Veba 3: Razdvajanje proteina iz preparata lizata makrofaga SDS-PAGE elektroforezom.

Transfer proteina sa gela na membranu

Western blot analiza

Western blot analiza podrazumeva transfer biolokih uzoraka sa gela na membranu, kao i njihovu detekciju na povrini membrane. Naziva se jo i imunobloting, zbog toga to se za detekciju specifinih proteina na membrani koriste antitela. Specifinost antigen-antitelo reakcije omoguava da se u smei razliitih proteina detektuje ciljni protein. Transfer proteina sa gela na membranu vri se zbog toga to je sa membranom lake manipulisati, na membrani se moe precizno detektovati vei broj ciljnih proteina (zahvaljujui postupku stripovanja membrane), a pored toga proteini koji se nalaze adsorbovani na membrani mnogo su dostupniji za reakciju sa antitelima (imunodetekciju) od proteina koji se nalaze u gelu. Prvi korak u Western blot proceduri je razdvajanje makromolekula iz smee, korienjem gel elektroforeze. Nakon elektroforeze razdvojeni molekuli se prenose na sekundarni matriks (nitrocelulozna ili PVDF membrana). Sledei vaan korak u Western blot analizi je tzv. blokiranje membrane u cilju onemoguavanja nespecifinog vezivanja antitela za povrinu membrane. Nakon toga proteini se inkubiraju sa antitelom (tzv. Primarno antitelo), koje treba specifino da prepozna samo ciljni protein (protein iju ekspresiju ispitujemo). Zatim sledi inkubacija sa tzv. Sekundarnim antitelom koje ne prepoznaje ciljni protein, ve se vezuje za primarno antitelo. Sekundarno antitelo je kompleksirano sa enzimom koji omoguava detekciju ciljnog proteina na membrani. Nakon dodavanja specifinog supstrata, enzim koji je prikaen za sekundarno antitelo prevee ga u obojeni precipitat na membrani koji se moe detektovati kolorimetrijski. Postoje i druge metode detekcije, meu kojima je u najiroj upotrebi metoda koja podrazumeva upotrebu hemiluminiscentnog supstrata, koji u reakciji sa enzimom daje umesto obojenog produkta daje svetlosni signal, koji se moe detektovati pomou fotografskog filma. Bez obzira na tip supstrata koji se koristi, intenzitet signala uvek je u korelaciji sa koliinom ispitivanog proteina koja je prisutna na membrani. Zavisno od principa koji je u osnovi detekcije ciljnog proteina razlikujemo dva osnovna tipa:

1. Direktnu detekciju u kojoj je primarno antitelo koje se koristi za detekciju eljenog proteina obeleeno enzimom ili fluorescentnom bojom. Ova metoda se ree koristi. 2. Indirektnu detekciju tokom koje se najpre dodaje primarno antitelo, koje se vezuje za eljeni protein, a nakon toga sledi dodavanje sekundarnog antitela koje e se vezati za primarno. Za obeleavanje sekundarnog antitela u upotrebi su: biotin, fluorescentne probe (fluorescin i rodamin), kao i enzimi (horseradish peroksidaza (peroksidaza rena) i alkalna fosfataza).

SLIKA 1. Direktna (A) i indirektna (B) detekcija

Ispiranje membrane
Western blot analiza podrazumeva nekoliko koraka tokom kojih se vri inkubacija membrane sa razliitim imunohemijskim reagensima (primarno antitelo, sekundarno antitelo i sl.). Kako bi se obezbedilo uklanjanje vika ovih reagenasa i dobijanje jaeg signala neophodni su odreeni koraci u kojima sa samo vri ispiranje membrane. Ispiranje membrane mora biti adekvatno prilagoeno reagensima koji se koriste. Ukoliko je ispiranje nedovoljno ostaci primarnog i sekundarnog antitela mogu zaostati na delovima membrane na kojima se ne nalazi specifian protein, te time onemoguiti jasnu detekciju eljenih proteinskih traka. U literaturi se za opis ovakve membrane upotrebljava termin tamna pozadina ( tj. high bacground) koji potie od opisa fotografskog filma dobijenog razvijanjem date membrane, gde se na tamnoj pozadini nejasno razaznaju tamne proteinske trake. Usled prekomernog ispiranja membrane moe se desiti da se sa membrane isperu i antitela koja su se vezala za protein od interesa, to takoe vodi ka slabljenju signala.

Za ispiranje membrane mogu se koristiti razliiti puferi, ali najee su u upotrebi TBS (Tris Buffered Saline) i PBS (Phosphate Buffered Saline). U cilju to boljeg uklanjanja nespecifino vezanih antitela, puferu za ispiranje dodaju se deterdenti, najee 0,05% Tween-20.

Blokiranje membrane
Membrane koje se koriste u Western blot analizi imaju veoma visok afinitet za vezivanje proteina. Kako su antitela koja se koriste za detekciju eljenog proteina po svojoj prirodi proteini, to ostavlja mogunost njihovog vezivanja za samu membranu, na mestima gde nema proteina, ime se remeti stvarno stanje u detekciji proteina od interesa. Da bi se ovo izbeglo membranu je neophodno blokirati tj. blokirati sva nespecifina mesta na membrani, upotrebom proteina koji e se vezati za membranu, a nee interagovati sa primarnim i sekundarnim antitelom. Velik broj proteinskih supstanci koriste se za blokiranje membrane: od mleka, serumskih proteina (BSABovine serum albumine), pa sve do visoko preienih proteina.

Primarna i sekundarna antitela

Izbor primarnog antitela za Western blot analizu zavisie od antigena tj. ciljnog proteina koji elimo da detektujemo. Danas se veliki broj primarnih antitela za detekciju raznih proteina komercijalno proizvodi i moe se naruiti. Za Western blot analizu upotrebljavaju se kako poliklonalna, tako i monoklonalna primarna antitela. Poliklonalna antitela su jeftinija, mogu se bre proizvesti i veoma esto ispoljavaju visok afinitet za antigen. Monoklonalna antitela se smatrju efikasnijim zbog njihove uske specifinosti, istoe i stabilnosti. Izbor sekundarnog antitela pre svega zavisi od ivotinjske vrste koja je posluila kao domainski organizam za produkciju primarnog antitela. Npr. Ukoliko je primarno antitelo mije monoklonalno antitelo, sekundarno mora biti anti-mije antitelo (tj. antitelo koje specifino prepoznaje mija antitela), produkovano u bilo kom ivotinjskom organizmu, sem u mijem. Sekundarna antitela mogu biti produkovana u velikom broju domainskih organizama, esto se deava da antitelo koje je produkovano u jednom domainu ne zadovoljava uslove efikasne analize (npr. Daje visok background), te tada treba pokuati detekciju sa sekundarnim antitelom koje je produkovano u nekom drugom domainu.

Izbor sekundarnog antitela zavisi i od naina na koji elimo da ono bude obeleeno, a to je pre svega odreeno metodom i aparaturom koja nam je dostupna za detekciju. Mnogo razliitih molekula koji obezbeuju detekciju mogu biti konjugovani sa sekundarnim antitelom. Radioizotopi su u prolosti bili esto upotrebljavani, ali danas sve ree, pre svega zbog visoke cene, kratkog roka upotrebe, i posebnog i zahtevnog naina rukovanja njima. Danas su ee u upotrebi: biotin, fluorescentne probe (fluorescin i rodamin), kao i enzimi (horseradish peroksidaza (peroksidaza rena) i alkalna fosfataza). Fluorescentne probe (fluorescin i rodamin) zahtevaju nekoliko dodatnih koraka i posedovanje specifine opreme za detekciju signala (aparature za merenje nivoa fluorescencije), stoga se danas za obeleavanje sekundarnog antitela najee koriste enzimi. Na dananjoj vebi mi emo upotrebiti sekundarno antitelo koje je obeleeno peroksidazom rena (horseradish peroksidase (HRP)). HRP je protein od 40 kDa koji katalizuje oksidaciju supstrata, u prisustvu vodonik-peroksida, pri emu kao produkt nastaje obojeno ili fluorescentno jedinjenje ili emisija svetlosti- kao sekundarni produkt reakcije. Koji od ovih produkata e nastati u reakciji sa HRP zavisi od supstrata koji se upotrebljava za detekciju, a sa kojim enzim treba da odreaguje. HRP optimalno funkcionie pri neutralnoj pH vrednosti pufera i moe biti inhibisana cijanidima, sulfidima i azidima. Velika upotreba HRP u obeleavanju sekundarnih antitela proizilazi pre svega iz njene visoke stabilnosti, niske cene i velikog broja razliitih supstrata za ovaj enzim.

Supstrat
Supstat za enzim kojim je obeleeno sekundarno antitelo moe davati obojeni produkt ili emisiju svetlosnog signala (hemiluminiscenciju), koja je proporcionalna sadraju ispitivanog proteina na membrani. Na ovoj vebi detekciju emo vriti hemiluminiscencijom, reakcijom enzima HRP sa supstrstom luminolom. Luminol je jedan od najee korienih hemiluminiscentnih reagenasa, koji tokom reakcije oksidacije, u prisustvu vodonik-peroksida dovodi do nastanka 3-aminoftalata, produkta koji se nalazi u ekscitovanom stanju. Prelaskom u nie energetsko stanje ovaj produkt emituje fotone svetlosti, koji se mogu detektovati pomou fotografskog filma.

SLIKA 2. Reakcija HRP sa luminolom

Stripovanje membrane
Membrana koja je upotrebljena za analizu nekog ciljnog proteina, moe se ponovo upotrebiti za detekciju nekog drugog proteina od interesa, zahvaljujui postupku stripovanja membrane. Stripovanje membrane podrazumeva njeno izlaganje takvim uslovima sredine koji e sa nje ukloniti supstrat (produkt), primarno i sekundarno antitelo, pri emu membrana dospeva opet u isto stanje u kojem se nalazila nakon skidanja sa transfera (tj. na njoj se nalaze samo proteini koji su se preneli sa gela). Uslovi kojima se membrana izlae u cilju stripovanja su: kombinacija raznih deterdenata, redukujuih agenasa, visokih temperatura ili niske pH vrednosti sredine.

Uputstvo za eksperimentalno izvoenje Western blot analize

Po zavrenom transferu membrane su isprane 3 puta po 10 min u 1xTBS puferu (prilog 1) i ostavljene na 4C do momenta korienja na dananjoj vebi. Membrane uvek ispirati u poloaju u kom je strana membrane koja je bila prislonjena uz gel okrenuta na gore i uz blago meanje na horizontalnoj mealici uz povremenu zamenu pufera. Nakon prve ture ispiranja (od prethodnog puta) potrebno je izvriti blokiranje membrana u cilju spreavanja vezivanja primarnog antitela za nespecifina mesta na samoj membrani. Blokiranje traje 2 h na sobnoj temperaturi u 5 % rastvoru mleka u TBS puferu sa 0.1 % Tween-om (TBS+Tween pufer). Sledi ispiranje membrana 3 puta po 10 min u 1x TBS+Tween puferu. Ovako pripremljene i blokirane membrane spremne su za inkubaciju sa primarnim antitelom specifinim za protein koji ispitujemo. Primarno monoklonalno antitelo na protein od ~130 kDa za inducibilnu azot-oksid sintazu (iNOS) razblaiti u odnosu 1:2500 u 5 % rastvoru mleka u 1xTBS puferu sa 0.1 % Tween-om (TBS+Tween pufer). Zatim ga inkubirati sa membranom 1h na sobnoj temperaturi uz sporo meanje na horizontalnom ejkeru. Po inkubaciji sa primarnim antitelom membrane isprati 4 puta po 15 min u 1xTBS+Tween puferu kako bi se uklonila nevezana primarna antitela, nakon ega sledi inkubacija sa odgovarajuim sekundarnim antitelom (anti-miije za monoklonalno iNOS). Sekundarno antitelo se razblauje odnosu 1:10000 u 5 % rastvoru mleka u TBS puferu sa 0.1 % Tween-om (TBS+Tween pufer) i inkubira na sobnoj tempereturi 1 h. Ono nije specifino za ispitivane proteine, ve se specifino vezuju za odgovarajue primarno antitelo. Konjugovano je sa peroksidazom rena koja e omoguiti kasniju vizuelizaciju proteinskih traka u reakciji sa odgovarajuim supstratom. Vizuelizacija i analiza Nakon reakcije sa sekundarnim antitelom membrane ispirati 4 puta po 15 min u 1xTBS+Tween puferu u cilju uklanjanja nevezanog sekundarnog antitela, a potom inkubirati 5 min sa supstratom za reakciju detekcije luminolom (1:1). Reaktivne trake se vizuelizuju upotrebom kita baziranog na luminolu (Pierce, Rockford, IL), a reakcija se detektuje sistemom poveane hemiluminiscencije koristei rentgenski film. Film izloiti

membranama, nakon ega ga je neophodno potopiti u razvija 1 min, pa u fiksativ 1 min i na kraju ispirati u vodi. Detekciju odgovarajuih proteinskih frakcija vriti na osnovu proteinskih markera poznatih molekulskih masa u rasponu 4-250 kDa (SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standard, Invitrogen; http://labs.mmg.pitt.edu/gjoerup/seeblueplus2.pdf. ).

Stripovanje membrane i detekcija -aktina Kako bismo membrane koje su ve upotrebljene za detekciju iNOS proteina upotrebili za detekciju -aktina neophodno je da prethodno budu stripovane kako bi se sa njih uklonila sva vezana antitela. Stripovanje vriti tako to se membrane postave u pufer za stripovanje (prilog 2) i izloe temperaturi od 55 0C u trajanju od 30 minuta, pri malim oscilacijama u shaker vodenom kupatilu. Nakon toga membrane ispirati 6 puta po 15 minuta u 1xTBS puferu uz konstantno meanje na horizontalnoj mealici. Zatim nastaviti sa standardnom procedurom Western blot analize koja je prethodno opisana, a koja podrazumeva najpre blokiranje membrane, a zatim inkubacije sa odgovarajuim primarnim i sekundarnim antitelom i ankraju detekciju sledeeg ciljnog proteina.

ZATO -AKTIN ??? Ekspresiju proteina koji nas interesuje (iNOS) trebamo da izrazimo relativno u odnosu na neki protein koji se ekspresuje podjednako u svim elijama (obino neki gradivni protein ). Ukoliko smo na prethodnim vebama (nakon Bradfordove metode) ujednaili koncentraciju proteina u svim uzorcima, onda oekujemo da na slici proteinske trake za -aktin budu jednake. U tom sluaju golim okom moemo da odredimo da li na slici koja pokazuje stanje iNOS-a u uzorcima postoje efekti. Ukoliko proteinske trake za -aktin nisu jednake postoje kompjuterski programi kojima moe da se izrazi gustina traka, kako za -aktin, tako i za iNOS. U tom sluaju stanje iNOS-a u odreenoj eliji (uzorku) moe relativno da se izrazi u odnosu na -aktin, te se moe prosuditi da li u datom uzorku postoji efekat na iNOS ili ne.

PRILOG 1 : Sastav pufera za Western blot (tris buffer solin-TBS)

TBS 10x 60.57 g Tris-HCl 88.25 g NaCl na 1l dH2O podesiti pH na 7,4 Radni pufer TBS 1x 100 ml TBS 10x 900 ml dH2O (autoklavirana) Radni pufer TBS 1x Tween 100 ml TBS 10x 900 ml dH2O (autoklavirana) 1 ml Tween-a

PRILOG 1 : Sastav pufera za stripovanje membrana (Striping buffer)

U 500 ml dH2O (autoklavirane) dodati: 7.56 g Tris-HCl 100 ml 20% SDS rastvora 7 ml -merkapto etanola Dopuniti do 1000 ml sa dH2O (autoklaviranom)