Manual de Laboratorio Clinico3

Pontificia Universidad Catlica del Ecuador
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Av. 12 de Octubre 1076 y Roca Apartado postal 17-01-2184 Telf: 593 2 299 15 21
1. DATOS INFORMATIVOS: MATERIA O MDULO: LABORATORIO CLNICO PRCTICAS CARRERA: MEDICINA NIVEL: SEGUNDO N CRDITOS: 1,5 (UNO COMA CINCO) CRDITOS TEORA: 1 CRDITOS PRCTICA: 0,5 DATOS DEL PROFESOR: Nombre: Celia Annabel Bowen Fernndez Grado Acadmico o Ttulo Profesional: Dra. Bioqumica y Farmacia opcin Bioq. Clnica Breve indicacin de la lnea de actividad acadmica: Docencia en diferentes en diferentes ramas de la patologa clnica (Laboratorio clnico y Microbiologa), coordinadora de los laboratorios en el rea de Destrezas Clnico Quirrgicas Indicacin de horario de atencin a estudiantes: Martes, Mircoles y Viernes 12:00 a 13.00 horas Correo Electrnico: bowencelia@yahoo.es Telfono: 084678618 PROFESOR: Grado acadmico o ttulo profesional: Dra. Bioqumica y Farmacia opcin: Bioq. Clnica/ Diploma Superior en Pedagogas Innovadoras 2. DESCRIPCIN DE LA MATERIA: En este nivel de la carrera se estudian los fundamentos bsicos del laboratorio clnico, su estructura y organizacin dentro de un servicio de salud, sus funciones y se dan las primeras correlaciones de las pruebas de laboratorio con casos clnicos. Se aprende el uso racional de las pruebas ms comunes y se pretende incentivar al estudiante a tomar con conciencia crtica las solicitudes de laboratorio y rescatar la interpretacin clnica como elemento fundamental de la Medicina de Laboratorio. 3. OBJETIVOS GENERAL: Reconocer la metodologa y realizacin de las pruebas bsicas de laboratorio clnico con el fin de corroborar la presencia y las concentraciones de los diferentes analitos en las muestras biolgicas, con la morfologa y fisiologa del individuo normal, estudiadas en las dems reas de las ciencias morfofuncionales del segundo nivel de la carrera. 4. ESPECFICOS: 4.1. ACTITUDINALES: a. Compartir conocimientos y experiencias durante el proceso de aprendizaje b. Manejar adecuadamente el manejo del microscopio segn las normas indicadas c. Identificar y cumplir las normas de bioseguridad

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4.2. PROCEDIMENTALES: a. Revisar el mtodo de la puncin venosa y capilar y realizar el procedimiento b. Aprender a preparar soluciones y diluciones y su aplicacin para deducir las unidades de medida utilizadas en el laboratorio c. Realizar y explicar los pasos del examen elemental y microscpico de orina y del coproparasitario y su respectiva interpretacin d. Realizar exmenes de glucosa, colesterol, rea, transaminasas y bilirrubinas as como relacionarlos con el respectivo diagnstico en caso de haber alteraciones 4.3. COGNITIVOS: a. Revisar los anticoagulantes y tubos de ensayo utilizados en las pruebas ms comunes b. Especificar el fundamento de las pruebas bioqumicas enzimo-colorimtricas, de la espectrofotometra y los clculos matemticos necesarios c. Conocer la tcnica de electroforesis y las diferentes fracciones proteicas sanguneas 5. CONTENIDOS 1. Laboratorio clnico: Normas de bioseguridad PRIMERA SEMANA 1 rotacin, DCIMA SEMANA 2 rotacin 2. Toma de muestras de sangre, anticoagulantes, tubos al vaco PRIMERA SEMANA 1 rotacin, DCIMA SEMANA 2 rotacin 3. Soluciones y diluciones, unidades de medida SEGUNDA SEMANA 1 rotacin, DCIMA PRIMERA SEMANA 2 rotacin 4. Elemental y microscpico de orina TERCERA SEMANA 1 rotacin, DCIMA TERCERA SEMANA 2 rotacin 5. Parasitologa, coprolgico-coproparasitario CUARTA SEMANA 1 rotacin, DCIMA CUARTA SEMANA 2 rotacin 6. Carbohidratos: glucosa QUINTA SEMANA 1 rotacin, DCIMA QUINTA SEMANA 2 rotacin 7. Lpidos: colesterol QUINTA SEMANA 1 rotacin, DCIMA QUINTA SEMANA 2 rotacin 8. Protenas: electroforesis y examen qumico SEXTA SEMANA 1 rotacin, DCIMA SEXTA SEMANA 2 rotacin 9. Funcin renal: urea SPTIMA SEMANA 1 rotacin, DCIMA SPTIMA SEMANA 2 rotacin 10. Pruebas de funcin heptica: transaminasas, bilirrubinas OCTAVA SEMANA 1 rotacin, DCIMA SPTIMA SEMANA 2 rotacin 6. METODOLOGA, RECURSOS: 6.1. Mtodos didcticos a. Charla de fundamentacin terica b. Explicacin prctica y observacin c. Realizacin de prcticas de pruebas de laboratorio
Autora: Dra. Celia Bowen
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6.2. Recursos a. Uso de manual de prcticas de Laboratorio Clnico b. Toma de fotos con respecto a las prcticas realizadas en clases (smartboard) c. Uso de Atlas de sedimento urinario y parsitos d. Equipos de Laboratorio de Clnico (Microscopios, incubadora, centrfuga, espectrofotmetro, etc.) e. Reactivos varios f. Muestras biolgicas varias 7. EVALUACIN: 7.1. CRONOGRAMA DE EVALUACIONES: 1era. Evaluacin (promedio de lecciones): Cada semana 2da. Evaluacin (terica): Octava semana 3ra. Evaluacin (prctica + carpeta): Novena semana SISTEMA DE CALIFICACIN: EVALUACIONES PARCIALES PRCTICA Y TERICA: 30 puntos 10 puntos de cada una de las evaluaciones ms trabajos o promedios de lecciones indicadas en el cronograma Nota final: 20 puntos Primera parte: 10 puntos con un examen final del rea de Prcticas en la semana 8 y 18 de la rotacin Segunda parte (examen integrador de la Macrorea de Morfofuncin): semana 9 y 18 de la rotacin 8. BIBLIOGRAFA: TEXTOS DE REFERENCIA: ngel M., G. y M. ngel R., Interpretacin Clnica del Laboratorio, 6. edicin, Editorial Mdica Panamericana, Bogot, 2.001 Manual de Bioseguridad en el Laboratorio, O. M. S., Ginebra, 1.994 TEXTOS RECOMENDADOS: Henry, J. B., Diagnstico y Tratamiento Clnicos por el Laboratorio, 9. Edicin, Editorial Salvat Mdica, Mxico, 1.993 Mtodos Bsicos de Laboratorio en Parasitologa Mdica, O. M. S., Ginebra, 1.992 Morn Villaroto, Obtencin de Muestras Sanguneas de Calidad Analtica, Editorial Mdica Panamericana, Mxico, 2.001
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PRCTICA No. 1 BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO CLINICO Definicin: Conjuntos de normas y procedimientos para obtener una situacin carente de riesgos o con riesgos limitados. PRECAUCIONES UNIVERSALES: 1. Acceso restringido, permitido solo a personas autorizadas 2. Prohibido usar el celular, comer, fumar, beber o almacenar comidas o cualquier objeto de uso personal dentro del laboratorio. 3. Usar ropa protectora de trabajo como mandil, mascarillas, guantes (de ltex) la misma que debe ser retirada antes de abandonar el laboratorio. Botas y gorra en casos de exposicin a microorganismos de alta peligrosidad. 4. Antes de iniciar cualquier actividad en el laboratorio asegurarse de que en la mano no existan escoriaciones. En caso contrario cubrir las mismas de manera adecuada. 5. Cambio inmediato de los guantes en caso de rotura y lavado de manos. 6. No tocarse la boca ni los ojos con las manos enguantadas 7. Evitar la formacin de aerosoles y gotas. 8. Manejo adecuados de los objetos corto punzantes. Una vez utilizados se deben almacenar en recipientes rgidos y eliminarse luego de ser decontaminados. 9. Terminantemente prohibido pipetear con la boca. Debe utilizarse los pipeteadores automticos. 10. Decontaminar las superficies de trabajo una vez terminado el trabajo diario.Se recomienda el uso de hipoclorito de sodio al 10% 11. Evitar conductas inseguras y de riesgo. 12. Manejo adecuado de los desechos desde el lugar de origen y realizar tratamiento adecuado especialmente de los infecciosos. 13. Los desechos de los fluidos corporales pueden eliminarse por las caerias habituales una vez que hayan sido decontaminados. 14. Lavarse las manos con abundante agua y jabn luego de haber terminado el trabajo diario. 15. Plan de inmunizaciones para el personal de laboratorio TRABAJO EN CLASE: Poner en prctica las normas anteriores durante cada sesin de laboratorio
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PRACTICA No. 2 Tema: Toma de muestras de sangre (venosa y capilar) Objetivos: 1. Conocer la tcnica para la obtencin de muestras de sangre como medio para mantener la integridad del profesional de salud y la del paciente 2. Adiestramiento adecuado para el manejo de instrumentos necesarios en la toma de muestras sanguneas 3. Aplicar las precauciones universales de bioseguridad en el laboratorio con respecto al manejo de lquidos biolgicos y material infeccioso 4. Conocer los usos de los diferentes anticoagulantes empleados en el laboratorio Fundamento terico: La relativa facilidad con que se obtiene la sangre venosa hace de esta tcnica el principal mtodo de obtencin de sangre en los laboratorios de anlisis clnicos. A partir de la sangre sin anticoagulante se obtiene suero, si la sangre contiene anticoagulante, se obtiene plasma. Del plasma forma parte el fibringeno, sustancia de la que carece el suero. Materiales: -Torniquete -Algodn -Alcohol antisptico (isoproplico al 70%) -Jeringuillas -Sistema vacutainer: capsula, tubos alvaco, agujas de toma mltiple - Lancetas -Tubos capilares heparinizados -Plastilina Tcnica de la puncin venosa: 1. Se identifica al paciente comprobando que la solicitud de exmenes corresponda al mismo 2. Si se solicita una muestra en ayunas, debe comprobarse que efectivamente el paciente no ha ingerido alimentos 3. Hay que dirigirse al paciente e informarle sobre el procedimiento a que va a ser sometido. Se debe tranquilizarle, eliminando en lo posible su tensin. 4. Se ha de colocar adecuadamente al paciente, segn ste se encuentre sentado, o en decbito prono, para tener acceso fcil y cmodo a la fosa antecubital.
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5. Hay que preparar todo el material, incluidos los tubos para recogida de la muestra, el torniquete, los objetos que se emplean para limpiar la piel, las jeringas, cuando sea necesario, la aguja estril para extraccin de sangre y dispositivo utilizado para fijar la aguja al tubo de extraccin al vaco. 6. Se solicita al paciente que cierre el puo para que las venas resulten ms palpables. 7. Se seleciona una vena adecuada para la puncin. Se prefieren las venas de la fosa antecubital, en particular la cubital interna y la ceflica. Tambin pueden utilizarse las venas de la mueca, el tobillo y la mano. Si existiera ya un catter intravenoso en un brazo, se utilizar el otro para la extraccin de la muestra. 8. Preparar la cpsula insertando la aguja pero dejando un poco flojo la capucha de la parte externa de la misma para retirarlo al momento de la puncin. 9. Se aplica un torniquete varios centmetros por encima de la zona de puncin (aproximadamente a cuatro dedos sobre el doblez del brazo). No hay que dejar nunca el torniquete ms de 1 minuto. En casos excepcionales no debe usarse el torniquete, por ejemplo cuando en el pedido est el Calcio. 10. Se limpia la zona de la venopuncin con una torunda embebida en solucin en alcohol antisptico. Se comienza en el punto de la puncin y se prosigue la limpieza hacia fuera siguiendo un movimiento en espiral. Se deje que la zona se seque y no se toca con ningn objeto que no haya sido esterelizado previamente. 11. Se fija firmemente la vena tanto por encima como por debajo del lugar de puncin, con la ayuda de los dedos pulgar y medio, o ndice y pulgar. 12. Se realiza la venopuncin. a) Se penetra a travs de la piel con la aguja formando un ngulo de aproximadamente 15 con el brazo y con el bisel hacia arriba. Se sigue la direccin de la vena con la aguja. B) Se introduce la aguja con suavidad pero con la suficiente rapidez para reducir las molestias del paciente. No hay que enterrar la aguja. C) Si se utiliza una jeringa, se tira hacia atrs del mbolo, con tensin lenta y uniforme a medida que la sangre va fluyendo en su interior. No debe realizarse este movimiento con excesiva rapidez, ya que podra hemolizarse la sangre o colapsarse la vena. d) Si se utiliza un tubo al vaco, en cuanto la aguja haya penetrado en la vena, se dirigir el tubo todo lo posible hacia delante en el dispositivo de sujecin. Al mismo tiempo se sujeta tenuemente la aguja en su lugar. Una vez que haya llenado el tubo, se retira, cogindolo por su extremo y tirando suavemente de l. 13. Cuando la sangre comience a fluir, se suelta el torniquete. 14. Una vez que se haya extrado toda la muestra, hay que indicar al paciente que relaje el puo y que no bombee con la mano. 15. Se coloca suavemente sobre el punto de la puncin una bola de algodn estril. Se extrae la aguja y a continuacin se ejerce presin sobre la zona. 16. Se venda el brazo. En general es suficiente una tira de esparadrapo sobre la bola de algodn, para detener la hemorragia. 17. Se mezclan los tubos con el anticoagulante. Si la muestra ha sido extrada con jeringa, se transferir la sangre a los tubos correspondientes tomando las debidas precauciones para evitar la hemlisis de las muestras. 18. Se comprobar el estado del paciente; por ejemplo, si se ha mareado y si la hemorragia est controlada.
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19. Se elimina el material contaminado: agujas, jeringas, algodones, etc. 20. Se marcan las etiquetas y se registra la hora en que se extrajeron las muestras. 21. Se envan los tubos de sangre para su anlisis a los correspondientes departamentos del laboratorio. Si es preciso, se hace constar la hora en la solicitud. Puncin capilar: 1. Tener todo el material en perfecto orden: algodn, alcohol, lancetas, tubos capilares y plastilina. 2. Pedir al paciente que se frote el dedo pulgar hasta que obtenga una buena irrigacin de la zona de puncin. 3. Desinfectar la zona y secarla con otro algodn libre de alcohol 4. Sacar la lanceta y realizar la puncin de forma rpida y firme. 5. Deshechar la primera gota para evitar contaminacin con restos de alcohol. 6. Colocar el capilar en la zona e ir llenndolo hasta las tres cuartas partes del tubo. 7. Retirarlo de la zona y colocar un algodn con poco alcohol y solicitar al paciente que se sostenga por unos minutos para que deje de fluir la sangre. 8. El capilar sellarlo con plastilina y colocarlo en el lugar designado para ese paciente. Anticoagulantes utilizados con mas frecuencia EDTA (tapn lila): Tubo estril con anticoagulante EDTA: sal de cido etileno diamina tetractico di o tripotasica o di sdica, concentracin: 1,2 a 2,0mg/ml de sangre(4,1 a 6,8mmol/l de sangre) basado en EDTA anhidro. Para uso en hematologa Citrato de sodio (tapn azul 1/9 y tapn negro 1/4): citrato trisdico con 0,100 a 0,136 mol/l de cido ctrico. Se recomienda 0,105 mol/l para lograr la estandarizacin recomendada por la WHO para que quede a 3,2%. Se usa para pruebas de coagulacin (TP, TTP, fibringeno), utilizar l parte de citrato y 9 de sangre entera. Tapn rojo: Tubo estril sin anticoagulantes ni aditivos ni geles separadores. Para obtener suero. Los tapones de colores con una banda Gris agregada indican que el tubo corresponde a uno los anteriores y que adems contiene gel separador de suero o plasma TRABAJO EN CLASE: Estudiar bien las instrucciones anteriores para ponerlo en prctica con algn compaero de clase PRACTICA No. 3
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Tema: Soluciones y diluciones Objetivos: - Conocer lo que es un soluto y un solvente para preparar soluciones a diferentes concentraciones - Conocer dos formas de expresar matemticamente la proporcin de soluto a solvente dentro de una solucin (p/v y v/v) - Realizar diluciones simples a partir de una solucin Fundamento terico: Las soluciones son mezclas homogneas de dos o ms substancias, que pueden separarse por mtodos fsicos en sus diversas substancias componentes. En una solucin, aquella substancia que se encuentra en mayor proporcin se conoce como Solvente y las dems como Solutos. Existen varias formas de expresar la concentracin de una solucin, esto es, la proporcin de soluto a solvente. Para efectos cualitativos, frecuentemente se habla de soluciones diluidas, concentradas, saturadas o sobresaturadas. Aunque existen diversas formas de expresar matemticamente la proporcin de soluto a solvente dentro de una solucin, las de uso mas extendido suelen ser Molaridad, el Porcentaje Peso a Volumen, el Porcentaje Peso a Peso y las Partes por Milln. El porcentaje Peso a Volumen es una relacin que expresa los gramos de soluto que se hallan contenidos en cada 100 mililitros de solucin. Materiales y reactivos: Materiales: - Probeta graduada de 50 ml - Vaso de precipitacin de 50 ml - Matraz aforado de 50 ml - Pipetas graduadas de : 1, 2, 5 y 10 ml. - Peras de seguridad - Tubos de ensayo - Gradillas - Balanza - Varilla de vidrio Reactivos: - Safranina en polvo - Cloruro de sodio en polvo - Agua destilada Procedimiento: 1. Mtodo para preparar soluciones: Unidades de medidas: p/v = peso de soluto sobre volumen de solvente expresado en gr/ 100ml
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v/v = volumen de soluto sobre volumen de solvente expresado en ml/100 ml. Ejemplo de soluciones p/v: Preparar 50 ml. de solucin de NaCl (cloruro de sodio) al 0.85% en agua destilada Datos V1= 50 ml. V2= 100 ml Concentrac. Solucin= 0.85% (pesar 0.85 gramos de NaCl y aforar con agua destilada hasta obtener 100 ml de solucin) 0.85 gr. NaCl 100 ml agua destilada X 50 ml agua destilada X= 0.425 gr. de NaCl disolver en agua destilada hasta obtener 50 ml de solucin Ejemplo de soluciones v/v: Preparar 40 ml. de solucin de Etanol al 70% en agua destilada Datos V1= 40 ml. V2= 100 ml Concentrac. Solucin= 70% (70 ml de etanol puro diluidos en 100 ml de agua destilada) 70 ml de etanol 100 ml agua destilada X 40 ml agua destilada X= 28 ml. de etanol puro diluir en 12 ml de agua destilada para obtener una solucin de 40 ml de etanol al 70% 2. Mtodo para realizar diluciones Partiendo de una solucin cualquiera que sea su concentracin las diluciones se realizan del siguiente modo: Si se tiene una solucin HCl (cido clorhidrico) y se quiere diluir en agua destilada 1:20 para obtener un volumen final de 50 ml se realiza los siguientes clculos: 1ml de soluc. HCl 20 ml. de agua destilada X 50 ml de agua destilada X =2.5 ml de HCl se necesita para obtener una solucin de 50 ml en agua destilada (medir 47.5 ml de agua) 3. Para obtener el factor de dilucin: Utilizando el ejemplo anterior el factor de dilucin se obtiene del siguiente modo: Fd = Volumen mayor = Volumen menor (alcuota) 50 = 2,5 20
La solucin en efecto est diluida 20 veces

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PRACTICA No. 4 Tema: Elemental y microscpico de orina Objetivos: 1. Analizar la orina realizando exmenes macrscopico, qumicos y microscpicos en la misma 2. Correlacionar los parmetros analizados con enfermedades renales o del tracto urinario Definicin de examen rutinario de orina: Es un examen fsico y/o qumico de la orina y comprende una serie de pruebas qumicas y microscpicas para evaluar infecciones del tracto urinario, enfermedad renal y enfermedades de otros rganos que provocan la aparicin de metabolitos anormales (productos de descomposicin) en la orina. El examen elemental y microscpico de orina consta de tres partes: 1) Macroscpico: color, aspecto 2) Qumico (tira reactiva): pH, leucocitos, protenas, glucosa, urobilingeno, bilirrubina, cuerpos cetnicos, sangre 3) Microscpico: leucocitos, eritrocitos, clulas bajas, clulas altas (se reporta numero por campo en 10 camposcon lente de 40x), moco, bacterias, cristales, parsitos, hongos (se reporta por cruces en 10 campos con lente de 40 x) y cilindros se reporta nmero por placa (con lente de 10x). 1. Instrucciones para recoger una muestra parcial de orina a. El frasco tiene que ser suministrado por el Laboratorio, o adquirir en la farmacia uno estril apropiado para la recoleccin de orina. b. Es preferible que la orina sea la primera orina de la maana. c. Practicar previo aseo genital, con agua y jabn, sin dejar residuos. Esto es especialmente importante en la mujer que debe lavarse el rea entre los labios de la vagina y evitar la contaminacin de la muestra con crema, antispticos y secreciones vaginales. Los hombres y nios deben limpiarse la cabeza del pene d. Deje escapar la porcin inicial de la miccin al inodoro, a continuacin recolecte en el frasco la porcin media (10 ml) y descarte la porcin final de la miccin nuevamente en el inodoro. e. Tape bien el frasco y entrguelo rpidamente al Laboratorio (mximo dos horas luego de tomar la muestra). f. NO recoger la muestra durante el Periodo Menstrual 2. Mtodo para el anlisis de orina macroscpico y qumico: a. Despus de recibir la orina en el laboratorio, analizarla tan pronto como sea posible. Antes del anlisis las muestras de orina deben estar a la temperatura ambiente b. Realizar la homogenizacin de la orina
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c. Con movimientos moderados en el recipiente transportado hasta el laboratorio (bien mezclada y no agitada) d. Verter en un tubo de ensayo de 16 x 100 mm aproximadamente 10 ml e. Determinar el color, aspecto (nitidez) f. Registrar la presencia de un olor inusual y de cantidades anormales de espuma coloreada g. Sumergir brevemente la tira reactiva, no ms de un segundo (evitar tocarla con los dedos, ya sea antes o despus de sumergirla) h. Eliminar el exceso de orina en la tira,: limpiar el borde de la misma con el reborde del tubo o con papel secante i. No permitir que los reactivos de la tira se junten j. No depositar la tira reactiva directamente sobre la superficie de trabajo k. Seguir exactamente las recomendaciones en cuanto al tiempo para cada test qumico l. Mantener la tira reactiva junto a la carta de colores y leer bajo una buena iluminacin m. Tener en cuenta las fuentes de error, la sensibilidad y la especificidad de cada prueba con la tira reactiva 2.1. Parmetros que se observan en el examen macroscpico : En el examen macroscpico se analiza el aspecto como por ejemplo si es trasnparente, ligeramente turbia, turbia, espesa, opaca y el color de la orina que puede ser amarilla plida, amarilla oscura, mbar, roja, verde, azul entre otros. 2.2. Parmetros que se observan en el examen qumico: Densidad ( gravedad especfica): Registra la concentracuin inica de la orina (es decir, qu tan concentrada o diluida se encuentra). Se basa en la liberacin de protones por un formador de complejos en presencia de cationes. Esto causa un viraje de color del indicador azul de bromotimol, de azul hacia amarillo, pasando por verde azulado pH: Indican la acidez o alcalinidad de la orina. Los valores pH ms frecuentes en orina fresca de personas sanas se encuentran entre 5 y 6. El test es especfico para la deteccin de iones hidronio, siendo el valor pH el logaritmo decimal negativo de la concentracin de iones hidronio. El papel reactivo contiene los indicadores rojo de metilo, fenolftalena y azul de bromotimol. Leucocitos: Comprueba la actividad estersica de granulocitos. Esta enzimas desdoblan un ster de indoxilo a indoxilo, que reacciona con una sal de diazonio formando un colorante violeta. se detectan leucocitos intacto y tambin los lisados (indicio de IVU) Nitrito: Los agentes patgenos ms frecuentemente causantes de infecciones de las vas urinarias, E. coli y la mayora de los grmenes patgenos urinarios, transforman el nitrato absorbido con la alimentacin en nitrito. Este es detectado por una coloracin del rosa al rojo de la zona reactiva. El ensayo se basa en el principio de la prueba de Griess y es especfico para el nitrito. (indicio de IVU)
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Protenas: El test se basa en el principio del error proteico de indicadores de pH y reacciona de manera especialmente sensible a la albmina. Glucosa: La deteccin de glucosa se efecta segn el mtodo especfico de la glucosa-oxidasa-peroxidasa. Cuerpos cetnicos: La deteccin se realiza en el principio de la prueba de legal y reacciona ms intensamente al cido acetilactico que a la acetona. Las cetonas son un subproducto del metabolismo de las grasas, presente con inanicin y diabetes. Urobilingeno: Es un producto de degradacin de la bilirrubina. El test se basa en que una sal de diazonio estable produce con el urobilingeno, casi instantneamente un colorante azico rojo Bilirrubina: En la orina es un producto de degradacin de la hemoglobina. La deteccin se basa en la copulacin de una sal de diazonio con bilirrubina para formar un colorante azoico. Incluso los ms leves matices rosa ya deben ser considerados como positivos. Hemoglobina: Es un indicio de hemlisis. La mioglobina cataliza la oxidacin del indicador por el hidroperxido orgnico contenido en el papel reactivo. Puntos verdes aislados hasta acumulados en la zona reactiva amarilla indican la presencia de eritrocitos intactos. La hemoglobina as como los eritrocitos hemolizados o la mioglobina son indicados por una coloracin verde homognea de la zona reactiva.
3. Mtodo para realizar el examen microscpico del sedimento urinario a. Una vez realizado el examen microscpico y qumico de la orina, se la centrifuga por 5-10 minutos a 1500-2000 rpm con la orina previamente homogenizada b. Eliminar cuidadosamente el sobrenadante. El volumen final utilizado para resuspender el sedimento puede variar segn el sistema estandarizado que se use, pero debe ser siempre constante en cualquier laboratorio dado. c. Resuspender con suavidad el sedimento, eliminar las dos primeras gotas y colocar la tercera gota en una placa portaobjetos, cubrir con un cubreobjetos. Dejar que la orina se deposite durante 30 a 60 segundos. d. Observar al microscopio con objetivos de pequeo y gran aumento. Para detectar algunas entidades del sedimento con un ndice bajo de refraccin ser necesaria una luz amortiguada o una iluminacin de contraste de fase. El foco fino debe variarse continuamente mientras se examina. Progresar de manera sistemtica a lo largo de toda la placa, teniendo cuidado de examinar los bordes en busca de cilindros. e. Recuento del nmero de cilindros por lo menos en 10 campos de pequeo aumento (10x) y anotar en el informe el nmero de cilindros por campo. Puede utilizarse un margen razonable, es decir, 0 a 2, 2 a 5, 5 a 10, etc. Usar el gran aumento (40x) para indicar el tipo de cilindros. Los cilindros se apreciarn si se utiliza microscopio de contraste de fase. f. Identificacin y recuento de los eritrocitos, leucocitos y clulas epiteliales renales utilizando el objetivo de gran aumento (40x). Efectuar el recuento
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g. h. i. j. k.
por lo menos 10 campo de gran aumento y expresarlo como clulas por campo. En el informe puede utilizarse un margen razonable. Reportar: Las clulas epiteliales (bajas) y altas si estn presentes en gran nmero o como fragmentos (clulas transicionales) Bacterias, levaduras, microorganismos. Una bacteriuria detectable a pequeo aumento puede expresarse por lo menos como 2 +. Los cristales se cuantifican bajo pequeo aumento. La presencia de cristales anormales debe confirmarse qumicamentey correlacionarse con la historia del paciente Grandes cantidades de moco
OBSERVACIN: Para el siguiente literal por favor revisar el atlas para segundo nivel ubicado en el internet cuya pgina es ftp.puce.edu.ec 3.1. Elementos que se observan en el examen microscpico:
Las bacterias y otros microorganismos (normalmente no estn presentes) Cilindros urinarios Cristales Grasa Moco Glbulos rojos (un indicio de dao en los tbulos) Clulas tubulares renales Clulas epiteliales de transicin Glbulos blancos (un indicio de infeccin del tracto urinario)
TAREA EN CLASE: Cada estudiante debe traer su muestra de orina siguiendo las instrucciones anteriores, realizar el anlisis clnico durante la prctica y realizar el reporte de la misma para archivar en la carpeta. PRACTICA No. 5 Tema: Parasitologa : Coproparasitario Objetivos: 1. Observacin macroscpica y microscpica de las heces para aprender a reconocer diferentes patologas gastrointestinales 2. Aprender a realizar la tcnica para la preparacin de un coproparasitario Materiales y rectivos: A. Materiales
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-Placa portaobjetos -Placa cubreobjetos -Microscopio -Guantes -Palillos de dientes B. Reactivos -Solucin fisiolgica al 0.85% -Solucin de lugol (dilucin 1:5 de lugol) -Muestra de heces Procedimiento: Recoleccin de la muestra: Debe recogerse en un recipiente limpio, debe tenerse cuidado de no mezclarse con orina, descartar los provenientes de pacientes tratados con bismuto y bario. Las muestras obtenidas deben enviarse rpidamente al laboratorio especialmente si son lquidas o semilquidas ya que las formas trofozoicas de los protozoos pierden movilidad y mueren poco despus de enfriarse. Procesar la muestra antes de dos (2) horas. Si esto no es posible, mantener las muestras en refrigeracin o temperatura de 4 Centgrados. 1. Examen macroscpico (fsico) heces: La inspeccin de las heces es importante, ya que puede conducir a un diagnsrtico de infectacin parasitaria, ictericia obstructiva, diarrea, malabsorcin, obstruccin rectosigmoidea, disentera o colitis ulcerosa, o prdida de sangre en el conducto gastrointestinal. a. Debe anotarse la consistencia (especificando si son pastosas, blandas, semilquidas lquidas duras) y color del excremento (caf, amarilla, rojiza, negruzca, verdes, etc) b. Los progltides o gusanos adultos se pueden detectar en el examen general, manchas de sangre o moco, y, la presencia de restos alimenticios. Color: Normalmente las heces son de color pardo de diferente intensidad, este color se debe a la presencia de urobilina, varia de acuerdo a la ingestin de alimentos y medicamentos. Olor: Las sustancias aromticas provenientes de la desaminacin y descarboxilacin del triptofano por las bacterias son las que le dan a la materia fecal el olor caracterstico. Consistencia: Normalmente las heces son blandas aunque moldeadas. Se observan heces extremadamente duras en el estreimiento y lquidas por accin de purgantes, o por causas que originen diarrea. Esta consistencia puede ser : Lquida, blanda o dura. Aspecto: Hay diferentes aspectos como son : Diarreico, cremoso, mucoide, granuloso, pastosa,caprino. Reaccin: La reaccin y el pH de la materia fecal depende del rgimen alimenticio.
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2. Exmen Microscpico de las heces: En una lmina portaobjetos se colocan dos gotas, en la parte izquierda solucin salina y en la derecha lugol, luego se toma con un palillo la muestra de materia fecal, se debe escoger la parte que tenga elementos anormales como sangre, moco, etc. y de otra parte para que as quede una muestra representativa, se homogeniza en la lmina primero en la solucin salina y luego en el lugol, se le colocan los cubreobjetos. La suspensin no debe quedar muy gruesa pero tampoco muy delgada. Residuos alimenticios: Fibras musculares: Se presentan en forma de cilindros con estras longitudinales y transversales. Grasas neutras: Aparecen como esferas refringentes de diferentes tamaos. Acidos grasos: Se observan como agujas incoloras. Almidones: Tienen formas irregulares y son refractiles al agregar el lugol. Fibras vegetales: Se caracterizan por ser de doble pared, contienen clorofila y poseen un canal central muy marcado. Productos de irritacin de la mucosa: Moco: Se observa en cualquier patologa. Glbulos Rojos: Su hallazgo indica lesin en la parte baja del aparato digestivo. Clulas epiteliales: Indican una excesiva irritabilidad. Bacterias: Carecen de significacin clnica. Leucocitos: Si hay gran cantidad indica irritacin bacteriana. Cristales de Charcot-leyden: Se ven en forma de rombos alargados.
2.
Exmen parasitolgico
NEMATODOS: Gusanos redondos Ascaris lumbricoides: Se observan huevos miden aprox. 45-75 x 30-50 mm, presenta una clula rodeada por tres capas, producen una patologa de dolor de estmago y desnutricin. CESTODOS: Gusanos planos -Taenia: Los huevos miden 20-30 x 30-40 mm, son ovoides con membrana gruesa, amarillenta que se encuentra estriada en forma de empalizada y encierra un embrin de seis ganchos poco visibles. Produce trastornos nerviosos. PROTOZOARIOS: Entamoeba histoltica: Se observan quistes miden aprox. 20 mm se observa con cuatro ncleos. Pueden causar lesin de la mucosa intestinal. Entamoeba coli: Son quistes ms grandes que los de histoltica, tiene ms de cuatro ncleos. Es considerada como no patgena.
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Giardia lamblia: es un protozoo flagelado patgeno que parasita el tracto digestivo de humanos y otros mamferos. Presenta un tamao de 20 micras de longitud y 15 de ancho. Posee 8 flagelos, 2 anteriores, dos posteriores, dos ventrales y dos caudales, cuya funcin es la de motilidad. Proyectada en un plano se parece una pera. OBSERVACIN: Por favor revisar el atlas para segundo nivel ubicado en el internet cuya pgina es ftp.puce.edu.ec TAREA EN CLASE Cada estudiante debe realizar un examen coproparasitario y hacer el reporte para archivarlo en la carpeta
PRACTICA No. 6
CARBOHIDRATOS: Determinacin de glucosa en sangre 1. Objetivos: 1. Conocer la tcnica mediante la cual se determina la glucosa en sangre 2. Diferenciar pacientes con hipo e hiperglicemia 2. Fundamento terico: La glucosa es la principal fuente de energa de las clulas en el organismo. La glucosa es un monosacrido con una concentracin postpandrial de 90 mg/dl en la sangre y sirve como una fuente de energa indispensable para la funcin celular. El diagnstico de los trastornos del metabolismo de los hidratos de carbono se apoya en parte en la medicin de la glucosa plasmtica, ya sea en ayuna o tras estimulacin o pruebas de supresin. Los resultados de la glucosa plasmtica pueden clasificarse como hiperglucmicos (como la diabetes mellitus) o hipoglucmicos. Principio de la reaccin: La prueba utilizada se determina mediante el mtodo enzimtico colorimtrico, basado en la reaccin de Trinder. Glucosa + O2 + H2O GOD (glucosa oxidasa) cido glucnico + H2O2 POD (peroxidasa) quinoneimina (rojo) + 4H2O
2H2O2 + 4-aminoantipirina + fenol
La glucosa se determina despus de la oxidacin enzimtica en presencia de glucosa oxidasa. El perxido de hidrgeno formado reacciona bajo la catlisis de peroxidasa con fenol y 4-aminoantipirina formando un complejo rojo violeta llamado quinoneimina.
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Punto final de una reaccin: Las reacciones catalizadas por enzimas son nicas en el sentido de que presentan aumentos muy grandes de la velocidad en relacin a las reacciones no catalizadas y muestran una cintica de saturacin, es decir la velocidad de la reaccin alcanza un valor mximo a una concentracin determinada de sustrato, no dan por resultado aumento de la velocidad de la reaccin. La medida se realiza siempre en las condiciones ptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc. En estas condiciones, la velocidad de reaccin observada es la velocidad mxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparicin de los productos o la desaparicin de los reactivos. En el caso de la reaccin de la glucosa catalizada por la enzima glucosa oxidasa y la peroxidasa llega a su punto final cuando todo el sustrato (glucosa) se ha oxidado, y despus se mide el cambio de color. Espectofotmetro: La absorbancia y la transmitancia de una sustancia en disolucin se miden con un aparato denominado espectrofotmetro, el cual consta bsicamente de los siguientes componentes: Fuente de luz: Lmpara que emite una mezcla de longitudes de onda. Colimador: Conjunto de lentes que enfocan la luz convirtindola en un haz de rayos paralelos. Monocromador: Dispositivo que selecciona luz de una nica longitud de onda. Detector fotoelctrico: Transductor de luz en electricidad. La luz provoca el desplazamiento de electrones en el metal del detector, produciendo una corriente elctrica que es proporcional a la intensidad de la luz recibida. Registrador: Mide la seal del detector, la compara y genera una medida en una escala determinada.
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A) Esquema de un espectrofotmetro de un solo haz B) Esquema de un espectrofotmetro de doble haz, en el cual se corrigen las variaciones espectrales de los diferentes elementos pticos que lo componen El funcionamiento del espectrofotmetro es el que sigue: la luz de una fuente continua pasa a travs de un monocromador, que selecciona una banda estrecha de longitudes de onda del haz incidente. Esta luz monocromtica atraviesa una muestra de espesor b, y se mide la potencia radiante de la luz que sale. Es necesario calibrar el espectrofotmetro con un blanco antes de medir las absorbancias de la disolucin problema. Esta celda o cubeta de referencia sirve para compensar los efectos de reflexin, dispersin o absorcin de luz de la celda con el disolvente. Cuando emerge poca luz de la muestra (absorbancia alta), la intensidad es difcil de medir. Cuando emerge mucha luz de la muestra (absorbancia baja), es difcil detectar la diferencia de absorbancia entre las celdas de muestra y de referencia. 3. Parte experimental: 3.1. Procedimiento: Ensayo: Longitud de onda: Hg 546 nm. Paso de luz: 1 cm Temperatura: 20-25C Medicin: frente a un blanco de reactivo. Se requiere un blanco de reactivo por serie Esquema de pipeteo: Microdeterminacin Pipetear en las cubetas Blanco de reactivo STD muestra STD muestra 5 ul Reactivo para glucosa 500 ul 500 ul Mezclar, incubar por 10 minutos de 20-25C 5 minutos a 37C. Medir la absorbancia del STD y las muestras frente a un blanco de reactivo antes de 60 minutos.
Materiales y reactivos:
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Materiales Espectrofotmetro Tubos de ensayo Gradilla Pipetas automtica Puntas de plstico para pipetas automt.. Reloj Cubetas de plstico para espectrofot.
Reactivos Reactivo para glucosa Estndar de glucosa (100 mg/dl) Muestras de suero sanguneo ( plasma)
Nota: El espectrofotmetro debe estar encendido 20 minutos antes de leer las absorbancias. 3. Clculo de la concentracin de la glucosa C (mg/dl)= 100 x A muestra A Estndar Valores de referencia: 70 100 mg/dl TRABAJO EN CLASE: Realizar el anlisis de glucosa en un suero sanguneo y luego reportar los clculos en la carpeta con la respectiva interpretacin del resultado
PRCTICA No 7 LPIDOS: Determinacin de colesterol en sangre 1. Objetivos: 3. Conocer la tcnica mediante la cual se determina el colesterol en sangre 4. Diferenciar pacientes con hipo e hipercolesteremia 2. Fundamento terico: Los principales lpidos del plasma humano son el colesterol, los steres del colesterol, los triglicridos, los fosfolpidos y los cidos grasos no esterificados. El colesterol es un importante componente estructural de las membranas celulares y un precursor para la biosntesis de los cidos biliares y las hormonas esteroideas. El riesgo cardiovascular es una funcin continua de la concentracin de colesterol y que los individuos situados en el lmite superior del margen normal tienen un riesgo mayor que los que estn situados en el lmite inferior.
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La prueba utilizada para determinar colesterol es mediante el mtodo enzimtico colorimtrico del siguiente modo: Principio de la reaccin: Esteres de colesterol + H2O Colesterol + O2 CHE(colesterol esterasa) colesterol + cidos grasos CHO (colesterol oxidasa) colesterol- 3-ona + H2O2 Quinoneimina (rojo) + 4 H2O
2H2O2 + 4-aminoantipirina + fenol POD (peroxidasa)
El colesterol se determina despus de hidrlisis enzimtica y oxidacin. El indicador es la quinoneimina (complejo rojo) formada por el perxido de hidrgeno y 4aminoantipirina en presencia de fenol y peroxidasa. 2. Parte experimental: 2.1. Procedimiento: Ensayo: Longitud de onda: Hg 546 nm. Paso de luz: 1 cm Temperatura: 20-25C Medicin: frente a un blanco de reactivo. Se requiere un blanco de reactivo por serie Esquema de pipeteo: Microdeterminacin Pipetear en las cubetas Blanco de reactivo STD muestra STD muestra 5 ul Reactivo para colesterol 500 ul 500 ul Mezclar, incubar por 10 minutos de 20-25C 5 minutos a 37C. Medir la absorbancia del STD y las muestras frente a un blanco de reactivo antes de 60 minutos.
Materiales y reactivos: Materiales Espectrofotmetro Tubos de ensayo Gradilla Pipetas automtica Puntas de plstico para pipetas automt.. Reloj
Reactivos Reactivo para colesterol Estndar de colesterol (200 mg/dl) Muestras de suero sanguneo (o plasma)
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Cubetas de plstico para espectrofot. Nota: El espectrofotmetro debe estar encendido 20 minutos antes de leer las absorbancias. 4. Clculo de la concentracin de colesterol C (mg/dl)= 200 x A muestra A Estndar Valores de referencia: hasta 200 mg/dl TRABAJO EN CLASE: Realizar el anlisis de colesterol en un suero sanguneo y luego reportar los clculos en la carpeta con la respectiva interpretacin del resultado CONSULTA: Criterios de la OMS para: - Sndromes metablicos - Factores de riesgo cardiovascular Nota: Archivar en la carpeta y estudiar para la evaluacin parcial
PRCTICA No. 8 TEMA: Mtodo para electroforesis de protenas en suero Objetivo: Aplicar la tcnica de electroforesis para separar las diversas fracciones protecas del suero humano Fundamento terico: La electroforesis es una tcnica basada en los movimientos de molculas cargadas en un campo elctrico, cada molcula se mueve hacia el electrodo de carga opuesta (ctodo y nodo), este movimiento denominado electroforesis da nombre a la tcnica. En el transporte electrofortico, a la fuerza del campo elctrico se opone la resistencia viscosa del medio, producindose, cuando se igualan una velocidad constante de desplazamiento de las partculas.
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En resumen, puede decirse que cuando una molcula cargada se coloca en un campo elctrico se mover hacia uno u otro electrodo dependiendo de: 1) su carga elctrica, 2) su tamao, 3) la intensidad del campo elctrico y 4) la temperatura del medio. La electroforesis se aplica en el campo de la Bioqumica a la separacin de compuestos que poseen grupos ionizables (aminocidos, pptidos, protenas, cidos nucleicos) teniendo en cuenta que la carga neta de estas sustancias depende del pH del medio en que se encuentren. Si la molcula tiene carga positiva migrar hacia el ctodo, si tiene carga negativa hacia el nodo. La fuerza inica de la solucin tampn tiene una importancia fundamental en la electroforesis, puesto que cuando es baja, permite velocidades de migracin de los solutos ms rpidas y con menor desprendimiento de calor. Las protenas estn compuestas de aminocidos que poseen grupos ionizables (principalmente -COO- y NH+ 3), pueden encontrarse cargadas positiva o negativamente, o bien de permanecer elctricamente neutras segn la proporcin de los diversos grupos ionizados a un determinado pH. En su punto isoelctrico (pI o pH I), la protena tiene carga neta cero. Por debajo de pI las protenas estarn cargadas positivamente y por encima del pI negativamente. El porcentaje normal de estas protenas en el suero humano es: -Albmina54-62% --globulinas9-15% --globulinas14-19% --globulinas14-19%
En el siguiente cuadro se observa la concentracin normal en mg/dl , peso molecular (PM) y funciones de las protenas (el cuadro no presenta una clasificacin completa de las protenas, se observan unos cuantos ejemplos que se encuentran en mayor concentracin) PROTENAS PM CONCENTRACIN FUNCIN 1)Albmina 69000 3500 a 4500 mg/dl Presin onctica y transporte 2)Globulinas alfa1 Alfa1 glucoprotena 40000 55 a 140 mg/dl Protena de fase cida aguda Alfa 1 antitripsina 54000 200 400 mg/dl Proteasa inhibidora 3)Globulinas alfa2 Alfa2 725000 140 420 mg/dl Proteasa inhibidora macroglobulina Haptoglobina 90000 380 a 780 mg/dl Liga HB circulante 3.Globulinas beta Transferrina 76000 200 a 300 mg/dl Transporte del Fe
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Hemopexina 4.Gama globulinas IgG IgA IgM Crioglobulinas
5700 150000 150000 a 300000 750000 a 900000 220
50 a 100 mg/dl 700 a 1500 mg/dl -
Liga el hem Anticuerpos Anticuerpos Anticuerpos Desconocido
TRABAJO EN CLASE: Realizar el anlisis de las protenas en un suero sanguneo y luego reportar en la carpeta con una foto los resultados con una posible patologa de la respectiva consulta (realizar un ejemplo de cada una en la misma foto) CONSULTA: Patologas que se presentan cuando hay aumento disminucin de cada una de las proteinas (albmina, alfa1 y alfa2 globulina, beta1 y beta globulina, gamma globulina) Nota: Archivar en la carpeta y estudiar para la evaluacin parcial PRCTICA No. 9 TEMA: Determinacin de urea (Mtodo enzimtico-colorimtrico) Fundamento terico: La urea es el principal compuesto nitrogenado no proteico ms imporatnte en la mayora de los lquidos biolgicos. En el hombre es el principal producto final del metabolismo proteco. Se produce en el hgado y es excretada en la orina a travs de los riones. Una elevacin de la concentracin srica de urea, se interpreta generalmente como una posible disfuncin renal. Sin embargo, no debe dejarse de lado el hecho de que los valores sricos de urea se encuentran ntimamente relacionados con la dieta y el metabolismo proteico, por lo que cualquier alteracin en estas variables se traducir en un cambio de la concentracin de urea en suero. Fundamento del mtodo: La urea se hidroliza por accin de la ureasa en presencia de agua para producir amonaco y dixido de carbono. En una reaccin de berthelot modificada los iones amonio reaccionan con hipoclorito y salicilato produciendo un complejo verde llamado indofenol que se determina colorimtricamente.
(NH4+)2 + CO2 Nitroprusiato (no es enzima) (NH4+)+salicilato+ClONa+ 2-oxoglutarato NH2 CO NH2 + H2O
ureasa
Indofenol (verde)
Parte experimental:
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1.Procedimiento (en suero o plasma): 1.1. En cuatro tubos de ensayo marcados como B (blanco), S (Standard), M1 (muestra 1) y M2 (muestra 2) agregar: B S M1 M2 Standard 10 ul Suero o plasma 10 ul 10 ul Reactivo 1 1000 ul 1000 ul 1000 ul 1000 ul Enzima ureasa 5 ul 5 ul 5 ul 5 ul Mezclar por agitacin suave e incubar 10 minutos a 20-25 C o por 3 minutos a 37C Reactivo 2 1000 ul 1000 ul 1000 ul 1000 ul Mezclar por agitacin suave e incubar 10 minutos a 20-25 C o por 5 minutos a 37C. Leer la absorbancia de la muestra (A muestra) y del estndar (A Estndar) en espectrofotmetro a Hg 578 nm frente a un blanco reactivo antes de 60 minutos Clculos de concentracin de urea: C (mg/dl)= A_muestra x 80 A estandar Valores de referencia en suero: 10 50 mg/dl Parmetros a considerar: - El espectrofotmetro debe estar encendido 20 minutos antes de realizar las lecturas de las muestras 2.Materiales y reactivos: 2.1. Materiales: -Gradilla -Cuatro tubos de ensayo -Espectrofotmetro -Pipetas automticas -Puntas de plstico para pipeta automtica -Cubetas de plstico para espectrofotmetro -Reloj 2.2.Reactivos: -Reactivo 1: Buffer fosfatos (pH 7.0), Salicilato de sodio, Nitroprusiato de sodio, EDTA -Reactivo 2: Buffer fosfato (pH 13), hipoclorito -Standard: solucin de urea 80 mg/dl -Ureasa (enzima): Solucin estabilizada y tamponada de alta potencia -Suero sanguneo TRABAJO EN CLASE: Realizar el anlisis de urea en un suero sanguneo y luego reportar los clculos en la carpeta con la respectiva interpretacin del resultado
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PRCTICA No. 10 TEMA: Determinacin de transaminasas : TGO y TGP Las transaminasas son unas enzimas, principalmente localizadas en el hgado. Las ms importantes son: - TGO: Transaminasa glutmicooxalactica. Est presente en casi todos los rganos, dentro de las clulas y que cuando se encuentran en sangre en niveles muy elevados significa que ha habido destruccin celular. - TGP: Transaminasa glutmicopirvica. Se localiza principalmente en el hgado y su misin es la fabricacin de glucosa. Se utilizan en la clnica para la confirmacin diagnstica del infarto agudo de miocardio y para el estudio de enfermedades hepticas o musculares. Para realizar el examen en sangre, previamente es necesario que el paciente, unos das antes, haga una dieta en la que no sobrecargue el hgado, no tomando alcohol, escasas protenas y grasas y tambin es necasrio no realizar esfuerzos fsicos importantes Parte experimental: 1.Procedimiento (en suero o plasma) tanto para TGO como para TGP: Longitud de onda: Hg 334 nm Temperatura: 25 C Cubeta: 1 cm paso de luz Ajuste cero: contra el aire Reactivo de trabajo Muestra 1000 ul colocar en la cubeta 100 ul colocar en la cubeta
Mezclar e incubar por 1 minuto a temperatura de 25 C, leer en el espectrofotmetro (A1), repetir las lecturas exactamente al 2do.( A2) y 3er. Minuto(A3) Realizar los clculos: A/ min = A1 - A2 (usando los dos primeros minutos de lecturas de absorbancia) A1/ min = A1 - A2 (usando los tres minutos de lecturas de absorbancia) A2/ min = A2 A3 A/ min = (A1 + A2)/2 Concentracin de TGP = A x 1790 Concentracin de TGO= A x 1790 Reportar los resultados en U/l
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Valores de referencia (vara de acuerdo a la marca comercial del reactivo y a la temperatura de medicin): TGO: Mujeres hasta 32 U/l Hombres hasta 38U/l TGP: Mujeres hasta 31 U/l Hombres: hasta 41 U/l Parmetros a considerar: - Espectrofotmetro encender 20 minutos antes de realizar las lecturas de las muestras 2.Materiales y reactivos: 2.1. Materiales: Espectrofotmetro, pipetas automticas, puntas de plsticos para pipeta, cubetas, reloj 2.2.Reactivos: TGO y TGP TRABAJO EN CLASE: Realizar el anlisis de TGO TGP en un suero sanguneo y luego reportar los clculos en la carpeta con la respectiva interpretacin del resultado
PRCTICA No. 11 TEMA: Determinacin de bilirrubina total y directa El 80-85% de la bilirrubina se origina de la degradacin de la hemoglobina con un 1520% que es derivada del citocromo, mioglobina y catalasas. La bilirrubina no conjugada, la cal se liga a la albmina del plasma, es producida en el curso de la degradacin en el sistema reticuloendotelial, clulas Kupffer del hgado, bazo y mdula sea. Los ensayo de bilirrubina son posible para evaluar el grado de severidadad de los sntomas clnicos de la ictericia as como para evaluar la funcin y el estado del hgado. Significado de los resultados anormales La ictericia es la coloracin amarillenta de la piel y de la esclertica del ojo, que ocurre cuando la bilirrubina se acumula en la sangre a un nivel mayor a 2.5 mg/dL aproximadamente. La ictericia se presenta porque los glbulos rojos se estn descomponiendo demasiado rpido para que el hgado los procese, lo cual podra suceder debido a una enfermedad heptica o a una obstruccin de las vas biliares. Si hay una obstruccin de las vas biliares, la bilirrubina directa se acumular, escapar del hgado y terminar en la sangre. Si los niveles son lo suficientemente altos, una
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parte de ella aparecer en la orina. Slo la bilirrubina directa aparece en la orina. El aumento de la bilirrubina directa generalmente significa que las vas biliares (secrecin heptica) estn obstruidas. El aumento de la bilirrubina indirecta o bilirrubina total pueden ser un signo de:

Sndrome de Crigler-Najjar Eritoblastosis fetal Enfermedad de Gilbert Cicatrizacin de un hematoma grande (moretn o sangrado bajo la piel) Anemia hemoltica Enfermedad hemoltica del recin nacido Hepatitis Ictericia fisiolgica (normal en los recin nacidos) Anemia drepanoctica Reaccin a una transfusin Anemia perniciosa
El aumento de la bilirrubina directa puede indicar:

Obstruccin de las vas biliares Cirrosis Sndrome de Dubin-Johnson (muy raro) Hepatitis Colestasis intraheptica (acumulacin de bilis en el hgado) debido a cualquier causa
En presencia del acelerador cafena, la bilirrubina total se acopla con el cido sulfnico para formar un complejo azobilirrubinado rojo, la intensidad del color es proporcional a la concentracin de la bilirrubina. La determinacin de la bilirrubina directa es desarrollada sin aditivo de cafena. La adicin de tartrato alcalino causa una transformacin del complejo rojo de la azobilirrubina a un complejo azul y las lecturas de las absorvancias son entre 546-578 nm. Bilirrubina total: Acido sulfanlico + NaNO2 Bilirrubina + cido sulfnico diazotizado Azobilirrubina + tartrato 1. Esquema de pipeteo: Bilirrubina total Microdeterminacin
cido sulfnico diazotizado cafena complejo verde azobilirrubina (rojo)
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Pipetear en las cubetas Blanco de reactivo Muestra Reactivo 1 100 ul 100 ul Reactivo 2 -----25 ul Reactivo 3 500 ul 500 ul Muestra 100 ul 100 ul Mezclar, incubar por 10-60 minutos a temperatura ambiente. Aadir: Reactivo 4 500 ul 500 ul Mezclar e incubar a temperatura ambiente por 5-30 minutos. Leer la absorbancia de la muestra contra el blanco Bilirrubina directa Pipetear en las cubetas Blanco de reactivo Muestra Reactivo 1 100 ul 100 ul Reactivo 2 -----25 ul Solucin NaCl 0.9% 1000 ul 1000 ul Muestra 100 ul 100 ul Mezclar, incubar por 5 minutos a temperatura ambiente. Leer la absorbancia de la muestra contra el blanco 2. Clculos: Bilirrubina total: C (mg/dl)= 10.8 x A bilirrubina total Bilirrubina directa: C (mg/dl)= 13.7 x A bilirrubina directa Bilirrubina indirecta: BI= Bilirrubina total (BT) - bilirrubina directa (BD) 3. Materiales y reactivos: Materiales Espectrofotmetro Tubos de ensayo Gradilla Pipetas automtica Puntas de plstico para pipetas automt.. Reloj Cubetas de plstico para espectrofot. Reactivos Reactivos para bilirrubina Muestras de suero sanguneo ( plasma)
Nota: El espectrofotmetro debe estar encendido 20 minutos antes de leer las absorbancias. Valores de referencia: Bilirrubina total: hasta 1.0 mg/dl Bilirrubina directa: hasta 0.25 mg/dl TRABAJO EN CLASE:
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Realizar el anlisis de las bilirrubinas en un suero sanguneo y luego reportar los clculos en la carpeta con la respectiva interpretacin del resultado BIBLIOGRAFIA:
ngel M., G. y M. ngel R., Interpretacin Clnica del Laboratorio, 6. edicin, Editorial Mdica Panamericana, Bogot, 2.001 Henry, J. B., Diagnstico y Tratamiento Clnicos por el Laboratorio, 9. Edicin, Editorial Salvat Mdica, Mxico, 1.993 Manual de Bioseguridad en el Laboratorio, O. M. S., Ginebra, 1.994 Mtodos Bsicos de Laboratorio en Parasitologa Mdica, O. M. S., Ginebra, 1.992 Morn Villaroto, Obtencin de Muestras Sanguneas de Calidad Analtica, Editorial Mdica Panamericana, Mxico, 2.001
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La solucin en efecto est diluida 20 veces

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2H2O2 + 4-aminoantipirina + fenol

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2H2O2 + 4-aminoantipirina + fenol POD (peroxidasa)

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Hemopexina 4.Gama globulinas IgG IgA IgM Crioglobulinas

5700 150000 150000 a 300000 750000 a 900000 220

50 a 100 mg/dl 700 a 1500 mg/dl -

Liga el hem Anticuerpos Anticuerpos Anticuerpos Desconocido

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El aumento de la bilirrubina directa puede indicar:

cido sulfnico diazotizado cafena complejo verde azobilirrubina (rojo)

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