Doenas genticas

Quadro terico Patologia geral Robbins As doenas genticas so muito mais comuns do que se acreditava. Estima-se que a frequncia de doenas genticas em indivduos vivos seja de 670 por 1000. Includos nesse nmero esto no s as doenas genticas clssicas mas tambm o cncer e as doenas cardiovasculares, as duas principais causas de morte no mundo ocidental. Ambas possuem componentes genticos importantes. As doenas cardiovasculares, como a aterosclerose e a hipertenso, resultam de interaes entre os gene e o meio ambiente, e, sabe-se agora, que a maioria dos cnceres resulta do acmulo de mutaes somticas (captulo 7). As doenas genticas encontradas na prtica mdica representam somente a ponta de um iceberg, que so aquelas com os erros genotpicos menos extremos, permitindo um desenvolvimento embrionrio completo e um nascimento vivo. Estima-se que 50% dos abortos espontneos nos primeiros meses da gestao tenham anormalidade cromossmica demonstrvel; isto , alm e vrios erros detectveis menores e muitos outros ainda alm do nosso alcance de identificao. Em torno de 1% de todos os recm-nascidos possui uma anormalidade cromossmica grosseira, e aproximadamente 5% dos indivduos com menos de 25 anos desenvolvem uma doena sria com um componente gentico significante. Quantas mutaes ainda permanecem escondidas? O rascunho da sequncia do genoma humano est completo e muito se aprendeu sobre a arquitetura gentica dos humanos. Algumas das coisas reveladas foram inesperadas. Por exemplo, sabemos agora que menos de 2% do genoma humano codifica para protenas, enquanto mais da metade representa bloco de cdigos de nucleotdeos cujas funes so misteriosas. O que foi totalmente inesperado foi que os humanos possuem meros 30.000 genes ao invs dos 100.000 preditos anteriormente. Muito extraordinariamente, esse nmero no muito maior que o de uma planta de mostarda, com 26.000 genes! Entretanto, sabe-se tambm que por splicing alternativo, 30.000 genes podem dar origem a mais de 100.000 protenas. Alm disso, estudos muito recentes indicaram que protenas completamente formadas podem ser cortadas e ligadas umas s outras para darem origem a peptdeos que no foram preditos na estrutura do gene. Os humanos no so to pobres, afinal de contas. Com o trmino do projeto genoma humano, um novo termo, chamado genmica, foi adicionado ao vocabulrio mdico. Enquanto a gentica o estudo de um nico gene ou de alguns poucos genes e de seus efeitos fenotpicos, a genmica o estudo de todos os genes do genoma e de suas interaes. Anlises de tumores atravs de micro-arranjos de DNA (microarrays; captulo 7) um exemplo do uso clnico atual da genmica. Entretanto, a contribuio mais importante da genmica para a sade humana ser no esclarecimento das doenas multi-fatoriais complexas que surgem da interao de mltiplos genes com fatores ambientais. Outras revelao surpreendente do progresso recente da genmica que, na mdia, dois indivduos quaisquer compartilham 99,9% das suas sequncias de DNA. Assim, a notvel diversidade dos humanos codificada em torno de 0,1% de nosso DNA. Os segredos da predisposio para doenas e da resposta a agentes ambientais e a drogas deve, ento, residir nessas regies variveis. Ainda que pequenas quando comparadas com a sequncia total de nucleotdeos, este 0,1% representa algo em torno de 3 milhes de pares de bases. A forma mais comum de variao no DNA no genoma humano o polimorfismo de nucleotdeo nico (SNP). Tipicamente, os SNPs so bi-allicos (i.e., somente duas opes existem para um dado local dentro da populao), e eles podem ocorrer em qualquer lugar no genoma dentro de xons, ntrons ou em regies inter-gnicas. Menos de 1% dos SNPs ocorre nas regies codificantes. Isso poderia, obviamente, alterar o produto gnico e gerar uma doena. Muito mais comumente, entretanto, o SNP somente um marcador que co-herdado com o gene causador da doena, devido proximidade fsica. Outra forma de expressar isso dizer que o SNP e o fator gentico esto em desequilbrio de ligao. Muito esforo est em andamento para construir mapas de SNPs do

genoma humano de forma que seja possvel decifrar os determinantes das doenas. Assim como a genmica envolve o estudo de todas as sequncias de DNA a protemica se preocupa com a medio de todas as protenas expressas em uma clula ou tecido. Atualmente, o progresso da protemica vem atrs do da genmica, porque a metodologia para identificar centenas de protenas distintas simultaneamente no est completamente desenvolvida, mas muito esforo continua sendo feito. Ainda que a genmica e a protemica estejam revelando um tesouro de informao, a nossa habilidade de organizar e extrair informao desse conjunto de dados to vasto no est completamente desenvolvida ainda. Para analisar padres de expresso envolvendo simultaneamente milhares de genes e protenas, necessitou-se do desenvolvimento paralelo de tcnicas computacionais que podem lidar com amplas colees de dados. Em resposta a isso, surgiu uma nova disciplina interessante chamada de bio-informtica. Isso envolveu bilogos, cientistas computacionais, fsicos e matemticos, um verdadeiro exemplo de uma abordagem multi-disciplinar na prtica mdica moderna. Muito desse progresso na gentica mdica resultou de avanos espetaculares na biologia molecular, envolvendo a tecnologia do DNA recombinante. Detalhes dessas tcnicas so bem conhecidos agora e no so repetidos aqui. Alguns exemplos, entretanto, do impacto da tecnologia do DNA recombinante na medicina merecem ateno: Base molecular das doenas humanas: duas estratgias gerais foram utilizadas para isolar e caracterizar genes envolvidos em doenas humanas. A abordagem da clonagem funcional, ou clssica, foi utilizada com sucesso para estudar uma variedade de erros inatos do metabolismo, como a fenilcetonria e as doenas da sntese de hemoglobinas. Comum a essas doenas genticas o conhecimento do produto gnico anormal e a protena correspondente. Quando a protena afetada conhecida, uma variedade de mtodos pode ser empregada para isolar o gene normal, clon-lo e no final determinar as mudanas moleculares que afetam o gene em pacientes com a doena. Como para vrias doenas mono-gnicas comuns, como a fibrose cstica, no existia pista sobre a natureza do produto gnico defeituoso, foi empregada uma tcnica alternativa chamada de clonagem posicional, ou de abordagem do gene candidato. Essa estratgia ignora inicialmente as pistas do fentipo e se guia pelo mapeamento do fentipo da doena a uma localizao cromossmica particular. Esse mapeamento facilitado se a doena for associada a uma mudana citognica reconhecvel (e.g., sndrome do X frgil) ou por uma anlise de ligao. Nessa ltima, a localizao aproximada do gene determinada pela sua ligao a SNPs ou a genes marcadores conhecidos que estejam prximos ao locus da doena. Uma vez localizado o gene mutante em uma regio de limites razoavelmente estreitos, o prximo passo clonar vrios pedaos de DNA do segmento relevante do genoma. A expresso do DNA clonado in vitro, seguida pela identificao dos produtos proteicos, podem ser utilizadas para identificar a protena aberrante codificada pelos genes mutantes. Essa abordagem foi usada com sucesso para diversas doenas, como a fibrose cstica, a neurofibromatose, a distrofia muscular de Duchenne (uma doena hereditria caracterizada por fraqueza muscular progressiva), a doena dos rins poli-csticos e a doena de Huntington. Alm dessa abordagem passo a passo, para clonar genes nicos, a anlise do micro-arranjo de cDNA permite a deteco simultnea de milhares de genes e de seus produtos de RNA. Quando tecidos normais e doentes so analisados dessa maneira, mudanas nos nveis de expresso de mltiplos genes podem ser detectadas, fornecendo, assim, um perfil mais compreensvel das alteraes genticas nos tecidos doentes. Produo de agentes humanos biologicamente ativos. Uma grande quantidade ultra-pura de agentes biologicamente ativos pode ser produzida em quantidades virtualmente ilimitadas pela insero do gene codificante em bactrias ou outras clulas adequadas em cultura de tecidos. Alguns exemplos de produtos de engenharia gentica atualmente disponveis incluem o receptor TNF para o bloqueio do TNF em tratamento da artrite reumatide,

ativadores do plasminognio tecidual para o tratamento do estado trombtico, o hormnio do crescimento para o tratamento de estados de deficincia, eritropoetina para reverter vrios casos de anemia e fatores mieloides de diferenciao e de crescimento (fator estimulante de colnias em granulcitos-macrfagos, fator estimulante de colnias de granulcitos) para elevar a produo de moncitos e neutrfilos em estados de baixa funo medular. Terapia gnica. O objetivo de se tratar doenas genticas por transferncia de clulas somticas transfectadas com o gene normal, mesmo que conceitualmente simples, ainda tem que melhorar para grandes escalas. Os problemas incluem desenhar vetores apropriados para carregarem o gene, alm das complicaes inesperadas que resultam da insero ao acaso do gene normal no genoma hospedeiro. Em casos recentes bem documentados, a terapia gnica em pacientes com SCID ligada ao X (imuno-deficincia combinada grave; captulo 6), que no possuem a cadeia comum gama dos receptores de citocinas, teve que ser interrompida porque o gene transduzido se inseriu prximo a um gene hospedeiro que controla a proliferao de clulas. A desregulao resultante deu origem leucemia de clulas T do paciente. Diagnstico de doenas. Sondas moleculares esto provando ser extremamente teis no diagnstico tanto de doenas genticas quanto no-genticas (e.g., infecciosas). A aplicao diagnstica da tecnologia do DNA recombinante est detalhada no final deste captulo. Esse pano de fundo de desenvolvimento da gentica humana nos permite classificar as doenas humanas em trs categorias: (1) aquelas determinadas pelo ambiente, (2) aquelas determinada geneticamente e (3) aquelas onde h influncia tanto de fatores ambientais quanto de genticos. A obesidade pode aparecer como sendo representativa da primeira categoria; entretanto, at aqui, com a descoberta de genes que controlam a saciedade e o metabolismo energtico (captulo 9), evidente que a super-nutrio e todas as doenas em maior ou menor grau condicionada pelo gentipo. Na terceira categoria acima mencionada se encaixam vrias doenas humanas importantes como a lcera pptica, a diabetes melito, a aterosclerose, a esquizofrenia, doenas auto-imunes e a maioria dos cnceres, onde claramente a natureza e a criao representam papis significativos. Est alm do alcance deste livro revisar as doenas genticas humanas normais. benfico revisar alguns conceitos fundamentais que sustentam o nosso entendimento das doenas genticas. Primeiro, entretanto, ns esclarecemos alguns termos comumente utilizados hereditrio, familiar e congnito. As doenas hereditrias, por definio, so derivadas de um dos genitores e so transmitidas na linhagem germinativa atravs das geraes e, portanto, so familiares. O termo congnito simplesmente significa nascido com. Algumas doenas congnitas no so genticas por exemplo, a sfilis congnita. Nem todas as doenas genticas so congnitas; pacientes com a doena de Huntington, por exemplo, comeam a manifestar a sua condio somente depois dos 20 ou 30 anos.

Mutaes
A mutao pode ser definida como uma mudana permanente no DNA. As mutaes que afetam a linhagem germinativa so transmitidas para a prognie e podem dar origem a doenas herdadas. As mutaes que surgem nas clulas somticas no causam doenas hereditrias, mas so importantes na gnese dos cnceres e de algumas mal-formaes congnitas. Baseado na extenso das mudanas genticas, as mutaes podem se classificadas em trs categorias. As mutaes genmicas envolvem perda ou ganho de cromossomos inteiros, dando origem a monossomias ou trissomias. As mutaes cromossmicas resultam do rearranjo do material gentico e do origem a mudanas estruturais visveis no cromossomo. As mutaes envolvendo mudanas no mero de cromossomos so transmitidas em baixa frequncia porque a

maioria incompatvel com a sobrevivncia. A grande maioria das mutaes associadas s doenas hereditrias so as mutaes gnicas sub-microscpicas. Essas podem resultar em deleo parcial ou completa de um gene ou, mais, frequentemente, afetar uma nica base. Por exemplo, uma nica base nucleotdica pode ser substituda por uma base diferente, resultando em uma mutao pontual. Menos comumente, um ou dois pares de bases podem ser inseridos ou deletados do DNA, levando a alteraes na fase de leitura da fita de DNA; assim elas so referidas como mutaes na fase de leitura. As consequncias das mutaes variam, dependendo de vrios fatores, incluindo o tipo de mutao e o stio genmico afetado por ela. Detalhes de mutaes especficas e de seus efeitos so discutidos com doenas relevantes ao longo do texto. Aqui, ns revisaremos brevemente os princpios gerais relacionados aos efeitos das mutaes gnicas. Mutaes pontuais dentro das sequncias codificantes: Uma mutao pontual (substituio de um nico nucleotdeo) pode alterar o cdigo de tri-nucleotdeos e levar reposio de um aminocido por outro no produto gnico. Como essas mudanas alteram o significado do cdigo gentico, elas so frequentemente chamadas de mutao de sentido trocado. Se a substituio desse aminocido causa pouca mudana na funo da protena, a mutao chamada mutao de sentido trocado conservativa. Por outro lado, uma mutao de sentido trocado no-conservativa substitui o aminocido normal por um outro muito diferente. Um exemplo excelente desse tipo a mutao falciforme afetando a cadeia beta-globina da hemoglobina (captulo13). Aqui, o tri-nucleotdeo CTC (GAC no RNA mensageiro (mRNA)), que codifica para o cido glutmico, mudado para CAC (ou GUG no mRNA), que codifica para a valina. Essa nica substituio de aminocido altera as propriedades fsico-qumicas da hemoglobina, dando origem a anemia falciforme. Alm da produo de uma substituio de aminocidos, uma mutao pontual tambm pode alterar um cdon de aminocido para um cdon de terminao, ou cdon de parada (mutao sem sentido). Tomando a beta-globina mais uma vez como exemplo, uma mutao pontual que afeta o cdon da glutamina (CAG) cria um cdon de parada (UAG) se o U for substitudo por C. Essa mudana leva terminao prematura da traduo do gene da beta-globina e o peptdeo resultante rapidamente degradado. Os indivduos afetados no possuem a cadeia beta-globina e desenvolvem uma forma grave de anemia chamada de beta0-talassemia (captulo 13). Mutaes dentro de sequncias no-codificantes: efeitos deletrios tambm podem resultar de mutaes que no envolvem os xons. Como se bem sabe, a transcrio do DNA iniciada e regulada por sequncias promotoras e acentuadoras que so encontradas abaixo ou acima do gene. Mutaes pontuais ou delees envolvendo essas sequncias regulatrias podem interferir com a ligao de fatores de transcrio e assim levar a uma reduo marcante ou ausncia total da transcrio. Esse o caso de algumas formas de anemias hemolticas hereditrias. Alm disso, mutaes pontuais dentro dos ntrons levam a emendas defeituosas das sequncias intrnicas. Assim, em troca, interferem com o processamento normal dos transcritos de mRNA mensageiro iniciais e resultam na falta de formao de transcritos de mRNA maduros. Consequentemente, a traduo no pode ocorrer, e o produto gnico no sintetizado. Delees e inseres: Pequenas delees ou inseres envolvendo a sequncia codificante levam a alteraes na fase de leitura da fita de DNA; assim, elas so conhecidas como mutaes de fase de leitura. Se o nmero de pares de bases envolvido for trs ou mltiplo de trs, a alterao na fase de leitura no ocorre; ao contrrio, sintetiza-se uma protena que no possui ou possui um ou mais aminocidos. Mutaes de repeties de tri-nucleotdeos: Mutaes de repeties de tri-nucleotdeos pertencem a uma categoria especial porque essas mutaes so caracterizadas pela amplificao de uma sequncia de trs nucleotdios. Ainda que a sequncia de nucleotdeo especfica que sofre amplificao difira em vrias doenas, quase todas as sequncias compartilham os nucleotdios guanina (G) e citocina . Por exemplo, na sndrome do X

frgil, o prottipo dessa categoria de doenas, exitem de 250 a 4.000 repeties sucessivas da sequncia CGG dentro do gene chamado de FMR-1. Em populaes normais, o nmero de repeties pequeno, na mdia 29. Essas expanses de tri-nucleotdios evitam a expresso normal do gene FMR-1, gerando assim um retardo mental. Outra caracterstica distintiva das mutaes de repeties de tri-nucleotdios que elas so dinmicas (i.e., o grau de amplificao aumenta durante a gametognese). Essas caractersticas, discutidas detalhadamente mais adiante, influenciam o padro de herana e as manifestaes fenotpicas das doenas causadas por essa classe de mutaes. Para resumir, as mutaes podem interferir na sntese de protenas em vrios nveis. A transcrio pode ser suprimida com delees gnicas e mutaes pontuais envolvendo sequncias promotoras. O processamento anormal de mRNAs pode resultar de mutaes que afetem ntrons ou junes de emendas ou ambos. A traduo afetada se um cdon de parada (mutao de terminao de cadeia) for criado dentro de um xon. Finalmente, algumas mutaes pontuais podem levar formao de uma protena anormal sem atrapalhar nenhum passo da sntese proteica. Para fechar, deve-se notar que, raramente, as mutaes podem ser protetoras. Como ser discutido no captulo 6, o vrus da imuno-deficincia humana (HIV) utiliza o receptor de citocina, CCR5, para entrar nas clulas; uma deleo no gene CCR5 protege, assim, da infeco por HIV. Voltamos nossa ateno agora para trs principais categorias de e doenas genticas: (1) doenas relacionadas com genes mutantes de grande efeito; (2) doenas com herana multi-fatorial e (3) doenas cromossmicas. A primeira categoria inclui vrias doenas relativamente incomuns, como as doenas de armazenamento e os erros inatos do metabolismo, todas resultantes de mutaes em genes nicos de grande efeito. Como a maioria dessas doenas segue o padro mendeliano clssico de herana, elas tambm so conhecidas por doenas mendelianas. A segunda categoria inclui algumas das doenas mais comuns em humanos, como a hipertenso e o diabetes melito. Elas so chamadas de multi-fatoriais porque sofrem influncia tanto de fatores genticos quanto de fatores ambientais. O componente gentico envolve o resultado conjunto de mltiplos genes de pequeno efeito; a contribuio ambiental pode ser grande ou pequena, e em alguns casos, necessria para a expresso da doena. A terceira categoria inclui doenas que resultam de mutaes genmicas e cromossmicas e so, portanto, associadas a mudanas numricas ou estruturais nos cromossomos. A essas trs categorias bem estabelecidas deve-se adicionar um grupo heterogneo de doenas monognicas com padres de herana no-clssicos. Esse grupo inclui doenas que resultam de mutaes de tri-nucleotdios, aquelas que surgem no DNA mitocondrial e aquelas onde a transmisso influenciada por inprinting genmico ou mosaicismo gonadal. Doenas desse grupo so causadas por mutaes em genes nicos, mas no seguem o padro mendeliano de herana. Elas so discutidas mais adiante neste captulo.

Doenas mendelianas
Todas as doenas mendelianas so o resultado de mutaes expressas em genes nicos de grande efeito. No necessrio detalhar as leis de Mendel aqui, porque todo estudante de biologia, e possivelmente toda ervilha de jardim, j aprendeu sobre elas quando criana. Somente alguns comentrios de relevncia mdica so feitos. O nmero de doenas mendelianas conhecidas cresceu em propores monumentais. Estima-se que cada indivduo seja um carreador de cinco a oito genes deletrios. A maioria destes so recessivos e, portanto, no trazem efeito fenotpicos srios. Em torno de 80% a 85% dessas mutaes so familiares. O restante representa mutaes novas adquiridas de novo por um indivduo afetado. Algumas mutaes autossmicas produzem expresso parcial no heterozigoto e expresso completa no homozigoto. A anemia falciforme causada pela substituio da hemoglobina normal

(HbA) pela hemoglobina S (HbS). Quando um indivduo homozigoto para o gene mutante, toda a hemoglobina do anormal, HbS, e mesmo em saturao normal de oxignio, a doena completamente expressa (i.e., a deformidade falciforme de todas as hemcias e a anemia hemoltica). No heterozigoto somente uma proporo da hemoglobina HbS (o restante sendo HbS), e, portanto, a hemcia falciforme, e possivelmente a hemlise, s ocorre quando h a exposio baixa tenso de oxignio. A isso se chama de trao falciforme para diferenciar da anemia falciforme completa. Ainda que a expresso gnica seja comumente descrita como dominante ou recessiva, em alguns casos, ambos os alelos de um par gnico podem ser completamente expressos no heterozigoto uma condio chamada de co-dominncia. Os antgenos de histo-compatibilidade e do grupo sanguneo so bons exemplos de herana co-dominante. Um nico gene mutante pode levar a muitos efeitos finais, denominados pleiotropismo; ao contrrio, mutaes em vrios lcus genticos podem produzir a mesma caracterstica (heterogeneidade gentica). A anemia falciforme pode servir como exemplo de pleiotropismo. Nessa doena hereditria, a mutao pontual no somente origina a HbS, que predispe a hemcia hemlise, como tambm as hemcias anormais tendem a causar entupimentos nos pequenos vasos, induzindo, por exemplo, a fibrose do bao, infartos orgnicos e mudanas sseas. Os vrios desarranjos finais so todos relacionados ao defeito primrio na sntese da hemoglobina. Por outro lado, a surdez infantil profunda, uma entidade clnica aparentemente homognea, resulta de qualquer um dos 16 tipos diferentes de mutaes autossmicas recessivas. O reconhecimento da heterogeneidade gentica importante no s no conselho gentico, mas tambm relevante para a compreenso da patognese de algumas doenas comuns, como o diabetes melito. Finalmente, deve-se notar que nem todas as mudanas de nucleotdios produzem genes que causam doenas. Quando uma mudana dessas ocorre no DNA de pelo menos 1% da populao, chamada de polimorfismo. Os SNPs, a forma mais comum de polimorfismo, foram descritos no comeo deste captulo.

Doenas com herana multi-fatorial

Como mostrado anteriormente, as doenas multi-fatoriais resultam de aes combinadas de influncias do meio ambiente om dois ou mais genes mutantes com efeitos aditivos. O componente gentico exerce um efeito de dosagem quanto maior o numero de genes deletrios herdados, mais severa a expresso da doena. Como os fatores ambientais influenciam significativamente a expresso dessas doenas, o termo polignico no deve ser utilizado. Vrias caractersticas fenotpicas normais so governadas por herana multi-fatorial como a cor dos cabelos, dos olhos e da pele, a altura e a inteligncia. Essas caractersticas exibem uma variao contnua nos grupos populacionais, produzindo uma curva de distribuio em forma de sino. As influncias ambientais, entretanto, modificam significativamente a expresso fenotpica das caractersticas multi-fatoriais. Por exemplo, o diabetes melito do tipo II possui vrias caractersticas das doenas multi-fatoriais. reconhecido clinicamente que indivduos frequentemente manifestam a doena depois de ganharem peso. Assim, a obesidade, como outras influncias ambientais, desmascara a caracterstica gentica da diabetes. As influncias nutricionais podem fazer com que gmeos idnticos atinjam alturas diferentes. A criana privada de cultura pode no alcanar a sua capacidade intelectual completa. Os traos seguintes caracterizam a herana multi-fatorial. Elas foram estabelecidas para a herana multi-fatorial de mal-formaes congnitas e, em todas as probabilidades, prevalecem para outras doenas multi-fatoriais. O risco de expressar uma doena multi-fatorial condicionado ao nmero de genes mutantes herdados. Assim, o risco maior em irmos de pacientes que possuem expresso severa da doena. Por exemplo, o risco de lbio leporino em irmos de um caso-ndice de

2,5% se o lbio leporino for uni-lateral, mas de 6% se for bi-lateral. Semelhantemente, quando maior o nmero de parentes afetados, maior o risco para outros parentes. A taxa de recorrncia da doena (varia de 2% a 7%) a mesma para todos os parente de primeiro grau (i.e., genitores, irmos e filhos) do indivduo afetado. Assim, se os genitores possuem um filho afetado, o risco de que a prxima criana seja afetada de 2% a 7%. Semelhantemente, existe a mesma chance de que um dos genitores seja afetado. A probabilidade de que ambos os gmeo idnticos sejam afetados significativamente menor que 100%, mas muito maior do que gmeos no idnticos sejam afetados. A experincia provou que, por exemplo, a frequncia de concordncia para gmeos idnticos est na faixa dos 20% a 40%. O risco de recorrncia da anormalidade fenotpica em gestaes subsequentes depende do resultado das gestaes anteriores. Quando uma criana afetada, existe at 7% de chance de que a prxima criana seja afetada, mas depois de duas crianas, o risco sobe para 9%. A expresso de uma caracterstica multi-fatorial pode ser contnua (ausncia de um fentipo distinto, e.g., altura) ou descontnua (com um fentipo distinto, e.g., diabetes melito). Nesta ltima, a doena expressa somente quando a influncia combinada dos genes e do ambiente cruzam um certo limiar. No caso da diabetes, por exemplo, o risco de expresso fenotpica aumenta quando os nveis de glicose sangunea cruzam um certo nvel.

A conferncia desse modo de herana a uma doena deve ser feita com cautela. Depende de muitos fatores, mas primeiramente no agrupamento familiar e na excluso de todos os modos de transmisso mendeliano e cromossmico. Uma gama de nveis de gravidade de uma doena sugestivo de herana multi-fatorial, mas como mostrado anteriormente, a expressividade varivel e a penetrncia reduzida de genes mutantes nicos tambm podem responder por esse fenmeno. Devido a esses problemas, algumas vezes difcil distinguir entre herana mendeliana e multifatorial. Ao contrrio das doenas mendelianas, muitas das quais incomuns, o grupo multi-fatorial inclui alguns dos males comuns dos quais os seres humanos so herdeiros. A maioria dessas doenas descrita em captulos apropriados em outro lugar neste livro.

Caritipo normal
Como bem se sabe, as clulas somticas contm 46 cromossomos; estes compreendem 22 pares homlogos de autossomos e dois cromossomos sexuais, XX nas mulheres e XY nos homens. O estudo dos cromossomos cariotipagem a ferramenta bsica do citogeneticista. O procedimento comum de produzir espalhados de cromossomos parar a mitose das clulas em diviso durante a metfase pelo uso de inibidores do fuso mittico (e.g., colcemida) e depois corar os cromossomos. Em um espalhado cromossmico, os cromossomos individuais tomam a forma de duas cromtides conectas pelo centrmero. Um caritipo o arranjo padro de um espalhado cromossmico em metfase corado e fotografado onde os pares de de cromossomos esto ordenados em tamanhos decrescentes. J foram desenvolvidos uma variedade de mtodos de colorao que permitem a identificao de cada cromossomo individualmente com base em padres confiveis e distintivos de bandas claras e escuras ao longo do comprimento do cromossomo. O mais comumente empregado utiliza o corante Giemsa e , portanto, chamado de bandeamento G. Com o bandeamento G, aproximadamente 400 a 800 bandas por conjunto haploide podem ser detectadas. A resoluo obtida por tcnicas de bandeamento pode ser bastante melhorada com a obteno de clulas em prfase. Os cromossomos individuais aparecem marcantemente alongados e at 1.500 bandas podem ser reconhecidas por caritipo. O uso dessas tcnicas de bandeamento permite a identificao exata de cada cromossomo, assim como o delineamento de pontos de quebra precisos e outras alteraes, como descrito a seguir.

Antes dessa discusso sobre caritipo ser concluda, deve-se fazer uma ressalva a respeito de alguns termos citogenticos comuns. Os caritipos so frequentemente descritos utilizando-se um sistema simplificado de notaes. A seguinte ordem utilizada: o nmero total de cromossomos dado primeiro; seguido pelo complemento sexual e finalmente pela descrio das anormalidades em ordem numrica ascendente. Por exemplo, um homem com trissomia do 21 designado 47,XY, +21. Algumas das notaes que denotam alteraes estruturais dos cromossomos so descritas ao longo do texto em conjunto s anormalidades. Aqui, devemos mencionar que o brao curto do cromossomo designado p (de petit) e o brao longo chamado de q (a letra seguinte do alfabeto). Em um caritipo bandeado, cada brao cromossmico divido em duas ou mais regies pelas bandas proeminentes. As regies so numeradas (e.g., 1, 2, 3) a partir do centrmero. Cada regio ainda sub-dividida em bandas e sub-bandas e estas tambm so ordenadas numericamente. Assim, a notao Xp21.2 se refere ao segmento cromossmico localizado no brao curto do cromossomo X, na regio 2, banda 1 e sub-banda 2. Hibridizao fluorescente in situ. A hibridizao fluorescente in situ (FISH) se tornou um aliado poderoso na cariotipagem rotineira e elevou muito o poder da anlise gentica. A principal limitao da cariotipagem que s aplicvel a clulas que esto se dividindo ou que possam ser induzidas diviso in vitro. Esse problema pode ser sobreposto por sondas de DNA que reconheam sequncias cromossmicas especficas. Essas sondas so marcadas com corantes fluorescentes e aplicadas aos ncleos interfsicos. A sonda se liga sua sequncia complementar no cromossomo e marca, assim, o cromossomo especfico, que pode ser visualizado ento sob microscpio fluorescente. O FISH pode, ento, ser utilizado para enumerar os cromossomos em ncleos interfsicos. Contudo, a aplicao do FISH no limitada a ncleos interfsicos. Pela utilizao de sondas de DNA, que so especficas para determinadas regies dos cromossomos, o FISH poe ser utilizado para demonstrar micro-delees sutis, translocaes complexas e alteraes telomricas que no seriam detectadas na cariotipagem rotineira. Alm da sua utilidade diagnstica, o FISH tambm pode ser utilizado como ferramenta para mapear fisicamente novos genes isolados de interesse clnico. Sequncias novas de DNA so marcadas com corantes fluorescentes e depois aplicadas a espalhados cromossmicos. O DNA se liga sua sequncia complementar e, assim, aponta a localizao do gene em um local especfico. A pintura cromossmica uma extenso do FISH, onde o cromossomo inteiro pode ser rotulado por uma srie de sondas de DNA fluorescentes que se ligam em stios mltiplos ao longo de um cromossomo em particular. O nmero de cromossomos que podem ser detectados simultaneamente por pintura cromossmica limitado pela disponibilidade de corantes fluorescentes que excitam comprimentos de onda de luz visvel diferentes. Assim, a pintura cromossmica tem habilidade limitada de visualizar todos os 46 cromossomos humanos simultaneamente. Essa dificuldade foi superada pela introduo a cariotipagem espectral. Pelo uso de uma combinao de cinco fluorocromos e de sinais gerados por computador apropriados, o genoma humano completo pode ser visualizado. A cariotipagem espectral (SKY) to poderosa que pode ser bem chamada de cariotipagem espetacular. Outra aplicao recente do FISH compara diretamente o contedo de DNA de populaes celulares normais e tumorais marcadas diferentemente pela sua co-hibridizao em espalhos cromossmicos metafsicos comuns (hibridizao genmica comparativa) ou em sries de clones de DNA alinhados em placas de vidro (hibridizao genmica comparativa em arranjo). Dessa maneira, pode-se determinar alteraes em nmero de cpias gnicas especficas de tumores.

Doenas citogenticas
As aberraes subjacentes s doenas citogenticas (mutaes cromossmicas) podem tomar a forma de nmero anormal de cromossomos ou de alteraes na estrutura de um ou mais cromossomos. O complemento cromossmico normal expresso como 46,XX para as mulheres e 46,XY para os homens. Qualquer mltiplo exato do nmero haploide e chamado de euploide. Se um erro ocorre na meiose ou na mitose, entretanto, e a clula adquirir um complemento cromossmico

que no mltiplo exato de 23, chamado de aneuploidia. As causas comuns de aneuploidia so a no-disjuno e o retardo da anfase. O primeiro ocorre quando um par de cromossomos homlogos no se separa durante a primeira diviso mittica, ou as cromtides no se separam nem na segunda diviso meitica u nas divises celulares mitticas, resultando em duas clulas aneuploides. Quando a no-disjuno ocorre durante a gametognese, os gametas formados possuem tanto um cromossomo extra (n+1) ou um cromossomo a menos (n-1). A fertilizao desses gametas por gametas normais resulta em dois tipos de zigotos trissmicos (2n+1) ou monossmicos (2n-1). No retardo da anfase, um dos cromossomos homlogos na meiose, ou uma das cromtides na mitose retarda e deixado para traz no ncleo celular. O resultado uma clula normal e outra com monossomia. Como visto subsequentemente, a monossomia ou a trissomia envolvendo os cromossomos sexuais, e at mesmo aberraes mais bizarras, so compatveis com a vida e so geralmente associadas a graus variveis de anormalidades fenotpicas. A monossomia envolvendo um autossomo geralmente representa perda de muita informao gentica para permitir o nascimento com vida ou at mesmo a embriognese, mas algumas trissomias autossmicas permitem a sobrevivncia. Com exceo da trissomia do 21, todas geram crianas gravemente incapacitadas que quase sempre morrem em idade precoce. Ocasionalmente, erros mitticos ocorrem no desenvolvimento inicial e do origem a duas ou mais populaes celulares no mesmo indivduo, uma condio chamada de mosaicismo. O mosaicismo pode resultar de erros mitticos durante a clivagem do ovo fertilizado ou nas clulas somticas. O mosaicismo que afeta os cromossomos sexuais relativamente comum. Na diviso do ovo fertilizado, um erro pode fazer com que uma das clulas filhas recebam trs cromossomos sexuais, enquanto a outra recebe somente um, gerando, por exemplo, um mosaico 45,X/47,XXX. Todas as clulas descendentes de cada um desses precursores possuiro tanto um complemento 47,XXX ou 45,X. Esse paciente um variante em mosaico da sndrome de Turner, com a extenso da expresso fenotpica dependente do nmero e da distribuio das clulas 45,X. Se o erro ocorrer em uma clivagem mais tardia, o mosaico possuir trs populaes de clulas, com algumas possuindo o complemento normal 46,XX (i.e., 45,X/46,XX/47,XXX). Erros mitticos repetidos podem levar a vrias populaes celulares. O mosaicismo autossmico parece ser muito menos comum do que o que envolve os cromossomos sexuais. Um erro em uma diviso mittica inicial afetando os cromossomos geralmente leva a um mosaico invivel com monossomia autossmica. Raramente, a perda de uma linhagem celular invivel tolerada durante a embriognese, gerando um mosaico (e.g., 46XY/47,XY+21). Um paciente desse tipo um mosaico da trissomia do 21 com expresso varivel da sndrome de Down, dependendo da proporo de clulas que expressam a trissomia. Uma segunda categoria de aberraes cromossmicas est associada a mudanas na estrutura dos cromossomos. Para ser visvel por tcnicas de bandeamento rotineira, uma quantidade relativa de DNA (aproximadamente 4 milhes de pares de bases), contendo muitos genes, deve estar envolvida. A resoluo muito maior com FISH. Mudanas estruturais nos cromossomos geralmente resultam de quebras cromossmicas seguidas por perda ou rearranjo do material. Essas alteraes ocorrem espontaneamente em uma baixa taxa que elevada por exposio a mutgenos ambientais, como produtos qumicos e radiao ionizante. Alm disso, vrias doenas genticas autossmicas recessivas anemia de Fanconi, sndrome de Bloom, e ataxia-telangiectasia so associadas a altos nveis de instabilidade cromossmica, tanto que so conhecidas como sndrome de quebras cromossmicas. Como discutido mais adiante, no captulo 7, existe um risco elevado de cncer em todas essas sndromes. Na seo seguinte, ns revemos brevemente as formas mais comuns de alteraes na estrutura dos cromossomos e as notaes utilizadas para indic-las. A deleo se refere perda de uma poro de um cromossomo. A maioria das delees so intersticiais, mas delees terminais podem ocorrer raramente. As delees intersticiais ocorrem quando existem duas quebras dentro de um dos braos cromossmicos, seguida por perda do material cromossmico entre as quebras e fuso das pontas quebradas. Pode-se especificar em qual regio e em quais bandas as quebras ocorreram. Por exemplo, 46,XY,del(16)(p11.2p13.1) descreve pontos de quebra no brao curto do cromossomo 16 em 16p11.2 e 16p13.1 com perda de material

entre as quebras. As delees terminais resultam de quebras nicas em um dos braos cromossmicos, produzindo um fragmento sem centrmero, que depois perdido na prxima diviso celular. A ponta do cromossomo quebrado protegida pela aquisio de sequncias telomricas. Um cromossomo em anel uma forma especial de deleo. produzida quando uma quebra ocorre em ambas as pontas de um cromossomo com fuso das pontas danificadas. Se o material gentico significante por perdido, podem surgir anormalidades fenotpicas. Isso pode ser expresso como 46,XYr(14). Os cromossomos em anel no se comportam normalmente na meiose ou na mitose e geralmente resultam em consequncias srias. A inverso refere-se a rearranjos que envolvem duas quebras em um nico cromossomo com re-incorporao do segmento. Esse tipo de inverso, envolvendo somente um dos braos cromossmicos, chamada de paracntrica. Se as quebras ocorrerem em lados opostos do centrmero, so conhecidas por pericntricas. As inverses so frequentemente compatveis com o desenvolvimento normal. A formao de iso-cromossomos ocorre quando um dos braos de um cromossomo perdido e o outro duplicado, gerando um cromossomo que consiste em somente dois braos curtos ou em dois braos longos. Um iso-cromossomo possui informao gentica idntica morfologicamente em ambos os braos. O iso-cromossomo mais comum em nascimentos vivos o que envolve o brao longo do X e designado i(X)(q10). O iso-cromossomo Xq associado monossomia para os genes do brao curto do X e trissomia para os genes do brao longo do X. Em uma translocao, um segmento de um cromossomo transferido para outro. Em uma das formas, chamada translocao balanceada recproca, existem quebras nicas em cada um de dois cromossomos, com troca de material. Esse tipo de translocao pode no ser descoberto sem as tcnicas de bandeamento. Uma translocao balanceada recproca entre o brao longo do cromossomo 2 o brao curto do cromossomo 5 seria escrita 46,XX,t(2;5)(q31;p14). Esse indivduo possui 46 cromossomos com morfologia alterada em um dos cromossomos 2 e em um dos cromossomos 5. Como no houve perda de material gentico, o indivduo provavelmente fenotipicamente normal. Um carreador de translocao balanceada, entretanto, tem chances elevadas de produzir gametas anormais. Por exemplo, no caso citado acima, pode-se formar um gameta contendo um cromossomo 2 normal e um cromossomo 5 translocado. Esse gameta seria no-balanceado porque no conteria o complemento normal de material gentico. A fertilizao subsequente por um gameta normal levaria formao de um zigoto anormal (no-balanceado), gerando um aborto espontneo ou o nascimento de uma criana mal-formada. O outro padro importante de translocao chamado de translocao robertosoniana (ou fuso cntrica), uma translocao entre dois cromossomos acrocntricos. Tipicamente, as quebras ocorrem prximo do centrmero de cada cromossomo. A transferncia dos segmentos leva ento a um cromossomo muito grande e a outro extremamente pequeno. Geralmente, o produto pequeno perdido; entretanto, porque carrega somente genes altamente redundantes (e.g., genes de RNA ribossomal), essa perda compatvel com um fentipo normal. A translocao robertsoniana encontrada em 1 a cada 1.000 indivduos aparentemente normais. Essa forma significativa de translocao tambm capaz de gerar uma prognie anormal, como discutido posteriormente com a sndrome de Down. Muitas outras aberraes numricas e estruturais so descritas em textos especializados, e o nmero de caritipos anormais encontrados nas doenas genticas aumenta a cada ms. Como ressaltado anteriormente, distrbios do cromossomos detectados clinicamente representam somente a ponta de um iceberg. Estima-se que aproximadamente 7,5% de todas as concepes possuam uma anormalidade cromossmica, a maioria das quais no compatvel com a vida. Assim, as anormalidades cromossmicas so identificadas em 50% dos abortos espontneos em 5% das crianas que nascem mortas ou que morrem no perodo imediatamente ps-natal. Mesmo em crianas nascidas vivas, a frequncia aproximadamente 0,5% a 1%. Est alm do alcance deste livro discutir a maioria das doenas cromossmicas reconhecidas clinicamente. Ento, focalizamos a ateno naquelas que so mais comuns.

Doenas mono-gnicas com herana no-clssica

J se tornou bastante evidente que a transmisso de algumas doenas monognicas no segue os princpios mendelianos clssicos. Esse grupo de doenas pode ser classificado em quatro categorias: Doenas causadas por mutaes de repeties de tri-nucleotdios Doenas causadas por mutaes nos genes mitocondriais Doenas associadas a imprinting genmico Doenas associadas ao mosaicismo gonadal

As caractersticas clnicas e moleculares de algumas doenas monognicas que exemplificam os padres de herana no-clssicos so descritos a seguir.

Diagnstico molecular
As aplicaes mdicas da tecnologia do DNA recombinante j atingiram a maioridade. Com o projeto do genoma humano, as sondas de DNA podem ser ferramentas poderosas no diagnstico de doenas humanas, tanto genticas quanto adquiridas. As tcnicas de diagnstico molecular encontraram aplicao em virtualmente todas as reas da medicina. Essas incluem as seguintes: Deteco de mutaes herdadas que esto envolvidas no desenvolvimento de doenas genticas tanto no pr-natal quanto depois do nascimento. Deteco de mutaes adquiridas que esto envolvidas envolvidas no diagnstico de neoplasias. Diagnstico e classificao precisos das neoplasias, especificamente aquelas que se originam no sistema hematopotico. Diagnstico de doenas infecciosas, incluindo a infeco pelo HIV. Determinao de parentesco e identidade em transplantes, teste de paternidade e medicina forense. Alm disso, usos futuros do diagnstico molecular incluem a deteco de polimorfismos que influenciam a suscetibilidade a doenas, como ocorre, por exemplo, no cncer de pulmo. Como descrito no captulo 15, alguns polimorfismos no sistema da mono-oxigenase P-450 predispem ao cncer de pulmo induzido pelo cigarro. Relacionado a esse campo, et a farmacogentica, onde alguns polimorfismos ditam a suscetibilidade a aes e efeitos adversos a drogas. Acredita-se que, atravs de anlises em grandes escalas, os perfis genticos completos de indivduos podem permitir o diagnstico pr-sintomtico de todas as possveis doenas genticas e o risco para doenas induzidas pelo ambiente. Essa capacidade poderosa espalhou, compreensivamente, muitas preocupaes a respeito do uso confidencial e tico da informao gentica. Na prxima seo, revisaremos brevemente as aplicaes diagnsticas das tcnicas moleculares conforme elas se relacionam a doenas genticas.

Diagnstico de doenas genticas

O diagnstico de doenas genticas necessita de exame do material gentico (i.e., cromossomos e genes). Portanto, dois grandes mtodos so empregados: a anlise citogentica e

anlise molecular. A anlise citogentica necessita de cariotipagem. A anlise cromossmica pr-natal deve ser oferecida a todos os pacientes que possuem risco de filhos anormais citogeneticamente. Pode ser realizada nas clulas obtidas na amniocentese, em bipsia das vilosidades corinicas ou em sangue de cordo umbilical. Algumas indicaes importantes so as seguintes: A idade materna avanada (mais de 34 anos de idade) devido ao maior risco de trissomias. Um genitor que carrega uma translocao balanceada recproca, uma translocao robertsoniana, ou inverso (nesses casos, os gametas podem ser desbalanceados, e, portanto, os filhos possuem risco de doenas cromossmicas). Um genitor com um filho anterior com anormalidade cromossmica. Um genitor que carreador de uma doena gentica ligada ao X (para determinar o sexo fetal). A anlise cromossmica ps-natal geralmente realizada nos linfcitos do sangue perifrico. As indicaes so as seguintes: Mltiplas anomalias congnitas Retardo mental ou retardo de desenvolvimento sem explicao Suspeita de aneuploidia (e.g., manifestaes da sndrome de Down) Suspeita de autossomos desbalanceados (e.g., sndrome de Prader-Willi) Suspeita de anormalidade nos cromossomos sexuais (e..g, sndrome de Turner) Infertilidade (para descartar anormalidades nos cromossomos sexuais) Mltiplos abortos espontneos (para descartar os genitores como careadores de translocaes desbalanceadas; ambos os parceiros devem ser avaliados)

Muitas doenas genticas so causadas por mudanas sutis em genes individuais que no podem ser detectadas por cariotipagem. Tradicionalmente, o diagnstico de doenas monognicas tem dependido da identificao dos produtos gnicos anormais (e.g., enzimas ou hemoglobina mutantes) ou em seus efeitos clnicos, como a anemia ou o retardo mental (e.g., fenilcetonria). Agora possvel identificar mutaes ao nvel de DNA e oferecer diagnstico gentico para vrias doenas mendelianas graves. O uso da tecnologia do DNA recombinante para o diagnstico de doenas herdadas tem vrias vantagens distintas sobre outras tcnicas: muito sensvel. A quantidade de DNA necessria para o diagnstico por tcnicas de hibridizao molecular pode ser prontamente obtida de 100.000 clulas. Mais ainda, o uso da PCR permite a amplificao do DNA ou do RNA em milhes de vezes, tornando possvel o uso de at 100 clulas ou 1 clula para anlise. Pequenas quantidades de sangue total ou at mesmo sangue seco podem ser suficientes para amplificao do DNA por PCR. Testes baseados em DNA no so dependentes de um produto gnico que pode ser produzido somente em algumas clulas especializadas (e.g., crebro) ou cuja expresso ocorra s tardiamente na vida. Como virtualmente todas as clulas do corpo do indivduo afetado possui o mesmo DNA, cada clula ps-zigtica carregam mesmo gene mutante. Essas duas caractersticas possuem implicaes profundas no diagnstico pr-natal de doenas genticas porque um nmero suficiente de clulas pode ser obtido de alguns mililitros de fluido amnitico ou de uma bipsia de vilosidade corinica que pode ser realizada ainda no primeiro trimestre. Existem duas abordagens distintas para o diagnstico de doenas monognicas pela tecnologia do DNA recombinante: deteco direta das mutaes e deteco indireta baseada na ligao do gene da doena com um gene marcador inofensivo.