DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA Y CATALTICA DE LA ENZIMA -AMILASA Y EVALUACIN DE LAS VARIABLES QUE LA AFECTAN. INHIBICIN DE LA ENZIMA POLIFENILOXIDASA. J.

Carrillo-Morenoa, J.P. Jimnez-Moncadaa, L. Arias-Loperaa, M.E. Higuita-Ramreza a Estudiantes Ingeniera Qumica, Universidad de Antioquia, Medelln, Colombia Resumen En el presente artculo se muestran los resultados experimentales obtenidos luego de la realizacin de diferentes prcticas de laboratorio con el fin de analizar la actividad enzimtica y cataltica de una enzima comercial (-amilasa), interpretando a partir de grficas y datos experimentales. Se estudia el comportamiento de esta enzima con respecto a los cambios en el medio variando diferentes parmetros como pH, temperatura y concentracin de la enzima, obteniendo un pH ptimo en un rango de 6.0 a 6.5, y una temperatura ptima de aproximadamente 60C. Se estudia tambin el comportamiento de un extracto enzimtico de origen vegetal que contiene polifeniloxidasa con el fin de evaluar el efecto que tiene un inhibidor sobre la actividad enzimtica. Palabras clave: -amilasa, actividad enzimtica, polifeniloxidasa, inhibicin enzimtica, pH, temperatura. Abstract In this paper, we present the experimental results obtained after performing different labs to analyze the catalytic and enzymatic activity of a commercial enzyme (-amylase), playing from plots and experimental data. It is studied the behavior of this enzyme with respect to changes in the medium by varying of different parameters such as pH, temperature and enzyme concentration, obtaining an optimum pH in a range of 6.0 to 6.5, and an optimum temperature of about 60 C. Also is studied the behavior of an enzyme extract of plant origin containing polifeniloxidase in order to evaluate the effect of an inhibitor on enzymatic activity. Keywords: -amylase, enzymatic activity, polifeniloxidase, enzymatic inhibition, pH, temperature. 1. INTRODUCCIN Actividad Enzimtica: Una enzima es una protena que cataliza las reacciones qumicas en los seres vivos. Existen varios factores que alteran o modifican la actividad enzimtica como temperatura, pH y concentracin. Las enzimas poseen

un pH caracterstico donde su actividad es mxima: por encima o debajo de ese pH la actividad disminuye. La relacin pH - actividad enzimtica, constituye un factor de regulacin intracelular de la actividad enzimtica. La velocidad de las reacciones enzimticas aumenta por lo general con la temperatura, dentro del intervalo en que la enzima es estable y activa. La velocidad por lo general se duplica por cada 10 C de aumento de temperatura. Sin embargo las enzimas se desnaturalizan cuando la elevacin de la temperatura sobrepasa cierta temperatura lmite. La cual a su vez es la temperatura ptima de trabajo. A bajas temperaturas, las reacciones disminuyen mucho o se detienen, pero la accin cataltica reaparece cuando la temperatura se eleva a valores normales [1]. Las enzimas amilasas son empleadas en la fabricacin de pan para romper azcares complejos como el almidn (presente en la harina) en azcares simples. La levadura puede entonces alimentarse de esos azcares simples y convertirlos en productos de fermentacin alcohlica. Este proceso da sabor al pan y hace elevar la masa. Las clulas de la levadura contienen amilasas pero necesitan tiempo para fabricar la suficiente cantidad para romper el almidn. Este es el motivo de la necesidad de largos tiempos de fermentacin (especialmente para determinadas masas). Las tcnicas modernas de elaboracin de masas incluyen la presencia de amilasas para facilitar y acelerar estos procesos, A nivel industrial, el sustrato principalmente utilizado en la produccin de cerveza es el almidn, el cual es degradado por las amilasas [2].

Inhibicin Enzimtica: Los inhibidores enzimticos son molculas que se unen a enzimas y disminuyen su actividad. Puesto que el bloqueo de una enzima puede matar a un organismo patgeno o corregir un desequilibrio metablico, muchos medicamentos actan como inhibidores enzimticos. Tambin son usados como herbicidas y pesticidas. Sin embargo, no todas las molculas que se unen a las enzimas son inhibidores. La unin de un inhibidor puede impedir la entrada del sustrato al sitio activo de la enzima y/u obstaculizar que la enzima catalice su reaccin correspondiente. La unin del inhibidor puede ser reversible o irreversible. Normalmente, los inhibidores irreversibles reaccionan con la enzima de forma covalente y modifican su estructura qumica a nivel de residuos esenciales de los aminocidos necesarios para la actividad enzimtica. En cambio, los inhibidores reversibles se unen a la enzima de forma no covalente, dando lugar a diferentes tipos de inhibiciones, dependiendo de si el inhibidor se une a la enzima, al complejo enzima-sustrato o a ambos [3]. Hay inhibicin cuando disminuye la actividad y la eficacia de una enzima. Las sustancias distintas del sustrato que tienen este efecto se denominan inhibidores [4]. Segn el modo de actuacin de los inhibidores, se pueden diferenciar Varios tipos de inhibicin: competitiva, no competitiva, acompetitiva o mixta [3], [4]. Las polifenoloxidasas (PFO) que se encuentran en las plantas son las responsables de las reacciones de pardeamiento enzimtico que ocurren durante el almacenamiento, manipulacin y procesamiento de frutas y vegetales. Las polifenoloxidasas catalizan la

hidroxilacin de monofenoles a ortodifenoles, posteriormente oxidados a ortoquinonas, las cuales se polimerizan dando lugar a pigmentos que presentan color marrn, rojo o negro, dependiendo de los componentes naturales presentes en los tejidos vegetales. Estas reacciones modifican las caractersticas organolpticas y nutricionales del alimento, depreciando su calidad. En el presente informe nos proponemos caracterizar el comportamiento de la enzima amilasa frente a cambios de temperatura, concentracin y pH es decir cmo cambia su actividad 2. Materiales y mtodos 2.1. Actividad cataltica de la amilasa y variables que la afectan 2.1.1. Evaluacin del cambio de pH sobre la actividad de la enzima amilasa: Se utilizaron soluciones buffer 0.1 Molar; citrato con pH: 3; fosfato con pH: 5 y 7; borato con pH: 9. Adems de estos reactivos tambin fueron necesarios NaCl, 0.4 ml de solucin amilasa salival 1 en 150, lugol y almidn. 2.1.2. Evaluacin del cambio de concentracin de la enzima sobre la reaccin de hidrlisis de la amilasa: Se emplearon soluciones acuosas de amilasas en proporciones 1 en 75; 1 en 100; 1 en 200 y 1 en 150; adems de NaCl 0.9 %, almidn 1% y finalmente lugol. 2.1.3. Evaluacin del cambio de temperatura sobre la actividad de la enzima amilasa:

enzimtica al modificarle estas condiciones utilizando como sustrato el almidn. Entre los propsitos de este artculo se encuentran experimentar, evaluar, comprender y analizar los mltiples aspectos de la labor enzimtica modificando ciertas condiciones y cmo estas influyen sobre su actividad cataltica, recopilando los resultados de cada procedimiento y analizando el porqu de ellos. Tambin determinamos experimentalmente la actividad de las enzimas polifenoloxidasas las cuales se extraen de los vegetales y en las que se aplica un inhibidor que modifica la actividad enzimtica. Se recurri a una solucin acuosa de -amilasa 1 en 150, NaCl 0.9 %, almidn 1% y lugol. En los procedimientos mencionados anteriormente fueron indispensables materiales como micropipetas para medir los volmenes que se emplearon en cada uno de los mtodos, tubos de ensayo, agitador magntico, recipientes con bao de hielo y bao termosttico; el espectrofotmetro, el cual se utiliz para medir absorbancia en cada uno de los procesos que se realizaron para evaluar cmo cambiaba la actividad de la enzima al modificar condiciones de pH, concentracin y temperatura. El almidn fue la poblacin utilizada en todos los procedimientos ya que sirvi como sustrato para evaluar la actividad de la enzima -amilasa, que se puede encontrar en frutas, granos de cereales y semillas de leguminosas. 2.2. Determinacin de la actividad enzimtica

Para medir la actividad enzimtica se utiliz solucin buffer de fosfato con pH 6.2, agua, alfametildopa, extracto enzimtico e inhibidor. Para este procedimiento se us primordialmente el espectrofotmetro en el cual se midi la absorbancia de cada solucin inmediatamente despus de agregar el extracto enzimtico. Para determinar la actividad enzimtica se aplica la relacin: velocidad de la reaccin/cantidad de enzima. El objeto de estudio fue el banano del cual se extrajo la enzima. El procedimiento consisti en pesar, adicionar solucin buffer de 6.2, triturar con la ayuda de un mortero, filtrar, centrifugar y decantar; se conserv el sobrenadante que cumpli el papel de extracto enzimtico. Todos los implementos (reactivos e instrumentos) utilizados y anteriormente mencionados fueron facilitados por los laboratorios de la Universidad de Antioquia, lugar en el cual se realiz el procedimiento. 3. RESULTADOS Y DISCUSIN

Grfica 1.1. Evaluacin del cambio de pH sobre la actividad de la enzima amilasa. La influencia del pH sobre la actividad enzimtica se ilustra en la grfica 1.1. El perfil de actividad muestra que la amilasa presenta actividad mxima en el rango de pH de 6.0 a 6.5. El efecto del pH sobre la catlisis enzimtica refleja el estado de ionizacin de algunos aminocidos importantes para que se lleve a cabo la reaccin cataltica, a partir de los datos obtenidos podemos afirmar que el rango de pH est acorde con los datos encontrados en la literatura [5]. A pH muy cidos o muy bsicos la enzima no funciona, o al menos disminuye notablemente su actividad. Tabla 1.1. Datos de absorbancia relacionada con el pH obtenidos en el laboratorio Intensidad pH Absorbanci color a Transparen 5 0,009 te Transparen 6,2 0,03 te Transparen 7 0,025 te transparent 9 0,013 e Azul Blanco Esto podemos concluir a partir de los experimentos encontrados en la

literatura, que manteniendo el resto de las condiciones iniciales, midieron la actividad de la amilasa. Tabla 1.2. Datos de absorbancia relacionada con la temperatura obtenidos en el laboratorio Intensidad Temperatu Absorbanci color ra (C) a Azul medio 4 0,01 Transparen 23 0,022 te Transparen 50 0,01 te Azul 96 0,009 Azul 23 1,286

fraccin de almidn que con el yodo forma un complejo de coloracin azul [6]. Tabla 1.3. Datos de absorbancia relacionada con la concentracin de sustrato obtenidos en el laboratorio Intensidad Concentrac Absorbanci color in de a almidn Transparen 0,013 0,013 te Transparen 0,01 0,016 te Transparen 0,005 0,022 te Azul Blanco 0,886

Grfica 1.2. Evaluacin del cambio de la temperatura sobre la actividad de la enzima amilasa. Podemos ver a partir de la grfica 1.2 que existe una mayor actividad enzimtica a una temperatura cercana a 50 C, punto en el cual la temperatura es ptima, al sobrepasar esta temperatura ocurre la desnaturalizacin de la enzima amilasa. En este momento la enzima ya no est haciendo efecto sobre el sitio activo del sustrato, lo que permite que el lugol entre a l, y se observa un cambio de color (de transparente a azul) que da cuenta de la presencia de amilosa: esta es la Grfica 1.3. Evaluacin del cambio de la concentracin sobre la actividad de la enzima amilasa. En esta grfica se puede observar que existe una relacin directamente proporcional entre el inverso de la absorbancia y la concentracin de sustrato (almidn), por lo que tambin se puede concluir que a mayor concentracin de la enzima amilasa es mayor la concentracin de producto debido a que estas dos

concentraciones son directamente proporcionales. Para hacer el anlisis, lo correcto era calcular la concentracin de sustrato y graficarla con respecto a la absorbancia. No se hizo de este modo debido a que los valores de absorbancia obtenidos en el laboratorio no se adaptan a la curva de calibracin de almidn que fue suministrada. Tabla 2.1. Actividad enzimtica sin inhibicin Tiempo (min) Absorbancia 0,2683 0,018 0,783 0,022 1 0,021 1,5 0,023 2 0,024 2,5 0,025 3 0,025 3,5 0,026 4 0,027 4,5 0,027 5 0,028 Grfica 2. Efecto de la inhibicin en la actividad enzimtica respecto al tiempo. La tendencia superior corresponde al comportamiento de la enzima sin inhibidor y la grfica inferior corresponde al comportamiento de la enzima con inhibidor. La pendiente de las dos grficas da cuenta de la actividad enzimtica, se puede concluir que el valor de la ecuacin de la recta para cada una que el valor de la pendiente es el mismo (m=0.0018), a partir de los resultados encontrados en la literatura podemos decir que en un rango de concentraciones de polifeniloxidasa el comportamiento en la actividad enzimtica es muy similar.

4. CAUSAS DE ERROR Las principales desviaciones presentes en los resultados se deben a errores humanos ya que muchas Tabla 2.2. Actividad enzimtica sin inhibicin Tiempo (min) Absorbancia 0,783 0,004 1,256 0,005 2,09 0,006 2,59 0,006 3,09 0,007 3,59 0,008 4,09 0,009 4,59 0,011 5,09 0,012 5,59 0,012

personas manipularon las muestras con diferentes tcnicas y precauciones. Puede pensarse tambin que debido al tiempo estipulado para la prctica no se obtuvieron los mejores resultados con respecto a la actividad enzimtica. Una de las posibles causas de error al momento de estudiar la actividad del extracto enzimtico vegetal es la temperatura a la que se encontraba y tambin su estado de maduracin, es decir, que tan (maduro o verde) estaba. Debido a que se estaba trabajando con instrumentos (equipos electrnicos) la descalibracin o mal manejo de estos puede desviar en gran medida los resultados y al momento de tomar uno de los volmenes al realizar la preparacin de soluciones con diferente concentracin una de las micropipetas estaba descalibrada. 5. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS. [3]. http://es.wikipedia.org/wiki/Enzima#In hibici.C3.B3n [5]. http://www.revista.unal.edu.co/index. php/dyna/article/view/15673/18741 [6]. La pgina 23 de la gua del laboratorio. Busquen en lo que mand el profe cmo se referencia.