Universidad de Oriente. Ncleo Bolvar. Escuela de Ciencias de la Salud Dr. Francisco Batisttini C Departamento de Ciencias Fisiolgicas. Asignatura: Bioqumica.

Ciudad Bolvar, Enero del 2012. INTRODUCCIN

Las enzimas son polmeros biolgicos que catalizan reacciones qumicas que hacen la vida posible. Son biomolculas muy especializadas, especficas y con un gran poder cataltico. La presencia equilibrada y completa de las enzimas, es necesaria para la desintegracin de nutrientes con el objeto de proporcionar energa y unidades que permitan la formacin y ensamble de protenas, ADN, clulas y tejidos. [1] Estas estructuras o enzimas son en su mayora protenas y, bsicamente lo que hacen es catalizar la transformacin de un compuesto llamado sustrato, en un compuesto diferente denominado producto. Son muy eficaces ya que mejoran la velocidad de la reaccin. Son adems muy selectivas o especficas, esto quiere decir que actan con un sustrato determinado. La catlisis de una enzima depende de la presencia de grupos prostticos, cofactores, coenzimas e inhibidores. Los grupos prostticos, son molculas orgnicas que se enlazan covalentemente, por ejemplo el fosfato de piridoxal y el mononucletido de flavina. Las coenzimas son compuestos orgnicos unidos de manera no covalente, y los cofactores estn unidos por fuerzas covalentes o no a la enzima pero son iones metlicos. En funcin de la actividad enzimtica de la catalasa, se realizar este informe. Esta enzima es una metaloprotena que posee cuatro grupos hemo y Fe3+. Es una enzima con funcin antioxidante, presente en el citoplasma glbulos rojos y es til en la eliminacin del perxido de hidrgeno (H 202) al impedir la catlisis de metales hacia el OH. Su funcin biolgica es descomponer el perxido formado en algunas reacciones catalizadas por oxidasas y superxido dismutasa [2] Los objetivos de la prctica en los que se basa este informe son los siguientes:

1. Describir como vara la velocidad inicial de una reaccin enzimtica en funcin de la concentracin de enzima. 2. Describir como vara la velocidad inicial de una reaccin enzimtica en funcin de la concentracin de sustrato. 3. Definir el concepto de Km. y de Vmx. 4. Determinar la Vo de la catalasa a diferentes concentraciones de sustrato. 5. Elaborar una grfica de actividad enzimtica vs. concentracin de sustrato a partir de datos experimentales de Vo. 6. Calcular Km. y Vmx en la grfica anterior. 7. Determinar la actividad de la catalasa a pH 5, 7 y 11 bajo concentraciones saturantes de sustrato. 8. Determinar la actividad de la catalasa a temperatura 0, 37, 40 y 60 C bajo concentraciones saturantes de sustrato. 9. Determinar el efecto del cianuro de potasio sobre la actividad de la enzima catalasa bajo concentraciones saturantes de sustrato. 10. Determinar el efecto del pH, temperatura, e inhibidores sobre la actividad de la catalasa. 11. Analizar la funcin biolgica de la catalasa.

REPORTE DE RESULTADOS

En funcin de los datos establecidos en la gua tenemos lo siguiente: [KMnO4] = 2mmol / L Quiere decir que: 2 mmol KMnO4 X X =? que: 2 mmol KMnO4 X 1 L KMnO4 1x10-3 L KMnO4 1 L KMnO4 1 ml KMnO4

Sabemos que 1 ml equivale a 1x10 -3 litros. Por lo tanto podemos decir

X= 2 mmol KMnO4 x1x10-3 L 1 L X= 2x10-3 mmol KMnO4 Entonces 2x10-3 mmol KMnO4 2mol KMnO4

Tomando en cuenta que el valor del tubo blanco fue 7,5 ml tenemos que: 1ml KMnO4 7,5 ml 2mol KMnO4 X

X= 7,5 ml KMnO4 x 2mol KMnO4 1 ml KMnO4 X= 15 mol KMnO4 De acuerdo a lo planteado en la gua de laboratorio tenemos que: 2 mmol KMnO4 5 mmol H2O2

Entonces esto implica que: 2mol KMnO4 5 mol H2O2

Ahora que tenemos los micromoles del tubo blanco, y sabemos la relacin de micromoles de permanganato y perxido de hidrgeno,

procedemos a obtener los milimoles de perxido de hidrgeno que se utilizaron en los tubos. 2 mol KMnO4 15 mol KMnO4 5 mol H2O2 X

X= 15 mol KMnO4 x 5 mol KMnO4 2 mol KMnO4 X= 37,5 mol KMnO4 Entonces buscamos cuantos micromoles equivalen a una solucin de 1 litro: 1 ml KMnO4 1000 ml KMnO4 37,5 mol H2O2 X

X= 1000 ml KMnO4 x 37,5 mol H2O2 1 ml KMnO4 X= 37500 mol H2O2 De acuerdo a lo que se plante en relacin a los milimoles y los micromoles 1x10-3 mol 37500 mol 1 mmol X

X= 37500 mol x 1 mmol = 37, 5 mmol 1000 mol CALCULO DE PH Ph control: 3.214 Tenemos los milimoles iniciales, ahora para obtener los metabolizados es necesario conocer los milimoles de perxido de hidrgeno neutralizados. Sabemos que: 7,5 ml KMnO4 Reaccionan con 7,5 mmol H2O2 Sabemos que el permanganato es un indicador y el titulante del perxido de hidrgeno en la reaccin, por lo 1 ml de permanganato reacciona con un ml

de perxido. Pero como nos piden son milimoles de perxido a fin de realizar la diferencia para obtener los milimoles metabolizados, tendremos lo siguiente: A pH 3 7,5 ml KMnO4 Reaccionan con 7,5 mmol H2O2 3,010 ml KMnO4 X Tubo 1 pH 3 min. 1

X= 3,010 ml KMnO4 x 7,5 mmol H2O2 = 3,01 mmol H2O2 7,5 ml KMnO4

7,5 ml KMnO4 Reaccionan con 7,5 mmol H2O2 3,010 ml KMnO4 X Tubo 3 pH 3 min. 3

X= 3,010 ml KMnO4 x 7,5 mmol H2O2 = 3,01 mmol H2O2 7,5 ml KMnO4

7,5 ml KMnO4 Reaccionan con 7,5 mmol H2O2 3,010 ml KMnO4 X Tubo 4 pH 3 min. 6

X= 3,010 ml KMnO4 x 7,5 mmol H2O2 = 3,01 mmol H2O2 7,5 ml KMnO4

A pH 5 7,5 ml KMnO4 Reaccionan con 7,5 mmol H2O2 0,185 ml KMnO4 X Tubo 1 pH 5 min. 1

X= 0,185 ml KMnO4 x 7,5 mmol H2O2 = 0,19 mmol H2O2 7,5 ml KMnO4

7,5 ml KMnO4 Reaccionan con 7,5 mmol H2O2

0,096 ml KMnO4

X Tubo 3 pH 5 min. 3

X= 0,096 ml KMnO4 x 7,5 mmol H2O2 = 0,09 mmol H2O2 7,5 ml KMnO4

7,5 ml KMnO4 Reaccionan con 7,5 mmol H2O2 3.010 ml KMnO4 X Tubo 4 pH 5 min. 6

X= 3.010 ml KMnO4 x 7,5 mmol H2O2 = 3.01mmol H2O2 7,5 ml KMnO4 A pH 7,4 7,5 ml KMnO4 Reaccionan con 7,5 mmol H2O2 0.280 ml KMnO4 X

X= 0.280 ml KMnO4 x 7,5 mmol H2O2 = 0.28mmol H2O2 7,5 ml KMnO4

Tubo 1 pH 7.4 min. 1

7,5 ml KMnO4 Reaccionan con 7,5 mmol H2O2 0,108 ml KMnO4 X Tubo 3 pH 7.4 min. 3

X= 0,108 ml KMnO4 x 7,5 mmol H2O2 = 0,11mmol H2O2 7,5 ml KMnO4

7,5 ml KMnO4 Reaccionan con 7,5 mmol H2O2 0.107ml KMnO4 X Tubo 4 pH 7.4 min. 6

X= 0.107ml KMnO4 x 7,5 mmol H2O2 = 0.11mmol H2O2 7,5 ml KMnO4

A pH 9 7,5 ml KMnO4 Reaccionan con 7,5 mmol H2O2

1,672 ml KMnO4

X Tubo 1 pH 9 min. 1

X= 1,672 ml KMnO4 x 7,5 mmol H2O2 = 1,67mmol H2O2 7,5 ml KMnO4

7,5 ml KMnO4 Reaccionan con 7,5 mmol H2O2 0,557 ml KMnO4 X Tubo 3 pH 9 min. 3

X= 0,557 ml KMnO4 x 7,5 mmol H2O2 = 0,56mmol H2O2 7,5 ml KMnO4

7,5 ml KMnO4 Reaccionan con 7,5 mmol H2O2 0,058ml KMnO4 X Tubo 4 pH 9 min. 6

X= 0,058ml KMnO4 x 7,5 mmol H2O2 = 0,06 mmol H2O2 7,5 ml KMnO4

A pH 11 7,5 ml KMnO4 Reaccionan con 7,5 mmol H2O2 0,238 ml KMnO4 X Tubo 1 pH 11 min. 1

X= 0,238 ml KMnO4 x 7,5 mmol H2O2 = 0,24mmol H2O2 7,5 ml KMnO4

7,5 ml KMnO4 Reaccionan con 7,5 mmol H2O2 0,290 ml KMnO4 X Tubo 3 pH 11 min. 3

X= 0,290 ml KMnO4 x 7,5 mmol H2O2 = 0,29mmol H2O2 7,5 ml KMnO4 7,5 ml KMnO4 Reaccionan con 7,5 mmol H2O2

0,268 ml KMnO4

X Tubo 4 pH 11 min. 6

X= 0,268ml KMnO4 x 7,5 mmol H2O2 = 0,29mmol H2O2 7,5 ml KMnO4

Una vez obtenidos estos datos en milimoles, podemos proceder a realizar las restas para obtener los milimoles metabolizados, a travs de la siguiente frmula

mmol metabolizados = mmol iniciales H2O2 mmol neutralizados H2O2

Tabla N 1 relacin de pH, tiempo, ml de KMnO4 gastados, mmol de H2O2 neutralizados y mmol de H2O2 metabolizados

pH

T (min.) 1 3 6 1 3 6 1 3 6 1 3 6

mmol iniciales de H2O2

ml de KMnO4 gastados 3,010 3,010 3,010 0,185 0,096 3.010 1,672 0,557 0,058 0,238 0,290 0,268

mmol de H2O2 neutralizados 3,010 3,010 3,010 0,185 0,096 3.010 1,672 0,557 0,058 0,238 0,290 0,268

mmol de H2O2 metabolizados 34,49 34,49 34,49 37,32 37.40 34.49 35.83 36.94 37.44 37.26 37.21 37.23

37,5

7.4

37,5 37,5

9 11

37,5

A partir de los milimoles metabolizados representados en la grfica y en relacin a los dos primeros tiempos (2 minutos y 1 minuto), podemos obtener la velocidad inicial, a travs de la siguiente formula: Vo= Y2 Y1 X2 X1 Donde Y representan los milimoles metabolizados y X el tiempo en minutos. Tenemos entonces que:

Vo tomando pH 5 ser: Vo= 34,49- 34,49= 0 mmol = 0 mmol/min 2-1 1min Vo a pH 7.4 sera:

Vo= 37.40-37,32 = 0,08mmol = 0,08 mmol/min 2-1 1min A pH 9 sera: Vo= 36.94 -35.83 = 1.11 mmol = 1.11 mmol/min 2-1 1min A pH 11 sera: Vo= 37.26 -37.21 = 0.05 mmol = 0.05 mmol/min 2-1 1min Estos valores representan las velocidades iniciales a los diferentes pH con los que se trabajo.

Grafica N 1 relacin de pH, tiempo, ml de KMnO4 gastados, mmol de H2O2 neutralizados y mmol de H2O2 metabolizados

Tabla N 2 relacin de la temperatura, tiempo, ml de KMnO4 gastados, mmol de H2O2 neutralizados y mmol de H2O2 metabolizados

Temperat ura (C)

Tiem po (min. )

mmol de H2O2

ml de KMnO4 gastad os

mmol de H2O2 neutraliza dos

mmol de H2O2 metaboliza dos

0C

1 3 6

37,5 37,5 37,5

0.237 ml 1.870 ml 1.704 ml

0.237 1.870 1.704

37.26 35.63 35.79

Vo1 = 0.815 mmol/min. 37C 1 3 6 37,5 37,5 37,5 2.696 ml 1.470 ml 0.430 ml 2.696 1.470 0.430 34.80 36.03 37.07

Vo2 = -0.615 mmol/min. 40C 1 3 6 37,5 37,5 37,5 0.310 1.200 0.900 0.310 1.200 0.900 37.19 36.30 36.60

Vo3 = 0.445 mmol/min. 60C 1 3 6 37,5 37,5 37,5 1.299 ml 0.847ml 0.862 ml 1.299 0.847 0.862 36.20 36.65 36.64

Grafica N 2 relacin de la temperatura, tiempo, ml de KMnO4 gastados, mmol de H2O2 neutralizados y mmol de H2O2 metabolizados

5 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0'C 37'C 40'C 60'C Tubo 6 Tubo 3 Tubo 1

DISCUSIN Cabe destacar que la cantidad de perxido de hidrgeno inicial no vari. En el caso de la prctica realizada en el laboratorio, la variacin fue de pH. Por lo tanto, la cantidad en milimoles de perxido de hidrgeno inicial, es constante en los tres tubos.

Una vez obtenido el valor inicial de perxido de hidrgeno, procedimos a buscar los milimoles de perxido de hidrgeno que se neutralizaron, ya que a partir de la diferencia de los milimoles iniciales, con los milimoles neutralizados se obtienen los milimoles de perxido de hidrgeno metabolizados. Sabemos entonces que una cantidad de permanganato de potasio en mililitros, reaccionar con una misma cantidad de perxido de hidrgeno, por ello los valores deben ser iguales. Ahora cmo llevar la cantidad de mililitros a milimoles y que sean igual? Se supone que las cantidades en mililitros de permanganato, deben ser las mismas en milimoles de perxido, puesto que el permanganato es el titulante del perxido de hidrgeno a fin de determinar la actividad de la catalasa; y lo que se gasta ser lo mismo que se neutraliza. 7,5 ml KMnO4 Reaccionan con 7,5 mmol H2O2. Sabemos que el permanganato es un indicador y el titulante del perxido de hidrgeno en la reaccin, por lo que 1 ml de permanganato reacciona con un ml de perxido. Pero como nos piden son milimoles de perxido a fin de realizar la diferencia para obtener los milimoles metabolizados, utilizamos la frmula que est en la parte de anlisis de resultados. Entonces el permanganato nos sirvi de indicador y, al saber cuanto gastamos de l podemos conocer cuanto se metaboliza de perxido de hidrgeno. Bsicamente se variaron los pH a fin de saber como influye este sobre la actividad de la enzima. Es sabido que una enzima trabaja a una temperatura y pH especfico. En el caso de la catalasa ella trabaja a pH fisiolgico 7,4 o 7,6 aproximadamente. En el caso de la prctica se vari el pH, se tomaron soluciones buffer de 5, 7 y 11 en el orden de pH.

Sabiendo que las enzimas son protenas, cualquier cambio brusco de pH puede alterar el carcter inico de los grupos amino y carboxilo en la superficie proteica, afectando as las propiedades catalticas de una enzima. A pH alto o bajo se puede producir la desnaturalizacin de la enzima y en consecuencia su inactivacin. Por ejemplo La fosfatasa cida es ms activa a pH 5,0, mientras que la fosfatasa alcalina lo es a pH 9,0. Muchas enzimas tienen mxima actividad cerca de la neutralidad en un rango de pH de 6 a 8. [3] El pH no afecta la actividad enzimtica, sino la concentracin de protones. Los protones adems de alterar la estructura de la enzima y el substrato, pueden participar tambin en la reaccin como substrato o producto. En esos casos, la concentracin de protones afecta directamente la velocidad de la reaccin.[3] La velocidad mxima representa que, independientemente de que se agregue ms sustrato la velocidad de reaccin se mantendr constante, o sin variaciones. El Km o constante de Michaelis Menten se define como la relacin que existe entre la constante de velocidad que hace desaparecer el complejo enzima sustrato, y la constante de velocidad que lo hace aparecer. Tambin lo podemos definir como la concentracin de enzima sustrato, que logra ocupar la mitad de la enzima o el sitio activo de la enzima para formar el complejo enzima sustrato. La constante de Michaelis se mide en unidades de concentracin de acuerdo a las que se estn utilizando, sea mol/L entre otras. Otra definicin es que Km es la concentracin de substrato que hay cuando la reaccin ha alcanzado la mitad de la velocidad mxima. Otro parmetro es; que el Km representa la afinidad existente entre la enzima y el sustrato. A mayor Km menor es la afinidad. Cuanto menor sea la Km menor ser la cantidad de sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la velocidad mxima, por lo que mayor ser la afinidad del enzima hacia ese sustrato.

Durante la cadena respiratoria, especficamente en el momento en que el oxgeno debe captar finalmente los electrones, se producen los radicales libres. Esto sucede, porque el oxigeno debe recibir cuatro electrones para reducirse a dos molculas de agua. Durante el proceso, el oxgeno recibe en primer lugar, un electrn que lo hace quedar en estado de anin superxido. Luego recibe otro electrn y se reduce. Pero la otra molcula de oxgeno que tambin recibir electrones a veces se queda como radical libre y se escapa de la clula. El oxgeno cuando pierde uno de sus electrones entra en desbalance y se vuelve altamente reactivo. Esa molcula empieza a girar, comienza a aumentar la fuerza de choque o aproximacin con otras molculas para tratar de combinarse y recuperar el electrn perdido. En ese constante giro, la molcula perfora la membrana celular, ese orificio nuevo por lo cual la membrana deja de funcionar como bicapa lipdica selectiva, se altera la entrada y salida de sustancias a la clula, se rompe entonces la homeostasis y la clula muere. Estos radicales se generan a cada instante en nuestro cuerpo ya que se producen con el oxgeno, y nosotros somos bsicamente aerbicos. Por ello el organismo tiene mecanismos que permiten eliminar radicales libres. Por ejemplo el anin superxido, es convertido a perxido de hidrgeno por accin de una enzima llamada superxido dismutasa, la cual lo convierte en perxido de hidrgeno. Este sigue siendo un radical libre, pero menos agresivo que el anin superxido. Aqu entra en accin la enzima con la que trabajamos en el laboratorio que es la catalasa, que libera oxgeno molecular y agua, que puede ser aprovechado por las clulas. La catalasa o perxido de hidrgeno oxidorreductasa, EC 1.11.1.6) es una de las enzimas ms abundantes en la naturaleza y se encuentra ampliamente distribuida en el organismo humano, aunque su actividad vara en dependencia del tejido; sta resulta ms elevada en el hgado y los riones, ms baja en el tejido conectivo y los epitelios, y prcticamente nula en el tejido

nervioso. A nivel celular se localiza en las mitocondrias y los peroxisomas, excepto en los eritrocitos, donde se encuentra en el citosol. Esta enzima es una metaloprotena tetramrica. Consta de 4 subunidades idnticas que se mantienen unidas por interacciones no covalentes. Cada subunidad contiene un grupo prosttico de protoporfirina IX y el contenido protohmico y el de hierro representan un 1,1 % y 0,09 % respectivamente del peso molecular total de la enzima. [4] Al ver las grficas de acuerdo a los valores obtenidos, podemos reafirmar lo que se plantea acerca del valor de pH al cual la catalasa tiene mejor actividad. Ya que en la grfica de pH general, podemos ver que es aproximadamente a pH 7 que la catalasa tiene mayor actividad enzimtica.

CONCLUSIN En trminos generales se lograron los principales objetivos de la prctica. Se logr definir a cabalidad los conceptos de velocidad mxima y Km, as como se determin la importancia mdica de la catalasa.

El organismo ha creado maneras de eliminar radicales libres del organismo, en funcin de que somos netamente aerbicos. Una manera de eliminar estos radicales es a travs de la catalasa, que elimina al perxido de hidrgeno que es txico para la clula y por ende para el organismo. Adems no es slo la catalasa la nica que elimina radicales libres, la superxido dismutasa elimina el anin superxido que tambin es un radical libre y lo transforma en perxido de hidrgeno. Logramos entender como el pH puede afectar la actividad enzimtica. Por ejemplo, la catalasa trabaja mejor a pH fisiolgico. Sabemos que el valor de pH puede afectar la actividad enzimtica, puesto que cada enzima tiene un pH al cual realiza mejor la misma. Otros factores tales como, temperatura pueden desnaturalizar a la enzima si sobrepasa el valor normal, o inactivarla si es muy baja. As como la presencia de inhibidores. Vemos que la concentracin de protones, puede actuar sobre la enzima cambiando su estructura y por ende la actividad. La velocidad de reaccin de la enzima, vara de acuerdo a estos factores mencionados, as como de acuerdo a la cantidad de sustrato presente. A mayor cantidad de sustrato, mayor es la velocidad de reaccin, sin embargo; cuando esta alcanza su velocidad mxima, no vara as se aada mas cantidad de sustrato. La velocidad se hace constante. No se utiliz el cianuro, por lo cual no se llev a cabo el objetivo nmero nueve establecido en la gua de laboratorio.

BIBLIOGRAFA [1] Murray Robert, Mayes Meter, Granner Daryl, Rodwell Victor. 2004. Harper Bioqumica Ilustrada. Editorial El Manual Moderno. 16ava edicin.

[2] Manual de Laboratorio de Bioqumica, Escuela de Ciencias De la Salud, Departamento de Ciencias Fisiolgicas, Universidad de Oriente Ncleo Bolvar. [3] http://www.forest.ula.ve/~rubenhg/enzimas/index.html , Material didctico elaborado por: Rubn Hernndez Gil, PhD. Profesor de Fisiologa Vegetal, Departamento de Botnica, Facultad de Ciencias Forestales y Ambientales. Universidad de Los Andes - Mrida Venezuela e-mail: rubenhg@ula.ve 31 de enero de 2007. [4] http://www.bvs.sld.cu/revistas/ibi/vol15_2_96/ibi01296.htm, Dra. Ela M. Cspedes Miranda, Dra. Ingrid Hernndez Lantigua y Dra. Niurka Llpiz Janer; Instituto de Ciencias Bsicas y Preclnicas "Victoria de Girn". Calle 146 No. 3102, esquina a 31, Reparto Cubanacn, municipio Playa, Ciudad de La Habana, Cuba Trabajos de Revisin Enzimas que participan como barreras fisiolgicas para eliminar los radicales libres: II. Catalasa Recibido: 26 diciembre de 1995. Aprobado: 5 de febrero de 1996.