Biologa Celular y Molecular 2011

Prctico de Bioqumica

PRCTICO de BIOQUMICA
La asistencia al prctico y la realizacin del informe son obligatorias.
Eliminado: la evaluacin Eliminado: obligatorias

Introduccin.
El prctico se desarrollar durante dos das realizando las siguientes actividades: 1- Estudiar la cintica de crecimiento de un cultivo de levaduras. 2- Evidenciar la gluclisis en el cultivo de levaduras, evaluando el consumo de glucosa y la produccin de CO2. 3- Evaluar el efecto de un inhibidor de la gliceraldehdo-3-fosfato deshidrogenasa sobre el crecimiento, el consumo de glucosa y la viabilidad celular en el cultivo de levaduras. 4- Presentacin y discusin de los resultados obtenidos.

DIA 1 1. Objetivos.
1- Iniciar un cultivo de levaduras y evaluar su crecimiento en ausencia y presencia de un inhibidor de la gluclisis. 2- Evaluar la produccin de CO2 por un cultivo de levaduras en ausencia y presencia de un inhibidor de la gluclisis.

2. Fundamento Terico
El metabolismo celular es una actividad altamente coordinada, en la que muchas reacciones catalizadas por enzimas organizadas en vas metablicas, cooperan para cumplir con las funciones de la clula (obtener energa, y sintetizar y degradar molculas) de acuerdo con sus necesidades (proliferacin, migracin, etc). Una va metablica es una sucesin de reacciones qumicas que conducen de un sustrato inicial a uno o varios productos finales, a travs de una serie de metabolitos intermediarios. Las vas metablicas que participan en estos procesos difieren en los distintos organismos sin embargo la gluclisis se encuentra altamente conservada en la evolucin. La gluclisis, va inicial del catabolismo de los carbohidratos, est formada por 10 reacciones que transforman a la molcula de glucosa en dos molculas de piruvato, el cual es sustrato de otras vas de oxidacin que generan energa. Las principales funciones de la gluclisis son: produccin de piruvato (sustrato que ser oxidado completamente en la mitocondria), la generacin de ATP y produccin de intermediarios de 3 y 6 carbonos que participan en distintas vas (ej. Ruta de las pentosas-fosfato). Ecuacin global de la gluclisis: Glucosa + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 Pi 2 Piruvato + 2 NADH + 2H+ + 2ATP + 2 H2O

Eliminado: .

Eliminado:

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En los organismos aerbicos el piruvato producto de la gluclisis es mayoritariamente oxidado totalmente a dixido de carbono (CO2) en la mitocondria y la energa obtenida en este proceso se utiliza para la sntesis de ATP en la fosforilacin oxidativa, siendo el oxgeno el aceptor final de electrones. Sin embargo, en determinadas condiciones, existe una va alternativa de metabolizacin del piruvato, la fermentacin, que les permite obtener energa rpidamente. Eso ocurre por ejemplo, en el msculo realizando ejercicio intenso, siendo la glucosa fermentada a lactato. De manera similar la levadura Saccharomyces cerevisiae presenta un metabolismo mixto aerbico-fermentativo regulado principalmente por los niveles de glucosa. A concentraciones altas de glucosa la levadura lleva a cabo principalmente la fermentacin alcohlica en la que el piruvato, formado en la gluclisis es convertido a etanol en dos pasos: 1) la descarboxilacin no oxidativa del piruvato a acetaldehdo catalizada por la piruvato decarboxilasa 2) la reduccin del acetaldehdo a etanol a expensas de NADH por la acetaldehdo deshidrogenasa. 1) piruvato acetaldehdo + CO2 2) acetaldehdo + NADH + H+ etanol + NAD+ Se postula que en presencia de concentraciones altas de glucosa la velocidad de la gluclisis excede a la de la reaccin catalizada por la piruvato deshidrogenasa y el piruvato es convertido en etanol. En cambio, cuando las concentraciones de glucosa son bajas y hay oxgeno Saccharomyces cerevisiae no produce etanol. El pasaje de un metabolismo fermentativo a un metabolismo aerbico recibe el nombre de cambio diuxico. En este prctico evaluaremos el consumo de glucosa la formacin de CO2 y la respiracin de la levadura asociados a la proliferacin en cultivo.

Con formato: Fuente: Cursiva

3. Procedimiento experimental
A- Evaluacin del crecimiento y el consumo de glucosa por un cultivo de levaduras. 1Preparacin del cultivo de levaduras: Preparar 2 matraces Erlenmeyer de 250 ml con: 0.1 g de levadura seca (Saccharomyces cereviseae) en 40 ml de medio de crecimiento (extracto de levadura 1%, glucosa 1%). Rotularlos 1 y 2. Agregar 0.4 ml de cloruro de mercurio (HgCl2) 100 mM al matraz 2 y agitar.
PRECAUCIN: El HgCl2 es altamente txico por contacto con la piel. Utilizar guantes o solicitar asistencia al docente.
Eliminado: tubos (marca falcon)

Eliminado: uno de los tubos Con formato: Fuente: 10 pto, Negrita, Cursiva Con formato: Fuente: 10 pto, Sin Negrita, Cursiva, Subndice Con formato: Fuente: 10 pto, Sin Negrita, Cursiva Eliminado: .

Tomar la muestra de tiempo 0 de cada matraz (ver punto -2-) y colocarlos en la estufa de cultivo a 30 C. 2Toma de muestras del medio de incubacin: Las muestras de los cultivos se tomarn a los 0, 0.5, 1, 2, 5 y 24 horas de iniciada la incubacin. Tomar muestras de 4 ml de material de los matraces 1 y 2 (en tubos de centrfuga rotulados). No olvide agitar los cultivos antes de la toma de la muestra.

Con formato: Fuente: 10 pto, Cursiva Eliminado: Agitar. Eliminado: tubo Eliminado: Eliminado: la bao termostatizado a 30C Eliminado: tubos

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Con formato: Fuente: Sin Negrita

Devolver los matraces 1 y 2 a la estufa de cultivo inmediatamente tras la toma de cada muestra. Tomar 0.5 ml de cada tubo de centrifuga, pasarlo a otro tubo y agregar 4.5 ml de agua para medir turbidez (absorbancia a 600 nm). Centrifugar el resto de la muestra inmediatamente durante 3 minutos y separar los sobrenadantes (volcando en tubo de plstico rotulado parte del sobrenadante, evitando la contaminacin con el precipitado). Guardar los sobrenadantes en tubos rotulados y congelar para realizar la determinacin de la concentracin de glucosa al da siguiente. B- Evaluacin de la produccin de CO2. Teniendo en cuenta que el peso molecular de la glucosa es 180 g/mol, preparar por pesada 100 ml de una solucin 10 mM. Preparar en 2 matraces de 125 ml la siguiente solucin: disolver 0.2 g de levadura seca (Saccharomyces cereviseae) en 45 ml de la solucin de glucosa 10 mM. Agregar 0.5 ml de cloruro de mercurio 100 mM a uno de los matraces. Preparar un tercer matraz con 45 ml de la solucin amortiguadora KH2PO4/ KHPO4 200 mM y glucosa 10 mM, pH 7.0 y 0.2 g de levadura. Colocar un tubo de ensayo con 2 ml de una solucin de rojo fenol pH 7.0 adentro de cada matraz y taparlos para evitar el intercambio gaseoso con el exterior. Incubar los matraces en la estufa de cultivo a 30 C y observar las variaciones de color en la solucin de rojo fenol luego de 24 hs.

Eliminado: a temperatura ambiente

DIA 2 1. Objetivos.
1- Utilizacin de un mtodo espectrofotomtrico para determinar la concentracin de glucosa. 2- Determinacin del consumo de glucosa por los cultivos de levaduras, en ausencia y presencia de un inhibidor de la gluclisis. 3- Evaluar la viabilidad celular de los cultivos de Saccharomyces cereviseae expuestos y no expuestos al inhibidor de la gluclisis.

Con formato: Fuente: Negrita Con formato: Fuente: Sin Cursiva

2. Fundamento terico
Espectrofotometra Cuando un haz de luz blanca atraviesa una masa de agua pura no sufre modificaciones; pero si al agua se le aade permanganato de potasio, la luz que emerge es de color violeta. La solucin de permanganato de potasio permite el paso de luz azul y roja, pero absorbe las dems radiaciones del haz incidente. Analizaremos el fenmeno de la absorcin de luz por una solucin: la figura 1 representa un recipiente transparente que contiene una solucin de una sustancia determinada; sta es atravesada por un haz de luz monocromtica. Si se miden las intensidades del haz incidente (Io) y del emergente (I) se observa que esta ltima es

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menor que la primera. Esto se debe a que parte de la radiacin que recibi la sustancia en solucin es absorbida por sus molculas. Fig. 1 Io l La cantidad de luz absorbida por la sustancia depende del nmero de molculas interpuestas en el trayecto del haz, de la naturaleza de la sustancia en solucin y de la longitud de onda () de la luz monocromtica empleada.As para una misma sustancia y para una misma longitud de onda la cantidad de luz absorbida depende de la concentracin de la sustancia en solucin y del espesor de la masa de solucin interpuesta (l). Se define transmitancia (T) a la relacin: T= I/Io La ecuacin que relaciona la transmitancia con la concentracin del soluto (c) y con el espesor de la masa de solucin interpuesta (l) se conoce con el nombre de Ley de Lambert y Beer: T= 10-.c.l : coeficiente de extincin molecular, depende de la naturaleza de la sustancia y de la longitud de onda del haz incidente. c: es la concentracin molar del soluto l: es el espesor de la masa de solucin interpuesta expresada en cm (paso ptico). Se define absorbancia (A) o densidad ptica (D.O) al cologaritmo de la transmitancia: A= - log T A= .c.l Las medidas de transmitancia se expresan como porcentaje y las de absorbancia en unidades de absorbancia (U.A). Espectro de absorcin: Como ya mencionamos la absorbancia de una sustancia depende de la longitud de onda. El grfico de la absorbancia de una sustancia en funcin de la longitud de onda constituye el espectro de absorcin de esa sustancia. Determinacin de la concentracin de un soluto por medida de la absorbancia: De acuerdo a la expresin lineal de la Ley de Lambert y Beer (A=.c.l) para una sustancia dada y a una longitud de onda dada, dejando constante l, la absorbancia vara nicamente con la concentracin. Este es el fundamento de la aplicacin de la medida de absorbancia para la determinacin de la concentracin de una sustancia en solucin. Dado que generalmente se utilizan cubas de espesor de 1 cm (l): A= .c, de donde = A/c. Es as que para determinar la concentracin (c) basta comparar su absorbancia con la de una solucin de concentracin conocida. La grfica de absorbancia en funcin de la concentracin de la solucin patrn a una longitud de onda dada se denomina curva de calibracin. I

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El rango de concentraciones dentro del cual se cumple dicha relacin es aquel en el que la curva es ajustable a una recta. La pendiente de esta recta corresponde al coeficiente de extincin molecular (). Por lo tanto, para valores mayores de pequeas variaciones de concentracin determinarn mayores variaciones de absorbancia. De lo anterior se deduce que las longitudes de onda a las cuales se deben realizar las medidas de absorbancia deben ser aquellas que correspondan a mayores valores de . El espectrofotmetro: es el instrumento mediante el cual se realizan las medidas de absorbancia y transmitancia. Consta de: fuente de luz: pueden ser lmparas que emiten luz de diferentes longitudes de onda: ultravioleta (200 a 400nm), visible (400 a 750 nm) e infrarrojo. monocromador: es un dispositivo para descomponer la luz policromtica procedente de la fuente, en haces de luz monocromtica. un diafragma: permite controlar la cantidad de luz que incide sobre la solucin y la pureza del haz monocromtico. cubeta: recipiente transparente donde se coloca la muestra. transductor fotoelctrico: est destinado a transformar en corriente elctrica el haz de luz emergente. La intensidad de la corriente que genera es proporcional a la intensidad de luz que recibe.
ampermetro: mide la intensidad de la corriente, expresando los valores en % de transmitancia o unidades de absorbancia.
Eliminado: Eliminado: Eliminado: 3. Procedimiento experimental. Con formato: Texto independiente 2, Justificado, No conservar con el siguiente, Borde: Inferior: (Sin borde)

Eliminado:

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3. Procedimiento experimental.

A. Determinacin de espectrofotomtrico:

la

concentracin

de

glucosa

por

un

mtodo

En soluciones alcalinas calientes, los glcidos reductores reducen al 3-5 dinitrosaliclico (DNS) para dar glcidos oxidados y 3-amino-5-nitrosaliclico, compuesto de color anaranjado intenso con pico de absorbancia a 550 nm. Dicha absorbancia es directamente proporcional a la concentracin de glcidos reductores y por tanto el mtodo puede utilizarse para cuantificar glucosa realizando una curva de calibracin. 1- Preparacin de una solucin de glucosa: preparar por pesada 50 ml de una solucin 10 mM de glucosa 2- Realizacin de una curva de calibracin y determinacin de la concentracin de glucosa de las muestras del cultivo. a- Utilizando la glucosa 10 mM preparar por dilucin soluciones de concentraciones conocidas de glucosa y agregar 0.5 ml de DNS a cada tubo (ver tabla): Curva de calibracin del DNS con glucosa: tubo B 1 2 3 4 5 glucosa10 mM (ml) 0.2 0.4 0.6 0.8 1 H2O (ml) 1 0.8 0.6 0.4 0.2 DNS (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Glucosa (mM)
Con formato: Fuente: Negrita Con formato: Fuente: Negrita Con formato: Fuente: Negrita Con formato: Centrado Con formato: Fuente: Negrita Tabla con formato Con formato: Fuente: Negrita Con formato: Fuente: Negrita Con formato: Centrado Con formato: Fuente: Negrita Con formato: Centrado, Sin vietas ni numeracin, Control de lneas viudas y hurfanas Con formato: Centrado Con formato: Fuente: Negrita Con formato: Centrado Con formato: Fuente: Negrita Con formato: Centrado Con formato: Fuente: Negrita Con formato: Centrado, Sin vietas ni numeracin, Control de lneas viudas y hurfanas Con formato: Centrado Con formato: Fuente: Negrita Con formato: Centrado

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b- Tomar 0.1 ml de las muestras obtenidas a partir de los sobrenadantes de los cultivos de levaduras. Agregar a cada tubo 0.9 ml de agua y luego 0.5 ml de DNS. c- Incubar todos los tubos en bao a 100C durante 5 minutos. Finalizada la reaccin, diluir todos los tubos agregando 3 ml de agua destilada y leer la absorbancia en espectrofotmetro a 550 nm de longitud de onda, contra blanco de la curva de calibracin. B. Observacin de los cultivos al microscopio ptico. Ensayo de viabilidad Preparar de los dos cultivos (1 y 2) una mezcla de 0.5 ml del cultivo con 0.5 ml de una solucin del colorante vital Trypan Blue (0.4%). Esperar 5 minutos a temperatura ambiente. Realizar un preparado fresco de cada cultivo y observar al microscopio ptico.

4. Anlisis de los resultados.

Informe de la actividad Prctica Los resultados obtenidos en el prctico debern ser procesados en un informe presentado en procesador de texto (doc. tipo Word) a travs de EVA, conteniendo los siguientes puntos: 1- Objetivos de la actividad Prctica 2- Resultados experimentales a)- Curva de crecimiento: es la grafica de absorbancia a 600 nm en funcin del tiempo para los cultivos de levaduras. Las curvas en ausencia y presencia del inhibidor se superponen en un nico grfico. b)- Curva de calibracin para el DNS: Grafica de Abs550nm en funcin de [glucosa] (mM). Debe mostrarse la ecuacin de la recta utilizada para obtener el valor del coeficiente de extincin molar (550nm) . c)- Consumo de glucosa: Grafica de concentracin de glucosa en funcin del tiempo para los cultivos de levaduras en ausencia y presencia del inhibidor. Ambas curvas se superponen en el mismo grafico. d)- Resultados del ensayo de viabilidad con Trypan blue 3- Conclusiones El informe no podra excederse de 3 carillas.

Eliminado: G Eliminado: a Eliminado: Eliminado: (curva de calibracin) Eliminado: Obtener Con formato: Sin Superndice / Subndice