Professional Documents
Culture Documents
R.I.A
INTRODUCTION
La radio-immunologie fait appel la physique nuclaire
radioactivit et l'immunologie, pour le dveloppement de la mthode de dosage radio-immunologique. Technique trs sensible qui permet de mesurer des quantits infimes de substances biologiquement actives. Avec la collaboration du mdecin amricain Solomon Berson, Rosalyn Yalow commence utiliser les radio-isotopes pour explorer et diagnostiquer diverses maladies. Leurs tudes sur les mcanismes du diabte de type 2 les conduisent dvelopper la mthode de dosage radioimmunologique : RIA Le premier dosage radio immunologique : Dosage de linsuline par Yalow et Berson en 1959 Point de dpart dun ensemble de mthodes dimmuno-dosages faisant appel un traceur.
En effet, on marque les molcules avec un radionuclide, qui est gnralement de l'iode 131 ou 125 ou du Trium H3
Le DRI repose sur lutilisation : Raction Ag-Ac Mthodes radioactives Cette combinaison est responsable de la spcificit et de la sensibilit du DRI
Les DRI peuvent tre classes en deux groupes selon les proportions relatives danticorps et dantignes prsentent dans la raction.
On distingue : -Le dosage R.I. classique : RIA ou dosage par comptition, en dfaut dAC -Le dosage immuno-radiometrique : IRMA, en excs dAC
Ag-Ac forms des Ac ou Ag rests en solution. L'Ac non marqu (Aco) et l'Ac marqu (Ac*) se fixent l'Ag dans les proportions de leur mlange. La quantit du complexe Ac*-Ag diminue au fur et mesure qu'augmente la quantit d'Aco dans le milieu. La mesure de la radio-activit du complexe Ac*-Ag ne peut tre faite qu'aprs limination de la fraction Ac* libre
B / F = B*/ F* Le signal dlivr par le marqueur est inversement proportionnel la concentration en antigne.
Les mthodes pour sparer le constituant libre et le constituant li dans le complexe Ag-Ac sont nombreuses et font appel diffrentes techniques -Prcipitations * soit immunologique (mthode du double Ac) : le complexe Ag-Ac est prcipit par un srum anti-gammaglobuline; * soit physico-chimique : par les solvants organiques (alcools...), le sulfate d'ammonium demi-saturation (Test de Farr), la protine A du staphylocoque; * soit fixation de l'Ag sur un support solide : c'est la mthode la plus dveloppe actuellement de par sa simplicit et sa rapidit de mise en uvre. Les dosages immunologiques par comptition sont raliss principalement avec les isotopes radioactifs et les enzymes comme marqueurs.
9
10
Sappliquent tous les antignes, en particulier aux haptnes Ncessitent une constante daffinit leve
Possibilit de ractions croises TSH, FSH-LH, HCG possdent en commun une sous unit Tout Ac qui reconnat un pitope reconnat les 4 hormones
11
prsence dun excs dAc utilisation dun 2eme Ac marqu 2 Ac dirigs contre 2 pitopes suffisamment loigns sur la molcule dAg
La molcule tester est prise en sandwich entre les deux Ac La radioactivit lie est proportionnelle la quantit dAg
12
Dans ces tests, l'Ag (ou l'Ac) est fix un support solide (billes,
tubes, plaques de microtitration en polystyrne. Dans le premier temps de la raction, le liquide biologique tester, contenant les Ac (ou les Ag), est mis en contact avec le support "sensibilis" qui est ensuite lav. Dans un deuxime temps, les Ac (ou les Ag) qui se sont fixs, sont rvls par l'addition d'un second Ac marqu : soit par un isotope radioactif pour les radio-immuno-assays (RIA), (soit par une enzyme pour l'enzyme linked immuno sorbent assay (ELISA) ou pour l'immunoblot, soit par un fluorochrome pour la fluorimtrie). Aprs lavage, l'activit rsiduelle est mesure par un systme adquat spcifique du marqueur (compteur de dsintgration, substrat de l'enzyme et spectrophotomtre, fluorimtre...)
13
14
Sensibilit Toute molcule(trace) dAg mise en prsence de lAc liant est susceptible dtre capte Gamme de concentrations plus tendues(dtections en exces)
Inconvnients
Pour liminer ce phnomne ; addition squentielle des ractifs spare par une tape de lavage.
Test de Farr est une technique de dosage radio-immunologique : elle utilise de lADN double brin marqu par un radio-isotope (125I).
Elle se droule en 4 tapes :
Incubation du srum du patient(Ac anti ADN) avec lADN double brin marqu Sparation des complexes immuns par prcipitation et centrifugation Elimination de lADN double brin marqu non li l Ac Mesure de la radioactivit (proportionnalit entre la radioactivit mesure et la quantit danticorps prsents dans le srum)
croissantes d'Aco pour une mme quantit connue et constante d'Ac*, permet par simple report de connatre une quantit inconnue d'Aco contenue dans un liquide biologique
16
17
Marqueurs
Elment
Radioactivit (Ci/mmol)
Demi-vie
Rayonnement
C14 H3
0.062 29
I125
I131
2200
16100
59.7 j
8.1 j
18
Principe du dosage
Le RIA-gnost hTSH permet de doser in vitro la thyrotrophine dans le srum (ou le plasma) humain daprs le principe du test sandwich 1 tape.
Au cours de ce test, il se forme un complexe entre lanticorps anti-hTSH (monoclonal, souris) fix sur la paroi du tube, la TSH contenue dans lchantillon et lanticorps anti-hTSH marqu l125I (monoclonal, souris). Une fois la raction effectue, la partie libre du traceur est limine par dcantation (ou aspiration) et rinage. La fraction de traceur spcifiquement fixe sur les tubes revtus danticorps est mesure laide dun compteur gamma. Lvaluation des rsultats fournis par les chantillons inconnus se fait laide dune courbe dtalonnage tablie dans des conditions identiques. En cas de dosages effectus en double, on peut traiter au maximum 42 chantillons de patients avec une seule courbe dtalonnage. Les anticorps monoclonaux contenus dans la trousse sont hautement spcifiques de la TSH. Une raction croise avec hLH, hFSH et hCG, dans les plages de concentrations importantes sur le plan physiologique est pratiquement exclue.
Les chantillons dpassant la plage de mesure sont dilus avec le tampon de lavage.
La standardisation t ralise par rapport au standard hTSH WHO 80/558.
19
cpm des standards S1 S6 dautre part la concentration de TSH correspondante (UI/ml). Construire la courbe talon Marquer les valeurs du srum de contrle et des chantillons doser, puis lire sur la courbe dtalonnage la concentration en TSH.
20
Standards (ml) Srum de contrle (ml) Echantillons (ml) N des tubes S1 S2 S3 S4 S5 S6 C, 1, 2..... Standards 200/200 l Srum de contrle / Echantillons Traceur antihTSH ------------------------------------------ 100 l ------------------------------------
21
--- Agiter pendant 2 h (300 50 tr/min) Tampon de lavage -------------------------------------------- 1 ml ---------------------------------------- Dcanter (aspirer) ; laver avec 1 ml Compter( cpm)
CONTRLE DE QUALITE
Dfinir les caractristiques de la mthode employe Rsultat doit tre prcis , reproductible Deux sortes derreurs
22
Erreur systmatique
Ecart toujours de mme signe entre un rsultat et la valeur vraie Paramtres entrainant une erreur systmatique
- Etalon : conservation - Ac : utilisation dAc peu spcifique ( rsultats plus levs) - Matriel : pipettes non calibres - Echantillon : prsence dauto anticorps
23
Erreur alatoire
Ecart de signe et de grandeur imprvisible entre un rsultat et la
valeur vraie.
Facteurs responsables
- Distribution des diffrents ractifs - Mthode de sparation - Erreurs de mesure du signal Lerreur alatoire estime la prcision de la technique
24
CRITERES DE QUALITE
Exactitude : valeur vraie ou estime au mieux ( dilution) Prcision : mesures rptes sur le mme chantillon Sensibilit : variation minimale imposer la concentration
25