NORMA TCNICA COLOMBIANA

NTC 4519
2009-04-15

MICROBIOLOGA DE LOS ALIMENTOS PARA CONSUMO HUMANO Y ANIMAL. MTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO DE MICROORGANISMOS. TCNICA DE RECUENTO DE COLONIAS A 30 C

E:

MICROBIOLOGY OF FOOD AND ANIMAL FEEDING STUFFS. HORIZONTAL METHOD FOR THE ENUMERATION OF MICROORGANISMS COLONY-COUNT TECHNIQUE AT 30 DEGREES C

CORRESPONDENCIA:

esta norma es modificada (MOD) con respecto a su documento de referencia, la norma ISO 4833:2003. microbiologa; alimentos para consumo humano; alimentos para animales; deteccin y numeracin de enterobacterias; tcnica de NMP; tcnica con pre-enriquecimiento.

DESCRIPTORES:

I.C.S.: 67.240
Editada por el Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin (ICONTEC) Apartado 14237 Bogot, D.C. - Tel. (571) 6078888 - Fax (571) 2221435

Prohibida su reproduccin

Primera actualizacin Editada 2009-04-28

PRLOGO

El Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin, ICONTEC, es el organismo nacional de normalizacin, segn el Decreto 2269 de 1993. ICONTEC es una entidad de carcter privado, sin nimo de lucro, cuya Misin es fundamental para brindar soporte y desarrollo al productor y proteccin al consumidor. Colabora con el sector gubernamental y apoya al sector privado del pas, para lograr ventajas competitivas en los mercados interno y externo. La representacin de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalizacin Tcnica est garantizada por los Comits Tcnicos y el perodo de Consulta Pblica, este ltimo caracterizado por la participacin del pblico en general. La NTC 4519 (Primera actualizacin) fue ratificada por el Consejo Directivo el 2009-04-15. Esta norma est sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en todo momento a las necesidades y exigencias actuales. A continuacin se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a travs de su participacin en el Comit Tcnico 25 Microbiologa. 3M COLOMBIA ALIMENTOS POLAR COLOMBIA S.A. ALPINA PRODUCTOS ALIMENTICIOS S.A. ANNAR DIAGNSTICA IMPORT LTDA. ARCHIVO DE BOGOT ALCALDA MAYOR DE BOGOT ASBIOQUIM LTDA. BIANLISIS BIOCONTROL LTDA. BIOQUILAB LTDA. BIOTRENDS LABORATORIOS LTDA. CALIDAD INDUSTRIAL LTDA. CARULLA VIVERO S.A. CONGELAGRO S.A. CASA LUKER CREPES & WAFFLES S.A. CONGELAGRO S.A. CORPOLAC ECOKAPKA ENZIPN DE COLOMBIA LTDA. INDUSTRIAS ALIMENTICIAS ZEN S.A. INDUSTRIA PRODUCTORA DE ACEITES RENOVABLES. INSTITUTO DE GENTICA UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA IVONNE BERNIER LABORATORIO LTDA. KOYOMAD S.A. LABCONTROL E.U. LABFARVE LABORATORIO DE FARMACOLOGA VEGETAL LABORATORIOS ERMA S.A. LABORATORIOS GRAM LABORATORIOS MICROLAB LTDA. LABORATORIO SFC LTDA. MERCADEO DE ALIMENTOS DE COLOMBIA S.A. MICROBILOGOS ASOCIADOS NULAB LTDA. PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA PURIFICACIN Y ANLISIS DE FLUIDOS LTDA QUALA S.A. SECRETARA DISTRITAL DE SALUD DE BOGOT SUIZO S.A. UNIVERSIDAD DE LOS ANDES UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA VECOL S.A. VILASECA LTDA. VITROFARMA S.A.

Adems de las anteriores las siguientes empresas aportaron durante la consulta publica: ACEGRASAS S.A. ACUAGYR S.A. E.S.P. ALGARRA S.A. AQUALAB AREPAS DOA ALEJA ASEBIOL ASINAL ASOCIACIN COLOMBIANA DE CIENCIA Y TECNOLOGA COSMTICA -ACCYTECASOCIACIN COLOMBIANA DE MICROBIOLOGA BAVARIA S.A. BECTON DICKINSON DE COLOMBIA LTDA. CALIDAD INDUSTRIAL LTDA. CARULLA VIVERO S.A. CERVECERA LEONA S.A. COLOMBIANA S.A. COMPAA NACIONAL DE CHOCOLATES S.A. CORPORACIN PARA EL AVANCE DE LA MICROBIOLOGA Y LA MICROSCOPIA MICROS CORPOICA - CORPOLAB DUPONT QUALICON EMPRESA DE ACUEDUCTO Y ALCANTARILLADO DE BOGOT E.S.P. FABRICA DE ESPECIAS Y CONDIMENTOS EL REY S.A. FRUGAL S.A. JOHNSON DIVERSEY KLIK S.A LABORATORIO A.B.B.A LABORATORIO BIOCONTROL LTDA. LABORATORIO DE GENTICA Y BIOLOGA MOLECULAR LA CAMPIA MICROBIOLOGOS ASOCIADOS LTDA. MULTIDIMENSIONALES S.A. NESTL DE COLOMBIA S.A. QUIK LTDA. ROCHE DIAGNOSTICS SERVICIOS DE LABORATIO CLNICO LTDA. UNIVERSIDAD MANUELA BELTRN

ICONTEC cuenta con un Centro de Informacin que pone a disposicin de los interesados normas internacionales, regionales y nacionales. DIRECCIN DE NORMALIZACIN

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NTC 4519 (Primera actualizacin)

CONTENIDO

Pgina INTRODUCCIN......................................................................................................................1

1.

OBJETO Y CAMPO DE APLICACIN ........................................................................1

2.

REFERENCIAS NORMATIVAS ...................................................................................2

3.

TRMINOS Y DEFINICIONES .....................................................................................2

4.

PRINCIPIO....................................................................................................................2

5. 5.1 5.2 5.3

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES......................................................................2 DILUYENTES ...............................................................................................................3 AGAR PARA RECUENTO EN PLACA (PCA).............................................................3 MEDIO DE RECUBRIMIENTO ....................................................................................4

6. 6.1

APARATOS Y MATERIAL DE VIDRIO .......................................................................4 APARATO PARA ESTERILIZACIN EN SECO (HORNO) O ESTERILIZACIN HMEDA (AUTOCLAVE) .............................................................5 ESTUFA DE INCUBACIN..........................................................................................5 CAJAS DE PETRI ........................................................................................................5 PIPETAS.......................................................................................................................5 BAO DE AGUA..........................................................................................................5 EQUIPO DE RECUENTO DE COLONIAS...................................................................5 PH-METRO...................................................................................................................5 TUBOS DE ENSAYO ...................................................................................................5

6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NTC 4519 (Primera actualizacin)

Pgina

7.

TOMA DE MUESTRAS ................................................................................................5

8.

PREPARACIN DE LA MUESTRA PARA ANLISIS ................................................5

9. 9.1 9.2 9.3

PROCEDIMIENTO........................................................................................................6 PORCIN PARA ANLISIS, SUSPENSIN INICIAL Y DILUCIONES ......................6 SIEMBRA E INCUBACIN ..........................................................................................6 RECUENTO DE COLONIAS........................................................................................6

10. 10.1 10.2 10.3 10.4

EXPRESIN DE LOS RESULTADOS.........................................................................7 MTODO DE CLCULO..............................................................................................7 PRECISIN ..................................................................................................................7 INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS ANALTICOS .......................................7 LMITES DE CONFIANZA............................................................................................8

11.

INFORME DE ANLISIS..............................................................................................8

BIBLIOGRAFA......................................................................................................................10 ANEXOS ANEXO A (Informativo) UTILIZACIN DE LA DIFERENCIA CRTICA (DC) PARA LA INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS...........................................................................................................9 ANEXO B (Informativo) CUADRO DE DIFERENCIAS ENTRE LA NTC4519 (Primera actualizacin) y la ISO 4833:2003 .......................................................................................................................12

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NTC 4519 (Primera actualizacin)

MICROBIOLOGA DE LOS ALIMENTOS PARA CONSUMO HUMANO Y ANIMAL. MTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO DE MICROORGANISMOS. TCNICA DE RECUENTO DE COLONIAS A 30 C

INTRODUCCIN Dada la gran variedad existente de productos alimenticios destinados al consumo humano y animal este mtodo horizontal puede no ser directamente aplicable para ciertos productos. En estos casos, se pueden emplear diferentes mtodos, especficos para estos productos, si est absolutamente justificado por razones tcnicas. Sin embargo, se debera intentar aplicar este mtodo horizontal siempre que sea posible. Cuando se revise esta norma nacional, se tendr en cuenta toda la informacin disponible en ese momento, sobre la aplicacin de este mtodo y las razones que han originado desviaciones para productos concretos. La armonizacin de los mtodos de anlisis no puede ser inmediata y, para ciertos grupos de productos pueden existir ya normas internacionales que no se ajusten a este mtodo horizontal. Se espera que cuando esas normas se revisen, se cambien para que se ajusten a esta norma nacional y que solo se conserven las divergencias inevitables justificadas por razones tcnicas. Esta norma es una adopcin modificada (MOD) por traduccin, respecto a su documento de referencia, la norma ISO 4833:2003. Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs. Horizontal Method for the Enumeration of Microorganisms Colony-Count Technique at 30 Degrees C

1.

OBJETO Y CAMPO DE APLICACIN

Esta norma nacional especifica un mtodo horizontal para el recuento de microorganismos, contando las colonias que crecen en un medio slido despus de la incubacin aerbica a 30 C. Esta norma nacional es aplicable a los productos destinados al consumo humano o animal, aunque sujeta a las limitaciones expuestas en la introduccin. La aplicabilidad de esta norma nacional al examen de determinados alimentos fermentados y alimentos para animales es limitada. Para el examen de determinados alimentos fermentados y alimentos para animales, pueden ser ms apropiados otros medios y/u otras condiciones de incubacin.

1 de 12

NORMA TCNICA COLOMBIANA

2. REFERENCIAS NORMATIVAS

NTC 4519 (Primera actualizacin)

Las normas que a continuacin se relacionan contienen disposiciones vlidas para esta norma nacional. En el momento de la publicacin estaban en vigor las ediciones indicadas. Toda norma est sujeta a revisin por lo que las partes que basen sus acuerdos en esta norma nacional deben estudiar la posibilidad de aplicar la edicin ms reciente de las normas indicadas a continuacin. Los miembros de CEI y de ISO poseen el registro de las normas internacionales en vigor en cada momento. NTC 4491-1, Microbiologa de los alimentos para consumo humano y animal. Preparacin de las muestras de ensayo, suspensin inicial y las diluciones decimales para examen microbiolgico Parte 1: Reglas generales para la preparacin de la suspensin inicial y de diluciones decimales NTC 4092, Microbiologa de los alimentos para consumo humano y animal. Reglas generales para los exmenes microbiolgicos GTC 78, Microbiologa de alimentos y alimentos para animales. Gua para la preparacin y produccin de medios de cultivo. Gua general para el aseguramiento de la calidad para la preparacin de los medios de cultivo en el laboratorio. ISO 8261, Leche y productos lcteos. Directrices generales para la preparacin de muestras para anlisis, suspensiones iniciales y diluciones decimales para el examen microbiolgico. ISO 4833-2, Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs. Horizontal Method for the Enumeration of Microorganisms. Surface Colony Count Technique at 30 C.

3.

TRMINO Y DEFINICIN

Para los propsitos de esta norma nacional, se aplica el siguiente trmino y definicin. 3.1 Microorganismo. Bacterias, levaduras y mohos que forman colonias contables, producidas en las condiciones especificadas en esta norma nacional .

4.

PRINCIPIO

4.1 Se siembran en profundidad dos cajas empleando un medio de cultivo determinado y una cantidad determinada de la muestra para anlisis, si el producto es lquido, o empleando una cantidad determinada de una suspensin inicial en el caso de otros productos. Se preparan otros pares de cajas en profundidad, bajo las mismas condiciones, empleando diluciones decimales de la muestra para anlisis o de la suspensin inicial. 4.2 Las cajas se incuban aerbicamente a 30 1 C durante 72 h 3 h

4.3 El nmero de microorganismos por mililitro o por gramo de muestra se calcula a partir del nmero de colonias obtenidas en cajas seleccionadas (vase el numeral 10).

5.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES

Para las prcticas habituales de laboratorio, vanse las normas NTC 4092 e ISO/TS 11133-1. 2

NORMA TCNICA COLOMBIANA

5.1 DILUYENTES

NTC 4519 (Primera actualizacin)

Vase la parte adecuada de la NTC 4491-1 5.2 5.2.1 AGAR PARA RECUENTO EN PLACA (PCA) Composicin
Digerido enzimtico de casena Extracto de levadura Glucosa anhidra Agar
1)

5,0 g 2,5 g 1,0 g de 9 g a18 g 1 000 mI

Agua

Cuando se examinan productos lcteos, adase 1,0 g de leche en polvo desnatada por litro de medio de cultivo. La leche en polvo desnatada debe estar libre de sustancias inhibidoras. 5.2.2 Preparacin

5.2.2.1 Preparacin a partir de medio completo deshidratado comercial. Sganse las instrucciones del fabricante y adase, si es necesario, la leche en polvo desnatada (vase el numeral 5.2.1). Se ajusta el pH, si fuera necesario, de manera que despus de la esterilizacin sea de 7,0 0,2 a 25 C. 5.2.2.2 Preparacin a partir de los componentes bsicos deshidratados. Se disuelven y dispersan en el agua en el orden siguiente: el extracto de levadura, el digerido enzimtico de casena, la glucosa y, si fuera necesario, la leche en polvo desnatada. Si se calienta el agua se facilita la preparacin. Se aade el agar y se calienta hasta ebullicin agitando frecuentemente, hasta que el agar se disuelva completamente. Se ajusta el pH, si fuera necesario, de manera que despus de la esterilizacin sea de 7,0 0,2 a 25 C. 5.2.2.3 Distribucin, esterilizacin y almacenamiento. Se reparte el medio en tubos de ensayo (vase el numeral 6.8), en cantidades de 10 ml a 15 mI por tubo, o en matraces o frascos (vase el numeral 6.8) de capacidad no superior a 500 mI. Se esteriliza en autoclave a 121 C De durante 15 min. Si el medio se va a usar inmediatamente, se enfra antes de su empleo a una temperatura entre 44 C y 47 C en un bao de agua (vase el numeral 6.5). En caso contrario, se almacena en oscuridad a una temperatura de 6 C 2 C por un perodo no mayor de 3 meses, bajo condiciones que no permitan ningn cambio de su composicin ni de sus propiedades. Antes de comenzar el examen microbiolgico, con el fin de evitar todo retraso en el momento de verter el medio, antes de su empleo se funde completamente el medio y a continuacin se enfra a una temperatura entre 44 C y 47 C en un bao de agua (vase el numeral 6.5).

1)

Dependiendo de la capacidad de gelificacin del agar.

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NTC 4519 (Primera actualizacin)

Con el objeto de comprobar la temperatura del agar, se recomienda colocar un termmetro en una porcin de una disolucin control de 15 g/l de agar en un recipiente separado idntico al empleado para el medio o se pueden utilizar termmetros por contacto. La temperatura de la disolucin control debera ser expuesta a las mismas condiciones de calentamiento y enfriamiento que el propio medio. 5.2.3 Anlisis de rendimiento para la garanta de calidad del medio de cultivo. Para analizar el rendimiento del medio, vase la GTC 78. 5.3 5.3.1 MEDIO DE RECUBRIMIENTO (si fuera necesario; vase el numeral 9.2.7) Composicin 12 g a 18 g 1 000 mI Preparacin

Agar1) de Agua 5.3.2

Se aade el agar al agua y se calienta hasta ebullicin agitando frecuentemente, hasta que el agar se disuelva completamente o se pone al vapor durante unos 30 min. Se ajusta el pH, si fuera necesario, de manera que despus de la esterilizacin sea de 7,0 0,2 a 25 C. 5.3.3 Distribucin, esterilizacin y almacenamiento

Se reparte el medio en tubos de ensayo (vase el numeral 6.8), en cantidades de 4 mI por tubo, o en matraces o frascos (vase el numeral 6.8) de capacidad adecuada. Se esteriliza en autoclave a 121 C durante 15 min. Si el medio se va a usar inmediatamente, se enfra antes de su empleo entre 44 C y 47 C en un bao de agua (vase el numeral 6.5). En caso contrario, se almacena en oscuridad a una temperatura de 6 C 2 C o segn las indicaciones dadas por el fabricante durante un mximo de 3 meses, bajo condiciones que no permitan ningn cambio de su composicin ni de sus propiedades. Antes de comenzar el examen microbiolgico, con el fin de evitar todo retraso en el momento de verter el medio, antes de su empleo se funde completamente el medio y a continuacin se enfra a una temperatura entre 44 C y 47 C en un bao de agua (vase el numeral 6.5).

6.

APARATOS Y MATERIAL DE VIDRIO

El material de un solo uso es una alternativa aceptable al material de vidrio reutilizable, si las especificaciones son similares. El equipamiento de laboratorio microbiolgico habitual y, en particular, lo siguiente:

1)

Dependiendo de la capacidad de gelificacin del agar.

NORMA TCNICA COLOMBIANA

6.1

NTC 4519 (Primera actualizacin)

EQUIPO PARA ESTERILIZACIN EN SECO (HORNO) O ESTERILIZACIN HMEDA (AUTOCLAVE)

Vase la NTC 4092 6.2 ESTUFA DE INCUBACIN

Capaz de operar a 30 C 1 C. 6.3 CAJAS DE PETRI

De vidrio o plstico y de 90 mm a 100 mm de dimetro. 6.4 PIPETAS

De capacidad nominal de 1 mI. 6.5 BAO DE AGUA

Capaz de operar a una temperatura entre 44 C y 47 C. 6.6 EQUIPO DE RECUENTO DE COLONIAS

Por ejemplo, puede emplearse uno consistente en una base iluminada con un fondo negro, equipado con una lente de aumento preferiblemente de unos 1,5x y un contador mecnico o electrnico digital. 6.7 PH-METRO

Que tenga una precisin de calibracin de 0,1 unidades de pH a 25 C. 6.8 TUBOS DE ENSAYO

Matraces o frascos de capacidad adecuada y no superior a 500 mI.

7.

TOMA DE MUESTRAS

Es importante que el laboratorio reciba una muestra que sea verdaderamente representativa y que no haya sufrido daos o cambios durante el transporte o el almacenamiento. La toma de muestras no constituye una parte del mtodo especificado en esta norma nacional. Para ello vase la norma internacional especfica referente al producto de que se trate. Si no existe una norma internacional especfica, se recomienda que las partes interesadas adopten un acuerdo sobre este punto.

8.

PREPARACIN DE LA MUESTRA PARA ANLISIS

La muestra para anlisis se prepara de acuerdo con la parte concerniente de la NTC 4491-1 y la norma ISO 8261, y con la norma especfica referente al producto de que se trate. Si no existe una norma internacional especifica, se recomienda que las partes interesadas adopten un acuerdo sobre este punto. 5

NORMA TCNICA COLOMBIANA

9. 9.1 PROCEDIMIENTO

NTC 4519 (Primera actualizacin)

PORCIN PARA ANLISIS, SUSPENSIN INICIAL Y DILUCIONES

Vase la parte concerniente de la NTC 4491-1 y la norma nacional especfica referente al producto de que se trate. 9.2 SIEMBRA E INCUBACIN

9.2.1 Se toman dos cajas de Petri estriles (vase el numeral 6.3). Mediante una pipeta estril (vase el numeral 6.4), se transfieren a cada placa 1 mI de la muestra para anlisis si es lquida, 1 ml de la suspensin inicial en el caso de otros productos (dilucin 10-1). 9.2.2 Se toman otras dos cajas de Petri estriles (vase el numeral 6.3). Mediante otra pipeta estril (vase el numeral 6.4), se transfieren a cada placa 1 ml de la dilucin 10-1 (producto lquido) o 1 mI de la dilucin 10-2 (otros productos). 9.2.3 Si es necesario, se repite el procedimiento con ms diluciones, empleando una nueva pipeta para cada dilucin decimal. 9.2.4 Si es adecuado y posible, se seleccionan slo las secuencias de diluciones criticas (por lo menos dos diluciones decimales consecutivas) para la siembra de las cajas de Petri que den recuentos de colonias entre 30 colonias y 300 colonias por placa. 9.2.5 Se vierten aproximadamente de 10 ml a 15 ml de agar para recuento en placa (vase el numeral 5.2) que se encuentre a una temperatura entre 44 C y 47 C en cada una de las cajas de Petri. El tiempo transcurrido entre el final de la preparacin de la suspensin inicial (o de la dilucin 10-1 si el producto es lquido) y el momento en el que el medio (vase el numeral 5.2) se vierte en las cajas no debe superar los 15 min. 9.2.6 Se mezcla cuidadosamente el inculo con el medio mediante rotacin de las cajas de Petri y se permite solidificar la mezcla dejando reposar las cajas de Petri en una superficie horizontal lisa. 9.2.7 Despus de que se haya completado la solidificacin y, slo en el caso en el que se sospeche que el producto que se est examinando contiene microorganismos cuyas colonias sobrecrecern en la superficie del medio, se vierten unos 4 mI del medio de recubrimiento (vase el numeral 5.3) que se encuentre entre 44 C y 47 C en la superficie del medio inoculado. Se deja solidificar como se describi anteriormente. 9.2.8 Las cajas de Petri preparadas se invierten y se sitan en la incubadora (vase el numeral 6.2) a 30 C 1 C durante 72 h 3 h. No se deben apilar ms de seis cajas una encima de la otra. Es conveniente que las pilas de cajas estn separadas una de otra y de las paredes y parte superior de la incubadora. 9.3 RECUENTO DE COLONIAS

9.3.1 Despus del perodo de incubacin especificado (vase el numeral 9.2.8), se cuentan las colonias de las cajas (vase el numeral 10.1), empleando el equipo de recuento de colonias (vase el numeral 6.6). Se examinan las cajas de Petri bajo luz tenue. Seria importante que las colonias en punta de alfiler sean incluidas en el recuento, pero es esencial que la persona que realiza la lectura evite confundir las partculas no disueltas o precipitadas con colonias en punta de alfiler. Se examinan con atencin los elementos dudosos, empleando una lupa cuando sea necesario, con el objeto de diferenciar las colonias de partculas extraas. 6

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NTC 4519 (Primera actualizacin)

Incluir la forma de hacer el recuento (que se referencia en la norma de coliformes)

NOTA Si es necesario, se pueden adicionar reactivos que faciliten la visualizacin de las colonias.

9.3.2 Las colonias invasoras deben ser consideradas como una sola colonia. Si menos de un cuarto de la placa est invadida por dichas colonias, se cuentan las colonias de la parte no afectada de la placa y se calcula el nmero correspondiente a la placa entera. Si est invadido ms de un cuarto de la placa, se desecha el recuento.

10. 10.1

EXPRESIN DE LOS RESULTADOS MTODO DE CLCULO

Vase la NTC 4092 10.2 PRECISIN

10.2.1 Generalidades Los datos de precisin han sido calculados para cajas que contienen entre 30 colonias a 300 colonias. Los datos de precisin dependen de la flora en asociacin y de la matriz de la muestra. Los datos presentados se derivan de estudios en colaboracin (vanse las referencias [1], [2] y [3]) Y son vlidos para leche cruda y pasterizada. Pueden utilizarse como estimacin en el caso de recuentos en otros productos. Vase la NTC 4092. 10.2.2 Repetibilidad La diferencia absoluta entre dos resultados analticos individuales independientes, obtenidos empleando el mismo mtodo sobre material analtico idntico, en el mismo laboratorio, por el mismo analista y empleando el mismo equipo en un intervalo de tiempo corto, no debera ser mayor que el lmite de repetibilidad, r= 0,25, en log10 microorganismos por mililitro (correspondiente a 1,8 en la escala normal de microorganismos por mililitro).
NOTA Este lmite de repetibilidad proviene de estudios colaborativos realizados sobre leche cruda y pasteurizada (vanse las referencias [1], [2] y [3]) y puede ser aplicado a dichos productos.

10.2.3 Reproducibilidad La diferencia absoluta entre dos resultados analticos individuales, obtenidos empleando el mismo mtodo sobre material analtico idntico, en diferentes laboratorios, por analistas diferentes y empleando equipos diferentes, no debera ser mayor que el lmite de reproducibilidad, R = 0,45, en log10 microorganismos por mililitro (correspondiente a 2,8 en la escala normal de microorganismos por mililitro).
NOTA Este lmite de reproducibiliIdad proviene de estudios colaborativos realizados sobre leche cruda y pasteurizada (vanse las referencias [1], [2] Y [3]) Y puede ser aplicado a dichos productos.

10.3

INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS ANALTICOS

En los siguientes ejemplos, se consideran los datos promedio de la precisin, un nivel de probabilidad del 95 % y el anlisis de una muestra. Se debera tener en cuenta que, en la prctica, se emplea a menudo el promedio de varias muestras. Las cifras se expresan en microorganismos por mililitro. 7

NORMA TCNICA COLOMBIANA

a) Condiciones de repetitibilidad Primer resultado:

NTC 4519 (Primera actualizacin)

105 = 100 000

La diferencia entre el primer y segundo resultado no debera ser superior a 0,25 unidades log10, Segundo resultado: log 104,75 = 56 000 log 105,25 = 178 000 La diferencia entre el primer y segundo resultado es aceptable si el segundo resultado no es inferior a 56 000 o no es superior a 178 000. b) Condiciones de reproducibilidad Resultados obtenidos en el primer laboratorio (media de la determinacin duplicada): 10 5 = 100 000 La diferencia entre el primer y segundo resultado obtenido en el segundo laboratorio no debera ser superior a 0,45 unidades log10. Segundo resultado: log 104,55 = 36 000, log 105,45 = 280 000 La diferencia entre los resultados obtenidos en el primer y segundo laboratorio es aceptable, si el segundo laboratorio obtiene un resultado que no es inferior a 36 000 y no es superior a 280 000. El Anexo A muestra los clculos y el empleo de las diferencias crticas (DC) para interpretar los resultados. 10.4 LIMITES DE CONFIANZA

Vase la NTC 4092

11.

INFORME DE ANLISIS

El informe del anlisis debe especificar lo siguiente: a) b) c) d) toda la informacin necesaria para la identificacin completa de la muestra; el mtodo de toma de muestras empleado, si se conoce; el mtodo analtico utilizado, con referencia a esta norma; todos los detalles operativos no especificados en esta norma o considerados opcionales, junto con los detalles de todo tipo de incidencias que pudieran haber afectado a los resultados; los resultados obtenidos. 8

e)

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NTC 4519 (Primera actualizacin)

ANEXO A (Informativo)

UTILIZACIN DE LA DIFERENCIA CRTICA (DC) PARA LA INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS En los siguientes ejemplos, se consideran los datos de precisin media, un nivel de probabilidad del 95 % y el anlisis de una muestra. Se debera tener en cuenta que, en la prctica, se emplea a menudo la media de varias muestras. Las cifras se expresan en microorganismos por mililitro. a) Condiciones de reproducibilidad Resultados obtenidos en el primer laboratorio (media de la determinacin duplicada): 105 = 100 000. La diferencia entre este resultado y un resultado obtenido en un segundo laboratorio (media de n determinaciones; n = 2 en este ejemplo) es aceptable si no excede la diferencia crtica (DC), en unidades log10,
CD = 1 R 2 r 2 1 n = R2 r2 = 2 0,45 0,25 2 2 = 0,41

en donde r R es el lmite de repetitibilidad; es el lmite de reproducibilidad.

La diferencia entre los resultados obtenidos en el primer y segundo laboratorio es aceptable si el segundo laboratorio obtiene un resultado que no es inferior a 104,59 = 39 000 o no es superior a 105,41 = 257 000. b) Comparacin con un lmite (test unilateral) Lmite: 105 = 100 000. La diferencia entre el lmite y el resultado del laboratorio (media de n determinaciones; n = 2 en este ejemplo) ha de compararse con el lmite de diferencia critica (LDC):
CDL = 0,84 2 x 1 R 2 r 2 1 n = 0,84 2 x R2 r2 2 = 0,24

Los resultados hasta 105,24 = 174 000 no indican una no conformidad con el lmite.

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NTC 4519 (Primera actualizacin)

ANEXO B (Informativo)

Cuadro de diferencias entre la NTC 4519 (Primera actualizacin) y la ISO 4833:2003

NTC 4519 (Primera actualizacin) OBJETO: Esta norma nacional especifica un mtodo horizontal para el recuento de microorganismos, contando las colonias que crecen en un medio slido despus de la incubacin aerbica a 30 C. ISO 4833:2003 OBJETO: Esta norma da directrices generales para el recuento de microorganismos presentes en productos destinados al consumo humano o alimentacin animal, contando las colonias que crecen en un medio slido despus de la incubacin aerbica a 35 C 2C. Sustentacin Tcnica El documento de referencia ISO 4833 de la NTC 4519 fue actualizado en el ao 2003, modificando la temperatura de 35 C a 30 C para la tcnica, cambio sustentado tcnicamente en la necesidad de que el mtodo permitiera tener recuentos verdicos teniendo en cuenta la posible contaminacin ambiental del proceso o por mala limpieza en el proceso adems porque se busca estudiar microorganismos mesfilos y psicrfilos y una parte de los termotolerantes; de esta manera la temperatura de 30 C es utilizada para determinar el deterioro del alimento y la calidad del procesamiento de los alimentos. En Colombia el Comit 25- realiz pruebas interlaboratorios teniendo en cuenta como comparativo condiciones de incubacin a 30 C, durante 48 h a 72 h y a 35 C de incubacin durante 48 h a 72 h. Al finalizar el tratamiento estadstico en el pas se da validez al sustento tnico internacional (ISO e Instituto Pasteur) para adoptar la temperatura a 30 C. (Acta No.113 2008-07-15). El tiempo de incubacin (72 h) se encuentra estandarizado por la ISO, adicionalmente el consenso del Comit define darle un rango de 3 h armonizando de esta forma con las condiciones de tiempo de incubacin estipuladas en los mtodos y documentos normativos colombianos. Las unidades de pH se establecen en un rango de 0,2. Armonizando las unidades de acuerdo con el documento de referencia ISO 4833. Las metodologas implementadas en el pas estipulan utilizar volmenes de medio de 10 ml en tubos de ensayo, ya que 10 ml es ms prctico para medir en material volumtrico (pipetas etc).

DEMAS PARTES DEL DEMAS PARTES DEL DOCUMENTO QUE REFIEREN A DOCUMENTO QUE REFIEREN LA TEMPERATURA DE A LA TEMPERATURA DE INCUBACIN INCUBACIN

4.2 Las cajas se incuban 4.2 Incubacin aerbica de las aerbicamente a 30 1 C durante cajas a 35 C 2 C durante 48 h 72 h 3 h.

MEDIO DE CULTIVO ... Se ajusta el pH, si es necesario, de tal modo que despus de la esterilizacin sea de 7,0 C a 25 C. 5.2.2.3 ... Se reparte el medio en 5.2.2.3 ... Se reparte el medio tubos de ensayo (vase el en tubos de ensayo (vase el numeral 6.8), en cantidades de 10 numeral 6.8), en cantidades de 12 ml a 15 mI por tubo ... ml a 15 mI por tubo ... 9.2.5...Se vierten aproximadamente 10 ml a 15 mI por tubo 5.2.2.3 ... En caso contrario, se almacena en oscuridad a una temperatura de 6 C 2 C

5.2.2.1 Se ajusta el pH, si fuera necesario, de manera que despus de la esterilizacin sea de 7,0 0,2 a 25 C.

9.2.5...Se vierten aproximadamente 12 ml a 15 mI por tubo 5.2.2.3 ... En caso contrario, se La temperatura estipulada para estas almacena en oscuridad a una condiciones en la ISO 7218:2008 es de 2 C a 8 C, con el rango que se define en este temperatura de 3 C 2 C documento se cumple requisito. 5.3.3 ... 6 C 2 C 5.3.3 ... 3 C 2 C 6.5 BAO DE AGUA 6.5 BAO DE AGUA El consenso colombiano define que las condiciones de operacin de estos equipos se Capaz de operar entre 44 C y 47 C O aparato similar, con capacidad encuentra entre estas temperaturas. de operar 45C 0,5 C Contina...

10

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NTC 4519 (Primera actualizacin)

ANEXO B (Informativo)
(Continuacin)

NTC 4519 (Primera actualizacin) 9.2.4 Si es adecuado y posible, se seleccionan slo las secuencias de diluciones criticas (por lo menos dos diluciones decimales consecutivas) para la siembra de las cajas de Petri que den recuentos de colonias entre 30 colonias y 300 colonias por placa. 9.3.1 ...

ISO 4833:2003 9.2.4 Si es adecuado y posible, se seleccionan slo las secuencias de diluciones criticas (por lo menos dos diluciones decimales consecutivas) para la siembra de las cajas de Petri que den recuentos de colonias entre 15 colonias y 300 colonias por placa.

Sustentacin Tcnica Las normas tcnicas colombianas que relacionan estas especificaciones de recuento, contemplan el recuento entre 30 colonias y 300 colonias

NOTA Si es necesario, se 9.3.1 ... No contempla la nota pueden adicionar reactivos que aclaratoria faciliten la visualizacin de las colonias.

Es necesario aclarar que se pueden utilizar este tipo de reactivos que son vlidos para la aplicacin de la tcnica en el pas.

11

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NTC 4519 (Primera actualizacin)

BIBLIOGRAFA

[1]

PITON, C., GRAPPIN, R. A Model For Statistical Evaluation Of precision Parameters Of Microbiological Methods: Application To Dry Rehydratable Film Methods And IDG Reference Methods For Enumeration Of Total Aerobic Mesophilic Flora And Coliforms In Raw Milk. J AOAC, 74, 1991, pp. 92-103. SCOTTER, S., ALDRIDGE. M., BACK, J., WOOD, R. Validation of European Community Methods for Microbiological and Chemical Analysis of Raw and Heat-Treated Milk. J. Assoc. Publ. Analyst., 29, 1993, pp.I-32. DAHMS. S., WEISS, H. Estimation of Precision Values for Microbiological Reference Methods: Standardized Pour Plate Technique. Milchwiss., 53, 1998, pp.555-559.

[2]

[3]

12