La funcin fundamental de las enzimas es aumentar la velocidad de las reacciones quimicasque ocurren en los seres vivos.

El comportamiento de esa velocidad y su moduicacin debido a la presencia de diferentes agentes fsicos o qumicos constituye el objeto de estudio de la cintica enzimtica. Lacaracterstica ms sobresaliente de estas reacciones es la participacin de las enzimas,lo cual significa que su velocidad est influida no slo por la concentracin desustrato y producto, sino adems y principalmente por la presencia de una molcula proteniea que no ser alterada por la reaccin en que participa. En la medida que la reaccin progresa la concentracin del sustrato va disminuyendo y la del producto aumenta, pero la concentracin total de la enzima permanece invariable. El objetivo final de la cintica enzimtica es aprovechar los estudios de velocidad paraesclarecer los diferentes mecanismos por los cuales las enzimas realizan su funcin y correlacionar stos con la estructura tridimensional de la proteina enzimtica. En este captulo se har un estudio de las caractersticas principales de la velocidaddelas reacciones en que intervienenlas enzimas, as como de los diferentes factoWque pueden modificarla.

Condiciones para los estudios cinticos

Para el estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas por una enzima y la interpretacin adecuada de sus resultados se requieren algunas condiciones. Teniendo en cuenta que son varios los factores que pueden modificar la velocidad de la reaccin slo puede estudiarse un factor a la vez, con cuidado de que todos los dems permanezcan constantes; sin embargo no pueden mantenerse contantes, la Concentracin del sustrato ni la del producto, pues su variacin es el ndice que asegun q u e l a reaccin est ocurriendo; parasalvar esa dificultad se introdujo el concepto de velocidad inicial (va) que es la velocidad de la reaccin cuando an no se ha Wnsumido el 10 % del sustrato inicial. Esto obliga a realizar primero algunos ensayos en diferentes tiempos de incnbacin, de forma tal que pueda Q a r r el intervalo necesario Para estar seguro de que en el estudio se miden velocidades iniciales.

Adems, la medida de la velocidad inicial evita que las determinaciones estn intluidas por otros factores como: 1. Si la reaccin es reversible, la velocidad de la reaccin inversa aumentar el1 la misma medida que la concentracin del producto y descender la velocidad de transformacin del sustrato. 2. Si uose proporciona sustrato en exceso su concentracin descender con el tienipo, lo que provocara una disminucin progresiva de la velocidad. 3. El producto de la reaccin puede inhihir la actividad de la enzima. La velocidad de una reaccin catalizada por una enzima, puede medirse por 2 tipos de procedimientos, utilizando una tcnica discontinua (de muestreo) en la que se toman muestras de la mezcla de reaccin en diferentes tiempos, se detiene la reaccin y se analiza el contenido de sustrato o producto en las muestras. Tainhiii puede aplicarse una tcnica de observacin continua en la que se hace uso de una propiedad fsica distintivadel sustrato o prodncto u otro participante de la reaccioii quese puede medir cuantitativamente sin interferir el desarrollo de la reaccin, corno puede ser el cambio que se produceen el espectro deabsorcin debido ala formacin del producto. Este tipode procedimiento es elms aconsejable, pero no siempre es factible. La velocidad inicial dehe medirse por la variacin de la concentracin del producto por unidad de tiempo, siempre que ello sea posible, pero en ocasiones no se dispone de los procedimientos necesariamente exactos y se hace midiendo la variacin de la concentracin del sustrato. En la prctica los estudios cinticos se realizan de la forma siguiente: en primer lugar se procedea determinar el tiempo deincnbacin como ya fue explicado, despus se prepara un conjunto de tubos de ensayo dondese encuentran todos los conipoiientes de la mezcla de reaccin (buffer,sustrato, activadores, etctera) menos la enzima; esta mezcla se coloca en bao de temperatura regulable, fijando sta en un valor determinado, donde tambin se incuba por unos minutos la solucin que contiene la enzima. Por ltimo, se aade a cada tubo la solucin de enzima; auxiliados de un cronmetro se mide el tiempo de reaccin a partir del momento en que se aadi la enzima, al transcurrir el tiempo indicadose procedea detener la reaccin para aadir algn agente desnaturalizante de protenas, uno de los ms empleados es el cido tricloroactico (TCA), se procede entonces a determinar la concentracin del producto (o del sustrato), se calcula la diferencia con la concentracin inicial (que en el caso del producto es cero) y este resultado se divide entre el tiempo de incubacin, con lo cual se obtiene el valor de la velocidad; despus se construye una grfica cartesiana donde se representa la velocidad inicial en el eje de las ordenadas y el factor que se ha variado en el eje de las abscisas, la curva que se obtiene es la variacin de la velocidad en funcin de la variacin del factor estudiado. Los factores que pueden modificar la velocidad de la reaccin son la concentracin de la enzima, del sustrato, de los cofactores y de iones H+ (expresadas conio unidades de pH), ascomo la temperatura, la presencia de inhibidores y activadores. Se estudiar a continuacin cada uno de ellos.

Efeeto de la concentracin de enzima

Si se procede de la forma indicada pero haciendo que cada uno de los tubos de ensayo contenga una concentracin diferente (creciente) de enzima, al procesar los datos obtendremos una grfica (Fig.16.1). La obtencin de una lnea recta que pasa por el origen de las coordenadas indica que existe una relacin de proporcionalidad directa entre la velocidad de la reaccin S laconcentracin de la enzima, que puede expresarse por la ecuacin

Fig. 16.1. Efecto de la concentracin d e enzima. La recta que se obtiene indica una relacin de pruporiionalidod directa entre la velocidad de la reacri6ii y la concentracin de la enrima, lo cual es el fundamento d e toda la ein6tiia mriniitira.

lo quesignica que la reaccin es de primer orden con respecto a la concentracin de e&a; esta relacin constituye el fundamento de toda la cintica enzimtica. ~~t~resultado era de esperar, si la concentracin de sustrato est en exceso, a quese aumentala concentracin de la enzimase incrementa la formacin del mmplejoES y una vez formado ste se producir la transformacin del sustrato. La actividad~ataltica las enzimas se expresa en unidades de enzima, g sta es de *&ente igual ala cantidad de enzima que catalizala transformacin de 1micmmol desustrato por minuto, bajo condiciones especficas. Cuando no se posee la enzima sino una preparacin impura, puede medirse en unidades por mL o su actividad P"B7 epeef~caen la preparacin como unidades por mg de protena total. La relacin de proporcionalidad directa entre la velocidad y la concentracin de enzimapermite la determinacin de la concentracin de alguna de ellas en los lquidos otejidos corporales. Basado en este principio se determinan en el laboratorio clnico lasconcentraciones sricas de transaminasas, quinasas, peptidasas, etctera.

Efecto de la concentracin de sustrato

Enestecaso lanica diferencia entre los tubos de ensayo radica en que el sustrato esten cada uno de ellos en concentracin diferente (Fig.16.2). La primera explicacin convincente para este comportamiento fue expriesta por LeonorMchaellis y Maud Menten en 1913, que segn ellos la reaccin se produce en Zetapas: la unin de la enzima (E) con el sustrato (S) para formar un complejo enzima-sustrato (ES)de manera rpida, y la transformacin del sustrato en producto (P)con laliberacin de la eniima, que resulta la etapams lenta

k,

k,,,

S +
k 2

ES & P + E

donde k,, k, y k c ,son las constantes de velocidad especfica para cada etapa de la reaccin. k_,se conoce tambin como nmero de recambio de la enzima. Comola segunda etapa es el paso limitante, la velocidad dela reaccin depende dela descomposicin del complejo ES segn la ecuacin:

sise puedemedir [ES] en diferentes momentos es factible calcular la velocidad, pero esto no siempre es posible, lo cual obliga a deducir una ecuacin que permita calcular la velocidad en funcin de variables que se puedan medir. Comola formacin de ES es reversible y se descompone lentamente en producto, se establecer un equilibrio entre E, S y ES cuando su velocidad de formacin (vJ sea igual a su velocidad de descomposicin (v,) y stas vienen dadas por las conocidas ~uaciones velocidad: de

Fig. 16.2. Efecto dc la conceiitraci~ide sustrato. En In mctliila que la concentracin dc sustrato es mayor, la velocidad d e la reaccin cs niayor, sin embargo, los incrementos en la velocidad no son uniformes, sino cada vez menores; cuando se alcanza un deterniinado valor de la coneentracin de sustrato, la velocidad se Iiaee prcticarnentc constante, en ese momento la reaccin Iia alcanzado la Vni. La coneentraeln de sustrato para la cual la velocidad de la reaccin cs igual a VmIZ es la constante dc Michaellis (Km), qiie es un ndice de In nfinidad de la enzima por el sustrato.

cuando vr=vd tendremos que:

el cociente de las 2 constantes, que es la constante de disociacion del complejo ES recibe el nombre de constante de Michaellis (Km). La enzima libre (E) ser igual a la enzima total (EL) menos la quese encuentra en forma de ES. Si se introducen estas consideracionesen la ecuacion (S),se tiene que:

si se despeja [ES]

[ES] = [Et][S]/(Km +[S]),

sustituyendo [ES] por su equivalente en (1)se obtiene:

(6)

v, =

k,,, [E,] [SI

Km + [S]

En esta ecuacion cabe considerar 3 casos: 1. Cuando [S] >>> Km: en este caso el denominador Km + [SI es casi igual a [S] y simplificandoobtenemos:

Las concentraciones muy elevadas de sustrato producen un efecto de saturacin,o sea, todos los centros activos de las enzimas han sido ocupados por el sustrato y casi toda la enzima se encuentra en forma de ES. Teniendo presente la ecuacin (1) es posible inferir que en ese momento se habr alcanzado la mayor velocidad posible para la reaccin que se denomina velocidad mxima (Vm). En estos momentos la velocidad se hace independiente de la [S],o sea, es de orden cero. As se obtiene la forma habitual de la ecuacin de Michaellis:

v, = Kmm+[SI v [S]
2. Cuando [SI <<Km: en este caso el valor del denominador ser prcticamenteigual a Km y la ecuacin se transforma en

v,= Vm -. Km

[SI

el cociente de las 2 constantes VmIKm es una constante y por lo tanto, la velocidad de la reaccin es directamente proporcional a la concentracin de sustrato o, dicho de otra forma, es de primer orden con respecto a la concentracin de sustrato. 3. Cuando [S]=Km: en este caso el denominador pasa aser 2 [S] que al simplicar nos queda:

esto significa que el valor de Km es igual a la concentracin de sustrato, la velocidad inicial es igual a la mitad de la velocidad mxima; en momento la mitad de las molculas de la enzima est en estado libre y la otra en forma de ES. silacurva tienesiempre la misma forma la diferencia entre ellas estardada por losvalores de Vm y Km, de ah que stos se conozcan como los parmetros cinticos de heeuaein de Mihaellis. Analicemos brevemente el significado de rada uno de ellos. Vm se alcanza cuando las molculas de sustrato han ocupado todos los sitios B,.&vos de todas las molculas de la enzima, por lo que la velocidad de reaccin en ese momentoslodependede la capacidad que tenga la enzima para transfomar el sustrato. A parr del valor de Vm se puede calcular el nmero de recanibio de la enzima; si una solucin 10dM de anhidrasa carbnica que cataliza la formacin de 0,6 M de H.CO, por segundo cuando esk completamente saturada de sustrato segn la ecuacin

podemos calcular ke,,pues

Vm = kcal [Et]

esto significa que la enzima produce600 0OOinolculas de H,CO, por seguiido y ste es precisamente el significado del nmero de recambio. La Km, como la hemos definido (otras definiciones pueden originar otros significados),esigual a laconstante de disociacin del complejo ES y por ello representa una medida de la afinidad de la enzima por el sustrato, de forma que mientras mayor sea la afuiidad menor serel valor de la Km. En la tabla 16.1 se relacionan los valores de Km y de k_, de algunas enzimas.

Tabla 16.1. Valores de la Km y la kcz,, algunas enzimas de

Enzima
Anhidrasa carbnica
Acealcoiima estearasa

cu?,
Acetilcolina
%O2

1.2 x 10-z 9,s x 10.' 2,s x 10.' 5,0 x 10~"

1.0 x 10h 1.4 x 10' 1 , x~10'

8,O x 10'

Catalasa
lhalas

Fumarato
Malato

hmma

2,s x 10'

9.0 x 10' 1,0 x 10'

Ureara

Um

2,s x 10.'

Para determinar de manera experiniental los valores de Vm y Km resulta niuy engorroso el empleo de la curva hiperblica, pues sera muy difcil dibujarla ajustada si los puntos experimentales estn muy dispersos, adems resulta difcil coiisegi~i~ concentracionessuficieiitementeelevadas de sustrato para alcanzar Vm, o casi iiiiprac. ticahle medir las bajas velocidades iniciales con pequeas concentraciones de sustrato, sa Todas et5dificultades se evitan con el mtodo de deterniinacin de Lineweaver y Burk, este procedimientoresulta de una tramfomacin de la ecuacin de Micliaellis y consiste en tomar los inversos de sta, representar el inverso de la velocidad inicial Wv,,)en el rje de las ordenadas y el inverso de la concentracin de sustrato (l/[S1) en el eje de las ahscisas; la transformacin de una ecnacin a la otra es muy sencilla. Al tomar los inversos en la ecuacin de Michaellis se obtiene

descoinponiendo el sumando y simplificando se obtiene

Ol~srvese Iio~nologacon ecuacin general de niialinea recta del tipo y=ai+b. la la cuya pendientees KmNni y con el intercepto igual a 1Nin para las ordenadas y -l/Kin para las ahscisas (Fig. 16.3). Esta lnea recta, la grfica doblemente recproca, se debe preferir a la gr6fica hiperblica comomtodode detcriiiinaciii de Vm y Km,ya que una lnea recta piiedc dibujarse y extrapolarse de forma ms rigurosa que cualquier curva. Este conociniiento es niny importante a la hora de analizar los inliibidores enzimticos.

Reacciones con 2 sustratos

Fig. 16.3. Ke1irescnlaciii de I.iriewca\er Uiirk. lin la ~ r f i c a , dohleniriite rrcprora al ploteai. llr,, centra 11 [S], se ubticiie uria iinca verla cnn i~itcrreptos IWni vara las ordcdc n u d a y - l l K r n pai-n la al~cisas,) periiiite la detcrrninaiiii de IUS parmcti-os riiifiros de blichaillis ron nijs ~ r a c t i l a dque la grfica IiiperI>lira.
( 0un

En mucha7 reacciones enziniticas de iniportancia biolgica se utilizan 2 sustitoS sustrato y una coenzima)para forniar 2 productos, por lociral la ecuacibn general
A+R

sena

P+Q

El mecanismo de estas reacciones es ms comple,jo que aqullas en que iiiter\iene un solo sustrato y sus eiuaciones cinticas ms difciles de deteniiinar. El Iieclio ms sobresaliente es el orden en que los sustratos se coinhinaii con la eiiziina y el orden en que se liberan los productos. Atendiendo a este aspecto se Iiali distinguido 3 inecanisnios ixsicos de reaccioiies bisustrato. Mecanismoordenado. Los sustratos se enlazan y los productos se lihcraii en ilil orden obligado como se muestra a continuacin:

donde EAB (coniple,jo enziina-siistratos) y EPQ (complejo enzima-prodiictos) se intercoiivierten rpidamente (Fig. 16.4). El ejemplo ms abundante son las desliidrogenasas que funcionan con NAW como coenziiiia aceptora de Iiidrgenos, en las cuales la enzima se une primero a la

EA

EAR

EPQ

EQ

w. Mecanismo ordcnado con 3 sustratos. La eiilinin (El debe iinirsc primer<,cun rl sustrato \ 16.4.
y formar el compleio EA, pies el sitio de iiiii<inde B ne es acccsihle a sic sirstrata. La iiriin de B da lugar a la formacin del cotiipleji, Irriiario B\ll que se transforma lentanienle en cl complejo enzima-productos (EPV). qur deqiiifr lihmi tambifn suc pridurtos dc fornia
ordenada.

coenzima y con posterioridad a1 sustrato, liberan primero el producto oxidado y despnsla coenzima reducida.

E + N A D ' d E:NAD'

+ LACA

E:NADA:LAC

E:NADH:PIR d P I R + E N A D H +E

+ NADH

Esta reaccin est catalizada por la enzima lactato-deshidrogenasa que oxida el lactato (LAC) en piruvato (PIK) con la reduccinsimultnea del NAD'a NADH. Este mecanismo desde el punto de vista estmctural se fundamenta en que el centro activo noest totalmente forniado en ausencia de los sustratos y la unin del prinicro de 40s produce un canibio conforniacional en la enzima que casi crea el sitio de reconocimiento para el segundo, de esta manera el orden de unin de los sustratos es obligado. Mefanismode orden azaroso. Los sustratos pueden unirse a la enzima en cnalqGe~orden,lo hace suponer que existe un sitio de unin diferente para cada uno que de ellos (Fig. 16.5).

Un ejemplo tpico de estas enzinias son las quinasas, que en el caso de la hexoquinasa sera:

En esta reaccin la enzima transfiere un grupo fosfato del ATPa la glucosa (GLC) Paraformarglucosa-6-fosfato(GLP)y ADP. Como se muestra, la enzima puede unir Primero a la glucosa o al A'I'Py liberar la glucosa-6-fosfatoantes o despus que el ADP.

Fig. 16.5. Meeanisnio de orden aleatorio ron 2 surtratos. La enzima (E) presenta sus 2 centros ;rtivor xcesibles s sus respectivos sustratos A y B , por eso cualquiera de ellos puede unirse ~irirnero para formar los compkjos EA EB: a estos complejos se une el otro sustrato ) se forma rl iomplc,jo tcrniirio EAB, que se transforma en el complejo enzima-productos EPQ que puede liberar sus productos cn cualquier ordcn.

Mefanismopingpong. Se caracteriza porque un producto se forma y libera antes de la incorporacin del segundo sustrato; esto puede explicarse por la existencia de una enzima en 2 formas (E y E*), una capaz de unir al primer sustrato y la otra al segundo. El paso de la ennma de una forma a otra de manera constante fue lo que quiso denotar Cleland cuando denomin pingponga este mecanismo.

Este mecanismo se ilustra en la figura 16.6.

EA

E'B

Fig. 1 6 6 . Mecanismo ping pong. La enzima ( l i ) s6lo piwdc iinirse al sustrato A foriiiaiirl~~ e' complejo EA que lihera el producto P y dqja niodifieada la enzima (E*), s61a etitiillccs puede unirse al sc~iindo sustrato B y formar el cenipleja E*U que libera el producto Q quedando la enzima en su forma inicial para comenzar un nuevo cielo iataltico.

290

ihqufmica Uedjca

gniPOS -o),

~1

ms caracterstico es el de las transaminasas (enzimas que transfieren en el caso de la transaminasa glutmico-pirkico tendremos

E + ALA

E: A A L, E*: PIR p + K G A * E : K G -E*:GLU-E+GLU

--.

E* + PIR

Enesta reaccin la enzima se une primero a la alanina (ALA) formando el complejo-aminasa-alanina (E:ALA), que al convertir la alanina en pirvico (PIR) deja modificada tambin a la enzima (E*), esta forma E* puede unirse al cido a&glurico (KG) que al hmsformarse en glutmico (GLU) regenera la forma oride la hansaminasa. La deduccin de las ecnaciones de velocidad para cada uno de estos tipos de reacciones va ms all del alcance de este texto.

Laconcentracin de cofactores suele tener un efecto similar a la concentracin de

svstrato.
Lacoincidencia de las 2 grficas es un hecho experimental importante para afirmarque los cofactores se unen a la enzima por un sitio especfico y en una relacin estequiomtricaque explica el fenmeno de saturacin observado; este sitio pudiera ser el eentro activo.

Efeeto del pH
Si realizamos una experiencia como la descrita pero haciendo que la mezcla de incubacin contenga soluciones hufferde diferentes valores de pH, se obtendr una g~%cacomola quese muestra en la figura 16.7. Como se observa, la curva tiene una forma acampanada con una zona central estrecha que se corresponde con los mayores valores de la velocidad; al valor de pH dondese obtiene la mayor velocidad se le denomina pH ptimo. Esta grfica se explica teniendo en cuenta que el pH modifica el estado de disociacin de los grupos qumicos presentes en la enzima o en el complejo enzima-sustrato, con lo que puede modificarse unasvecesla unin y otras la transformacin.En valores extremos de pH (cerca de 0 14) puede producirse desnaturalizacin de la protena enzinitica, lo que contribuye a la Pocaactividad observada en esta zona. El pH ptimo es un valor caracteristico para cada enzima y expresa que en ese valor la enzima se encuentra en su conformacin ms activa. Supongamos que los D'Upos que forman el centro activo puedan existir en 3 estados de disociacin dependientes del pH,

Fig.

16.7. Efecto

del pH. Se obtiene una figura en forma arnnipaniida B m de se puede determinar la zona dc pH iiptinio. Obsrwse que In dianiiniirim o aumento del pll en relaeiiin con el pH 6ptimo provoca iiiia disiiiinuci6n de la vcloiidad de la rencri6n.

siel estado ms activo es EH-ohtendremosla curva descrita que es la dela mayora de las enzimas; si fiiera EH, la curva carecera de la rama ascendente, como siicede con la Pepsina; si fuera E=carecera de la descendente, como sucede con la tripsina; estas 3 sihiacionesse representan en la figura 16.8.

Efecto de la temperatura
Un experimento semejante a los descritos, pero esta vezcon los tubos de ensayo bajo temperaturas diferentes, muestra sus resultados en la f i p r a 16.9. La influencia de la temperatura sobre la velocidad dela reaccin es un problema complejo en el cual intervienen variosfactores,entre ellosel aumento de la energa del sistema alaumentar la teiiiperatiira,locual hace que los reactantes posean una cner@a cintica mayor y por tanto estn ms prximos al estado activado,adems, los efectos desestabilizantes de la temperatura sobre la estructura tridimensional de la protena enzimtica son imprescindibles para su accin. Teniendo en cuenta al menos estos 2 factores puede resuniirse el comportainiento de la velocidad en funcin dela temperatura comosigue. El aumento de la temperatura refleja un aumento de la energa cintica de las molculas,lo cual favorece la colisin entre las molculas de enzima y sustrato, rnieii. tras mayor sea la temperatura mayor es el nmero de choques y mayor la velocidad de la reaccin; pero a partir de un valor de temperaturacomienza la desnaturalizacinde la protena enzimtica y con ello la prdida de la actividad que se observa en los valores elevados de temperatura.

I'igiirn 16.8. Difereiirias en el pH litiniu. I>cpciidi~ii<loe lii forma inica d donde la enzima tiene su mayor actividad sc pueden ohtenrr curvas diferentes que reflejan qinr rada enriim tiene u n pH 6ptinio rili.actcristire,eitiisedebea la preseniiia en rl centro activo de la enrima de Crupas qumicos que ticneii dil'ci-cnir reaccin ante los ranibios de pII.

Efecto de los activadores

Como activadores enziinticos se definen a las pequeas molculas, generalmente iones inorgnicos, que son requeridos, o al nienos estimulan, la actividad catalitica de una enzima, y al contrario de los cofactores, no son participantes explcitos de la reaccin. Aun cuando pueden plantearse diferentes formas de actuar, nos limitai-ernos a los 2 casos mejor conocidos: la interaccin obligatoria con la enzinia libre y la interaccin obligatoria con el sustrato libre. En el primer caso se encuentran muclias enzimas que poseen iones metlicosen su centroactivo como la carboxipeptidasa que contiene Zn"; otras enzimas parecen requerir la presencia de un ion para estabilizar su conformacin de mxima actividad catalitica. La reaccin general puede ser descrita de la forma siguiente:

Kg. 16.9. Efecto dc la teniperatura. La velocidad de la rcncrin auineiiia ron la temperatura, pues sta es im rcfleje del sun>ento rlc la energa cinetira rlc los componentes de la reaeri6n. lo cual favorece los chuques lnternioleeulares: despus dc cse incremento de velocidad al aumcnwr la teniprriitura, se producen alteraciones cn la estructura tridimensional d e la protena cnrimtica que detfrminan una disminucin cn la velocidad d e reaccin.

EA

+
S

+ EAS

EA EA

+P

En el segundo caso se encuentran enzimas que catalizan reacciones en las cuales intervienen nuclesidos di y trifosatados, que requieren de la participacin siniultnea de un catin divalente (especialmente Mgz+) cantidades estequiomtricds. Las en investigaciones sobre estas reacciones han mostrado que un mecanismo probable para esta activacin es la combinacin del ion con el sustrato previo a sninteraccin conla enzima. El verdadero sustrato de la reaccion sera el complejo sustrato-catin, el esquema de reaccin sera:

SA

E + ESA

+E +

PA

La deduccin de las ecuaciones cinticas para estos casos rebasa los marcos de este texto.

a &

de los inhibidores

inhibidores enzimticos son sustancias que tienen en comn la propiedad de disminuir la velocidad de las reacciones catalizadas por las enzimas. Casi siempre se distinguen 2 tipos generales de inhihicio, la reversible y la irreversible, en el primer easoel inhibidor forma con la enzima un complejo enzima-inliihidor (El) unido por fuenm no covalentes y que por tanto puede disociarse; en el segundo, se producen modificaciones covalentes de la enzima que no pueden eliminarse fcilmcnte. En este c a p f ~slo se tratar de los primeros. o para estudiar el efecto y tipo de los inhibidores se realira una experiencia igual a ladeterminacin del efecto de la concentracin de sustrato sohre la velocidad, pero &oraencadaunode los tnbos de ensayo se ha aadido un inhibidor en unaconcentrafija. Como en los casos anteriores los resultados se llevan a una grfica y de amedocon sta se clasifican los inliihidores; slo se estudiarn los casos ms tpicos.

En la figura 16.1Use presenta una grfica en la que aparecen tambin los resultadosobtenidos sin el inhibidor. La grfica nos indica que para casi todas lai concentraciones de sustrato utilizada? lavelocidad de la reaccin siempre es menor en presencia del inhihidor, slo en concentraciones muy elevadas del sustratose logra superar la inhibicin y eso hace que la Vmseaigual en ambos casos; esto implica que se niodifique el intercepto del eje de las abscisasquecomo sabemos es una hiiciii de la Km. Si laKm est aumentada y la Vni est sin niodificacin,sc dice que el inhibidor es de tipo competitivo. El hecho de que la Vm no se altere significa que la capacidad catalticade laennma es la misma con inhibidor osin l. El aumento de Km indica que existeuna disminucin de la afinidad de la enzima por el sustrato; estos hechos son compatibles si suponemos que el inhihidor es capaz de unirse al centro activo para impedir la entrada del sustrato; si el sustrato no entra al centro activo no puede ser transformado por la enzima y esto explica la disminucih de la velocidad, o sea, se establece una competencia entre el sustrato y el inhibidor por ocupar el centro activo de laenzima. Cuando las concentraciones de siistrato son elevadsimas la probabilidaddeuninenzima-sustratoes muy alta y por ello se alcanza la velocidad inximade la reaccin. El esquema de la reaccin en presencia de un inhibidor competitivo sera:

Y para ello se definen 2 constantes de disociacin,la Km que ya conocemosy la Ki para la disociacin del comple,joE1 y resulta

el valor aparente de KmkL se obtiene con el inliibidor,se relaciona con la Km sin el que inhibidor por la ecuacin

Ntese que parte de la enzima se encuentra en forma de complejo E1 que no da producto, pues no puede unir al sustrato, lo que significa que existe una disminucin del nmero de centros activostilesy, por tanto, una menor velocidad de la reaccin. Una caracterstica de los inhibidorescompetitivos es quesu estructura es semejante a la del sustrato. En la figura 16.11 se muestra cmo la succinato desbidrogenasa puede ser inhihida de forma competitiva por el malonato, cuya estructura es muy similar a ladel succinato, que es el sustrato naturaldela enzima.

Fig. 16.11. Mecanismo de la inhihicin competitiva. La similihid estructuraldel inhibidor con cl sustralo hace que aqul pueda unirse al centra activo, pero sus diferencias le impiden la transformacin. La enzima auccinato-deshidrogenasa une al cido sucrinico y acta sobre los hidrgenos colocados eii carbonos adyacentes. C u a n d o el cida malnieo, que tiene una estructura similar, se une al centro activo de la enzima produce una inhibicin, pues no puede ser transfarmado, quedando unida al centro activo y, por tanto, impide la entrada y transformacin del sustrato verdadero.

Wbieio no competitiva
I Y"

, .
,/'

,/

'.

VM

.,'

-':,

,/

"
' ,

, !

,
.1 -

"M

~d

1 1%

Fig. 16.12. Inhihidares no competitivas. El inhibidor no competitivo no se aloja en el centro activo y no puede impedir la entrada delsustrala,pera de alguna forma dificulta su transformacin; en supreaencialaseurvas que se obtienen difieren en el valor de I N m , pero no alteran el valor de -1lKm. Variaciones en la concentracin del inhibidor dan origen a una familia de curvas que se cortan en cl eje de las abeisas en el punta -I/Km.

En la figura 16.12 al igual que en el caso anterior semuestran adems los resultados del experimento sin el inhibidor. Los efectos de este inhibidor sobre los parmetros cinticos son contrarios al anterior, se observa una disminucin de la Vm sin alteraciones de la Km; ni siquiera en concentracioneselevadsimas de snstrato se logra eliminar la inhibicin. Si la Km no se ha modificado quiere decir que no existe impedimento para la unin de la enzima con el sustrato. oero la afectacin de la Vm indica aue el inhibidor , disminuyede alguna forma la capacidad cataltica de la enzima. Se acepta que la unin enzima-inbibidor se produce en un sitio diferente del centro activo y que esa unin modifica las propiedades catalticasde la enzima, posiblemente modificando la conformacin del centro activo de forma que no impide la unin del sustrato pero dificulta grandementesu transformacin. El esquema de la reaccin con la participacin de un inhibidor no competitivo ser

E + S +ES+ E + I d E I ES + 1 +EIS E1 + S +EIS

La enzima existe en un estado libre y en forma de varios complejos (EI, ES y EIS) de los cuales slo ES da productos. Si suponemos que la unin de S a la enzima no

i d u y e sobre la unin de 1y viceversa,entonces la constante de disociacinde E1 ser igual a la de EIS y viene dada por cualquiera de las ecuaciones siguientes:

El valor aparente de Vm' que se obtiene en presencia del inhibidor se relaciona con la Vm de la reaccin sin el inhibidor por la ecuacin

~ m ='Vm. (1+ -)

[Il
Ki

En este caso tambin la enzima existe en forma de varios complejos de los cuales slo ES puede dar productos, pero no existe ningn impedimento para la unin con el sustrato; la existencia de esos complejos determina una disminucin del nmero de centros activos tiles en la preparacin y, por tanto, una disminucinde la velocidad de reaccin. Los inhibidores no competitivos no son anlogos estructurales del sustrato; el iodoacetato es un potente inhibidor no competitivode las enzimas que poseen grupos sulfibidrilos en, o cerca de, su centro activo. Algunos medicamentos utilizados diariamente en la prctica mdica son inhibidoresennmticos, como el caso de las sulfamidasque se emplea en el tratamiento de infeccionesbacterianas. En general las armas qumicassuelen ser tambin inhibidores enzimticosque al bloquear determinadas reacciones puedeu daar un rgano o tejido especfico. si la enzima que resulta inhibida est presente slo en l, o al organismo en su totalidad si la enzima inbibida est muy distribuida en la economa. La lucha contra la produccin, almacenamientoy utilizacin de las armas qumicas debe constituir una posicin de principio de todo cientfico, pues es parte del comportamiento tico impedir el uso de los avances de la ciencia en perjuicio de la humanidad.

Resumen
La eintica enzimstica es la parte de la enzimologh que se ocupa del estudio de
la velocidad de las reacciones enzimeas v de las factores aue la modiscan. En los &dias eineos se deben obsekar algunas reglas que permitan hacer una interpretacin ademada de las resuliadas, wmo son medir siempre velddades ini&es y variar en cada experimento slo uno de las factores que pueden alterar la velocidad. Los principales factores que ininyen sobre la velocidad de la reaeO6n son las concentracionesde etuimas, mistraios y wfactores, la temperatura, el pH y la presencia de activadores o inhibidores. La velocidad de las reacciones enzimtieas es diredamente proporcional a la wnceniraci6n de enzima, lo cnal constuye el fundamento de toda la cintica enzimtica.La wncentraci6n de sustrato M u y e sobre la velocidad de forma muy caracterstica.A medida que la wncentraci6n de mistrato aumenta se produce un aumento de l velddad, pero en concentraciones muy elevadas de mistrato se a produce un estado de saturaci6n de la enzima que no permite mayores incrementas de velocidad. Para explicar este comportamiento se emplea la teora deMiehaellisMenten, segn la cnal bastan 2 parmetms para explicarlo, uno, la Km define la

&dad

de la enzima por el sustratoy el otm, Vm es un indicador de la capacidad cataoca de la emima Cuando en la reacein intervienen 2 susiratos, uno de los mpeetosms importantes que se debe determinares el orden en que seiigsnlm sustratosy seliberan los productos. Atendiendo a este punto de vista se describen los mecanismos ordenados, los azarow y el ping pong. La inilueneis de la mncentraein de los whctores es similar a la del sustrato. La velocidad varia con el pH y existe una wna de pH pmo donde la velocidad es la mayor. Variaciones del pH en ambas lados de esta wna determinan una disminucin de la velocidad. Al aumentar la temperaturala velocidad de reaeein aumenta, pero pasado un limite comienza a disminuir, pues se producen alteraciones de la estructura tridimensonal de la emima. Los activadoresproducen un aumento de la velddad de la reaccin, se distinguen 2 principales, aqulios que se unen a la enzima libre y los que se unen al nishsto. Por su parte los inhibidores disminuyen la velocidad de la reaccin, bien porque modiean la Km, en cuyo caso son de tipo competitivo, o por alteraciones de la Vm, que reciben el nombre de no competitivos. Los eshidioseinticm son importantespara el conocimiento del meraniSrno de Muchos media d n de las enzimas, con el propsito de conocerlo y modi~~rlo. eamenios y algunas armas qumicas suelen ser bbibidores enzimticosespeefim.

..

Ejercicios
1.Cules son las razones por las que en los estudios cinticos debe siempre medirse velocidades iniciales? 2. En una experienciacintica se observa que al aumentarla concentracin de enzima no se produce el esperadoaumento proporcional de la velocidad. A qu factores pueden deberse estos resultados? 3. Si 2 enzimas actan sobre el mismosustrato con Km de 4 x 10" v 7 x 10.",resnectivamente Qu conclusiones pueden derivarse deestos valores? 4. Calcule el nmero de recambio de una enzima que al estar en una concentracin de 10" M forma 3 x 10.' M del producto en un segundo. 5. Una enzima cataliza la reaccin:

Alanina - - -Etanolamina + Co, - - ,

en un experimento realizado a pH=8 y a 30 "C se obtienen los datos siguientes:

V"(pmol de CO, min-')

Calcule la Km para la reaccin

6. En el estudio de la reaccin:

L-asprtico

L-ala + Co,

se encontr que el P-hidroxi-asprtico era un inhibidor de la enzima. Al tratar de determinar qu tipo de inhibidor era se obtuvieron los datos siguientes:

[L-asprtico] mmol 1.'

vo(mmol de CO, min-') (mg de protena)-'

sin inhibidor

con inhibidor

Constmya una grfica de l/vu vslI[S] y determine de qu tipo de inhibidor se trata.