Metabolismo de Zymomonas mobilis para produccin del etanol

Villada Arellano Victor Manuel

Ingeniera en Biotecnologa, Universidad Politcnica del Estado de Morelos, Boulevard Cuauhnhuac #566, Col. Lomas del Texcal, Jiutepec, Morelos

INTRODUCCIN Los procesos fermentativos son la etapa ms importante de un proceso de produccin de un metabolito de alto valor agregado como es el etanol. En esta etapa, tres factores preponderantes han de ser considerados para garantizar la obtencin de altos rendimientos de producto y estos son: el sustrato, las condiciones de operacin y el microorganismo fermentador. El sustrato se describe como el resultado de un pretratamiento que se efecta sobre la materia prima original tal. En esta etapa una alta cantidad de azcares asimilables son liberados de los componentes principales de la materia prima convirtindose en el sustrato que ha de consumir el microorganismo fermentador.(1)

ANTECEDENTES La humanidad emplea la fermentacin alcohlica desde tiempos inmemoriales para la elaboracin de cerveza (empleando cereales) y del vino(empleando el fruto de la vid: la uva en forma de mosto) fundamentalmente. Los griegos atribuan el descubrimiento de la fermentacin al dios Dionisio. En el ao 1864 Antoine Lavoisier hizo experimentos en 1789 determinando las cantidades de los elementos intervinientes en la fermentacin (carbono, oxgeno e hidrgeno). Con el advenimiento de los descubrimientos qumicos en el ao 1815 el investigador francs Joseph Louis Gay-Lussac fue el primero en determinar una reaccin de fermentacin obteniendo etanol a partir de glucosa, Durante los aos 1830s los qumicos Jns Jakob Berzelius y Justus von Liebig desarrollaron una teora mecanicista que explica la fermentacin, teoras que estaban en contraposicin con las creencias de Louis Pasteur en el ao 1857 que se fundamentaba en la teora vitalista como explicacin de los mecanismo bsicos de la fermentacin,

fue el mismo Pasteur que en el ao 1875 demostr que la fermentacin era un proceso anaerbico (en ausencia de oxgeno). (Arthur Harden. 1914) (2)

OBJETIVOS General:

Analizar el metabolismo de Zymomonas mobilis para la produccin de etanol por medio de la via Entner Doudoroff.

Analizar otras rutas del microorganismo

FERMENTACIN Los procesos de fermentacin, en sentido metablico, son aquellos en los que se produce una oxidacin de compuestos orgnicos reducidos siendo el aceptor final de electrones un compuesto orgnico interno que se reduce. En estos procesos puede producirse algn rendimiento energtico; pero su principal funcin es la reoxidacin del NADH+H+ a NAD necesario para poder iniciar los primeros pasos del catabolismo. Los diferentes procesos pueden identificarse por sus productos finales. Las rutas fermentativas son anaerobias porque no requieren oxgeno como aceptor final de los electrones. Esto no quiere decir que en ausencia de oxgeno slo se pueda producir fermentacin: el aceptor final de los electrones puede ser un compuesto inorgnico oxidado que los reciba al final de la cadena respiratoria producindose un proceso de fosforilacin oxidativa en ausencia de oxgeno. En estos procesos decimos que los microorganismos son capaces de respirar otras molculas diferentes al oxigeno como son los nitratos (NO3) los sulfatos (SO4), etc. Los procesos de fermentacin son universales; esto es: se encuentran en todo tipo de organismos y, por consiguiente, probablemente represente una de las formas ms antiguas de conservacin de la energa. Cuando una clula carece de cadena respiratoria, el NADH+H+ no puede reoxidarse a NAD+ y, por consiguiente, no se puede regenerar el agente aceptor de hidrgeno necesario para las primeras fases de la gluclisis. Los procesos fermentativos reducen el piruvato regenerando el NAD+ necesario para los procesos metablicos inciales del catabolismo de la glucosa. Diferentes tipos de bacterias reducen el piruvato de maneras diversas dando lugar a distintos procesos de fermentacin que se conocen por sus productos finales (3).

FERMENTACIN ALCOHLICA La fermentacin alcohlica (denominada tambin como fermentacin del etanol o incluso fermentacin etlica) es un proceso biolgico de fermentacin en plena ausencia de aire (oxgeno - O2), originado por la actividad de algunos microorganismos que procesan los hidratos de carbono (por regla general azcares: como pueden ser por ejemplo la glucosa, la fructosa, la sacarosa, el almidn, etc.) para obtener como productos finales: un alcohol en forma de etanol (cuya frmula qumica es: CH3-CH2-OH), dixido de carbono (CO2) en forma de gas y unas molculas de ATP que consumen los propios microorganismos en su metabolismo celular energtico anaerbico. (4)
Figura 1 - Fermentacin etanlica o alcohlica: Proceso de fermentacin llevado a cabo por levaduras y algunas bacterias. El piruvato se reduce para formar etanol y CO2.

PROCESO BIOQUMICO DE LA FERMENTACIN ALCOHLICA La fermentacin alcohlica tiene como finalidad biolgica proporcionar energa anaerbica a los microorganismos unicelulares (levaduras) en ausencia de oxgeno para ello disocian las molculas de glucosa y obtienen la energa necesaria para sobrevivir, produciendo el alcohol y CO2 como desechos como consecuencia de la fermentacin. Las levaduras y bacterias causantes de este fenmeno son microorganismos muy habituales en las frutas y cereales y contribuyen en gran medida al sabor de los productos fermentados. Una de las principales caractersticas de estos microorganismos es que viven en ambientes completamente carentes de oxgeno (O2), mxime durante la reaccin qumica, por esta razn se dice que la fermentacin alcohlica es un proceso anaerbico. (3)

FERMENTACIN MICROBIANA La sntesis de etanol por va microbiana generalmente es llevada a cabo por levaduras, siendo la ms representativa Saccharomyces cerevisiae. Sin embargo, ha sido reportado en la literatura la produccin de bioetanol por Zymomonas mobilis bajo diferentes condiciones, resultando en procesos altamente ventajosos comparado con S. Cerevisiae. Zymomonas mobilis es una bacteria Gram negativa, anaerobia facultativa con morfologa de bacilo (como se muestra en la Figura 2). Se encuentra predominante como parte de la flora natural en fermentacin de las savias, por ejemplo el agave, la palma y la caa de azcar, donde estn presentes altas concentraciones de glucosa; as como en las cervezas, peras y las sidras, donde acta como flora de los desechos (M. Coton. et al. 2005) (5) .Figura 2 y 3 - Zymomona mobilis. Imagenes tomada de la red

Como ya se menciono anteriormente, se ha reportado que puede producir etanol con rendimientos hasta cinco veces mayores bajo condiciones anaerobias (Tao. et al. 2005) (6). Produciendo 1 mol de ATP por mol de glucosa, a diferencia de la va de S. Cerevisiae, que produce 2 mol de ATP por mol de glucosa, este decremento permite que ms energa sea usada para la formacin de etanol (Wilkins, 2009; Rogers, Davis, Pearce y Peiris, 2006). (7)(8). En la Tabla 1 se muestran los microorganismos con sus respectivos rendimientos y sustratos. El rendimiento se define como la relacin entre los g de etanol producido por cada g de sustrato consumido y para la produccin de este alcohol el rendimiento terico, que sirve de referencia para cuantificar la eficiencia de un microorganismo, es de 0.511 g de etanol producido/g de sustrato consumido. (9)

Tabla 1 comparacin de S. cerevisiae y Z. mobilis, ambos productores de etanol

Z. mobilis presenta altos rendimientos y productividades de etanol debido a que este microorganismo metaboliza la glucosa anaerbicamente mediante la va de Entner Doudoroff (ED) en lugar de la de Embde Meyerhof Parnas (EMP) . La va ED genera slo la mitad del ATP generado por la va EMP por mol de glucosa, como consecuencia, Z. mobilis genera menos biomasa y por lo tanto una mayor cantidad de carbono es dirigida hacia los productos de fermentacin. Adems, todas las enzimas relacionadas con la fermentacin se expresan de manera constitutiva y comprenden aproximadamente el 50% de la biomasa. Va de Entner Doudoroff (ED) La ruta de Entner-Doudorof es una ruta metablica alternativa que cataboliza glucosa a piruvato usando una serie de enzimas distintos a la gluclisis y a la ruta de la pentosa fosfato. Es exclusiva de un nmero reducido de microorganismos carentes de la ruta Embden Meyerhof. El 6-fosfogluconato puede deshidratarse a 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato. Este compuesto puede desdoblarse luego en piruvato y gliceraldehido-3-fosfato mediante una aldolasa. Mediante esta ruta se produce menos NADPH que en situacin en la que el 6-fosfogluconato es descarboxilado a ribulosa-5-fosfato. Adicionalmente, el gliceraldehido-3-P se oxida a piruvato por la va de Embden-Meyerhof, descarboxilndose en ambos casos el piruvato y originando acetato.
Figura 4 Reaccin en general de la ruta de Entner-Doudorof

En Gluconobacter oxydans y Melanogenes, el 6fosfogluconato puede deshidratarse a 2-ceto-3-desoxi6-fosfogluco neto. Este compuesto puede desdoblarse luego en piruvato y gliceraldehido-3-P mediante una aldolasa. Mediante esta ruta se produce menos NADPH que en la situacin en la que el 6fosfogluconato es descarboxilado a ribulosa-5-P Adicionalmente, el gliceraldehdo-3-P se oxida a piruvato por la va de EmbdenMeyerhof, descarboxilndose en ambos casos el piruvato y originando acetato tal como ha sido descrito anteriormente. Esta va se conoce como va de Entner-Doudoroff, y es la mismautilizada por Zymonomas mobilis para llevar a cabo una fermentacin alcohlica con una estequiometria similar a la de las levaduras (Figura N 2.5 y Figura N 2.6). Comienza con las mismas reacciones de las pentosas fosfato. Se forma 2-ceto-3desoxi-6-fosfogluconato o KDPG. Desde GAL-3P hasta Piruvato es catalizado porenzimas comunes a la va Glicoltica. Se produce 1NADPH y 1 NADH por molcula de glucosa metabolizada

Figura 5 Esquema de la va de EntnerDoudoroff como estrategias microbianas de fermentacin alcohlica.

La mayora de las bacterias tienen las vas glucoltica y de las pentosas fosfato, pero algunas sustituyen la gluclisis por la Va Entner-Doudoroff. (9)

Figura 7 Esquema resumido de la va de EntnerDoudoroff, el destino de la mayora de los distintos tomos de carbono. (10)

Figura 7 - Las dos vas del 6-P-gluconato. (a) sistema de la 6-Pgluconato deshidrogenasa (b) reaccin clave de la va de EntnerDoudoroff (c) origen de los tomos de C de las molculas de CO2 formadas en la fermentacin alcohlica de la glucosa por las levaduras (va de EmbdenMeyerhorf) y Zymononas mobilis (va de EntnerDoudoroff).

OTRAS VAS METABLICAS DEL ZYMOMONAS MOBILIS No hay literatura disponible de las otras rutas metablicas que realice este microorganismo en especfico, sin embargo, se han hecho pruebas del comportamiento del gnero al estimularlo con diversos nutrientes pero no se han logrado a entender a fondo como para poder representarlo en un esquema como se presentaron antes, por ejemplo: Formacin de acetaldehdo el acetaldehdo puede ser atrapado durante la fermentacin de la glucosa, este compuesto, junto con cantidades variables de sulfuro de hidrgeno, contribuye al sabor y olor desagradables del sidra. Esto debe ser considerado como uno de carcter general y se aplica a un tipo de fermentacin que se distingue por la descomposicin de los azcares para producir no solo etanol, si no aldehdos en suficiente cantidad para llamarlo fermentacin de aldehdos Se sabe que tambin el gnero Zymomonas lleva a cabo la formacin de acetilmetilcarbonilo metabolismo de los aminocidos, de alcoholes superiores, de H2S y el metabolismo del azufre CONCLUSIN Zymomona mobilis es una bacteria muy inusual ya que fermentan la glucosa anaerobicamente por la ruta de Entner Doudoroff. El etanol es un combustible limpio, renovable, que puede reducir la dependencia del petrleo; sin embargo, aunque el proceso fermentativo para la produccin de bioetanol es ya bien conocido, los costos de produccin son todava el impedimento clave para su amplio empleo como combustible. Para que esto resulte factible, es necesario seguir llevando a cabo proyectos de investigacin enfocados al uso de cepas altamente eficientes en la produccin de etanol, como lo es Zymomonas mobilis, con capacidad de co-fermentar C5/C6, sustratos de fermentacin econmicos, inmovilizacin de clulas, y optimizacin de condiciones para que ocurra la fermentacin. REFERENCIAS 1. Triana Caranton, C.F. (2010). Produccin de etanol a partir de residuos provenientes del cultivo de caf. Universidad Nacional de Colombia sedes Manizales, Tesis de posgrado. 2. Arthur Harden, 1914, Alcoholic Fermentation .Ed. Longmans, Green and co 3. http://biolcchn.wikispaces.com/Fermentaciones

4. http://www.unac.edu.pe/documentos/organizacion/vri/cdcitra/Informes_Final es_Investigacion/Octubre_2011/IF_DECHECO%20EGUSQUIZA_FIPA/CAP ITULO%20N%BA%2002.pdf 5. Coton, M., Laplace, J. M., Auffray, Y., y Coton, E. (2005). Duplex PCR method for rapid detection of Zymomonas mobilis in cider. Journal of the Institute of Brewing, 111(3), 299-303 6. Tao, F, Miao, J. Y., Shi, G. Y., y Zhang, K. C. (2005). Ethanol fermentation by an acid-tolerant Zymomonas mobilis under non-sterilized condition. Process Biochemistry, 40, 183-187. 7. Wilkins, M. R. (2009). Effect of orange peel oil on ethanol production by Zymomonas mobilis. Biomass and Bioenergy, 33, 538-541. 8. Rogers, P., Davis, L., Pearce, J., y Peiris, P. (2006). Evaluation of Zymomonas-based ethanol production from a hydrolysed waste starch stream. Biomass and Bioenergy, 30, 809-814. 9. http://www.unac.edu.pe/documentos/organizacion/vri/cdcitra/Informes_Final es_Investigacion/Octubre_2011/IF_DECHECO%20EGUSQUIZA_FIPA/CAP ITULO%20N%BA%2002.pdf 10. J Swings and J De Ley. 1977. The biology of zymomonas. Bacteriol Rev. 41 (1). 1-46.