Cuantificacin de protenas

AUTOR: Mariel Rodrguez Salinas B. Ximena Olivares Guadarrama Francisco Javier Mora vila Xochitl Dvila Gonzlez Asley Mara Solano Snchez Autoevaluacin: Profesores: GERARDO PREZ HERNNDEZ, REFUGIO CRUZ TRUJILLO UEA: LABORATORIO DE BIOQUMICA Trimestre: 13I

Evaluacin del profesor:

INTRODUCCIN
En mtodo Bradford se basa en utilizar un colorante hidrofbico (comassie blue G-250) cuyas disoluciones acuosas en presencia de cido fosfrico tienen un color pardo que al entrar en contacto con la parte hidrofbico del interior de una protena se fija. Las protenas se unen a la forma azul para formar un complejo protena-colorante con un coeficiente de extincin mayor que el colorante libre. La determinacin del contenido proteico de una muestra requiere la comparacin del valor de absorbancia de la muestra con los obtenidos a partir de cantidades conocidas de protenas, con los que se construye una curva de calibracin: a mayor cantidad de protenas, mayor color desarrollado y por lo tanto, mayor absorbancia, es por ello que se considera un cromforo exgeno. Es un mtodo que depende de la interaccin relativamente inespecfica entre un colorante hidrofobico y las protenas, por lo que es sensible a la presencia de contaminantes tales como los restos de detergentes y lquidos orgnicos, ya que las protenas pueden perder su estabilidad y perder su forma nativa, lo que provocara la perdida de la unin entre el cromforo y la zona hidrofbica de las protenas. Para determinar la concentracin total de protena se realiza una curva de calibracin empleando una protena patrn que generalmente es la seroalbumina bovina. Se preparan tubos testigos con distintas cantidades de protena y otra disolucin llamada blanco que solo contiene agua y reactivo Bradford y en los tubos testigos se les mantiene constante el reactivo Bradford siendo los volmenes de todos los tubos iguales. Una vez preparados los tubos se mide la absorbancia a cada uno de ellos a una longitud de onda de 595nm, es calibrado el equipo con el tubo blanco (no contiene protena) de esta manera se construye la grfica de absorbancia vs concentracin

OBJETIVOS Conocer el procedimiento empleado para cuantificacin de protena. Interpretar los resultados, mediante una curva de valores conocidos. Realizar un anlisis matemtico, para saber cul es la concentracin de protena, una vez se haya realizado un ajuste lineal de la curva patrn.

Materiales y mtodo.

Procedimiento 1. Se agrega 10 ml de agua destilada a cada uno de los tubos falcon que contienen las muestras tras las diferentes centrifugaciones, y se remueve con una espatula para poder diluir. 2. Se tom 10 microlitros de cada muestra ya diluidas y se deposit en diferentes alicuotas, a cada una de ellas se le adicion 990 microlitros de agua destilada. 3. Colocar en siete tubos de ensayo albumina en diferentes proporciones 0, 5, 10, 25, 40, 50 y 60 microlitros, aadir agua destilada hasta tener un volumen de 200 microlitros y posteriormente agregar 800 microlitros de reactivo de bradford. 4. Colocar en otros diez tubos de ensayo 10 microlitros de albumina de las difernentes alicuotas, 2 muestras de cada alicuota, 190 microlitros de agua destilada y 800 microlitros de reactivo de bradford. 5. Posteriormente se medira la absorbancia a cada una de las soluciones que contienen los tubos. Estas soluciones deberan ser deporsitadas en .. para que puedan ser leidos por el espectrofotometro. El tubo uno se tomar como muestra blanco ya que no contiene albumina.
TUBO REACTIVO DE BRADFORD ALBMINA

1 2 3 4 5

800 800 800 800 800

200 195 190 175 160

0 5 10 25 40

6 7

800 800

150 140

50 60

Tabla1. Cantidades a adicionar en los tubos.

TUBO REACTIVO DE BRADFORD

ALBMINA

MUESTRA 1 2 800 800 190 190 10 10

MUESTRA 1ra. CENTRIFUGACIN 3 4 800 800 190 190 10 10

MUESTRA 2da. CENTRIFUGACIN 5 6 800 800 190 190 10 10

MUESTRA 3ra. CENTRIFUGACIN 7 8 800 800 MUESTRA DIALISIS 9 10 800 800 190 190 10 10 190 190 10 10

Tabla 2. Cantidades a adicionar en los tubos

RESULTADOS

Fig.1 Alcuotas con muestra de albmina y dilisis respectivamente.

Fig. 2 Se coloc en cada tubo la cantidad sealada en la tabla de BSA y de agua.

Fig. 3 Posteriormente se aadi el Reactivo de Bradford a cada tubo. Es importante que el reactivo se adicione al final.

Fig. 4 Imagen de los tubos, una vez terminado de aadir todo lo necesario.

Fig. 5 Los tubos de la parte delantera contienen BSA y en la parte trasera contienen nuestra protena X.

Fig. 6 Preparando el espectrofotmetro para analizar la absorbancia, tanto de la protena patrn, como de la protena X.

Fig. 7 Para colocar las muestras dentro del espectrofotmetro, se deben vaciar dentro de los pequeos tubos mostrados.

Fig. 8 Una vez colocada la muestra en ese tubo, se mete en el espectrofotmetro.

Fig. 9 Se cierra el espectrofotmetro y se presiona el botn para que nos seale la absorbancia.

Fig. 10 Una vez obtenida la absorbancia, se retira el tubo pequeo y se vaca la muestra al tubo original.

Muestra Licuado 1 Centrifugacin

Volumen

[Potena] Bradford

2 Centrifugacin Sulfato de Amonio 3 Centrifugacin Sulfato de Amonio Dilisis

40%

60%

Tabla 1 Disolucin del sobrenadante en agua destilada.

Tabla 2. Representa concentracin BSA, agua y absorbancia de albmina, protena a comparar con LDH-Deshidrogenasa. Tubo 1 2 3 4 5 6 7 BSA (Albmina) O 5 10 25 40 50 60 Absorbancia (nm) 0.562 0.204 0.357 0.710 0.987 1.047 1.233 [P] 30.710 11.1475 19.508 8.554 53.934 57.213 67.377

Curva patrn
1.4

R = 0.9763

ABSORBANCIA

1.2
1

0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 10 20 30 BSA (L) 40 50 60 70 Series1

Grfica 1. Representacin lineal de absorbancia, con respecto a la concentracin de albmina en cada tubo.

Concentracin de albumina
1.4 A b s o r b a n c i a 1.2

R = 0.7712

1
0.8 0.6 Absorbancia(y)

0.4
0.2 0 0 20 40 60 80

[P]

Grafica 2. Representacin de los datos obtenidos de la concentracin de albmina con respecto a la absorbancia En la siguiente tabla se presentan los valores de la cantidad de protena y absorbancia obtenida en cada tubo de nuestra protena desconocida. Muestra Tubo (Licuado) 1 2 Tubo (1ra ) 3 4 Tubo (2nda ) SA 40% 5 6 Tubo (3ra ) SA 60% 7 8 Concentracin de prtena Absorbancia (nm) [P]

10 10

0.109 0.114

5.956 6.229

10

0.074 0.078

4.043 4.262

10 10

0.047 0.035

2.568 1.912

10 10

0.050 0.052

2.732 2.841

Tubo (Dilisis) 9 10

10 10

1.467 1.541

80.163 84.207

Concentracin de protena "x"

1.8 a B S O R B A N C I A 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 Absorbancia(y)

R = 1

0.2
0 0 20 40

[PX]

60

80

100

Grfica 3. Representacin de la concentracin de protena desconocida con respecto a la absorbancia en cada muestra

DISCUSIN

El mtodo para cuantificar protena empleando cromoforos exgenos, puede ser afectado por los componentes de la solucin como el tipo de buffer. La eleccin de uno u otro cromoforo va a depender de la cantidad que deseemos medir. En esta prctica se empleo azul de coomassie, y lo que se midi fue la unin de este a los diferentes tipos de protena desconocida y albmina. Una vez obtenidos los valores, se grafico la absorbancia de albmina (ver grafica1) la cual ser nuestra curva patrn ya que bien se sabe la concentracin de protena empleada para el anlisis. Adems se tiene la certeza de que la albmina no est junto con otro tipo de protenas sino esta ya purificada, caracterstica que aun falta definir en el cumulo de protena desconocida. Una vez que se adicionaron los reactivos necesarios (ver, procedimiento) se midi la absorbancia de albmina, y los valores obtenidos fueron mayores a 0.204nm y menores a 1.233nm. Por dicha razn, la

absorbancia a diferentes concentraciones de protena desconocida, no deben sobrepasar este rango, ya que no conoceramos la cantidad ni actividad a analizar ms all de 1.233nm. Sin embargo, al medir la absorbancia de la protena desconocida se encontraba entre 0.035nm a 1.541nm evidentemente menores y mayores a los ya establecidos, por eso se aument hasta tres veces la concentracin de protena en cada tubo. Pero tampoco, se obtuvieron los valores dentro del rango previsto, inferimos que las diluciones que contenan la protena no se agitaron antes de pipetear la cantidad requerida o que el espectrofotmetro no fue calibrado adecuadamente, fueron las posibles causas que dieron lugar a datos, que no favorecen al anlisis de cuantificacin mediante el reactivo de Bradford. Por otro lado los valores, de concentracin en cada tubo tanto, de albmina como de protena desconocida se muestran en las figuras 2 y 3. CONCLUSIN De acuerdo a las observaciones vistan el clase y los resultados obtenidos se puede llegar a la conclusin que el metodo de Brandford esta basado en el cambio de color del colorante esto se debe a las desigualas en la concentracion de proteina este intereactua especialmente con Arginina (es un aa bsico con grupos R cargados positivamente), esto provoca un cambio en el mximo de absorbancia del colorante desde 465 a 595 nm. Este mtodo nos permite cuantificar la concentracin de protenas presentes, basados en las propiedades que muestran las protenas en solucin. Tambin se puede subrayar algunas de las ventajas de este mtodo que son: La intensidad de absorbancia que depende del contenido de aminocidos que tiene la protena, de igual manera la unin colorante-protena es estable durante algn tiempo (1 hora), por lo tanto resulta un mtodo rpido, adems se puede saber que tan fuertemente una substancia absorbe la luz a una longitud de onda proporcionada (coeficiente de extincin). En comparacin con otros mtodos por ejemplo el de Lowry es un tcnica colorimtrico de valoracin cuantitativa de las protenas tiene como desventaja que algunos agentes como los quelantes y Cu interfieren en la reaccin esto provoca que las protenas producirn diferentes intensidades de color dependiendo del contenido de Tyr y Trp. De acuerdo a la obtencin de nuestra curva patrn de la cual partimos de datos conocidos en este caso fue (BSA) que se utiliza universalmente como protena estndar y as poder determinar la cantidad de protenas presentes en nuestra muestra incgnita. Esto se refleja en los resultados que obtuvimos con la absorbancia de nuestra protena se vieron afectados directamente por nuestra tcnica y manipulacin de los reactivos y de los instrumentos que en este caso fueron las pipetas. Esto se pudo observar con mayor precisin al momento de graficar ya que los valores de la dilisis sobrepasaron los valores de 1.0 por lo tanto ya no pudimos utilizarlo o tomarlos en cuenta dentro de nuestra curva patrn

PERSPECTIVAS Tener cuidado de que las burbujas no se formen durante la agitacin y la adicion de reactivos, porque esto puede generar que la enzima se desnaturalice. Es importante tener precisin al momento de utilizar las micropipetas, pues si se le da un manejo inadecuado pueden variar las cantidades que se desean medir. Se tienen que agitar las alcuotas para que no quede el precipitado en el fondo y asi no alteren los datos de absorbancia. Mantener cuidado con las puntillas para las micropipetas, evitando tocar las puntas pues podran ser contaminadas.