Biotechnologies animales et vgtales

TD2: Les applications de la fusion de protoplastes

Sommaire

I. Un exemple d'exploitation des ressources gntiques par l'hybridation somatique (cas des agrumes)! 2
I.1. Ressources gntiques! I.2. Mthodologie!
I.2.a. Obtenir un systme de rgnration partir de protoplastes efcaces! I.2.b. La mthode de fusion (fusion lectrique)! I.2.c. Slection des produits de fusion!

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I.3. Rsultats!
I.3.a. Elargir le pool gntique! I.3.b. Crer de nouveaux porte-greffes! I.3.c. Crer des cultivars triplodes!

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II - Introduction de caractres provenant d'espces sauvages (cas de la pomme de terre)! 10 III. Grer les gnomes cytoplasmiques!
III.1. Gnome chroloroplastique du colza! III.2. Le gnome mitochondrial de la tomate!

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3 applications majeures: largir les ressources gntiques au sein de pools gntiques d'espces
L'hybridation somatique (fusion symtrique) 2n + 2n 4n (cas des agrumes)

Introgresser des gnes provenant d'espces sauvages des espces cultives

Fusion asymtrique: spontane ou induite (cas de la pomme de terre)

Grer les gnomes cytoplasmiques:

Chloroplastes: - Rsistance des herbicides - limination des dciences chlorophyllienne (cas du colza) Mitochondries strilit mles cytoplasmiques (cas de la tomate)

I. Un exemple d'exploitation des ressources gntiques par l'hybridation somatique (cas des
agrumes)

Figure1: Diffrentes associations nuclo-cytoplasmiques gnrales par hybridation somatique

I.1. Ressources gntiques

Pool primaire, 3 genres: Citrus espces consomms Fortunella quelques cultivars (comme le kumquat) Poncirus trifoliata porte-greffe (il apporte des rsistances)

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Ces 3 genres sont thoriquement sexuellement compatible et du coup, on retrouve une plus grande variabilit gntique dans les: " " " " Caractres pomologiques (caractres lis la morphologie du fruit): - Couleur - Forme - Taille - Albedo

Figure2: Diversit des fruits au sein du genre Citrus " Caractres organoleptiques: - Gout (acidit, amertume, sucr, armes, huiles essentielles...) Caractres agronomiques: "
!

Priode de production des fruits Le mandarinier saltuma produit en septembre

! ! ! !

Oranger Valencia Late produit en juillet aout

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" " " " " " " " "

Rsistance: Contraintes biotiques " " " " " " " " " " " " " " " Maladie due aux champignons Bactrie (chancre citrique) Virus (tristga) Nmatodes Contraintes abiotiques Rsistance la scheresse Rsistance au sel (mandarinier Cloptre) Rsistance au froid (kumquat) Rsistance au calcaire (citrus macrophylla)

Facteur limitant la reproduction sexue:

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Polyembryonie

Ces embryons ne sont pas issus de la fcondation, mais ils sont issus du dveloppement des cellules du nucelle (2n cellules somatiques) et donc les plantes sont identiques la plante mre. Ce phnomne ne sapplique pas aux cdratiers, quelques mandariniers et pamplemousses

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Strilits mles et femelles L'htrozygotie leve La longueur de la phase juvnile

Fabriques par l'Homme et empche maintenant de faire des croisements

Il faut beaucoup de temps avant de faire des croisements (6 ans parfois pour obtenir la premire eur)

Pool secondaire: plantes toujours sexuellement compatible avec celles du pool primaire, mais on obtient des hybrides striles. Eremocitrus et macrocitrus ont une trs forte rsistance au sel Pool tertiaire: sexuellement incompatible avec celle du pool primaire On a alors entrepris de faire de lhybridation somatique an de contourner la non-compatibilit des pools entre eux

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I.2. Mthodologie
! I.2.a. Obtenir un systme de rgnration partir de protoplastes efcaces

Figure3: Induction et gestion des cals embryognes dagrumes Il faut partir de matriel trs jeune (embryons ou ovules) qui donne des cals embryognes lorsquils sont dans un milieu + saccharose. Ces cals lorsquils seront dans un milieu avec du galactose, se transformeront en embryon somatique et donneront des plantules
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I.2.b. La mthode de fusion (fusion lectrique)

Figure4. lectrofusion de protoplastes et rgnration d'embryons. a: Mlange de protoplastes de cals de mandarinier Commun (A1) et de protoplastes de feuille de kumquat Marumi (A2). b: Alignement des protoplastes dans le champ lectrique. c: Population de protoplastes aprs mission de pulses lectriques (C1: htrofusions ; C2: homofusions ; C3: protoplastes parentaux). d : Rgnration d'embryons partir de protoplastes lectrofusionns Les cals embryognes protoplastes A Feuilles protoplastes B On obtiendra des protoplastes AB htrocaryons et des protoplastes AA et BB homocaryons ! ! I.2.c. Slection des produits de fusion

Ils ont commenc faire une double slection, mais la mort des protoplastes AA et BB librs des composs toxiques pour les protoplastes AB Ils ont donc fait une slection tardive sur les plantes rgnres:

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On peut utiliser la cytomtrie de ux les plantes AB auront double quantit d'ADN comme les htrofusion et homofusion, mais on ne peut pas distinguer les plantes AA ou BB des AB

Figure5. Analyse par cytomtrie en ux (le citronnier Lisbonne est utilis comme tmoin interne diplode) du niveau de plodie d'hybrides rgnrs partir de fusions de protoplastes haplodes de clmentinier et diplodes de mandarinier Kinnow . a : hybride somatique triplode. b: hybride somatique ttraplode

Pour les distinguer les plantes AA, BB et AB: " - Caractres morphologiques " - Marqueurs molculaires " - Marqueurs biochimiques (isoenzymes) ce que les chercheurs de Grenoble ont utilis

Figure6. Analyse par lectrophorse enzymatique (phosphoglucomutase) de l'origine nuclaire de plants rgnrs aprs fusions de protoplastes de pomelo Star Ruby et de limettier Mexicain . P: pomelo Star Ruby ; L: limettier Mexicain ; SP: plantes rgnres aprs fusion de protoplastes

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On amplie par PCR une petite squence spcique du gnome mitochondrial et ensuite, on la clive avec une enzyme de restriction. Si il y a du polymorphisme au niveau du site de restriction et bien on aura ou non une coupure du fragment PCR

Figure7. Analyse par CAPS (amorce: trnT3/trnD2 (44) et enzyme de restriction DraI) de la sgrgation des chloroplastes parentaux chez des hybrides somatiques entre le pomelo Star Ruby et le mandarinier Commun . 1: marqueur de taille, 2 11: hybrides somatiques, 12: mandarinier Commun , 13: pomelo Star Ruby Ils ont ralis une analyse par caps sur une squence intergnique du gnome chloroplastique. Cest une squence qui est situ entre le gne TRNt et le gne TRNd (TRN correspond des gnes qui codent pour des ARN de transfert). Ils ont ampli la squence qui est entre les 2 parce quils savaient quil y avait du polymorphisme au niveau dun site de restriction (marqueur dj mis au point avant). Ensuite il ont fait agire lenzyme de restriction DRA1 et chez les mandarinier sa oupe le fragment au niveau du site de restriction et chez le pamplemousse il ny a pas de site de restriction donc sa coupe pas le fragment donc on a 2 fragments pour le mandarinier et quun seul fragment pour le pamplemousse et lorsquon analyse nos hybrides somatiques, on peut voir si notre chloroplate vient dun parent ou de lautre parent car comme il ny a pas de recombinaison du gnome chloroplastique, si on a un seul marqueur, cela nous permet de dire sil sagit du chloroplaste de lun ou de lautre parent, ce qui nest pas le cas avec les mitochondrie car comme les mitochondrie recombine, si on utilise quun seul marqueur cela ne veut pas dire quil y a quand mme eu des recombinaisons. Donc le fait davoir 2 fragments chez un hybride veut dire que lon a obligatoirement le gnome chloroplastique du mandarinier commun. Et donc en fonction des hybrides, on a pas forcement le mme gnome chloroplastique (chez certains cest le mandarinier et chez dautres a sera le pamplemousse)

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I.3. Rsultats
! I.3.a. Elargir le pool gntique

Fusion d'espces polyembryonnaires:

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Alloplaste: Le noyau d'une cellule et le cytoplasme d'une autre cellule 2n + 2n 4n restauration de la fertilit 4n + 2n 3n triplodes striles donc varits sans ppins

Fusion entre plantes des diffrentes gntiques:

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C'est un chec et sa montre la limite de la fusion de protoplaste, il faut rester dans la mme espce. Pour y arriver, il faudrait faire de la fusion asymtrique ! ! I.3.b. Crer de nouveaux porte-greffes

Les chercheurs de Grenoble ont choisi de croiser le Citrus reticulata trs rsistant aux sols calcaires avec le Poncirus trifoliata ! ! I.3.c. Crer des cultivars triplodes

2n + n (technique d'haplodisation, mais cela ne marche que sur le clmentinier)

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II - Introduction de caractres provenant d'espces sauvages (cas de la pomme de terre)

Pomme de terre Solanum tuberosum (4n) de la famille des solanaces 2n = 4x = 48 Elle est trs sensible aux nombreuses maladies. Tandis que les espces sauvages sont trs rsistantes aux maladies comme Solanum brevidens, elle rsiste l'erwinia (soft rot) et 3 virus (PLRV, PVY, PVY). Mais elle est 2n = 24 Donc pour faire de la fusion de protoplastes, ils doivent rduire le lot de 48 24 de la pomme de terre (dihaplode) Fusion S.t + S.b donne des hybrides striles, ils ne sont donc pas intressants. On a essay la fusion asymtrique. Pour se faire, il irradie le noyau de S.b pour liminer des chromosomes. De 2 17 chromosomes ont t conservs et c'est intressant si lon garde les chromosomes avec les bons gnes

III. Grer les gnomes cytoplasmiques

! III.1. Gnome chroloroplastique du colza
On a utilis la fusion de protoplaste pour transfrer un gne de rsistance an d'liminer la dcience chlorophyllienne Tout a commenc avec un colza qui au dpart nest pas mle strile. Il croise le colza + radis an dobtenir des colzas mles striles. Ils ont russi, mais la plante obtenue pousse trs mal parce que les chloroplastes du radis ont t aussi transfrs
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Ils ont donc fait de la fusion de protoplastes en slectionnant que les croisements qui possd les bons chloroplastes

Ils ont voulu introduire en plus un gne de rsistance l'atragine pour le colza. Ils ont donc crois le colza mle strile avec la navette (qui possde le gne de rsistance l'atrasine) et comme ces 2 plantes sont trs proches, il n'y a pas d'incompatibilit des chloroplastes

III.2. Le gnome mitochondrial de la tomate

Tomate licopersicon exculentum de la famille des solanaces. Elle dispose de 24 chromosomes comme chez la pomme de terre Ils ont fait des fusions de pomme de terre avec des tomates qui donnent des hybrides somatiques, c'est la pomate Ils utilisent des rayons gamma sur le noyau de pomme de terre et un inhibiteur mtabolique pour inhiber la mitochondrie de la tomate an que les mitochondries ne se divisent plus

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Dans les 2 cas, on obtient 2 types de protoplastes qui peuvent rgnrer des plantes, mais en fusionnant les 2 protoplastes, ils esprent que le noyau de l'un (tomate) utilise le cytoplasme de l'autre (pomme de terre) Ils ont obtenu 88 cals 3 plantes: 2 qui sont 2n = 24 1 qui est 4n = 48 (car fusion de 2 protoplastes de tomate avec un protoplaste de pomme de terre)

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