核磁共振波谱及其

核磁共振波谱
在
生物学中的应用
2003 年 9 月 4 日
 联系方法

生命科学学院结构生物学实验室
施蕴渝 3607464 yyshi@
ustc.edu.cn

牛小刚
 教材

核磁共振原理及其在生物学中
的应用 夏佑林，吴季辉
，施蕴渝
学习方式
上课，阅读，作业，
• http://www.cis.rit.edu/htbooks/nmr/nmr-main.
htm
• http://www.ch.ic.ac.uk/local/organic/nmr.html
• http://www.spincore.com/nmrinfo/
 在大规模测序完成后
蛋白质科学成为新的科学
前沿
蛋白质是生物学功能
的主要承担者
"Proteins are central to our
understanding of cellular function
and disease processes, and without a
concerted effort in proteomics, the
fruits of genomics will go
unrealized."
Nature 409, 747
(2001)
基因组研究为蛋白质科学研
究创造了前所未有的机遇
人类：
约 3-4 万个基因

大约 10 万个蛋白

发现新蛋白 , 测定新结构 , 揭示新

功能
蛋白质组学
活细胞水平上生物学功能
分子机制
创新药物 的研 究的 基础

现有 483 个药物分子靶标
，在未来结构基因组学研
究中可能扩大 10-20 倍。
PDB Holdings List: 2-Sep-2003

Molecule Type
Proteins,
Protein/Nu
Peptides, Nucleic Carbohy
cleic Acid total
and Acids drates
Complexes
Viruses
E X-ray
x Diffracti
17415 841 689 14 18959
p on and
. other
T
e
NMR 2737 93 540 4 3374
c
h
.
Total 20152 934 1229 18 22333
• 在日本第三代同 射光源
Spring-8 同 射工厂已于
1997 年 10 月建成，其中有 4 条结
构生物学光束线， 2 条结构基因
组专用光束线。
 RIKEN NMR Park
规模化的核磁实验室
900 MHz x 4
800 MHz x 6
600 MHz x10
进一步 发
展为 40 台
蛋白 质三维 结构 测定的 主要方
法
• X- 射线晶体衍射 ，
• NMR
• 电镜三维 重构

• 交叉学科
 核磁共 振波谱技 术
• PDB 数据库中 15- 20 % 结构
由 NMR 测定
• PDB 数据库 中， NMR 测定的 结
构 75% 无晶体 结构
• 精度相 当 2.0-2.5 A 的晶体结
构
• 最大 MW 30KD 260 个残基
• 预期上限 60~70 KD
• 发展迅 速 , 国际上给 以极大重
 生物大分子的复杂性
推动核磁共振波谱学的发展
• 19 46 年， Purc ell 和 Bl och 观察到
核磁共振现象。 于 1952 年获得 诺贝尔
物理奖
• 1945 -1951 年间， 化学位移和 自旋偶
合的发现， NM R 技术的化学 应用。
• 1953 年 世界上第一 台商品化 NM R
谱仪 .
• 1964 年 世界上第一 台超导磁场 的
NMR 谱仪
• 1971 年 世界 上第一台脉 冲傅立叶变 换
NMR 谱仪
 NMR 在生物分子中的应用
• 开始于 50 年代
• 困难
•1976 年 R.R.Ernst 发表了二维核磁共振的理
论和实验的文章。获得 1991 年诺贝尔化学 奖
• 1979 年开始瑞士 K.Wuthrich 发展了用核
磁共振波谱测定生物大分子溶液结构的
方法首先将 2D-NMR 的方法用于蛋白质，
1982 年发表了用 2D-NMR 对蛋白质 1H 谱
进行分析的系统方法。
• 1998 年提出 TROCY 方法， 2002 年获诺
贝尔化学奖 Th e 200 2 Nob el Pr ize
in C hemis try:
 600MHz TXI 1H{13C/15N} with Z-gradient

2D NOESY
0.5 mM Lysozyme
90% H2O
10% D2O
50 mM NaCl

56 min.
 多维 异核核 磁共 振
• 90 年代
• 13 C, 15 N 标记 , 多维异核核磁
共振波谱
• 2D NMR < 100 个残基
• 3D,4D NMR 15~35 KD
• 相当 2.5A 分辨率晶 体结构
•
•
多维 NMR

CBCA(CO)NH triple
resonance spectrum of 2mM
RNase T1 in
90% H2O taken with
a 600MHz Triple Resonance
1
H{13C/15N} NMR CryoProbeTM
with Z-gradient. Experiment
time for the full 3D spectrum
was 3.8h and 2 scans were
accumulated for each
increment. The experiment
time for the first 1H,13C plane
of the CBCA(CO)NH
experiment was 6min.
 生物大分子核磁共振技术
不断发展
核自旋体系演化的密度算符理论
新的实验方法 , 新的脉冲序列
样品制备技术 , 标记技术
计算生物学 , 生物信息学
 90 年代末结 构基 因组学
对 NMR 技术提 出新 的要求
1. 快速 测定蛋白质 的三维结构
2. 分子 识别 , 测定复合物 的三维结构
蛋白质 - 蛋白质
蛋白质 - 核酸
蛋白质 - 配基
3. 分子 柔性与运动 性
4. 膜蛋 白
新实验方法
生物样 品新 的标记 方法
• 13C/15N/ 2H 标记 蛋白质
• 13C/15N/ 标记 DNA 和 RNA
• 选择 性标记
• 自旋 标记
Residual dipolar couplings 实
验
有希望用较少的实验数据
快速解出蛋白质结构
residual dipolar couplings 实验

Residual dipolar 
couplings are 
proportional 
to (3 cos2 θ ­1)

The additional information from magnetic

interactions in partially aligned molecules
allows the alignment of parts of the
structures that are not well constrained by
NOEs.0

J. H. Prestegard Nature Stuctural Biology, NMR II Special Issue. 1998
TROSY 实验
transverse relaxation
optimized spectroscopy
CRINEPT 实验

分子量 极限 被突 破
250kD
Line Width vs Frequency in TROSY

τ c (ns) Mr
320 800,000
60 150,000
20 50,000

dN-H 0.104 nm
HSQC vs TROSY, Aldolase (78 kDa, 1 mM !)
 Through Hydrogen Bonding

Cross-hydrogen bond 3hJCO,N coupling constant:

Correlation between 3hJCO,N coupling constant value

and the hydrogen bond length, RNO:

RNO = 2.75 -0.25ln(3hJCO,N)+-0.06

3h
JCO,N coupling constants give valuable additional
information for a structure refinement
90 年代末核磁共振波谱技术的
新进展
高场超 导核磁谱仪 的使用

900MHz
• 800MHz
 高磁 场谱仪

分 辨 率: ∆ ω ∝ ∆a (B0)

灵 敏 度: S/N ∝ γ 5/2

(B0)3/2

 磁各向异性 : m ∝ (B0)2

弛 豫 率 : R1,2 ∝ f (B0)
NMR Sensitivity & Dispersion

1
H freq. 0.1% EB Resolution Price
S/N CH2 ($)

600MHz 1200:1 1.00 800k

700MHz 1512:1 1.17 1,400k

800MHz 1847:1 1.33 2,000k

900MHz 2110:1 1.50 4,500k

低温 探头 CryoProbe
30K
Sensitivity 500MHz ~1-1.5GHz
节约测量时间
低样品浓度
 Experiment Time Comparison

a) sensitivity specification for standard TXI 5mm,

0.1% ethylbenzene:

500MHz: 900:1
b) sensitivity specifications for CryoProbeTM TXI 5mm,
0.1% ethylbenzene:

500MHz: 3000:1
600MHz: 4000:1
800MHz 6000:1
c) relation between experiment time and sensitivity*:

experiment time = (SNCryoProbe/SNstandard probe)2

* assuming ideal conditions
 Experiment Time Comparison

Experiment times: Comparison conventional versus

CryoProbes

2.8%
800MHz

6.3%
600MHz CryoProbe
Conventional Probe
11%
500MHz

0 20 40 60 80 100 %
Automated structure
analysis
生物大分子 NMR 能提供什
么重要信息
NMR 在生物大分子上的应用

• 蛋白 质三维 结构 测定 , 原子
分辨 率下的 结构 与功能 研
究
• 分子 柔性与 运动 性
• 复合 物结构 测定 , 分子识 别
• 膜蛋 白
核磁共振基本原理 - 引言
吴季辉

核磁共 振在 生物科 学
中的 主要应 用
•测定生 物大分 子空 间结构
•研究生 物大分 子与 配基的 相互 作用
•测定生 物大分 子的 动力学 性质
•跟踪蛋 白质的 折叠 过程 , 捕获折 叠过程 中瞬
态中间 物
•测定可 滴定基 团的 解离常 数
•测量溶 液中分 子的 扩散系 数
•研究酶 反应机 理
•跟踪活 细胞的 代谢 过程
•用于医 学成像 以及 神经科 学中 的脑功 能成 像
 膜蛋 白
• 受体，离子通道 药物 作用靶点
• PDB 数据库 中 < 30 个膜蛋 白 ,
• ~160 00 水溶性蛋
白
•人 ~360 00 个基因
• ~10 万个蛋 白质
• 真核细胞中 ~3 0% 膜蛋白
• < 0. 2% 膜蛋白结
 膜蛋白 结构
• 蛋白质晶体学 , 电镜三维重构
• NMR 小肽 <50 残基 , 蛋白质
• 在去垢剂形成的微胶囊 (micelles) 中 , 液
体 NMR
• 在去垢剂或脂形成的双层微胶囊
(bicelles) 中 , 液体 NMR
• 在脂形成的脂双层 (bilayers),
• 固体 NMR
 蛋白质动 力学
• 蛋白质 运动性和功 能有密切关 系
• 酶的柔性运动性 与酶反应机 理
•
• NM R 弛豫时间
• 1
H/ 2 D 交换速率
 药物设计 和筛 选

• 高通量筛 选

• 设计，筛 选结合
•SAR － By-NM R 药物筛
选
药物设计 和筛 选
核磁共振基本原理 - 引言
吴季辉

蛋白质 折叠 –去折 叠研究

• Schematic diagram summarizing the roles of unfolded, partially

folded proteins, and misfolded proteins in biology.
核磁共振基本原理 - 引言
吴季辉

捕获折 叠过程中瞬 态中间物

 用 NMR 连续监 测蛋白质复 性过
核磁共振基本原理 - 引言
吴季辉

• Stopped-flow 19F NMR spectra of the refolding of 6-19F-tryptophan

labeled Escherichia coli dihydrofolate reductase following dilution from
5.5 to 2.75 M urea at 5 °C in the presence of 3.8 mM NADP+
核磁共振基本原理 - 引言
吴季辉

平衡常数 测量
A + B ←
k ,k
→ AB
1 −1
 围棋高级认知功能的 fMRI 研究

1. 围棋 - 高级智能 中华 文化 瑰宝 2. 专业棋 手 - 高级智

能学习
3. 围棋 - 象棋比 较 : 为人工 智能提 供启示
国际象 棋：计 算 机 - 战胜 - 世界 冠军
围　　 棋：业 余棋 手 - 战胜 - 计 算 机

反射
镜

BLANK 30sec RANDOM 30sec GAME 30sec

 BOLD signal time course in left and right BA7 Left
Right
6

BOLD signal change (%)

4
2
0
-2
-4
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360
Time (s)

A. ( 上 ) 围棋 B. （下） 国际 象棋的 fMRI 结果

围棋 与国际 象棋 的区别 ：较 强的激 活 围 棋 - 右侧， 国际 象棋 - 左侧。
有证 据表明 : 右半球 参与整 体水 平加 工 . 本结果 提示 ：
围棋 -- 更依赖于 - 整体 水平 加工， 国 际象 棋 -- 更注 重于 - 局部计 算。
 Genome, Proteome,
Metabolomics, Systems Biology
核磁共振基本原理 - 引言
吴季辉

核磁共振 现象

•核磁共振（ Nuclear Magnetic Resonance ，

简写为 NMR ），是指核磁矩不为零的核，
在外磁场的作用下，核自旋能级发生塞曼
分裂（ Zeeman Splitting ），共振吸收某一
特定频率的射频（ radio frequency 简写为
rf 或 RF ）辐射的物理过程。
核磁共振基本原理 - 引言
吴季辉

核磁矩与磁 场的相 互作用

1
H,13C,15N 等核自旋量子数 I=½, 在外磁场中有两种取
核磁共振基本原理 - 引言
吴季辉

核磁 能级间 的跃 迁
核磁共振基本原理 - 引言
吴季辉

乙醇 CH 3 CH 2 OH 的 1H 谱