Universidade Catlica de Gois

Departamento de Matemtica e Fsica

Curso de Engenharia de Alimentos











ENGENHARIA BIOQUMICA












Vernica Ortiz Alvarenga












Goinia Gois
2009
2

SUMRIO
1 INTRODUO ...................................................................................................... 4
1.1 Definio de Engenharia Bioqumica .............................................................. 4
1.2 Histrico e Evoluo ....................................................................................... 4
1.3 Definio de Biotecnologia ............................................................................. 6
1.3.1 Evoluo da biotecnologia ....................................................................... 7
1.4 Microrganismos e sua utilizao na indstria .................................................. 7
1.4.1 Fontes de microrganismos de interesse .................................................. 8
1.4.2 Caractersticas desejveis de microrganismos ........................................ 8
1.4.3 Participantes na tecnologia de alimentos ................................................. 9
2 TECNOLOGIA DAS FERMENTAES .............................................................. 11
2.1 Consideraes sobre metabolismo energtico ............................................. 11
2.2 Os microrganismos e as fermentaes dos alimentos .................................. 13
2.2.1 Definio de bioprocesso....................................................................... 13
2.2.2 Substrato ............................................................................................... 14
2.2.2.1 Fonte de energia ................................................................................ 15
2.2.2.2 Fonte de carbono ............................................................................... 15
2.2.2.3 Fonte de nitrognio ............................................................................ 16
2.2.2.4 Fonte de minerais .............................................................................. 16
2.2.3 Esterilizao .......................................................................................... 16
2.2.3.1 Esterilizao pelo calor ...................................................................... 17
2.2.3.1.1 Esterilizao pelo calor seco ........................................................ 17
2.2.3.1.2 Esterilizao por calor mido ........................................................ 17
2.2.3.2 Esterilizao qumica ......................................................................... 18
2.2.3.3 Esterilizao por irradiao de luz ultravioleta .................................... 18
2.2.4 Desenvolvimento dos agentes de bioprocessos e a exigncia de
oxignio..................................................................................................................18
2.2.5 Desenvolvimento dos agentes de fermentao e estado fsico do
substrato .............................................................................................................. 19
2.2.5.1 Fermentao em estado lquido ......................................................... 19
2.2.5.2 Processos de fermentao em meio lquido e na superfcie ............... 19
2.2.5.3 Processos de fermentao em meio lquido submersos..................... 20
2.2.5.4 Fermentao em estado slido .......................................................... 20
2.2.6 Cintica dos bioprocessos ..................................................................... 22
2.2.6.1 Processo de fermentao .................................................................. 24
2.2.6.1.1 Descontnuo simples .................................................................... 24
2.2.6.1.2 Descontnuo com recirculao de clula ....................................... 26
2.2.6.1.3 Semi-contnuo .............................................................................. 26
2.2.6.1.4 Descontnuo alimentado (fed batch) ........................................... 27
2.2.6.1.5 Contnuo ....................................................................................... 28
2.2.6.1.6 Vantagens e desvantagens do processo contnuo em relao ao
processo descontnuo ................................................................................... 29
2.2.6.1.7 Definio dos parmetros cinticos .............................................. 30
2.2.6.1.7.1 Definio das velocidades instantnea de crescimento ou de
transformao ........................................................................................... 30
2.2.6.1.7.2 Velocidades Especficas de crescimento ou transformao ... 31
2.2.6.1.7.3 Fatores de Converso ............................................................ 31
3

2.2.6.1.7.3.1 Coeficiente de rendimento celular (rendimento de substrato
a clulas)..................................................................................................31
2.2.6.1.7.3.2 Coeficiente de rendimento de produto (rendimento de
substrato a produto) ............................................................................... 32
2.2.6.1.7.4 Determinao da velocidade de crescimento ......................... 32
2.2.6.1.7.5 Cintica de Crescimento de Monod ........................................ 34
2.2.6.1.7.6 Metabolismo endgeno .......................................................... 35
2.2.6.1.7.7 Modelos de crescimento no estruturados ............................. 36
2.3 Biorreatores .................................................................................................. 38
2.3.1 Reatores Biolgicos ideais ..................................................................... 39
2.3.2 Reatores de mistura .............................................................................. 39
2.3.2.1 Reatores em Batelada ....................................................................... 39
2.3.2.1.1 Preparo do inculo........................................................................ 39
2.3.2.1.2 Equaes do reator em batelada .................................................. 40
2.3.2.2 Reatores em batelada alimentada ...................................................... 41
2.3.2.3 Reatores de mistura contnuos........................................................... 42
2.3.2.3.1 O Quimiostato: o reator de mistura ideal ....................................... 42
2.3.2.3.1.1 Balano de clulas ................................................................. 43
2.3.2.3.1.2 Balano do substrato .............................................................. 43
2.3.2.3.1.3 Produtividade ......................................................................... 45
2.3.2.3.1.4 Auto regulao de um quimiostato ......................................... 46

4


1 INTRODUO
1.1 DEFINIO DE ENGENHARIA BIOQUMICA
Durante muitos anos vrias definies de Engenharia Bioqumica apareceram
na literatura. Praticamente todas elas definem a Engenharia Bioqumica como uma
cincia que nasceu pela combinao de 3 reas do conhecimento cientfico:
Microbiologia, Bioqumica e Engenharia Qumica. Seu papel, na realidade, de
transformar conhecimentos obtidos por microbiologistas e bioqumicos em processos
industriais, com vistas a aperfeio-los, assim com aumentar produtividade e
rendimento. Para isto, um engenheiro bioqumico deve no s ter sua formao em
princpios bsicos de engenharia, como tambm em cincias biolgicas.

1.2 HISTRICO E EVOLUO
Milnios antes de saber da existncia de seres microscpicos, o homem j se
utilizava deles. assim que o homem das cavernas j sabia que a carne maturada
tinha melhor sabor, produzia bebida alcolica, assim como fabricava queijos e
produzia coalhada e vinagre desde tempos remotos. O po fermentado por leveduras
foi encontrado em pirmides egpcias construdas h milnios. Muitos produtos obtidos
pela ao de microrganismos podem ser includos nesta lista histrica: vinho
(conhecido pelos antigos gregos), cerveja (2000 anos A.C.), soja fermentada, etc.
At meados do sculo XIX o homem permaneceu na ignorncia total sobre as
causas da fermentao. Em 1857, Pasteur demonstrou que a fermentao alcolica
era produzida por leveduras e que estas eram clulas vivas. Demonstrou tambm que
vrias doenas eram causadas por microrganismos. Em 1901, Rudolf Emmerich e
Oscar Loco, da Universidade de Munique, isolaram a piocianase de Pseudomonas
aeruginosa. Centenas de pacientes foram tratados com sucesso pela piocianase, o
primeiro antibitico conhecido. Porm, a piocianase estava muito a frente de seu
tempo e pela inexistncia de tcnicas seguras e apropriadas de produo e controle
de qualidade, foi abandonada prematuramente pelos riscos apresentados.
No incio do sculo XX j se produzia levedura de panificao em tanques
abertos e aerados. Durante a I Guerra Mundial, Chain Weismann conseguiu
produzir acetona a partir de amido usando uma bactria, Clostridium acetobutilicum,
livrando a Inglaterra de uma sria falta de munio, pois acetona usada na
fabricao de cordite. Em 1923, Pfizer inaugurou a primeira fbrica para obteno de
cido ctrico por fermentao, utilizando Aspergillus niger na converso do acar em
cido, barateando o produto. Alexander Fleming, em 1928 manipulando
Staphylococcus aureus, notou que numa das placas de cultura deste microrganismo
5

havia contaminao por bolor da famlia Penicillium, e que ao redor deste no houve
crescimento da bactria. Extraiu do bolor uma substncia, a qual denominou de
penicilina, ativa contra bactrias. Mas foi somente durante a II Guerra que a penicilina
foi industrializada devido a grande necessidade de agentes bactericidas mais
eficientes que a sulfa, at ento utilizada. Seguiu-se aps, o aparecimento de outros
antibiticos. Selman Waskman isolou um actinomicete, Streptomyces grisens, da
garganta de uma galinha, produtor de estreptomicina. Este antibitico mostrou-se
altamente eficaz contra bactrias causadoras da tuberculose. A lista dos antibiticos
hoje longa, alm das penicilinas e estroptomicinas. A pesquisa intensa e cada ano
novos produtos, novas tcnicas e novos processos vm se juntar aos j existentes.
Muitas vitaminas so produzidas por fermentaes, com, por exemplo, vitamina B
2

(riboflavina), vitamina B
12
(Cianocobalamina) e vitamina C (cido ascrbico).
Processos fermentativos tambm so usados na produo de cortisona e seus
derivados, assim como na sntese de aminocidos (L-lisina e cido glutmico). A
gibelerelina, hormnio regulador do crescimento das plantas, um novo produto de
fermentao usado principalmente no Oriente. Inseticidas bacterianos (B.
thuringiensis) encontram grande aplicao na agricultura.
Antes da produo de penicilina em escala industrial ter comeado, j se
produziam industrialmente certos produtos como leveduras de panificao, cido
ctrico e cido glicnico onde as condies de acidez do meio de cultura eram
adversas a microrganismos contaminantes. Da mesma forma, na obteno de
produtos como sorbose, acetona, butanol e etanol, as concentraes de substrato ou
produto eram demasiadamente elevadas de forma que microrganismos contaminantes
eram quase que inexistentes. Assim sendo, os requerimentos para uma cultura pura
nos processos de obteno dos produtos acima descritos, eram praticamente nulos.
Porm, no caso da penicilina, as condies de operao tinham que ser estritamente
asspticas. Assim, os engenheiros bioqumicos se encontraram em face de um grande
problema. Esse desafio fez com que surgisse uma nova filosofia de design de
fermentadores, de tcnicas de operao e de equipamentos em geral, de forma que
uma perfeita esterilidade fosse obtida. Alm disso, para a extrao de alguns produtos
como a penicilina, que era encontrada no meio de cultura em pequenas concentraes
e relativamente instvel, exigiu o desenvolvimento de novas tcnicas de filtrao,
extrao, adsoro e concentrao, dando origem a tcnicas modernas de extrao e
purificao de produtos de origem biolgica.
As tcnicas desenvolvidas para a produo de penicilina, como a fermentao
submersa, foram posteriormente aplicadas em outros antibiticos e tambm a
diferentes produtos, de forma que os equipamentos sofreram uma espcie de
6

padronizao, com algumas adaptaes dependendo das caractersticas de certos
processos. Alm disso, os equipamentos e operaes empregados em diferentes
processos fermentativos so similares aos de processos qumicos. Por isso a
Engenharia Bioqumica baseada nos conceitos de operaes unitrias e processos
unitrios da Engenharia Qumica, assim como em seus princpios estequiomtricos,
cinticos e termodinmicos. No entanto, evidente que, apesar de caractersticas
comuns entre as duas disciplinas, existem peculiaridades diferentes entre elas, de
forma que a engenharia bioqumica encarada como um ramo especializado da
engenharia qumica. Como exemplo de operaes unitrias comuns entre elas
podemos citar: mistura de trs fases heterogneas (microrganismos, meio e ar),
transporte de massa (oxignio do ar para o microrganismo), transporte de calor (do
meio de cultura para o ambiente).
Transformaes de matria-prima em produtos por ao microbiolgica
possuem aspectos comuns sob o ponto de vista qumico ou fsico, fornecendo-nos a
possibilidade de classificar os diferentes mecanismos de reao em processos
unitrios, como por exemplo, redues, oxidaes, converses de substrato,
transformaes, hidrlises, polimerizao, biossnteses complexas e formao de
clulas.

1.3 DEFINIO DE BIOTECNOLOGIA
definido como uso de microrganismos, clulas de plantas, clulas de animais
ou parte de clulas, assim como, enzimas, imunoglobulinas ou genes para elaborao
de produtos ou para conduzir processos.
A biotecnologia fornece diversas aplicaes para melhorar a indstria de
alimentos, como por exemplo, modificaes genticas em aves, como a reduo na
quantidade de gordura e aumento da massa muscular.
A interao da biotecnologia industrial com os ramos dos conhecimentos est
apresentado na figura 1.

Figura 1. Interao da biotecnologia com os ramos do conhecimento

7

1.3.1 Evoluo da biotecnologia
As tcnicas de fermentao, que at o presente momento constituem os
processos principais da biotecnologia, so conhecidas e utilizadas desde a
antiguidade, principalmente na produo de cervejas e vinhos. No oriente, os antigos
j utilizavam bebidas fermentadas, da mesma forma de que, na Amrica pr-
colombiana, tambm j se produziam bebidas com a utilizao de processos
rudimentares de fermentao. H sculos que no Japo e na China se utilizam
processos de produo de bebidas e alimentos pela tcnica de fermentao.
O troglodita sabia que a carne deixada em repouso alguns dias era mais
saborosa que aquela ingerida logo aps a matana; Sabia, tambm que bebidas
intoxicantes poderiam ser feitas de gros e frutas. O envelhecimento da carne e a
fabricao de bebidas alcolicas foram os primeiros usos de fermentao pelo
homem;
A fabricao de queijo e molho de soja na China e no Japo conhecida h
milhares de anos;
Foram encontrados pes nas pirmides egpcias construdas h milhares de
anos





1.4 MICRORGANISMOS E SUA UTILIZAO NA INDSTRIA
Muitos microrganismos, atravs de processos bioqumicos, so empregados
em geral, para obteno de produtos alimentcios, farmacuticos, etc. Este meio sofre
a ao dos biocatalisadores (microrganismos), pela inoculao de uma suspenso
suficientemente concentrada de clulas ativadas ou recicladas ao processo.
Bactrias: As bactrias so onipresentes na natureza, em ambientes aerbios
e anaerbios contendo gua. Entre os gneros, as habilidades sintticas
variam desde quelas das espcies autotrficas, que requerem apenas
compostos inorgnicos para o crescimento, quelas das espcies
heterotrficas. Igualmente h uma enorme amplitude de habilidade
degradativa. Por causa dessas capacidades diversas, as bactrias tm sido
exploradas industrialmente para acumular produtos intermedirios e finais do
metabolismo. So uma rica fonte de produo de enzimas.
Vrus: Os vrus so os menores microrganismos. Os vrus parasitos de
bactrias so denominados bacterifagos. A cultura de vrus para testar drogas
8

antivirais e para a produo de vacinas um importante empreendimento
industrial.
Fungos: Os fungos so amplamente espalhados na natureza em ambientes de
umidade mais baixa do que aquela que favorece as bactrias. O metabolismo
de fungos essencialmente aerbio. Do ponto de vista morfolgico os fungos
so divididos em dois grandes grupos: os bolores e as leveduras.
o Bolores: caracterizam-se por formarem um miclio que um conjunto
de estruturas filamentosas denominadas hifas.
o Leveduras: so fungos geralmente unicelulares de forma e tamanho
muito variados, indo desde elementos esfricos at clulas elpticas,
quase filamentosas.
Para todos os microrganismos existem trs temperaturas cardeais:temperatura
mnima abaixo da qual no h crescimento; temperatura mxima acima da qual no h
crescimento; temperatura tima, onde o crescimento mximo. A temperatura tima
de crescimento microbiano varia com o tipo de microrganismo. A faixa de crescimento
mais comum situa-se entre 25 e 45 C.
Termfilas: em torno de 60C
Psicrfilas: em torno de 10C
Mesfilas: entre 20 e 40C


1.4.1 Fontes de microrganismos de interesse
Microrganismos que possam ter interesse industrial podem ser obtidos
basicamente das seguintes formas:
Isolamento a partir de recursos naturais;
Compra em colees de cultura;
Obteno de mutantes naturais;
Obteno de mutantes induzidos por mtodos convencionais;
Obteno de microrganismos recombinantes por tcnicas de
engenharia gentica.

1.4.2 Caractersticas desejveis de microrganismos
Para uma aplicao industrial, espera-se que os microrganismos apresentem
as seguintes caractersticas gerais:
Elevada eficincia na converso do substrato em produto;
Permitir o acmulo de produto no meio para se ter elevada
concentrao do produto no substrato;
9

No produzir substncias incompatveis com o produto;
Apresentar constncia quanto ao comportamento fisiolgico;
No ser patognico;
No exigir condies de processo muito complexas;
No exigir substratos dispendiosos;
Permitir a rpida liberao do produto para o meio.

1.4.3 Participantes na tecnologia de alimentos
Muitos alimentos devem suas produo e caractersticas s atividades
fermentativas dos alimentos. Vrios produtos, como queijos maturados, conservas,
chucrutes, lingias fermentadas, so alimentos que possuem uma vida-de-prateleira
consideravelmente maior que a matria-prima da qual eles foram feitos. Alm de
serem mais estveis, todos os alimentos fermentados possuem aroma e sabor
caractersticos que resultam direta ou indiretamente dos microrganismos
fermentadores. Em alguns casos, o contedo de vitaminas dos alimentos cresce
juntamente com o aumento da disgetibilidade da matria-prima. O processo de
fermentao reduz a toxicidade de alguns alimentos (por exemplo, gari e peujeum
1
),
enquanto outros podem se tornar extremamente txicos durante a fermentao (como
no caso do bangokrek
2
)
As transformaes bioqumicas que ocorrem durante a fermentao, quando
controladas so benficas. Para tanto, as condies de fermentao, pH, temperatura
e composio do mosto de fermentao, devem ser monitoradas, de forma que o
microrganismo converta o substrato presente no mosto, em produtos de interesse.
Caso haja descontrole nas condies de processo, as transformaes bioqumicas
podem ser indesejveis como, por exemplo, putrefao de alimentos.
Alguns alimentos, que passam pelo processo de fermentao esto
relacionados na tabela 1.
Tabela 1. Alimentos fermentados

1
Gari (frica) e Peujeum (Indonsia) alimentos tpicos preparados a partir da mandioca. Depois de
cozida a vapor e amassada, a mandioca mistura com o ragi (farinha de arroz que age como cultura
starter), embrulhada em folhas de bananeira e postas em potes de barro para fermentar por um ou dois
dias.
2
Bangkrek produto preparado a base da fermentao de tempe (comida tpica da Tailndia feita com
soja fermentada) e com resduos de coco que sobram da extrao do seu leo. Pode ser mortal quando
se desenvolve a bactria Pseudomonas. Mesmo tendo sido proibida a sua fabricao e venda, 40
pessoas morreram intoxicadas em 1988 na Tailndia
10



Na indstria qumica, farmacutica e na agricultura a aplicao da engenharia
bioqumica est listada abaixo
11



2 TECNOLOGIA DAS FERMENTAES

2.1 CONSIDERAES SOBRE METABOLISMO ENERGTICO
O termo metabolismo refere-se a todas as reaes qumicas que ocorrem na
clula, incluindo tanta as reaes que produzem energia como as que utilizam a
energia para a biossntese ou outras funes celulares. Energia traduzida como a
capacidade de realizar trabalho. Uma clula viva deve realizar diferentes tipos de
trabalho, tais como produzir enzimas, sintetizar parede celular e membrana
citoplasmtica e reparar danos ocorridos na clula.
Para realizar o trabalho, a clula necessita de uma grande quantidade de
energia. A fonte desta energia para alguns organismos so as molculas qumicas
(nutrientes) que so absorvidas pelas clulas. Quando as ligaes qumicas desses
nutrientes so quebradas, a energia liberada em forma de energia qumica que a
clula armazena e posteriormente utiliza para executar trabalho. Para outros
12

organismos, a fonte de energia a luz; quando expostos a ela, eles convertem a
energia luminosa em energia qumica utilizada no metabolismo (Figura 2).


Figura 2. Aspectos macroscpicos do metabolismo dentro do
interrelacionamento global dos organismos vivos na biosfera. Fonte:
Lehninger, 1988.

O metabolismo composto por duas reaes bsicas (Figura 3):
1- Catabolismo: reaes de degradao (liberao de energia)
2- Anabolismo: reaes de biossntese (consumo de energia)

Figura 3. Metabolismo = catabolismo+ anabolismo. Fonte: Lehninger, 1988
13

A clula requer energia para realizar diferentes tipos de trabalho:
Biossntese das partes estruturais da clula: parede, membrana e
apndices externos;
Sntese de enzimas, cidos nuclicos, polissacardeos, fosfolipdeos,
protenas e outros componentes qumicos;
Transporte de nutrientes
Reparo de danos e manuteno da clula em boas condies;
Crescimento e multiplicao;
Armazenamento de nutrientes e excreo de produtos indesejveis;
Mobilidade.

2.2 OS MICRORGANISMOS E AS FERMENTAES DOS ALIMENTOS
2.2.1 Definio de bioprocesso
Bioprocessos compreendem um conjunto de operaes que incluem o:
Tratamento da matria prima;
Preparo dos meios de propagao e produo;
Esterilizao e a transformao do substrato em produto(s);
Processos de produo;
Processos de separao e purificao de produto(s).
A distino entre bioprocessos e processos qumicos est calcada na natureza dos
catalisadores utilizados em suas reaes. Os bioprocessos so conduzidos mediante
ao de:
Microrganismos;
Clulas animais ou vegetais;
Enzimas.
Um esquema geral para processos fermentativos (bioprocesso) est representado na
figura 4.
14


Figura 4. Esquema geral de um processo fermentativo

2.2.2 Substrato
Uma grande variedade de matrias-primas, geralmente provenientes da
agroindstria, so utilizadas como fonte(s) de substrato(s) e outros nutrientes. De uma
forma geral, as matrias-primas de bioconverses podem ser agrupadas em funo da
estrutura e da complexidade molecular dos substratos. A matria-prima um dos
componentes mais relevantes nos custos de produo, havendo casos em que pode
representar at 75% do custo total, sendo esta uma das razes pelo crescente
interesse no aproveitamento de resduos agroindustriais. A escolha dos nutrientes
adequados gerao do produto de interesse est relacionada atividade metablica
desenvolvida pelos microrganismos. Nesse ponto, destaca-se a importncia das
informaes obtidas sobre as exigncias nutricionais da populao microbiana
envolvida no processo. Torna-se necessrio, ento, utilizar fontes adequadas, isto ,
que possuam os componentes necessrios so bom desempenho do microrganismo.
Assim, preciso fortificar a matria-prima com os componentes que faltam e retirar
aqueles que inibem, de modo a permitir uma rpida e eficiente converso do substrato
em produto com o rendimento desejado.
15

As condies que permitem a produo mxima de massa molecular no so
necessariamente as mesmas que permitem a mxima produo de um determinado
produto. Aspergillus niger, por exemplo, d melhores rendimentos de cido ctrico,
quando seu crescimento restringido, por concentraes de semi-inanio de
nitrognio, fsforo, porem com alta concentrao de acar.
Agrupamento das fontes de substrato em funo da estrutura e da complexidade
molecular dos substratos.
Substratos solveis: que podem ser facilmente extrados produto(s) como por
exemplo, sacarose, glicose, frutose e lactose, provenientes de cana-de-acar,
beterraba, melao, soro de leite, etc.
Substratos insolveis: que precisam de tratamento moderado
para solubilizao e hidrlise, antes da converso em produto(s)
comopor exemplo, amido de milho, mandioca, trigo, cevada,
batata, etc.
Substratos insolveis muito resistentes: que necessitam de pr-tratamento
fsico, seguido de hidrlise qumica ou enzimtica para produzir substratos na
forma monomrica a ser convertidos em produto(s) como, por exemplo,
celulose e hemicelulose.

2.2.2.1 Fonte de energia
A adenosina-trifosfato (ATP) o composto mais importante nas transformaes
de energia das clulas. As bactrias e as algas fotossintticas podem utilizar a energia
da luz para formao de ATP; as bactrias autotrficas podem gerar ATP pela
oxidao de compostos inorgnicos; ao passo que as bactrias, leveduras e fungos
heterotrficos formam ATP oxidando compostos orgnicos. Nas indstrias de
fermentao, a fonte mais comum de energia amido ou melao.

2.2.2.2 Fonte de carbono
As necessidades de carbono so supridas com a fonte de energia, porm as
bactrias autotrficas e fotossintticas utilizam dixido de carbono. A via pela qual os
heterotrficos metabolizam carbono de substrato importante para se determinar a
quantidade de carbono convertido em material celular. Verifica-se que os organismos
facultativos incorporam cerca de 10% do carbono do substrato quando metabolizam
anaerobiamente, porm 50 -55% com metabolismo completamente aerbio.

16

2.2.2.3 Fonte de nitrognio
O nitrognio pode ser suprido maioria dos organismos industrialmente
importantes por meio de amnia ou de seus sais, embora o crescimento seja mais
rpido quando se utiliza nitrognio orgnico. Os compostos orgnicos nitrogenados
mais utilizados industrialmente so: farelo de soja, farelo de amendoim, farinhas de
peixe ou carne, as borras de cerveja, extrato de levedura, soro de leite.

2.2.2.4 Fonte de minerais
Fsforo e magnsio so constituintes particularmente importantes no meio de
cultura, pois so relacionados com todas as reaes de transferncia de energia
envolvendo ATP. Tambm so indispensveis para o bom desenvolvimento da cultura,
o clcio, potssio, enxofre e sdio, assim como os micronutrientes: ferro,cobalto, cobre
e zinco.

2.2.3 Esterilizao
A esterilizao de um meio de cultura ou ambiente a operao pela qual
todas as formas de vida (sejam vegetativas ou esporuladas) so eliminadas
(destrudas ou removidas) deste meio ou ambiente.
Em alguns processos biotecnolgicos industriais, a eliminao parcial da
populao microbiana dos equipamentos e meios de crescimento suficiente para
garantir a qualidade que se deseja no produto. Por exemplo, nos processos onde
inibidores de crescimento so produzidos (fermentao alcolica, produo de
vinagre, cido lctico, antibiticos e outro biocidas), o teor de inibidor impede em maior
ou menor grau o crescimento de vrios microorganismos.
Existem, tambm, bioprocessos em que se prescinde totalmente de assepsia,
como o caso dos biotratamentos, nos quais a microbiota nativa, atuando de forma
consorciada extremamente desejvel, para que haja reduo da carga orgnica
poluidora.
Na prtica, considera-se que uma esterilizao foi realizada com sucesso
quando estiver garantida a assepsia adequada.
O conceito de esterilizao difere do conceito de desinfeco pelo fato de que
neste ltimo processo ocorre o emprego de uma substncia que destri ou inibe o
crescimento de certos microrganismos em determinados meios.
Os agentes de esterilizao e desinfeco podem ser fsicos ou qumicos:
Agentes fsicos: calor (seco ou mido); filtrao (obteno de meio ou ar estril);
radiao (ultra-sons, ultravioleta, raios catdicos).
17

Agentes qumicos: cidos, bases, sais, halognios, alcois, aldedos, teres,
fenis.
A tendncia atual considerar os agentes qumicos como ligados aos
processos de desinfeco e os fsicos aos de esterilizao.
Os processos de maior interesse industrial so os efetuados por agentes
fsicos e consubstanciam os processos de esterilizao.
A pasteurizao (80
o
C, 15) um processo mais brando que a esterilizao
(121
o
C, 15). Na pasteurizao a inteno a de eliminao de clulas vegetativas,
sobretudo as clulas de microrganismos patognicos que so mais sensveis ao calor.

2.2.3.1 Esterilizao pelo calor

2.2.3.1.1 Esterilizao pelo calor seco
A esterilizao pelo calor seco feita a temperatura de 160-170
o
C por duas
horas. No aplicada a meios de cultura ou lquidos. Aplicvel vidraria e material de
laboratrio, e no caso da esterilizao do recheio fibroso dos filtros de ar.

2.2.3.1.2 Esterilizao por calor mido
feita num ambiente de vapor saturado a 1atm de presso (T=121
o
C) durante
15-20min. Estas condies so suficientes para a eliminao das formas esporuladas
(vida latente) de bactrias, muito mais resistentes que as formas vegetativas. Esta
esterilizao pode ser feita por dois mtodos:
a) Com vapor latente (100
o
C): utilizado vapor presso atmosfrica. Este
mtodo preferido sempre que haja no meio de cultura compostos que se
decomporiam ou reagiriam com outros temperaturas mais elevadas, ou quando as
condies de cultura inibem o crescimento de contaminantes (pH baixo, por exemplo).
Existem basicamente 2 processos:
a
1
) esterilizao simples por vapor fluente: 20 a 30 minutos.
a
2
) tindalizao: o aquecimento em ambiente mido com vapor fluente feito
100
o
C/30min e repetido mais 2 vezes com intervalos de 24horas. Os esporos
sobreviventes ao primeiro aquecimento desenvolver-se-o nas 24 horas
seguintes e as formas vegetativas da resultantes seriam eliminadas no
segundo aquecimento. Por garantia faz-se um terceiro aquecimento aps
24horas.
b) com vapor saturado sob presso: feita em autoclaves 1atm (121
o
C) por 15
a 20 minutos.
18


2.2.3.2 Esterilizao qumica
um mtodo menos importante que os anteriores. utilizado para a
esterilizao de superfcies. Para a esterilizao de equipamentos muito utilizado o
xido de etileno. Ele destroe tanto clulas vegetativas, como esporos, mas s efetivo
em presena de gua. utilizado em mistura com dixido de carbono ou nitrognio,
na forma gasosa (2-50% de concentrao). Dois grupos:
Desinfetantes: so substncias que agem diretamente sobre estruturas
microbianas, causando a morte do microrganismo. Agem tanto sobre
microrganismos como sobre seres superiores. So portanto, txicos gerais,
sem especificidade;
Agentes quimioterpicos: So substncias que interferem em determinadas
vias metablicas. So portanto especficos aos microrganismos que possuem a
via metablica sensvel. Podem ser sintticos como as sulfas e cloranfenicol ou
naturais como os antibiticos.

2.2.3.3 Esterilizao por irradiao de luz ultravioleta
A radiao UV absorvida por muitas substncias celulares, mas de modo mais
significativo porcidos nucleicos, onde geralmente ocorrem as leses. A regio do
espectro de UV com ao esterilizante de 220 a 300 nm, muitas vezes chamada de
regio abitica.

2.2.4 Desenvolvimento dos agentes de bioprocessos e a exigncia de
oxignio
Muitas clulas vivas necessitam de oxignio para manuteno de seu
metabolismo. Nos bioprocessos conduzidos com microrganismos aerbios,
(Bioprocessos aerbicos)o oxignio suprido ao biorreator, via de regra, como
bolhas de ar, atravs de um compressor, como ser visto mais adiante.
Nos bioprocessos anaerbicos, os microrganismos obtm o oxignio metablico
atravs de substncias que contm oxignio ligado molecularmente.
Nos primeiros, o suprimento adequado de oxignio para atender a demanda da
clula imperativo, assim como a manuteno de condies anaerbias estritas no
segundo caso. Se essas exigncias no forem atendidas o processo ter seu potencial
limitado, podendo haver desvios no metabolismo celular ou mesmo sua interrupo,
com a conseqente morte da clula.
Fungos algas e algumas bactrias so aerbicos obrigatrios;
19

Algumas bactrias so anaerbicas estritas ;
Leveduras e muitas bactrias podem desenvolver-se em ambas as condies,
so aerbicas facultativas.

2.2.5 Desenvolvimento dos agentes de fermentao e estado fsico do
substrato
Substrato lquido
o superfcie
o profundidade (submerso)
Substrato slido ou semi-slido.

2.2.5.1 Fermentao em estado lquido
o processo que se desenvolve na presena de grande quantidade de gua.
O processo de fermentao conduzido em tanques de fermentao com grande
variao no tamanho, tipo de material de construo, abertos ou fechados, etc.
O surgimento desse processo permitiu o aumento de escala para muitos produtos
limitados pelo processo de fermentao em meio slido. Vrios produtos so obtidos
por esse processo: lcool etlico; bebidas alcolicas; antibiticos, vitaminas; vacinas;
enzimas; insulina e muitos outros. A fermentao lquida apresenta uma srie de
vantagens operacionais sobre a fermentao em meio slido tais como:
Medio e controle de pH, temperatura, oxignio, produto substrato;
Separao e purificao do produto;
Maior facilidade de se ter um processo contnuo e automatizado.

2.2.5.2 Processos de fermentao em meio lquido e na superfcie
So aqueles em que a biomassa situa-se na superfcie do meio lquido, em
contato direto com o ar atmosfrico, que fornece o oxignio necessrio produo
microbiana. A diminuio da concentrao de nutrientes nas camadas superficiais faz
com que cheguem superfcie, por difuso, os nutrientes das camadas mais
profundas.Tambm, por difuso, o(s) produto(s) do metabolismo se dispersa(m) no
meio em fermentao. Portanto, a difuso e a relao entre a rea oferecida e o
volume de meio desempenham papel importante em bioprocessos operados em
superfcie. O meio de cultivo colocado em recipientes rasos, de modo a oferecer
grande rea ao desenvolvimento do agente. Como as taxas de transferncia de massa
de nutrientes so lentas, os tempos de fermentao so consideravelmente longos.
Os processos em superfcie so de operao difcil e so considerados
antieconmicos, devido ao alto custo de produo resultante da manipulao custosa
20

da esterilizao (incluindo ambiente), enchimento, esvaziamento e limpeza das vrias
bandejas necessrias a produo em larga escala. Este tipo de processo limita-se, via
de regra, aos fungos filamentosos, que tendem a formar pelcula micelial na superfcie
do meio.

2.2.5.3 Processos de fermentao em meio lquido submersos
So aqueles em que o microrganismo produtor se desenvolve no interior do
meio de fermentao, geralmente agitado. No caso de fermentaes aerbias, o
oxignio necessrio populao em desenvolvimento suprido, atravs de um
compressor, por borbulhamento de ar. A maioria das fermentaes industriais
importantes realizada por processo submerso. Pode-se citar que uma determinante
reduo no preo de muitos produtos, anteriormente obtidos por processos em
superfcie, foi a possibilidade de adapt-los aos processos submersos. Comparados
com os processos em superfcie, os processos submersos oferecem uma srie de
vantagens:
Pode-se manipular, com maior facilidade, maiores volumes de meio;
A massa de microrganismos responsveis pela transformao fica totalmente
submersa no meio nutriente de maneira uniforme, o que pode ser ajustado
para fornecer as condies ideais de crescimento e produo;
A absoro de nutrientes e excreo de metablitos executada com maior
eficincia, levando a menores tempos de fermentao e, consequentemente,
melhor produtividade;

2.2.5.4 Fermentao em estado slido
Processo que refere-se a cultura de microrganismos sobre ou no interior de
partculas em matriz slida, onde o contedo de lquido ligado aela est a um nvel de
atividade de gua que, assegure o crescimento e metabolismo das clulas e, por outro
lado, no exceda a mxima capacidade de ligao da gua com a matriz slida.A
fermentao em estado slido, tambm denominada de Fermentao em meio semi-
slido, o mais antigo processo fermentativo.

21

Fermentao em estado slido remete idia de dois tipos de materiais
insolveis em gua, sobre os quais os microrganismos iro crescer: quando osuporte
slido atua ele prprio como fonte nutrientes e e no caso em que os nutrientes so
solveis em gua e os microrganismos esto aderidos a uma matriz slida, inerte ou
no, que ir absorver o meio de cultura lquido. A maioria dos processos utiliza o
princpio em que o suporte slido atua tambm como fonte de nutrientes.
Os Substratos tradicionalmente utilizados so produtos agrcolas como o arroz,
o trigo, o paino, a cevada, o milho e a soja, alm de substratos no convencionais
como os resduos agro-industriais e florestais, destacando-se: o bagao de cana-de-
acar, o sabugo de milho, o farelo de trigo e a palha de arroz.
O grande interesse nesses processos decorre do fato dessas matrias-primas
no possurem custos de produo associados diretamente, sendo uma forma de se
agregar valor a resduos que se formam em abundncia.
Em linhas gerais, a operao dos bioprocessos em meios semi-slidos, pode ser
realizada sem agitao mecnica, com agitao ocasional ou contnua em reatores
dos tipos: bandeja; tambor rotativo; esteira rolante; reator tubular horizontal; tubular
vertical; sacos plsticos.
A fermentao em meio slido apresenta as seguintes vantagens:
Simplicidade dos meios de fermentao. O substrato slido pode requerer
somente adio de gua, embora outros nutrientes possam ser adicionados;
Ausncia de requerimentos de mquinas e equipamentos sofisticados;
Demanda reduzida de energia;
Baixo grau de umidade, reduzindo os problemas de contaminao;
As condies de crescimento do microrganismo agente do bioprocesso so
similares s encontradas em seu ambiente natural;
Ausncia de formao de espuma;
Fatores limitantes:
o Menor acessibilidade e disponibilidade de substrato;
o Problemas de transferncia de massa (oxignio e nutrientes), calor;
o Dificuldades no Controle de variveis fsico-qumicas: pH, temperatura,
oxignio;
o Dificuldades no aumento de escala.



22

2.2.6 Cintica dos bioprocessos
Quando uma pequena quantidade de clulas vivas colocada numa soluo
contendo nutrientes essenciais em condies favorveis de pH e temperatura, as
clulas se reproduziro. No caso de microorganismos unicelulares que se dividem
quando crescem, o aumento da biomassa (massa de material vivo) acompanhado
pelo aumento do nmero de clulas, ou seja, aumento de populao. Quando se trata
de bolores ou fungos filamentosos a situao completamente diferente. Aqui
crescimento associado ao comprimento e nmero de miclios, aumentando em
dimenso e densidade a biomassa, mas no em nmero.
Associados ao crescimento existem dois processos: consumo de material do
meio e liberao de metablitos.
A medida do processo de crescimento feita em geral por mtodos gravimtricos
(peso seco) e turbidimtricos (densidade tica).
A cintica de um bioprocesso consiste na anlise da evoluo dos valores de
concentrao de um ou mais componentes do sistema produtivo, em funo do tempo
do bioprocesso (figura 5). Entende-se, como componentes, o microrganismo
(biomassa), os produtos do processo (metablitos) e os nutrientes ou substratos que
compe o meio de cultura.
A Tabela 2 traa um perfil de quo complexo o processo de crescimento de um
microrganismo.
Tabela 2. Processo de crescimento de um microrganismo.
Meio Populao celular
Multicomponentes
Nutrientes


Componentes mltiplos
Reaes em soluo Produtos

Heterogeneidade entre indivduos
Equilbrio cido-base Reaes mltiplas
pH, T, . . . variveis Calor

Controles internos
Prop. reolgicas variveis Adaptabilidade
Fases mltiplas (G-L, S-L, G-S..) Int. Mecnicas

Probabilidade
Heterogeneidade espacial Degenerescncia

23


Figura 5. Cintica de processo fermentativo
A curva de crescimento dos microrganismos est representada na figura 6.

Figura 6. Curva de crescimento microbiano
Fase LAG (adaptao ) As clulas que foram inoculadas se adaptam ao
novo meio. As clulas sintetizam as enzimas necessrias ao metabolismo dos
componentes presentes no meio. No h reproduo celular. A durao dessa
fase varia com a concentrao do inoculo, com a idade do microrganismo
(tempo de pr-cultivo) e com o seu estado fisiolgico.
Fase exponencial ou logartmica Caracterizada por uma grande velocidade
de crescimento. A produo de biomassa atinge velocidade mxima.
Fase de transio A velocidade de crescimento comea a diminuir por
motivos como:
a) inibio por produtos da fermentao
b) inibio pela alta concentrao de biomassa
c) deficincia de oxignio
d) inibio por produtos secundrios txicos
Fase estacionria A taxa de crescimento iguala-se taxa de morte de
clulas.
24

Fase de morte Caso o processo seja continuado, observa-se uma fase
decrescente na curva de desenvolvimento celular porque a taxa de morte de
clulas passa a ser maior do que a de crescimento.

2.2.6.1 Processo de fermentao
Existem infinitas formas de se conduzir um reator biolgico, dependendo das
caractersticas prprias do microrganismo, meio de cultivo, e dos objetivos especficos
do processo que se pretende executar.
Sero abordadas as formas mais gerais, entendendo tal estratgia permitir as
particularizaes que se fizerem necessrias:
Descontnuo
o Com um inculo por tanque
o Com recirculao de clulas
Semi-contnuos
o Sem recirculao de clulas
o Com recirculao de clulas
Descontnuo alimentado
o Sem recirculao de clulas
o Com recirculao de clulas
Contnuo
o Executado em um reator (com ou sem recirculao de clulas)
o Executado em vrios reatores (com ou sem recirculao de
clulas)
2.2.6.1.1 Descontnuo simples
O processo descontnuo simples (figura 7 e 8), ou seja, aquele efetuado com
um inoculo por tanque, consiste na preparao do substrato adequado ao
desenvolvimento do microrganismo; colocar esse substrato em um biorreator;
adicionar o microrganismo responsvel pelo bioprocesso e aguardar que o processo
ocorra. Aps o tempo necessrio de processo, retira-se o caldo do biorreator e
executa-se as operaes unitrias necessrias para a recuperao e purificao do
produto.
No nvel de aplicaes prticas, para um bioprocesso razoavelmente evoludo,
dificilmente ser conduzido como um reator descontnuo simples, havendo
freqentemente alguma elaborao adicional. O descontnuo ser sempre a base para
as comparaes de eficincias atingidas nessas elaboraes, mas a sua baixa
eficincia estimula o surgimento das formas alternativas.
25

O principal problema desta forma de operar bioprocessos decorrente de
fenmenos de inibio pelo substrato, produto, ou outros metablitos.
Concentraes elevadas de substrato inibem o agente biolgico. Este efeito est
relacionado, em clulas vivas, a fenmenos osmticos que resultam em plasmlise
celular. As possveis razes para o fenmeno so a represso na sntese de enzimas
e a desidratao dos sistemas enzimticos, devida perda de gua da clula ou
inibio do transporte de nutrientes para o seu interior.

Figura 7. Esquema de um processo descontnuo

Figura 8. Cintica do processo descontnuo
fato bem conhecido que a clula viva polui seu ambiente com produtos do
seu metabolismo at fazer cessar o crescimento e, eventualmente, perder sua
viabilidade, fenmeno conhecido como inibio pelo produto.

26

2.2.6.1.2 Descontnuo com recirculao de clula
Uma alternativa ao processo batelada simples a recirculao de clulas, ou
seja, ao se encerrar a batelada efetua-se a separao das clulas por centrifugao
ou mesmo sedimentao no interior do prprio biorreator, enviando apenas o lquido
fermentado para a recuperao do produto. Com isso busca evitar o preparo de um
novo inculo para cada batelada, reduzindo custos e reduo de tempo para a
obteno de altas concentraes de clula no reator. Esse processo tambm
conhecido como batelada repetida.

2.2.6.1.3 Semi-contnuo
O sistema semi-contnuo (figura 9 e 10) diferencia-se do descontnuo
alimentado, pelo fato de se retirar o lquido processado e se proceder ao
preenchimento do reator a uma vazo muito elevada, de forma a se imaginar que o
reator esteja sendo preenchido instantaneamente. Ao final do novo ciclo, procede-se
novamente retirada de uma dada frao do volume, 30 a 60% e se preenche o reator
instantaneamente. Na verdade, na prtica, para grandes volumes esse preenchimento
contnuo no ocorre, recaindo no reator descontnuo alimentado. De qualquer forma,
trata-se de uma tcnica distinta, na qual est embutida a idia a operao por choques
de carga de substrato. Alertamos sobre a possibilidade de uso de misturas de conceito
(descontnuo, contnuo, descontnuo alimentado), a fim de se conseguir o mximo de
desempenho de um dado sistema biolgico, reforando a idia sobre a enorme
flexibilidade que dispe para a operao de um biorreator.

Figura 9. Sistema semi-contnuo de fermentao

27


Figura 10. Cintica do processo semi-contnuo

2.2.6.1.4 Descontnuo alimentado (fed batch)
aquele no qual inicialmente se introduz o inoculo, ocupando uma frao do
volume til da ordem de 10 a 20%, iniciando-se ento a alimentao com o meio de
cultura, a uma vazo adequada, sem ocorrer a retirada de lquido processado (Figura
11 e 12). Essa operao prolonga-se at o preenchimento do volume til do reator,
quando ento inicia-se a retirada do caldo processado para a recuperao do produto.
Pode-se incluir a essas operaes o reciclo de clulas a fim de se iniciar um novo
perodo de alimentao. A alimentao pode ser constante ou intermitente, com
vazes constantes ou no. Como tambm, pode-se variar a composio do meio de
alimentao.
O processo descontnuo alimentado pode ser dividido em dois grupos,
baseados no fato de a adio de substrato ser ou no controlada por um mecanismo
de retroalimentao.

Figura 11. Sistema de fermentao descontnuo alimentado
28



Figura 12. Cintica do processo descontnuo alimentado

2.2.6.1.5 Contnuo
No processo contnuo (figura 13 e 14) procura-se estabelecer um fluxo
contnuo de lquido atravs do reator, ou reatores dispostos em srie.
A operao de um sistema contnuo, constitudo por vrios reatores em srie, no
qual a alimentao de um dado reator da srie o efluente do reator anterior, visa o
estabelecimento de diferentes condies nos vrios biorreatores da srie.


Figura 13. Esquema do processo contnuo

F vazo
S
0
Concentrao inicial de
substrato
X
0
Concentrao inicial de
clulas
P
0
Concentrao inicial de
produto
S Concentrao final de
substrato
X Concentrao final de clulas
P Concentrao final de
produtos
29


Figura 14. Cintica do processo contnuo

2.2.6.1.6 Vantagens e desvantagens do processo contnuo em relao ao processo
descontnuo
As principais vantagens apresentadas pelo processo contnuo, em relao ao
descontnuo, tradicional, so decorrentes da operao em estado estacionrio,
podendo-se destacar:
Aumento da produtividade do processo, em virtude de uma reduo dos
tempos mortos ou no produtivos;
Obteno de caldo bioprocessado uniforme, o que facilita o projeto das
operaes unitrias de recuperao e purificao do produto de
interesse (downstream);
Manuteno das clulas em um mesmo estado fisiolgico;
Possibilidade de associao com outras operaes contnuas
na linha de produo;
Maior facilidade no emprego de controles avanados;
Menor necessidade de mo de obra.
Entretanto, ao lado das inmeras vantagens apontadas, o processo contnuo
apresenta tambm algumas desvantagens ou problemas prticos, os quais
destacamos:
Maior investimento fixo na planta;
Possibilidade de ocorrncia de mutao gentica espontnea,
resultando da seleo de mutantes menos produtivos;
Maior possibilidade de ocorrncia de contaminao, por se tratar de
um sistema essencialmente aberto, necessitando de manuteno
30

de condies de assepsia nos sistemas de alimentao e retirada
de meio;
Dificuldade de manuteno de homogeneidade no reator, quando
se trabalha com baixas vazes, ou quando o caldo adquire
comportamento pseudoplstico, como o caso do cultivo de fungos
filamentosos;
Dificuldade de operao em estado estacionrio em determinadas situaes
(formao de espuma, crescimento do microrganismo nas paredes de reator,
ou ainda nos sistemas de entra e sada de lquido.

2.2.6.1.7 Definio dos parmetros cinticos
2.2.6.1.7.1 Definio das velocidades instantnea de crescimento ou de transformao
Para definir as diferentes velocidades de reao que ocorrem em processos
fermentativos em geral, considere um cultivo em batelada, uma forma simples de
cultivo amplamente utilizada no laboratrio e na indstria. Refere-se a um cultivo de
clulas num tanque fechado com uma carga inicial de meio de cultura que inoculada
certa quantidade de microrganismos.
Num processo em batelada possvel, a partir de amostras retiradas ao longo do
cultivo, visualizar as cinticas de crescimento celular, de consumo de substrato e de
formao de produto a partir de perfis de concentrao de clulas (X), substrato (S) e
de produto (P).
Balanos de massa para as clulas (X), substrato (S) e produto (P) nesse
cultivo definem as velocidades instantneas de crescimento celular (rx), de consumo
de substrato (rs) e de formao de produto (rp) como sendo:

dt
dX
r
x
= (1)
dt
dS
r
s
= (2)
dt
dP
r
P
= (3)

Ou seja, em cultivos em batelada possvel determinar tais velocidades
instantneas de reao a partir das tangentes (inclinaes) das curvas num dado
tempo de cultivo. possvel definir velocidades de reao (r
x
, r
s
e r
p
) em diferentes
formas de cultivo (descontnuos, contnuos e semicontnuos) a partir de balanos de
massa especficos para cada um deles.

31

2.2.6.1.7.2 Velocidades Especficas de crescimento ou transformao

Devido ao fato da concentrao celular variar durante um processo
descontnuo (normalmente aumenta) e as clulas constiturem o catalisador das
reaes microbianas, logo o aumento da concentrao celular acarreta tambm no
aumento da concentrao do complexo enzimtico responsvel pela transformao do
substrato no produto sendo mais lgico analisar os valores das velocidades
instantneas em relao concentrao celular (X). Logo, torna-se necessrio a
definio das velocidades especficas de crescimento celular, consumo de substrato e
de formao de produto, nas formas que seguem:

dt
dX
X
1
= (4)

|

\
|
=
dt
dS
X
1
q
S
(Tambm conhecida como
S
) (5)

dt
dP
X
1
q
P
= (Tambm conhecida como
P
) (6)

2.2.6.1.7.3 Fatores de Converso

Os coeficientes de rendimento so definidos com base no consumo de um
material para a formao de outro em um intervalo de tempo para processos
descontnuos ou em relao ao espao (entrada e sada do reator) para processos
contnuos, tratando-se de parmetros relacionados com a estequiometria. Como
exemplos de coeficientes de rendimento temos:

2.2.6.1.7.3.1 Coeficiente de rendimento celular (rendimento de substrato a clulas)

S S
X X
Y
O
O
S X

=
/
(7)

Y
X/S
definido na equao acima o coeficiente global de converso de
substrato em clulas, tambm conhecido como coeficiente de rendimento aparente ou
observado. O valor deste parmetro varia ao longo de um cultivo, alcanando o valor
mximo durante a etapa de crescimento exponencial em cultivos descontnuos
(batelada).
32


2.2.6.1.7.3.2 Coeficiente de rendimento de produto (rendimento de substrato a
produto)
S S
P P
Y
O
O
S P

=
/
(8)

Assim como para Y
X/S
, trata-se de um coeficiente global, varivel durante o
cultivo. Os coeficientes globais levam em considerao o consumo total de um
material para a formao de um outro. Por exemplo, Y
X/S
indica a razo entre a
quantidade de clulas formada e a quantidade total de substrato consumida num
cultivo, podendo este substrato tambm ser utilizado para outros fins, tais como para a
formao de produto e energia de manuteno celular.
Para um determinado tempo t* o clculo do coeficiente de rendimento celular e
de produto instantneos realizado de acordo com as seguintes relaes:
dS
dX
Y
S X

=
/
(9)
dS
dP
Y
S P

=
/
(10)

Conforme as definies de velocidades (eqs. 1, 2 e 3) e velocidades
especficas (eqs. 4, 5 e 6), resultam as seguintes relaes:
S
X
S
X
S X
r
r
Y

= =
/
(11)
S
P
S
P
S P
r
r
Y

= =
/
(12)

2.2.6.1.7.4 Determinao da velocidade de crescimento
Diviso celular Nde clulas Nde geraes Genera lizao




1 0 X0*2
0
2 1 X0*2
1
4 2 X0*2
2
8 3 X
0
*2
3

X
0
=nmero inicial de clulas; N=nmero de geraes X
0
*2
N

Ento para N geraes temos:
N
0
2 X X * =

(19)
Se chamarmos de g o tempo de gerao ou o tempo de duplicao de uma
populao e t o tempo de crescimento, teremos:

33

g
t
N = (20)

Ento:
g
t
2 X X
0
* = (21)

aplicando Ln tem-se:

g
t
69 0
X
X
Ln 2 Ln
X
X
Ln
0 0
g
t
* , =
(

=
(

(22)

Se 0,69/g for constante, teremos uma reao de primeira ordem. Definindo
como a velocidade especfica de crescimento, temos:

t
X
X
Ln
g
69 0
0
*
,
=
(

= (23)

Esta relao pode ser demonstrada experimentalmente da seguinte maneira: a
velocidade aumento da populao ser diretamente proporcional a esta populao, ou
seja:
X
dt
dX
* = (24)


Ento a constante de proporcionalidade (velocidade especfica de
crescimento) ser igual a:


dt
dX
X
1
* |

\
|
= (25)
Integrando, obtm-se:

t
X
X
Ln
0
* =
(

(26)

Onde a velocidade especfica de crescimento, corresponde ao aumento da
populao por unidade de tempo e por unidade de populao. A mxima inclinao,
obtida na parte linear da curva, como ilustrado na Figura 15,
max
, ou seja, a
velocidade especfica de crescimento mxima.


Aumento da populao Quantidade populacional
34










Figura 15. Grfico para obteno de
max

2.2.6.1.7.5 Cintica de Crescimento de Monod
Se somente um substrato limitante os outros em excesso, de forma que
somente a mudana da concentrao do substrato limitante relevante, a cintica de
crescimento varia tipicamente numa forma hiperblica, como mostrado na figura
abaixo, onde S o substrato limitante (normalmente fonte de carbono) e a
velocidade especfica de crescimento (figura 16).












Figura 16. Cintica de crescimento de Monod

Monod expressou este tipo de curva numa forma idntica de Michaelis-
Menten para enzimas, ou seja:
S k
S
s
max
+
= onde
dt
dX
X
1
= (27)
As mesmas consideraes feitas para a equao de Michaelis-Menten so
vlidas aqui:
max
= >>
S
k S (S > 10 k
s
) (28)

S k k S
S
* = << (S < 0,10 k
s
) (29)

S k
2
S
mx
= =

(30)

max

max
/2
k
s

max

ln X
Tempo
35

Onde k
S
pode ser tomado como o valor da concentrao de substrato abaixo
da qual linearmente dependente de S e acima da qual torna-se independente de
S.
A determinao de k
S
e
max
melhor feita pela linearizao da equao de
Monod. A equao de Lineweaver-Burk um exemplo (consultar o captulo 6 para
outros tipos de linearizaes), como segue:
S
1 K 1 1
s

max max
(31)

Assim, da figura 17 pode-se determinar as constantes k
s
e
max
pelos
coeficientes da reta.










Figura 17.Linearizao da equao de Monod


2.2.6.1.7.6 Metabolismo endgeno
Em alguns casos, notadamente quando a taxa de diluio em fermentador
contnuo muito baixa, verifica-se um desvio da equao de Monod, que se
transforma no seguinte:
e
s
max
k -
S k
S
+
= (32)
onde k
e
chamada de taxa de metabolismo endgeno, que significa que ocorrem
reaes nas clulas de material intracelular. Por outro lado, k
e
pode ser tambm
encarado como taxa de morte, de forma que tenhamos:
d
k -
obs
= (33)

Onde:

obs
: velocidade especfica de crescimento observada;
: velocidade especfica de crescimento segundo Monod;
k
d
: coeficiente especfico de morte.

Assim:

1
max
1

max S
K
1/S
36


d
s
max obs
k -
S k
S
+
= (34)

Ou ainda:

X k -
S k
X S
dt
dX
d
s
max

+

= (35)

2.2.6.1.7.7 Modelos de crescimento no estruturados
A tabela 3, 4 e 5 apresentam as referncias e alguns modelos no-estruturados.
Tabela 3. Modelos cinticos sem inibio e com um substrato limitante
Referncia Modelo Cintico
Monod
s K
s
S
+
=
max

Teissier ( )
Ks s
e 1
/
max

=

Moser
n
S
n
s K
s
+
=
max

Contois
Fugimoto
s x K
s
S
+
=
max

Powell
( ) s K K
s
D S
max
+ +
=

Blackman
2K s para 1 e
2K s para
K
s
2
1
> =

< =

max
max

Dabes et al.


+ =
max
S
K
K s

Kono
Kono e Asai
X r
x
=


Um grande nmero de modelos pode ser encontrado na literatura. Modelos de
crescimento podem ser muito restritos, representando um dado processo, com um
dado microrganismo, ou mesmo uma determinada fase de um processo fermentativo.
As tabelas abaixo trazem um resumo de alguns modelos de crescimento de
microrganismos.




37

Tabela 4. Modelos cinticos com inibio pelo substrato
Referncia Modelo Cintico
Andrews
Noack
S 1 S S 1 S
K s 1
1
s K
s
K s s K 1
1

+

+ +
=
/ / /
max max

Webb
( )
'
'
max
/
/
S
2
S
S
K s K s
K s 1 s
+ +
+
=


Yano et al
( )

+ +
=
j
j
S 1 S
K s s K 1
1
/ /
max

Aiba et al
S 1
K s
S
e
s K
s

+
=
/
max


Teissier-Type

( ) ( ) [ ]
S S 1
K s K s / exp / exp
max
=


Webb
( )
inica fora com e
K 1 K s
s
17 1
S 1 S
=
+ +
=

,
max

Tseng e
Waymann
Waymann e
Tseng
( )
C S 1
S
s s K
s K
s

+
=
max

Siimer
( ) ( ) [ ]
2
S S
2 P S S S S 0 cat
c b a
K K 1 1 1 e k
r


+ +
+ +
=
/ /
'























38

Tabela 5.Modelos cinticos para cintica com inibio pelo produto
Referncia Modelo Cintico
Dagley e Hinshelwood
( ) ( ) p k 1
s K
s
p s
S

+
=
max
,

Holzberg et al.

( )
2 1
k p k =
max

Ghose e Tyagi
|
|

\
|
=
max
max
p
p
1
Aiba e Shoda
( )
kp
S
e
s K
s
p s

+
=
max
,
Jerusalimsky e Neronova
( )
p K
K
s K
s
p s
P 1
P 1
S
+

+
=

max
,
Bazua e Wilke
( )
( )
2 1
0
2 1 0
p p 1
p k p k
max max
max
+ =
=

Levenspiel
( )
n
crit obs
S
obs x
p p 1 k k com
x
s K
s
k r
=

+
=

Hoppe e Hansford
( ) [ ] s s Y K
K
s K
s
0 S P P 1
P 1
S
+

+
=
/
max


2.3 BIORREATORES
Os biorreatores ou reatores bioqumicos so o corao dos processos
bioqumicos. So reatores onde uma dada reao bioqumica ocorre. Esta reao
pode ser o resultado de crescimento de microrganismos ou uma reao catalisada por
enzimas. No primeiro caso dizemos que o biorreator um fermentador. O conceito de
biorreatores pode ser tambm estendido para outros tipos de processos que envolvem
microrganismos ou produtos de origem biolgica como tanques para tratamento
biolgico de guas residurias ou ainda colunas de purificao de bioprodutos
(enzimas, vitaminas, aminocidos, etc.). Os biorreatores podem ser divididos tambm
nas formas clssicas dos reatores de mistura e tubulares. O estudo do
comportamento, projeto e dimensionamento de cada biorreator possvel de ser
efetuado pela combinao de conhecimentos de cintica das reaes biolgicas com
balanos de energia e massa.
Neste captulo consideraremos inicialmente a forma simplificada dos reatores
ideais, para melhor entendimento das caractersticas essenciais dos biorreatores,
para, em seguida, estudarmos os desvios da idealidade nos reatores reais, como
conseqncia dos desvios da hidrodinmica dos sistemas.
39

2.3.1 Reatores Biolgicos ideais
Dentro dos biorreatores reais estudaremos inicialmente os fermentadores do
tipo reatores de mistura perfeita, nas suas diferentes formas de operao, tais como,
reatores em batelada, batelada alimentada e contnuos. Em seguida, veremos os
reatores tubulares e os enzimticos.

2.3.2 Reatores de mistura
2.3.2.1 Reatores em Batelada
Este processo constituiu-se basicamente de duas etapas: preparao do
inculo e a fermentao propriamente dita.
2.3.2.1.1 Preparo do inculo
Inculo (p-de-cuba ou p-de-fermentao) o volume de uma suspenso de
microrganismos capazes de garantir a fermentao de um dado mosto. O volume de
inculo pode variar segundo as condies de 0,5 a 50% da capacidade do tanque. A
tcnica de seu preparo compreende uma fase de laboratrio e outra industrial,
segundo o esquema abaixo, obedecendo a regra do volume crescente (figura 18) .



















Figura 18.Tcnica de preparo do inculo

Existem, basicamente, trs modos de operao de um sistema batelada:
processos em que a dorna recebe um inculo;
processos com recirculao do microrganismo;
processo por meio de cortes.
cultura pura
incubao
V
1
V
2
>V
1
incubao
fase
laboratrio
fase
planta ind.
V
3
> V
2
Incubao
V
4
V
n
40

No primeiro caso, o sistema oferece as melhores condies para uma boa
fermentao, pois recebe o inculo de clulas ativas e praticamente isenta de
contaminantes. No segundo caso, algumas dornas so incubadas no incio do
processo. O meio, uma vez fermentado, centrifugado obtendo-se assim uma
suspenso de microrganismos de elevada concentrao. A suspenso tratada (ou
no) com o objetivo de eliminar as clulas inativas e os microrganismos
contaminantes. Esta suspenso re-utilizada ento como inculo de outro
fermentador. No terceiro caso, inocula-se uma dorna no incio do processo e quando a
fermentao atinge um estgio apropriado, passa-se parte do contedo para uma
outra dorna e completa-se ambas as dornas com o meio fresco, a fermentar. A
sucesso de cortes pode ocasionar perda de rendimento principalmente se o meio no
esterilizado. Este processo pode ser utilizado tambm na preparao do inculo o
que evita que o processo seja reiniciado repetidas vezes. Existem tambm processos
mistos que associam dois dos processos citados.
2.3.2.1.2 Equaes do reator em batelada
A forma matemtica geral de balano para reatores em batelada pode ser
escrita da seguinte forma:
entrada - sada consumo (ou crescimento) = acmulo
Balano de clulas

S K
SX
X
dt
dX
s
max
+
= = (36)
Balano de substrato

S K
SX
Y
1
dt
dS
s
max
s x
+
= (37)
Estas equaes podem ser somadas, aps a multiplicao da equao de S
por Y
x/s
, e obteramos a equao abaixo:

( )
0
dt
S Y X d
s x
=
+
(38)
Ou seja, para X(0)=X
0
e S(0)=S
0
:

0 s x 0 s x
S Y X S Y X + = + ( ) S S Y X X
0 s x 0
+ = (39)




41


2.3.2.2 Reatores em batelada alimentada
A batelada alimentada um tipo especial de processos em batelada onde o
substrato alimentado constantemente, durante o processo fermentativo, de forma a
manter esta concentrao constante, ou aproximadamente constante, resultando num
sistema com volume varivel. A batelada alimentada um processo de muito sucesso,
pois elimina a inibio pelo substrato, resultando em altas produtividades, geralmente
muito maiores que as obtidas na batelada simples. Os balanos so muito similares
batelada simples, exceto pelo fato de que existe uma alimentao e, portanto o volume
do reator varivel.
Onde V o volume do reator num tempo t e F a vazo de alimentao, r
s
e r
x

so as velocidades de consumo do substrato e de crescimento, respectivamente.
Sabendo-se que:
X r
x
= (40)

Como S mantido constante pelo efeito da adio de substrato (na
concentrao S
*
), toma-se constante e igual a *. Assim, integrando-se a equao
acima de (XV)
0
a um (XV) genrico tem-se:
( )
t
0
*
e XV XV = (41)

( )
t
0 0
*
s x
*
a
*
e V X
Y
1
S S F = (42)
De onde tira-se a equao para F, que a vazo de alimentao necessria
para manter S constante.
( )
*
a s x
t
0 0
*
S S Y
e V X
F
*

=
(43)
A estimativa da variao do volume pode ser tirada da seguinte equao,
obtida da integrao da equao acima ao se substituir F por dV/dt:
( )
( )
(
(

+ = 1 e
S S Y
X
1 V V
t
*
a s x
0
0
*
(44)
e a concentrao da biomassa
( )
( )
(
(

+
=
1 e
S S Y
X
1
e X
X
t
*
a s x
0
t
0
*
*
(45)




42


2.3.2.3 Reatores de mistura contnuos
2.3.2.3.1 O Quimiostato: o reator de mistura ideal
O uso de reatores contnuos comeou na dcada de 50 com os trabalhos de
Monod. A descoberta de que as culturas de microrganismos podiam ser mantidas em
estado estacionrio por longos perodos, em qualquer taxa de crescimento at
max
, foi
um passo importante no entendimento da fisiologia e metabolismo dos
microrganismos.
A configurao tpica de um reator de mistura contnuo ilustrada na figura 19.

















Figura 19.Configurao tpica de um reator de mistura contnuo.

Meio novo, normalmente estril, introduzido no reator e o volume mantido
constante para que a retirada de meio fermentado seja em igual taxa na qual
introduzido o meio novo. O nome quimiostato deriva das propriedades qumicas do
ambiente que so constantes quando o sistema funciona em regime permanente.
Um outro sistema, conhecido como turbidiostato, um quimiostato provido de
uma clula fotoeltrica para regular a turbidez da cultura, ou seja, para aumentar a
vazo de entrada do meio (F), quando a concentrao celular ultrapassa o nvel
desejado.
O volume de lquido mantido constante atravs de um controlador de nvel. A
diferena bsica existente entre o turbidiostato e o quimiostato, que no primeiro a
densidade da biomassa fixada e a taxa de diluio ajusta-se ao regime estacionrio
Reservatrio de meio
Reservatrio de cido
ou base
Reservatrio de meio
fermentado
Sada de gases
(O2, CO2)
Entrada de ar estril
V
X
S
Fs
X
S
Fe
X0
S0
Controle de pH
43

e no segundo a taxa de diluio fixada e a concentrao de biomassa ajusta-se ao
regime estacionrio.
As equaes de balano podem ser escritas para as principais variveis do
processo:

2.3.2.3.1.1 Balano de clulas
Clulas entrando Clulas saindo + Clulas crescendo = Acmulo de clulas

( )
V r FX X F
dt
XV d
x O O
+ = (46)
Sabemos que X r
x
= , F
o
=F, e que V constante, portanto:
( )
X X
V
F
X
V
F
dt
X d
. . .
0
+ = (47)
Usualmente X
0
= 0, o que nos d:
V
F
dt
dX
X dt
dX
X X
V
F
= = + .
1
. . (48)

Em regime permanente:
0
dt
dX
=
, logo:
V
F
= (49)
Chamando
V
F
de taxa de diluio D, que o inverso do tempo de residncia ( ),
temos:

1
= = D
(50)
Portanto, em regime estacionrio, a taxa especfica de crescimento ser igual
taxa de diluio D.

2.3.2.3.1.2 Balano do substrato

Substrato entrando Substrato saindo Substrato consumido = Acmulo de
substrato

dt
dS
X . .
Y
1
S .
V
F
S .
V
F
s x
0
= (51)
Em regime estacionrio:
0
dt
dS
=

44

0 X . .
Y
1
S .
V
F
S .
V
F
S
X
0
= == =
(52)
S
X
0
Y
X .
) S S ( D

= == =
(53)
Como =D
) S S ( Y X
0 s x
=
(54)

Consideraes feitas para obteno desta equao:

s x
Y independe de e D (o que nem sempre verdadeiro);
X independe de todos os nutrientes, exceto o limitante;

s x
Y afetado somente pelo tipo de substrato.
As duas ltimas so relativamente corretas em certas condies (Temperatura,
pH, O
2
, constantes e excesso de todos os outros nutrientes).
Temos deduzidas as equaes: = D
) S S ( Y X
0 s x
=
(55)
J conhecemos a equao de Monod:
S K
S
S
mx
+
=
(56)
Ento podemos escrever para um quimiostato em regime permanente:
S K
S
D D
S
c
+
= (57)
Onde D
C
a taxa de diluio crtica que representa a mxima diluio em que
um quimiostato pode operar. Com algumas excees, D
C
geralmente igual a
mx
. A
equao acima fica:
D
D.K
S
max
S

= (58)
Substituindo as equaes temos:
)
D
D.K
(S Y X
max
S
0 s x

= (59)
Usando as equaes acima, o comportamento terico de um quimiostato pode
ser representado na figura 20, onde nas ordenadas tem-se os valores das variveis X,
S e Pr em regime permanente e nas abscissas os valores da taxa de diluio D:





45















Figura 20.Variaes da taxa de diluio em funo de X, S e P

O washout o ponto onde a concentrao de clulas atingir zero, em regime
permanente, devido taxa de alimentao ser superior a taxa de reproduo do
microrganismo. Essa taxa de diluio normalmente conhecida como diluio crtica
(D
c
). Pode ser determinada aproximadamente pela relao:
0 s
0 max
c
S K
S
D
+

=
(60)

2.3.2.3.1.3 Produtividade
Um processo de fermentao sempre avaliado pelo fator de converso ou
rendimento e pela produtividade mdia. A produtividade Pr definida como:
X . D Pr = (61)
onde
a volumtric ade produtivid
t L
M
p
V
r
=
(

=
.
3

A produtividade volumtrica faz referncia eficincia do processo ou equipamento
mssica ade produtivid
t
M
p
m
r
=
(

=

A produtividade mssica est relacionada capacidade de produo da indstria.
(
(

|
|

\
|

=
D
D
K S Y . D Pr
mx
S 0 s x
(62)
A variao de Pr em funo de D est representada na figura anterior. A taxa
de diluio necessria para obteno da produtividade mxima ser a derivada
primeira da equao acima igualada a zero. Derivando obtm-se D
M
X
X
washout
S
S
Pr
D
S
Pr
D
M
D
c

46

(
(
(

|
|

\
|
+
=
2
1
0 S
S
mx M
S K
K
1 D
(63)

Ento a produtividade mxima Pr
M
ser:
M
2
1
0 S
S
mx M M M
X .
S K
K
1 X . D Pr
(
(
(

|
|

\
|
+
= = (64)
interessante notar que a produtividade mxima no ocorre necessariamente
em uma taxa de diluio que corresponde converso mxima do substrato. Portanto
neste processo, a otimizao deve ser feita levando-se em conta a produtividade, o
rendimento e o substrato residual no efluente.

2.3.2.3.1.4 Auto regulao de um quimiostato
Considerando as equaes:
D
dt
dX
.
X
1
=
(65)
S K
S
S
mx
+
=
(64)
( ) X . .
Y
1
S S . D
dt
dS
s x
0
=
(65)

Analisemos os 4 casos abaixo:

Perturbao Resposta

D , , S 0,
dt
dS
, D
D , , S 0,
dt
dS
, D
X 0,
dt
dX
, , S 0,
dt
dS
X 0,
dt
dX
, , S 0,
dt
dS
>
<
< <
> >


Neste ltimo caso, se D >
max
, ocorrer uma lavagem no reator, ou washout,
com a eliminao total dos microrganismos.





X

X

F

F
47

Bibliografia
Almeida, P.F. Metabolismo microbiano. Curso de Graduao. Instituto de Cincias da
Sade Universidade Federal da Bahia BA. 2008.

Maugeri Filho, F. Apostila de Engenharia Bioqumica. Curso de Graduao. Faculdade
de Engenharia de Alimentos Unicamp. Campinas SP. 2006.