核磁共振基本原理 10

讲
吴季辉

核磁 共振原 理及 其在
生物学中 的应 用

第九章 二维磁 共振波谱基 本原

理
§ 9.1 — § 9.4
核磁共振基本原理 - 引言
吴季辉

蛋白质的 1H 谱

蛋白质的第一张 1H 谱 ( 核糖核酸
酶, 40MHz), 记于 1957 年 2.0 mM Rnase T1 的 900MHz 1H
[Adapted from Jeremy N.S.Evans 谱
(1995) Biomolecular NMR
Spectroscopy. p.3, Oxford University
核磁共振基本原理 - 引言
吴季辉
核磁共振基本原理 - 引言
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1
H- N 异核二 维相 关谱
15
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二维 NMR
• 比列时的 Jeener 于 1971 年提出二维 NMR 的思想
• 瑞士的 Ernst 对二维 NMR 进行了深入研究，于
1976 年用量子统计的系综理论对二维 NMR 原理进
行详尽的理论阐述， 1983 年又提出乘积算符理论
，大大简化了脉冲序列的分析。由于在 PFT-NMR 及
2DNMR 二方面的贡献而获得 1991 年诺贝尔化学奖
• 瑞士的 Wüthrich 首先将 2D-NMR 的方法用于蛋白
质，发展了将 2D-NMR 和距离几何结合得到蛋白
质在溶液中的空间结构的方法 ，第一个用 NMR
方法解析出蛋白质的空间结构。获得 2002 年诺贝
核磁共振基本原理 7
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同核去耦
图 (a) 是正常氢谱，
它是很复杂的，因
为它属于 ABCX3 体
系。图 (b) 是把去耦
场频率设置在 CHO
峰上，此时谱就变
成 ABX3 体系。图
(c) 是把去耦场频率
设置在 CH3 峰上，
这时谱就简化为
ABC 体系。图 (d)
是用两个去耦场，
分别对准 CHO 与
CH3 共振照射，这
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谱编辑
按 CHn 中 n 的奇偶性将碳分类
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二维谱举 例一 ： COSY
NOE
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二维谱举 例二 ： NOESY
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二维谱举 例三 ： HSQC
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二维谱的 优点

• 交叉峰包含的信息比普通一维谱丰富得多
• 引入另一个频率变量，使原来拥挤在一个线段
上的密集谱线，可以分散在一个平面上，提高
图谱的分辨率
• 实验方法灵活多样 ，被称为“自旋工程”
(Spin engineering)
• 可以间接检测到在普通一维 NMR 实验中检测
不到的跃迁，如多量子跃迁
二维核磁共振波谱的基本思想

F(t1) FT F(ω1)

t1

FT FT
F(t1,t2) F(ω1, ω2)

t1 t2
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二维核磁共振波谱的基本思想

• 二维 NMR 实验在时间域上可分为四个时
期
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2D-FID
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• 记录的是时间域的二维信号 S(t1,t2) ，经二维

Fourier 变换即得频率域的二维核磁共振谱 S(ω1,ω2)
记录二维谱时，实际上是记录一个二维数据矩阵，
t1 维的点数为 n1 ， t2 维的点数为 n2 ，总的数
据点为 n1*n2 。
由于 t2 维的 n2 数据点是在同一个 FID 中记录的
，其点数的增加只是导致记谱时间增加这些点对应
的采集时间；而 t1 维的 n1 数据点表示需要记录
n1 个 FID ，其点数的增加需要整个脉冲序列以及
序列前的弛豫延迟的完整重复，因此记谱时间与
n1 成正比。通常记录二维谱时， t2 维的点数可
以取得稍大一些，而 t1 维的点数不宜太大，以免
记谱时间过长。所以通常二维谱的 t2 维的数据分
辨率高于 t1 维的数据分辨率。
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堆积图 方式 表示的 二维谱

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等高线图 方式 表示的 二维谱

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二维谱的 线形

二维谱需要设计特殊的相位循环才能得到纯吸收谱，通常称
为相敏谱，方法有 TPPI ， State ， State-TPPI ，等等
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同核 化学 位移 相关谱
同核化学位移相关谱就是通过同核 1H-1H 之间的
J 耦合或 NOE 来建立核与核之间的联系的 NMR
谱，常见的有：
COSY ( 又分为相敏 COSY 和幅度 COSY)
DQF-COSY
E-COSY
TOCSY
NOESY
ROESY
 COSY

乙醇
CH 3 CH 2 OH 的
COSY 谱
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相敏 COSY
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对角峰与交叉峰相位相反
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NH-CHα

CHβ CHβ

复杂的自旋体系将产生进一步的自旋分裂
交叉峰对应的两个质子间的耦合称为主动耦合，在 COSY 谱
上形成反相裂分
交叉峰对应的质子同其他质子间的耦合称为被动耦合，在
COSY 谱上形成同相裂分
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XM

AX XM

XA 几种自旋系统的相敏 COSY 交叉峰的精细结

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DQF-COSY
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DQF-COSY 的对角峰
与其交叉峰一样也是
正负交替的纯吸收峰
，因此 DQF-COSY 对
角线附近的谱峰结构
比相敏 COSY 和幅度
COSY 好得多，适合
于观察对角线附近的
交叉峰，也可用来测
量 J 耦合常数 。另外
由于 DQF-COSY 只允
许双量子信号通过，
而水中的两个质子是
磁等性核，不可能转
换成双量子，因而水
峰的干扰小
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反相谱的 特点
相敏 COSY ， DQF-COSY ， E-COSY 等属于反相谱，其
峰型是正负交替的，数据采集时的数据分辨率要求较
高，以免正负两部分的信号产生部分重叠，而使信号减
弱。这对于 t2 维一般不成问题，但 t1 维则不然：因为实
验时间与 t1 维点数成正比

数据分辨率对裂分的影响 线宽对裂分的
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TOCSY

COSY 的交叉峰表明二个质子之间有 J 耦合，而

TOCSY 的交叉峰表明二个质子同属一个自旋系统
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COSY 谱（不 考虑 其精 细结
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构）

(a) 一个三自旋体系 AMX ; (b) 两个三自旋体系 AMX 、 A′M

′X′
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TOCSY 谱

(a)AMX 体系， (b)AMX 和 A'M'X' 体

系
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TOCSY 是同相谱，可提供整个自旋体系的连接，而且
信号强，对于谱峰证认很有用
异核谱
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磁化
磁化 ( 向量 ): 单位体
积中 某种核 的磁 矩的
总和
<Iz>=(P1-P2+P3-P4)/2
<Sz>=(P1+P2-P3-P4)/2
( 自旋 ) 极化 : 核自 旋在磁 场中 形成的 不同 能级
上的布 居数 之差
I 核的 极化 = P1-P2= P3-P4 ∝ γ I
S 核的 极化 = P1-P3= P2-P4 ∝ γ S
 极化
( 自旋 ) 极化 : 核自旋 在磁
场中形 成的不 同能 级上的 布
居数之 差
I 核的 极化 = P1-P2= P3-P4 ∝ γ I
S 核的极 化 = P1-P3= P2-P4 ∝ γ
S

观察到 的核磁 信号 正比于 该

核的极 化
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极化转 移
若对 I 核施 加一个 选
择性 180 度脉 冲 , 使能
级 1 和 2 的布 居数反
转
S 核的磁 化不变 , 但是极化 发生 变化 : 由于 一种
核的极 化改变 导致 与之耦 合的 其他核 的极 化改变
，这种 现象称 为极 化转移
S 核的极 化 = P1-P4≠ P2-P3
现在 2-4 能级跃 迁的信 号强 度正比 于 P1-P4 ∝ γ S+ γ
I
原来 2-4 能级跃 迁的信 号强 度正比 于 P2-P4 ∝
核磁共振基本原理 9

INEPT 实验
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(in se nsit iv e nu clei e nh an ced by p ol ariz at io n

tran sf er)

•脉冲序列中 未
注明的 脉冲相
位均为 x 方向
∀τ=1/4JCH

90º 脉冲后 时间 后 180º 脉冲作用于 H 后 180º 脉冲作用于 C

后 回波
 质子能级粒子
1
H
数翻转增强碳
τ=1/4JCH
13 信号
α
90°
τ

β β
β 180°
β
90°
τ

α
α
α
• 对质子加回波序 列 , 演化中期 , 质子
脉冲的作用，确 保第二个 /2 脉冲前
化学位移的影响 已被消除 ( 自旋回波 )

• 在质子 脉冲的同时 , 加碳 脉冲 , 使
碳核自旋符号反 转 , 确保不同自旋态 的
质子不被会聚

• 最后一个 /2 脉冲使质子能 级粒子数

反转 , 使碳 13 纵向磁化矢 量变为横向 磁
化矢量以便检测
γ H/ γ C=4/1 现在 2-4 能级跃 迁的信 号
P1-P4 ∝ γ S+ γ I 强度正 比于 P1-P4 ∝ γ S+ γ I
P2-P4 ∝ γ S 原来 2-4 能级跃 迁的信 号
强度正 比于 P2-P4 ∝ γ S
(P1-P4)/ (P2-P4 )=5/1
P2-P3 ∝ γ S - γ I 现在 1-3 能级跃 迁的信 号
强度正 比于 P2-P3 ∝ γ S - γ I
P1-P3 ∝ γ S
(P2-P3)/ (P1-P3 )= － 3/1 原来 1-3 能级跃 迁的信 号
强度正 比于 P1-P3 ∝ γ S
CH 二重峰 5 －3
实际应用中第二个脉冲相位在 +y 和－ y 之间交替
消除天然磁化的贡献
5 －3
)1 1
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INEPT 谱线峰型
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INEPT 类型实验的优 点

•检测 灵敏度增强 （ H
/γ 13C ≈ 4
倍）
•脉冲序列前的弛豫恢复间隔时间
由 H 的弛豫时间而不是 C 的弛豫
时间决定，因而 减少实验时间
•脉冲序列经过修改后可以进行 谱
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异核化 学位 移相关 谱：
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HSQC

1
H （ I 核）信号通过 INEPT 序列极化转移到 S 核（如 13C 或
15
N ），进行时间标记，然后再通过极化转移传回 1H ，进行
检测
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异核化 学位 移相关 谱：
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HMQC

HMQC 谱提供的信息与
HSQC 类似，出现交叉峰
表明二个核通过单键耦合
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异核化 学位 移相关 谱：
HMBC

HMBC 主要用于获得碳
－氢间的远程耦合信息
同核谱与异核谱
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NOESY
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NOESY 是通过 NOE 效应来建立核与核之

间的联系的， NOESY 的交叉峰表明二个
质子之间有足够强的 NOE 效应，由交叉
峰强度可得出核与核之间的距离
•通常二个质子之间的距离不大于 5Å 时才
可能观测到 NOE 效应
NOESY 谱及其变化（如异核编辑
NOESY 谱）是生物大分子结构测定最重
要的核磁实验之一
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NOESY 的谱形 , • 表示正峰 , ο 表示负

峰
NOE 增强因子 η
I z , ss − I Z ,ref σ IS S 0
η ss = = z
I Z ,ref ρI I 0
z

S z0 S ( S + 1) γ s
=
Iz0
I ( I + 1) γ I
1
I =S=
2
σ IS γ s W2 − W0 γs
η= =
ρ I γ I 2W1 + W0 + W0 γ I
I
 小分子

τR∼10-10-10-12s 满足极窄条件
ω < 7*109rad/s
2
(ω I + ω S )τ R << 1
K
W0 = 6
2τR
20r
K2 1 γs
W1 = 3τR η=
2γI
6
20r
K2
W2 = 6
12τR
20r
 γ(T•s)-1
1
H 2.67*108
13
C 6.73*107
15
N -2.71*107

同核时，
=1/2

照射质子，观察碳 13C η= 1.988

照射质子，观察 15N η=
-4.932
 生物高分子
极窄条件不再满足：
5 + ω 2τ R2 − 4ω 4τ R4
η=
10 + 23ω 2τ R2 + 4ω 4τ R4
η
0 .5

ωτR<0.1 η=0.5 0
ωτR>10 η=-1
ωτR=1.118 η=0 - 0 .5

-1
-2 -1 0 1
lo g ω τ R
NOE 受邻近核的影响
照射质子 B, 质子 A 的 NOE
增强远大于质子 C 的 NOE
增强 ,
原因：质子 C 周围有质子 D,
与它有驰豫

多自旋 系统

ρIX 与其它核的驰豫，

ρ* 其它驰豫机制
直接 NOE 间接 NOE
自旋扩散
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•混合时间 m
不宜过长，否则将出现自旋扩散。一
般来说，对于分子量在一万以下的蛋白质的 NOESY
实验， m=150-200ms ；而对于分子量超过一万的蛋
白质的 NOESY 实验， m<150ms 。若 m 过长，有
些峰的强度将下降。这就是由于纵向磁化经第二个核
，进一步转移给第三个核，即自旋扩散所导致的。此
时 NOESY 谱将出现一些新的峰，这些峰就是由于自
旋扩散而产生的假峰。从这些假峰不能得到正确的距
离信息
•核与核之间的距离的测量通常以亚甲基 CH2 的两个
质子的交叉峰强度作为参考。亚甲基 CH2 的两个质子
的距离为 1.75 Å ，通过交叉峰强度的对比，就可得出
任意质子间的距离
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ROESY
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•ROESY 谱特别适合于中等大小分子的质子
间的距离的测定
•不管分子量的大小，在旋转坐标系中二个
质子间的交叉弛豫速率总是正的 , 因而交
叉峰与对角峰符号相反，通常对角峰调成正
峰，而交叉峰为负峰
•与 NOESY 谱比较， ROESY 谱的干扰峰
较多，因此除非是小肽，一般的蛋白质结构
解析多用 NOESY 谱