INTRODUCCION

Con el nombre de cumarinas se conoce a un grupo muy amplio de principios activos fenlicos que se encuentran en plantas medicinales y tienen en comn una estructura qumica de 2H-1- benzopiran-2-ona, denominada cumarina. Sobre esta estructura, que se origina biosintticamente por lactonizacin del cido cumarnico (2-hidroxi-Zcinmico), se disponen sustituyentes de distinta naturaleza qumica lo que da lugar a distintos tipos de cumarinas: sencillas y complejas.

Las cumarinas son compuestos ampliamente distribuidos en las plantas principalmente en la familia de las Umbeliferae y Rutaceas, se encuentra en todas partes de la planta desde la raz a flores y frutas. Las cumarinas son esteres cclicos de la orto hidroxi del acido cinmico, en realidad son lactonas de los cidos o hidroxicinamicos. El nombre de cumarina proviene de un rbol nativo de la Guayana Coumarona o rbol de la Tonka de donde se obtuvo cristalizado. Despus se ha encontrado en estado libre bajo forma de glucsido en diversos vegetales a los que da su agradable olor.

PRINCIPIOS TEORICOS

CUMARINAS
Las cumarinas constituyen un grupo importante de compuestos naturales, se le considera derivados de la lactona del cido o-hidroxicinmico, usualmente llamada cumarina:

u m

a r i n a

Prcticamente todas las cumarinas, a excepcin de la cumarina propiamente dicha, poseen un sustituyente hidroxlico en posicin 7, ya sea libre, como sucede en la umbeliferona, o combinado (metilo, azcares, etc.). Las cumarinas sencillas pueden poseer adems hidrxilos adicionales tambin libres o combinados. Ejemplo de ellas son el esculetol del castao de Indias con dos hidrxilos libres sobre los carbonos C-5 y C-7 o el escopoletol presente en algunas Solanceas (belladona) que posee un hidroximetilo en C-5 y un hidrxilo libre en C-7. Las cumarinas son compuestos ampliamente distribuidos en las plantas, principalmente en las familias Umbelferas y Rutaceae; se encuentran en todas las partes de la planta, desde la raz a flores y frutos siendo ms abundante en estos ltimos; se presentan a menudo como mezclas, en forma libre o como glicsidos.

Clasificacin de las cumarinas

1. 2. 3. 4. 5. 6. Hidroxicumarinas. Cumarinas preniladas: cadenas isoprnicas. Furanocumarinas: anillo de furano condensado. Piranocumarinas: anillo pirano condensado. Dicumarinas. Cumarinas sustituidas.

La cumarina se puede encontrar en las plantas como tal o en forma de cido hidroxicinmico (prdida de agua)

Hidroxicumarinas a) 7-hidroxicumarina; (umbeliferona) aislada por primera vez a partir de resinas de umbeliferas b) 6,7-dihidroxicumarina (esculetina) encontrada en el Castao de Indias en forma de 6-glucsido, llamado esculina c) 6-metoxi-7,8-dihidroxicumarina (fraxetina) encontrado en forma de hetersido, llamado fraxina d) 6-metoxi-7hidroxicumarina (escopoletina) que tambin se puede encontrar en forma de 7-glucosido, llamado escopolina Furanocumarinas Pueden ser de dos tipos: a) Lineales, el anillo se condensa en 6-7 ( 6,7-furanocumarinas) b) Angulares, el anillo se condensa en 7,8 (7,8-furanocumarinas) Piranocumarinas Pueden ser: a) Lineales, 6,7 piranocumarinas b) Angulares: 7,8 piranocumarinas Dicumarinas Condensacin por un metileno (dicumarol) Propiedades Las cumarinas son slidos cristalizables, blancos o amarillentos, algunos son sublimables. a) Las hidroxicumarinas sencillas son solubles en etanol, acetato de etilo y agua. b) Las pirano y furanocumarinas son solubles en agua en etanol, pero tambin en disolventes orgnicos apolares: ter de petrleo. c) Las hidroxicumarinas sencillas presentan al ultravioleta fluorescencia azul o verde. d) Lo ms tpico es el anillo de lactona, que se puede aprovechar para la identificacin pero tambin para la extraccin. Deteccin de cumarinas por su anillo de lactona El clorhidrato de hidroxilamina en presencia de tricloruro de hierro es bastante especfico de lactonas, pero poco sensible. La cromatografa en papel o capa delgada y observacin al ultravioleta o pulverizacin con reactivo. Las cumarinas sublimables se pueden detectar poniendo la droga en agua en un tubo de ensayo, se tapa con papel de filtro impregnado con NaOH, calentamos el tubo y despus se observa el papel de filtro al ultravioleta, tiene que verse una fluorescencia, donde la sosa juega el papel de aumentarla.

Extraccin A partir de las plantas desecadas, como hay variacin de estructura y solubilidad, es mejor hacer extraccin con distintos disolventes, empezando por los menos polares y aumentando progresivamente. Eter de petrleo, cloroformo, ter, acetato de etilo, metanol, agua. Purificacin Se usan distintas columnas cromatogrficas con distintos adsorbentes y una vez aislados se hace la caracterizacin por espectroscopia. Para las hidroxicumarinas, extraemos con lcali diluido y caliente, se abre el anillo de lactona y se forman las sales correspondientes del cido hidroxicinmico, para lavar las impurezas el lcali diluido se extrae con ter, acidificamos y la cumarina vuelve a formarse. Se extrae con ter la cumarina pero es frecuente que existan otros cidos fenlicos junto a la cumarina. Para eliminarlos, extraemos con bicarbonato de sodio, ah pasarn los cidos y en el ter quedarn las cumarinas puras. Ensayos Normalmente la extraccin se hace con metanol caliente y se lleva el extracto a cromatografa. Se pueden usar reacciones de color: a) Clorhidrato de hidroxilamina ms tricloruro de hierro b) Ester amino etlico del cido difenilbrico Valoracin a) b) c)

Fluorimetra, Castao de Indias. Colorimetra. Coagulacin con sales de diazonio de fenoles.

Importancia en farmacognosia a) La cumarina es un aromatizante. b) Tienen propiedades vitamnicas, disminuyen la permeabilidad capilar y aumentan la resistencia de las paredes de capilares (protegen la fragilidad capilar y actan como tnico venoso) c) Las furanocumarinas son fotosensibilizadoras de la piel. d) Las piranocumarinas tienen accin antiespasmdica y vasodilatadora de coronarias. e) Algunos tienen propiedades sedantes, como la angelicina. f) Pueden tener propiedades hipnticas. g) Propiedades estrognicas. h) Accin antiinflamatoria. i) Accin antibacteriana. j) Accin hipodrmica. k) Accin analgsica. l) Accin anticoagulante.

m) Reconocimiento de algunas drogas (mana, solanceas midriticas, castao de indias). PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Muestra: Ruda 1. Reaccin de identificacin Colocar 2 gotas de extracto en una tira de papel whatman y colocar sobre ella una gota de NaOH 10%. La observacin de fluorescencia verde amarillenta bajo la lmpara UV 365 nm indica la presencia de cumarinas fijas. 2. Anlisis cromatogrficos Sistemas: Solventes CHCl3:CH3OH Hexano:EtOAc CH2Cl2:MeOH CHCl3:CH3OH Tolueno:EtOAc Proporci n (9:1) (3:1) (12:1) (1:1) (97:7)

La fluorescencia verde indica la presencia de furanocumarinas como el bergapteno. La fluorescencia prpura indica la presencia de alcoxicumarinas.

RESULTADOS Muestra:(foto cortesa: de otro grupo)

Ruda 1. Reaccin de identificacin

Cromatograma con NaOH 10%

DISCUSION DE RESULTADOS

En la presente practica se determino la presencia de cumarinas, para ello el extracto etanlico de ruda es colocado en papel de filtro y otro en algodn tratado con una gota de NaOH, mediante una lmpara ultravioleta (UV) 365 nm se observan fluorescencia verde amarillenta, la cual nos indica la presencia de cumarinas fijas. La adicin de la sosa juega el papel de aumentar la fluorescencia. En la practica se realizo el anlisis gromatogrfico en capa fina (CCD) ya que la mayora de las cumarinas carecen de la polaridad adecuada para separarse bien por cromatografa en papel; pero con la cromatografa en capa delgada es muy conveniente para determinar cumarinas y aun para aislarlas. El sistema fue hexano: EtOAc (3:1). Luego de desarrollar la cromatografa y preceder el revelado mediante un agente fsico UV se detecto la presencia de furanocumarinas como el bergaptano (componente cumrico principal en la Ruda).

CONCLUSIONES El extracto etanolico presenta cumarinas. Mediante la propiedad de fluorescencia que presenta la cumarina (especialmente la furanocumarina y las alcoxicumarinas) estas sern detectadas fcilmente mediante lmpara UV (a 365nm). Todas las cumarinas se caracterizan por la estructura benzo - - pirona y su carcter lactnico hacen que sean solubilizadas en solventes polares como el etanol. La adicin de sosa (NaOH) es importante en la adicin de las cumarinas, ya que aumenta la fluorescencia. El extracto etanolico de Ruda revela furanocumarinas, esencialmente Bergaptano componente cumrico de la Ruda (Ruta graveolens L.).

RECOMENDACIONES

El calentamiento por reflujo (en Soxhlet) se debe realizar por un tiempo de 2 horas para nuestro caso, para poder extraer las cumarinas presentes en la muestra vegetal. Este tiempo ser en funcin de la cantidad de la muestra.(Lo hicieron los otros grupos) Realizar un cartucho adecuado de tal forma que no permita la salida de partculas posibles de muestra seca de Ruda. El papel debe ser tupido. Se debe recuperar el etanol una vez extradas las cumarinas, en el mismo equipo retirando el cartucho y poniendo en reflujo solo el solvente hasta concentrar por lo menos 30 mL del extracto.

BIBLIOGRAFIA

Domnguez Xorge Alejandro, Mtodos de investigacin Fitoqumica, Editorial Limusa, 1973, Pginas: 111 114. Lock de Ugaz, Olga Investigacin Fitoqumica, 2da. Edicin, 1994, Editorial Fondo Pontificia Universidad Catlica del Per, Pginas: 146 - 154. SALIBA, Elosa de Oliveira Simoes, RODRIGUEZ, Norberto Mrio, MORAIS, Srgio Antonio Lemos de et al. Lignins: isolation methods and chemical characterization. Cienc. Rural, sep./oct. 2001, vol.31, no.5, p.917-928.

Internet: http://www.racve.es/actividades/zootecnia/2000-06-09LeopoldoCuellar Carrasco.htm http://www.elergonomista.com/fitoterapia/cumarinas.htm http://www.ucm.es/info/ffarma/Proyecto/Asignaturas/FarmacognosiaI/Tema13.htm

http://milksci.unizar.es/bioquimica/temas/toxico/micotoxinas.html http://www.portalfarma.com/pfarma/taxonomia/general/gp000011.nsf/voDocum entos/4DE2A2030B26B6F0C1256A790048D68C/$File/233.pdf http://www.fibra-salud.com/.%5CObra%5C9.htm

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CUESTIONARIO 1. Cules son las funciones de actividad biolgica conocida de estos compuestos? De cinco ejemplos con su actividad biolgica. Tienen propiedades vitamnicas, disminuyen la permeabilidad capilar y aumentan la resistencia de las paredes de capilares (protegen la fragilidad capilar y actan como tnico venoso). Las piranocumarinas tienen accin antiespasmdica y vasodilatadora de coronarias. Algunos tienen propiedades sedantes, como la angelicina. Pueden tener propiedades hipnticas. Propiedades estrognicas (cumestrol). Accin antiinflamatoria. Accin anticoagulante y antibacterial (dicumarol). Accin hipodrmica. Accin analgsica. Accin insecticida (surangin A y B). Accin hepatoxicidad y carcinogenicidad (flatoxinas). Accin antibitica (novobiocina). Reconocimiento de algunas drogas (mana, solanacaeas midriticas, castao de indias), utilidad en el tratamiento de algunas alteraciones de la piel como por ejemplo la psoriasis debido a sus propiedades fotosensibilizantes (furanocumarinas: bergapteno y xantotoxina). Las cumarinas inhiben la germinacin de semillas y en pequeas concentraciones favorecen el crecimiento de las races, lo cual es probable que tenga significacin fisiolgica.

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2. Nombre cinco cumarinas (las ms importantes) con su estructura.

3. A que cree Ud que se debe la fotosensibilidad de estos compuestos? La actividad fotosensibilizante de las furanocumarinas sobre las clulas, se manifiesta como fototoxicidad que altera y desorganiza numerosos procesos biolgicos en diferentes tipos de clulas como clulas bacteriales o fngicas, en virus a nivel de DNA, en clulas de mamferos in Vitro, en tejidos vegetales, y en clulas epidrmicas en aves y mamferos. Esta actividad fotosensibilizante es explicable debido a la reactividad del estado triplete de las furanocumarinas que se genera cuando stas interactan con la radiacin U.V., y cuyas posibles reacciones se pueden agrupar en dos categoras:

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 Los fotoenlaces directos con macromolculas como el DNA, el RNA y las protenas. Las fotomodificaciones indirectas a los sustratos biolgicos a travs de formas reactivas del oxgeno.

Las furanocumarinas se han usado, junto con la radiacin U.V., en el tratamiento de varias enfermedades de la piel como la psoriasis, el vitiligo y la micosis fungoides; el bergapteno, adems se usan como protectores solares en preparaciones cosmticas. 4. Por qu usa la cromatografa para su deteccin? Cual es la diferencia de usar una cromatografa de celulosa y una de silicagel? Se usa la cromatografa porque permite la separacin de componentes cumarios de una determinada muestra. La cromatografa es una tcnica fisicoqumica que permite separar los componentes o sustancias integrantes de una mezcla en movimiento por absorcin o separacin diferencial de estos componentes sobre una superficie estacionaria o inmvil. La diferencia de una cromatografa de celulosa y una silicagel radica en que la mayora de las cumarinas carecen de la polaridad adecuada para separarse bien por cromatografa en papel; pero con la cromatografa en capa delgada es muy conveniente determinar cumarinas y aun para aislarlas. El adsorbente mas usado ha sido la gel de slice. 5. Qu son aflatoxinas? Cmo se forman? Quin las produce? Cmo se les puede identificar? Las aflatoxinas (AF) son un grupo de mohos, micotoxinas producidas por hongos del gnero Aspergillus (especialmente A. Flavus, A. Parasiticus y A. nominus). Se trata de mohos toxignicos, capaces de desarrollarse en gran variedad de sustratos, pudiendo contaminar los alimentos cuando stos son cultivados, procesados, transformados o almacenados en condiciones adecuadas que favorezcan su desarrollo. El crecimiento de estos mohos y la produccin de toxinas dependen de muchos factores como el alimento en cuestin, su grado de acidez, la temperatura o humedad ambientales y la presencia de microflora competidora La composicin qumica de las aflatoxinas vara con las cepas, el sustrato o materia orgnica sobre el cual crece y las condiciones ambientales del crecimiento del hongo. En los alimentos (leche y carne, entre otros) y granos (maz, trigo etc.), generalmente se han identificado cuatro tipos de aflatoxinas, que son aflatoxina B1 (AFB1), aflatoxina B2 (AFB2), aflatoxina G1 (AFG1) y aflatoxina G2 (AFG2). La AFB1 es la ms txica y carcinognica y generalmente es la que predomina. En rumiantes la AFB1 se metaboliza por la microflora ruminal a aflatoxina M1, identificndose concentraciones sanguneas apreciables de sta. La glndula mamaria constituye una ruta de eliminacin importante para estas sustancias. Se reporta que del 1 al 3 % de la AFB1 ingerida por el organismo, se elimina en la leche en forma de AFM1.

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Los micelios de sta y otras especies afines productoras de aflatoxinas, son capaces de colonizar semillas y tortas de oleaginosas de man, girasol, algodn, soja, ssamo, avellanas, almendras y cereales y sus derivados dispuestos en sacos o silos. El crecimiento de este hongo se ve afectado por la termohigrotropa, es decir que responde al estmulo de la temperatura y la humedad relativa de la atmsfera y del sustrato.

As, la formacin de aflatoxinas en el man tiene lugar si este se almacena entre 20 y 40C con un 10-20% de humedad y con un 70-90% de humedad relativa en el aire: el crecimiento del hongo se ve favorecido si los granos estn daados por insectos o roedores. Para el anlisis de aflatoxinas totales se utiliza un mtodo de cromatografa de afinidad con anticuerpos monoclonales (AFLATEST) y su confirmacin e identificacin se realiz mediante cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) con deteccin por fluorescencia. Entre las principales manifestaciones asociadas a la exposicin de estas sustancias, estn el dao heptico y renal, mutagnesis, teratognesis, carcinognesis, inmunosupresin y citotoxicidad. Algunas caractersticas importantes de estas toxinas son su capacidad de bioconcentracin, bioacumulacin y su gran estabilidad. 6. En que tipos de alimentacin se pueden formar las aflatoxinas y cuales serian las consecuencias en el ser humano. Los mayores niveles de contaminacin por aflatoxinas se han descrito en semillas de algodn y maz, cacahuates, nueces, avellanas y otros frutos secos. En cereales como el trigo, arroz, centeno o cebada, la presencia de estos txicos suele ser menor. Se cree que las condiciones climticas de las zonas tropicales favorecen la contaminacin por aflatoxinas, aunque estn pueden estar presentes tambin en zonas templadas. Se han identificado hasta 18 tipos de aflatoxinas, de las cuales la B1, secretada en la leche de los animales que consumen alimentos contaminados ostenta una preocupacin sanitaria especial. Estudios fisiolgicos han revelado que las aflatoxinas poseen una actividad mutgena y carcingena, as como que la variedad B1 es la mas toxica. Un comit mixto de la FAO y la OMS, integrado por expertos en aditivos, ha definido a las aflatoxinas como potentes carcingenos humanos, si bien no existe aun informacin suficiente para establecer una cifra fija sobre grados de exposicin tolerable. Los expertos se limitan a aconsejar que no se abuse en el consumo de frutos secos. Los efectos nocivos de la intoxicacin por aflatoxinas en los animales (y presumiblemente en humanos) ha sido clasificada en dos formas generales: Se produce aflatoxicosis aguda cuando se consumen niveles medios a altos de aflatoxinas. Los efectos de esta intoxicacin pueden incluir hemorragia, dao agudo del hgado, el edema, la alteracin en la digestin, la absorcin y/o el metabolismo de alimentos, y posiblemente la muerte. La aflatoxicosis crnica resulta del consumo de niveles bajos a moderados de aflatoxinas. Los efectos son generalmente subclnicos y difciles de reconocer. Algunos

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de los sntomas comunes son una difcil y deteriorada absorcin de los alimentos e ndices de crecimiento mas lento. Para que un animal (o ser humano) haya muerto por causa de las alfatoxinas debi ser suministrado con grandes dosis de las mismas y posiblemente durante largo tiempo, esto pone en duda la cadena entera de control de calidad sobre la que el gobierno nacional (adems de la empresa) tiene una gran cuota de responsabilidad.

7. Que son ligninas? De ejemplos con sus respectivas estructuras. La lignina se caracteriza por ser un complejo aromtico (no carbohidrato) del que existen muchos polmeros estructurales (ligninas). Resulta conveniente utilizar el trmino lignina en un sentido colectivo para sealar la fraccin lignina de la fibra. Despus de los polisacridos, la lignina es el polmero orgnico ms abundante en el mundo vegetal. Es importante destacar que la lignina es la nica fibra no polisacrido que se conoce La lignina realiza mltiples funciones que son esenciales para la vida de las plantas. Por ejemplo, posee un importante papel en el transporte interno de agua, nutrientes y metabolitos. Proporciona rigidez a la pared celular y acta como puente de unin entre las clulas de agua, nutrientes y metabolitos. Proporciona rigidez a la pared celular y acta como puente de unin entre las clulas de la madera, creando un material que es notablemente resistente a los impactos, compresiones y flexiones. Realmente, los tejidos lignificados resisten el ataque de los microorganismos, impidiendo la penetracin de las enzimas destructivas en la pared celular. La estructura de la lignina est compuesta por polmeros fenilproplicos en las paredes celulares, son altamente condensados y muy resistentes a la degradacin. Ellos son compuestos de unidades phidroxifenil (H), guaiacil (G) y siringila (S), en proporciones diferentes, de acuerdo con su origen.

8. Por qu es importante el uso de bloqueadores solares? Los bloqueadores solares constituyen la primera lnea de defensa contra el cncer. Estos productos protegen la piel absorbiendo, reflejando y diseminando las radiaciones ultravioleta (UVA y UVB). Estas radiaciones no producen calor, por lo que pueden ocurrir quemaduras por descuido, cuando hay brisa o cielo nublado. Por otra parte, la sombra ofrece poca proteccin ya que las radiaciones ultravioleta se reflejan en el agua y la arena, adems penetran algunos metros bajo el agua. La mayora de bronceadores bloquean la radiacin ultravioleta B (UVB), que produce bronceado, quemaduras y riesgo de cncer, pero pocos productos protegen contra la radiacin ultravioleta A (UVA) que penetra mas lentamente, causando cambios en al vasculatura sangunea, manchas, envejecimiento cutneo y riesgo de cncer.

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Para reconocer los diferentes tipos de bloqueadores, se utiliza la escala SPF (Sun Protection Factor). A mayor SPF, mayor ser la proteccin que el producto ofrecer. La escogencia del bloqueador solar depender de su tipo de piel: si se quema fcilmente con exposicin solar mnima, debera utilizar un bloqueador con SPF alto. Por ejemplo: un factor SPF de 10, permitira a una persona que se quema en media hora de exposicin solar, recibir sol durante 5 horas, es decir, 10 veces mas tiempo que el usual.

Los compuestos importantes en los bloqueadores solares son las cumarinas: umbeliferota, esculetina y herniarina, estos se agregan a los preparados de proteccin solar principalmente por su capacidad de absorcin en la regin UV (280 a 315 nm), cuya radiacin causa la formacin de eritemas en la piel. 9. Qu tipo de cumarinas estn presentes en la ruda y el apio? En la ruda se encuentran especialmente la furocumarinas como el bergapteno. En el apio se encuentran los piranocumarinas con la rutaretina. 10. Dnde se encuentran a las cumarinas generalmente? Las cumarinas se encuentran generalmente en frutos, tallos, semillas, hojas. Famila: Rutaceae, Umbeliferaceae,, Solanaceae, Gramineceae, laminaceae.

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