias

Las bacterias varan tanto de tamao como de forma. Las ms pequeas, miembros del gnero Mycoplasma miden aproximadamente 0.3 m de dimetro, casi el tamao de los virus mayores (poxvirus). Recientemente se han publicado investigaciones sobre clulas incluso menores. Las nanobacterias o ultramicrobacterias que tienen un dimetro aproximado de entre 0.2 y 0.05 m. Escherichia coli es un bacilo de tamao medio que mide 1.1-1.5 m de ancho por 2-6 m de largo. Algunas bacterias son bastante grandes; ciertas espiroquetas pueden alcanzar a veces una longitud de 500 m. Se ha descubierto una bacteria enorme en el intestino del pez cirujano. Esta bacteria llamada Epulopiscium fishelsoni (80 x 600 m) tiene un tamao mayor que el promedio de las culas eucariticas.

Una bacteria de tamao monstruoso

Esta fotografa realizada con un microscopio de campo oscuro, muestra a Epulopiscium fishelsoni (procariote) en la parte central de la fotografa, empequeeciendo a los paramecios (eucariotes) que aparecen en la parte inferior (x200)

Otro microorganismo gigantesco llamado Thiomargarita namibia

Bibliografa
Black, J.G. 1999. Microbiology Principles and Explorations. 4a. Ed. Prentice Hall, Inc. Madigan M.T., J.M. Martinko y J.Parker. 1999. Brock Biologa de los Microorganismos. 8a Ed. Prentice Hall, Inc. Madigan, M.T., J.M. Martinko y J. Parker. 2000. Brock Biology of Microorganisms. 9a. Ed. Prentice Hall Inc. Prescott L.M., J.P. Harley y D.A. Klein. 1999. Microbiologa. 4a. Ed. McGraw Hill-Interamericana

Caractersticas tintoriales. Tamao, forma, agrupacin y presencia de esporas.

Los microscopios tendran poca utilidad a menos que los especimenes a observar sean preparados adecuadamente. El poder de resolucin y el aumento son cualidades importantes en microscopa, pero igualmente cruciales son el grado de contraste observado entre las estructuras a ser observadas y el entorno, por lo que se han desarrollado tcnicas especiales que acentan las caractersticas morfolgicas de los microorganismos y que permiten conservarlos para su estudio posterior. Aunque los microorganismos vivos se pueden observar directamente con un microscopio ptico, a menudo hay que fijarlos y teirlos para aumentar su visibilidad.

Fijacin
Las clulas teidas que se observan con un microscopio deben parecerse lo mas posible a las clulas vivas. La fijacin es el proceso por el cual se conservan y fijan en su posicin las estructuras externas e internas de las clulas. Inactiva enzimas que podran alterar la morfologa y endurece las estructuras celulares, de manera que no cambien durante la tincin ni la observacin. El proceso de fijacin mata al microorganismo, coagula sus protenas y lo adhiere firmemente al portaobjetos.

Tipos de Fijacin
Existen dos tipos de fundamentalmente diferentes: 1.- Fijacin Fsica 2.- Fijacin Qumica fijacin

Fijacin Fsica
Los bacterilogos la utilizan rutinariamente fijando al calor frotis bacterianos. Esto se logra calentando suavemente a la flama del mechero una fina pelcula de bacterias secada previamente al aire. Si el frotis no se ha secado completamente, al pasarlo por el mechero se provoca la ebullicin y destruccin del microorganismo. Si la fijacin es insuficiente, la fina pelcula de bacterias no se pegar al portaobjetos y ser fcilmente arrastrada en los pasos subsecuentes. Si se fija en exceso incineraremos a los microorganismos.

Fijacin Qumica
Se emplea cuando se desea proteger la subestructura fina y la morfologa de microorganismos delicados. Los fijadores qumicos penetran las clulas y reaccionan con los componentes celulares, normalmente protenas y lpidos para inactivarlos y convertirlos en insolubles e inmviles. Entre las sustancias comnmente utilizadas como fijadores qumicos se encuentran el etanol, cloruro mercrico, cido actico, formaldehdo, cido tnico y glutaraldehdo.

Colorantes
Un colorante es cualquier sustancia colorida que al combinarse con una segunda sustancia, le imparte color. En trminos qumicos es un compuesto orgnico que posee un grupo cromforo y un grupo auxcromo unidos a un anillo benceno. El grupo cromforo imparte al compuesto la propiedad de color. El anillo benceno que tiene radicales cromforo se le conoce como cromgeno. Este compuesto que es colorido no tie, es decir no tiene afinidad o capacidad de unirse a fibras o tejidos. El color puede entonces removerse fcilmente por medios mecnicos. Para ser colorante es necesaria la presencia del grupo auxcromo que le imparte al compuesto la propiedad de disociacin electroltica. La funcin del auxcromo es la de proporcionar la propiedad de sal al compuesto.

Colorantes usados en Microbiologa

Los numerosos tipos de colorantes empleados para teir microorganismos poseen dos caractersticas en comn: 1) Todos poseen grupos cromforos, grupos con enlaces dobles conjugados que dan color al colorante. 2) Pueden unirse a las clulas mediante enlaces inicos, covalentes o hidrofbicos.

Clasificacin de los colorantes por su carga

Los colorantes ionizables se pueden dividir en dos clases, tomando como base la naturaleza de su grupo cargado. Los colorantes bsicos como el cristal violeta (violeta de genciana), azul de metileno, safranina, fucsina bsica, verde de malaquita, son catinicos o tienen grupos cargados positivamente. Estos colorantes se unen a molculas cargadas negativamente, como cidos nucleicos y muchas protenas. Como las superficies de las clulas bacterianas estn cargadas negativamente. Los colorantes cidos, como la eosina, la fucsina cida,y el rosa de bengala son aninicos o poseen grupos cargados negativamente como hidroxilos (-OH) o carboxilos (-COOH). Estos colorantes debido a su carga, se unen a estructuras cargadas positivamente.

Utilidad de las Tinciones

Las bacterias son semitransparentes y difciles de ver sin teir por lo que se utilizan colorantes que : 1.-Permiten hacer visibles a los objetos microscpicos y transparentes. 2.-Nos revela su forma y tamao. 3.-Muestran la presencia de estructuras internas y externas 4.-producen reacciones qumicas especficas. Adems, la presencia de ciertas estructuras as como su reaccin a determinadas tcnicas nos permite CLASIFICAR a las bacterias.

Tincin simple
Los microorganismos se pueden teir adecuadamente con una tincin simple, esto es utilizando un solo colorante. El valor de esta clase de tincin radica en su simplicidad y facilidad de empleo. Se cubre el frotis previamente fijado al calor, con un colorante durante el tiempo adecuado, se lava el exceso de colorante con agua y se deja secar al aire. La tincin simple se emplea con frecuencia para determinar:

a) el tamao b) la forma c) la agrupacin d) la presencia de esporas

Tinciones diferenciales
Los mtodos de tinciones diferenciales clasifican a las bacterias en grupos distintos segn sus propiedades tintoriales. Las tinciones diferenciales mas comnmente utilizadas son la tincin de Gram y la tincin de Ziehl-Neelsen

Tincin de Gram
La tincin de Gram desarrollada por el mdico dans Christian Gram en 1884, es el mtodo de tincin mas ampliamente utilizado en bacteriologa. Se trata de un mtodo de tincin diferencial porque divide a las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivas (G+) y Gram negativas (G-)

Tincin de Gram
En el primer paso de esta tincin, el frotis se cubre con el colorante bsico cristal violeta llamado colorante primario. Se deja actuar durante un minuto y se enjuaga el exceso con agua corriente, se adiciona posteriormente lugol que es una solucin yodada que acta como mordente. Esto es, el yodo aumenta la interaccin entre la clula y el colorante, de forma que la clula se tie mas intensamente. Luego se decolora el frotis lavndolo con una mezcla de etanol-acetona. Este es el paso crtico de la tincin, las bacterias G+ retienen el cristal violeta y las G- lo pierden y se decoloran. Finalmente el frotis se tie de nuevo con un colorante distinto al cristal violeta. La safranina es el colorante secundario o de contraste mas comn. Y tie a las bacterias G- de rosa o rojo dejando a las G+ de color violeta

Tincin de Gram del Bacilo de Dderlein

Tincin de Gram de Lactobacillus acidophilus, microorganismo predominante en la vagina de las mujeres. Los bacilos tienen una longitud de 3-4 um

Tcnica de Tincin de Gram

Tcnica de Gram por pasos

Fundamento de la tcnica de Gram

La diferenciacin entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas se establece en la naturaleza de la pared celular bacteriana. Las bacterias Gram positivas poseen una gruesa pared de peptidoglicana que es capaz de retener al complejo cristal violeta-yodo. Durante la decoloracin con alcohol acetona se provoca una deshidratacin de esta gruesa pared y se reduce la porosidad, atrapando entonces al complejo dentro de la clula. En cambio en las Gram negativas, la delgada capa de peptidoglicana no puede impedir la salida del complejo colorante-mordente y es entonces fcilmente teida por el colorante secundario o de contraste.

Tincin de Ziehl-Neelsen
La tincin de Ziehl_Neelsen desarrollada inicalmente por Paul Ehrlich para poner de manifiesto la presencia de los bacilos causantes de tuberculosois en muestras clnicas de pacientes es otra muy importante tincin diferencial. Algunas especies, particularmente del gnero Mycobacterium y Nocardia no se tien con colorantes comunes y requieren de tratamientos mas drsticos que incluyen calentamiento y el uso de una mezcla de colorante en soluciones alcalinas con una pequea cantidad de fenol. Una vez que el colorante ha penetrado, las clulas llamadas cido alcohol resistentes no son decoloradas por la mezcla alcohol-cido y permanecen teidas con el colorante primario. Las no cido alcohol resistentes son fcilmente decoloradas y toman el colorante secundario o de contraste.

Tcnica de tincin de ZiehlNeelsen

1.-Hacer un frotis con la cepa de prueba, dejar secar al aire y fijarlo al calor. 2.-Cubrir el portaobjetos con fucsina fenicada. 3.-Calentar suavemente con el mechero hasta la emisin de vapores. El colorante no debe hervir ni secarse, aadir ms si es necesario. 4.-lavar con agua 5.-Decolorar exhaustivamente con alcoholcido. 6.-Lavar con agua. 7.-Cubrir el frotis con azul de metileno durante un minuto 8.-Lavar con agua, escurrir, dejar secar. 9.-Observar al microscopio con el objetivo de inmersin. Las bacterias ZN+ o BAAR se observarn teidas intensamente de color rojo.

Fundamento de la tincin de Ziehl-Neelsen

Los gneros Mycobacterium y Nocardia presentan en su pared celular un alto contenido de cidos grasos de cadena muy larga constituidos en ceras, cidos miclicos y nocrdicos, respectivamente. Se ha postulado que el alto contenido de cidos grasos interviene decisivamente en la coloracin ya que al calentar la preparacin con el colorante primario hasta la emisin de vapores se favorece la fusin de las ceras y se aumenta la energa cintica de las molculas facilitndose la penetracin del colorante a la clula; al suspender el calentamiento y lavar con agua fra se provoca la solidificacin de las ceras de modo que el colorante ya no puede salir. Tambin se ha postulado que la mezcla del colorante-fenol es mas soluble en los lpidos bacterianos que en el agente decolorante, lo que contribuye a su permanencia en el interior de la clula. Puesto que el proceso de decoloracin es muy enrgico, cualquier bacteria que no contenga abundantes lpidos perder el colorante primario durante la decoloracin y tomar el colorante de contraste.

Importancia de la Tcnica de Ziehl-Neelsen

Las bacterias que resisten la decoloracin por alcohol-cido se denominan bacilos cido-alcohol resistentes (BAAR). Actualmente la tincin de Ziehl-Neelsen tiene gran importancia como una de las pruebas en el diagnstico de Mycobacterium tuberculosis, agente causal de la tuberculosis, enfermedad cuya incidencia est aumentando recientemente. As como en la identificacin de Mycobacterium leprae, agente etiolgico de la lepra.

Mycobacterium leprae
Tincin de ZiehlNeelsen. Observe las masas de micobacterias rojas en el interior de las clulas husped azul-verdosas. Mycobacterium leprae. 400X

Diversos tipos de tinciones

Tinciones selectivas
Las tinciones selectivas tienen por objeto poner de manifiesto las estructuras de las clulas aprovechando las propiedades qumicas o fsicas de algunos de sus componentes o bien, proporcionar informacin acerca de la naturaleza de ciertas estructuras a travs de su comportamiento tintorial. Estas tcnicas de tincin se basan en el hecho de que la estructura celular que se desea poner de manifiesto tiene afinidad mayor por los colorantes utilizados que el resto de la clula. Se pueden entonces demostrar estructuras como la pared celular, cpsula, flagelos, material nuclear, e inclusiones como depsitos de materiales de reserva de poli--hidroxibutirato, glucgeno y grnulos metacromticos.

Observacin de esporas
Algunas bacterias producen endosporas en un estadio particular de su ciclo de vida. Las endosporas son las estructuras ms resistentes que se conocen a agentes fsicos y qumicos debido al nmero y estructura qumica de las cubiertas. Por ese motivo, las endosporas son impermeables a los colorantes, por lo que cuando se hace una tincin, se observan al microscopio como cuerpos altamente refringentes y sin teir. Sin embargo, las endosporas se pueden teir aplicando calor a la preparacin previamente cubierta con una solucin de colorante que en la tcnica de Shaeffer y Fulton es el verde de malaquita. El lavado con agua elimina este colorante de las clulas vegetativas y la aplicacin de un colorante de contraste permitir distinguir claramente a las esporas de color verde.

Tincin de esporas

Tcnica de Shaeffer y Fulton

1.-Hacer un frotis con la cepa de prueba. Dejar secar al aire y fijarlo al calor 2.-Cubrir todo el portaobjetos con verde de malaquita y calentar suavemente la preparacin a emisin de vapores durante 5 minutos. El colorante no debe hervir ni secarse, aadir mas si es necesario 3.-Lavar la preparacin exhaustivamente con agua de la llave. 4.-Cubrir la preparacin con safranina y dejar actuar durante un minuto. 5.-Lavar de nuevo con agua, dejar secar al aire y observar a inmersin. Las esporas se observan intensamente teidas de color verde y la clula vegetativa toma el colorante secundario mostrndose de color rojo.

Observacin de esporas con una tincin simple

Observacin de endosporas: esquema y microfotografas

Observacin de cpsula
Los colorantes cidos, que no tien a la clula, son a veces tiles para revelar las capas superficiales con bajo ndice de refraccin, como la cpsula, que se encuentra sobre la pared celular envolviendo a los microorganismos.La cpsula puede hacerse visible con una tincin negativa como el mtodo de rojo Congo, o aadiendo tinta china o nigrosina al medio de suspensin y como las partculas coloidales de carbn o las molculas del colorante no pueden penetrar a travs de la cpsula, esta se observa como una zona clara que rodea a la clula.

Mtodo del Rojo Congo para cpsula

Tincin de Rojo Congo

1.-Con el asa estril tomar un poco del cultivo de una bacteria capsulada, suspenderlo en una gota de Rojo Congo y hacer un frotis. Dejar secar al aire. 2.-Sin fijar al calor, cubrir el frotis con mordente de cpsula y dejarlo actuar durante un minuto. Lavar con agua destilada y dejar secar al aire. 3.-Observar la preparacin al microscopio. La cpsula se observa como una zona clara alrededor de la bacteria de color rojo en un campo de color azul oscuro.

Mtodo de la tinta china para cpsula

1.-En el centro de un portaobjetos se coloca una gota de agua, otra de tinta china y un poco del cultivo de una cepa capsulada. Se mezcla suavemente sin extender. 2.-Se coloca un cubreobjetos sobre la suspensin y se presiona suavemente evitando que queden burbujas. 3.-Observar inmediatamente al microscopio. 4.-Desechar la preparacin en un recipiente con antisptico. La cpsula se observa como una gran estructura alrededor de la clula delimitada por los pequeos fragmentos de carbn de la tinta china.

Observacin de pared
La pared celular bacteriana puede teirse por un colorante bsico despus de aplicar cido tnico y alumbre de potasio como mordente. Este tratamiento permite observar la pared como una estructura engrosada

Tincin de pared celular

Tcnica de Knaysi

1.-Hacer un frotis con la cepa de estudio en la forma usual y fijarlo al calor. 2.-Cubrir el frotis con mordente de Knaysi y dejarlo actuar durante 10 minutos. 3.-Lavar con agua destilada. 4.-Colocar con el asa una gota de fucsina sobre la preparacin. 5.-Poner un cubreobjetos y observar al microscopio. La pared se observa de color rojo intenso alrededor de la bacteria cuyo citoplasma se ver de color rosa o rojo tenue.

Observacin de grnulos metacromticos

Los grnulos metacromticos, de polimetafosfato o volutina se encuentran en muchas bacterias, hongos, algas y protozoarios, estn formados de cmulos de polimetafosfato y sirven como material de reserva de energa de la clula. Se ponen de manifiesto con el colorante azul de metileno de Leffler y se tien de color rojo violeta en tanto que la clula se observa de color azul tenue.

Tincin de Flagelos
Los flagelos son estructuras frgiles y termosensibles que requieren de cuidadosas manipulaciones para ser observados. El xito de las tcnicas depende del mordente que debe ser de reciente preparacin. Los flagelos estn por debajo del poder de resolucin del microscopio ptico por lo que deben de cubrirse con un mordente que permita engrosarlos. Los mtodos de tincin mas utilizados son el de Gray y el de Leifson.

Observacin de flagelos
Algunos apndices como los flagelos se pueden observar bajo el microscopio ptico despus de aplicar la tincin de Leifson

Observacin de diversas bacterias flageladas

Tinciones fluorescentes
En microbiologa se han diseado diversos mtodos de tincin que permiten cuantificar a los microorganismos en su habitat. A pesar de que estos mtodos revelan poco sobre la fisiologa o la composicin filogentica, son muy empleados y altamente confiables para obtener informacin cuantitativa sobre el nmero total de clulas en una muestra natural. Se han utilizado ampliamente dos colorantes fluorescentes: el naranja de acridina y el 4,6-diamido-2-fenil indol (DAPI). Estos colorantes se unen a los cidos nucleicos. La observacin de las clulas se hace utilizando un microscopio de epifluorescencia. En la actualidad, estas tcnicas de tincin han tenido importantes aplicaciones y se utilizan en la cuantificacin de microorganismos en alimentos, muestras clnicas y del ambiente.

Tincin con Naranja de Acridina

Esta imagen corresponde a una microfotografa de fluorescencia de una comunidad microbiana natural que se encuentra colonizando las races de una planta. La tincin se hizo con naranja de acridina.

Tincin con DAPI

Clulas de Escherichia coli teidas con DAPI se observan de color azul brillante sobre un fondo oscuro. Esta tcnica se utiliza frecuentemente para hacer cuentas totales

Tinciones Vitales
Se han desarrollado diversos mtodos que permiten diferenciar clulas vivas de clulas muertas utilizando colorantes fluorescentes. Esto nos permite tener informacin no solo del nmero de microorganismos presentes en una muestra sino que tambin nos informa sobre su viabilidad. La base de la diferenciacin est en la membrana citoplsmica que debe mantenerse intacta. Se utiliza una combinacin de dos colorantes el verde penetra todas las clulas viables y no viables mientras que el colorante rojo que contiene yoduro de propidium se incorpora solo a las clulas muertas

Tinciones Vitales
En esta microfotografa se observan clulas vivas (de color verde) y clulas muertas (de color rojo) de Micrococcus luteus (coco) y Bacillus cereus (bacilo) teidas con la tcnica de viabilidad que utiliza LIVE/DEAD Bac Light
TM

Tinciones por hibridacin in situ fluorescente (FISH)

Bibliografa
Black, J.G. 1999. Microbiology Principles and Explorations. 4a. Ed. Prentice Hall, Inc. Madigan M.T., J.M. Martinko y J.Parker. 1999. Brock Biologa de los Microorganismos. 8a Ed. Prentice Hall, Inc. Madigan, M.T., J.M. Martinko y J. Parker. 2000. Brock Biology of Microorganisms. 9a. Ed. Prentice Hall Inc. Prescott L.M., J.P. Harley y D.A. Klein. 1999. Microbiologa. 4a. Ed. McGraw Hill-Interamericana