Universidad Nacional Autnoma de Mxico Facultad de Estudios Superiores Cuautitln Campo 1

Carrera: Qumica Asignatura: Bioqumica estructural Grupo: 2601 Reporte de la prctica No. 8 Cintica enzimtica de la ureasa Equipo No. 2 Chvez Ramos Kenia Len Len Donaldo Gamaliel Fecha de realizacin de la prctica: 25 de abril de 2012 Fecha de entrega del reporte: 2 de mayo de 2012 Asesoras: Q. Karla Hernndez Prez QFB Jessica Filisola Villaseor

Introduccin
Las enzimas son molculas de naturaleza proteica que catalizan reacciones qumicas, siempre que sean termodinmicamente posibles: Una enzima hace que una reaccin qumica que es energticamente posible (ver Energa libre de Gibbs), pero que transcurre a una velocidad muy baja, sea cinticamente favorable, es decir, transcurra a mayor velocidad que sin la presencia de la enzima. En estas reacciones, las enzimas actan sobre unas molculas denominadas sustratos, las cuales se convierten en molculas diferentes denominadas productos. Casi todos los procesos en las clulas necesitan enzimas para que ocurran a unas tasas significativas. A las reacciones mediadas por enzimas se las denomina reacciones enzimticas.

Figura 1. Graficas de las energias de las diferentes fases de una reaccin qumica. Las velocidades de las enzimas dependen de las condiciones de la solucin y de la concentracin de sustrato. Aquellas condiciones que desnaturalizan una protena, como temperaturas elevadas, pH extremo o altas concentraciones de sal, dificultan o impiden la actividad enzimtica, mientras que elevadas concentraciones de sustrato tienden a incrementar la actividad. Para encontrar la mxima velocidad de una reaccin enzimtica, la concentracin de sustrato se incrementa hasta que se obtiene una tasa constante de formacin de producto. A la mxima velocidad (Vmax) de la enzima, todos los sitios activos de dicha enzima tienen sustrato unido, y la cantidad de complejos ES es igual a la cantidad total de enzima. Sin embargo, Vmax es slo una de las constantes cinticas de la enzima. La constante de Michaelis-Menten (Km), que viene a ser la concentracin de sustrato necesaria para que una enzima alcance la mitad de su velocidad mxima. Cada enzima tiene un valor de Km caracterstico para un determinado sustrato, el cual puede decirnos cmo de afn es la unin entre el sustrato y la enzima.

Figura 2. Curva de saturacin de una reaccin enzimtica donde se muestra la relacin entre [S] y la velocidad de reaccin. Los inhibidores son molculas que regulan la actividad enzimtica, inhibiendo su actividad. A grandes rasgos, pueden clasificarse en reversibles e irreversibles. Las irreversibles se unen covalentemente a la enzima sin posibilidad de revertir la modificacin, siendo tiles en farmacologa. Las reversibles se unen de forma reversible a la enzima, pudiendo clasificarse a su vez, segn la forma en que intervienen en la reaccin, en competitivas, acompetitivas y mixtas.

Figura 3. Inhibicin enzimtica.

Objetivos.
Extraer ureasa de frijol de soya aplicando homogeneizacin mecnica con un mortero y empleando centrifugacin esto con el fin de analizar factores que modifican la cintica de esta enzima sobre la urea. Analizar los siguientes factores: concentracin de sustrato, temperatura, pH y tiempo en la modificacin de la velocidad de reaccin enzimtica para determinara la condiciones ptimas de trabajo de la enzima. Obtener experimentalmente valores de Vmx y de Km por medio del modelo de Michaellis-Menten y por el modelo de Lineweaver-Burk y estos compararlos con los reportados en la literatura.

Diagrama ecolgico.

Metodologa.
La extraccin de la enzima, se llevo a cabo por cada equipo. La modificacin realizada a la prctica, fue que se reparti el resto de las actividades; siendo el pH el factor con el que trabajamos empleando la metodologa indicada en el manual de Bioqumica, correspondiente a la prctica No. 8, pgina 65.

Observaciones y resultados.
Se trituraron 0.3g de frijol de soya y se agregaron 10 mL de etanol hasta obtener un homogeneizado. Kenis no recuerdo si tomast foto a esto, si si lo tomast anexala sino omite esto. Figura 4. Homogeneizado de frijol de soya. Se centrifugo el homogeneizado a 2500 rpm durante 15 min. La misma indicacin anterior kenis. Figura 5. Centrifugado del homogeneizado. Se preparo una serie de 5 tubos de acuerdo a las indicaciones en el manual de prcticas que serian los blancos, tambin se preparo otra serie de tubos siguiendo otra metodologa tambin indicada en el manual pero estos sern los tubos problema. Estas dos series de tubos se incubaron a 50c durante 5 minutos pasado este tiempo se les adiciono 0.5 mL del extracto de ureasa mientras volvindose a incubar por 30 min a 50C, terminado el tiempo a los tubos problema se les adiciono 4 gotas de bicloruro de mercurio y a ambas series se les agrego 2 gotas de rojo de metilo y se procedi a valorar con HCl 0.1N hasta un vire de color canela. Figura 6. Coloracin canela esperada.

Clculos y grficos.
Se procedi a calcular los micromoles de urea hidrolizados para cada uno de los factores de cada uno de los tubos, teniendo en cuenta que al hidrolizarse la urea se producen dos iones de amonio que reaccionan con el HCl 0.1N que contiene 100 micromoles/mL, de tal manera que los micromoles de urea hidrolizados se obtienen multiplicando el valor de titulacin corregido (VTC) de cada tubo por 50, esto porque por cada dos iones de amonio reacciona un micromol de HCl, es decir, se tienen 50 micromoles por cada molcula de amonio formada por la hidrlisis de la urea

que estn reaccionando con los 100 micromoles de HCl. Creo q s x esto el 50, si cres q s otro cosa kenis, asmelo saber!.

Tabla 1. Efecto del pH sobre la velocidad de la reaccin. Tubo 1 2 3 4 5 pH 4.5 6 7.2 8.5 10 VTB 0 0.1 1.7 2.4 2.6 VTP 0 0.6 2.3 2.6 2.8 VTC 0 0.5 0.6 0.2 0.2 moles de urea hidrolizadas 0 25 30 10 10

Cabe mencionar que la coloracin inicial de la muestra a valorar con la gotas de rojo de metilo era de color amarillo y al adicionar HCl 0.1N y alcanzar el volumen de vire se observaba una coloracin color canela como se menciono anteriormente. En el caso de los tubos 1 y ya que los valores son de 0 en el caso del blanco presentaba una coloracin rojiza intensa esto significa que el pH en el medio es ms bajo en comparacin de la muestra problema que est presentaba la coloracin canela. Se realizo un grafico de Velocidad de reaccin donde esta se expresa en micromoles/mL en funcin del pH.
V / moles mL-1 35 30 25 20 15 10 5 0 0 2 4 6
pHopt

10

12 pH

Grfica 1. Velocidad de reaccin en funcin del pH.

La lnea punteada muestra que el pH ptimo de trabajo es de 7.2, esto quiere decir, que al valor de pH mencionado es el valor donde la enzima presenta su mayor actividad cataltica. Como mtodo alternativo; el pH es una funcin logartmica de la concentracin de protones ([H+]) por lo tanto se realizara un grafico parecido al anterior con la diferencia que ahora se expresara la velocidad de reaccin en escala logartmica, es decir, se graficara log v en funcin del pH. Ya que el primer valor es cero, a este no se le aplicara logaritmo ya que es un error matemtico.
log V 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 2 4 6
pHopt

10

12 pH

Grfica 2. Logaritmo de la velocidad de reaccin en funcin del pH. De acuerdo al grfico la velocidad mxima se da al valor de pH de 7.2, mismo valor determinado anteriormente, por lo tanto, el pH ptimo es de 7.2

Para obtener los micromoles de urea hidrolizadas para el resto de los factores en estudio, los equipos nos proporcionaron sus resultados para poder lograr los objetivos, presentados en las posteriores tablas (tabla 2, 3 y 4) posteriormente se realizo un grafico para cada factor de velocidad de reaccin (moles de urea hidrolizadas) en funcin de cada factor. Tabla 2. Efecto del tiempo sobre la velocidad de la reaccin. Tubo 1 2 3 4 5 t/min 10 20 30 40 50 VTB 0.4 0.3 0.4 0.3 0.4 VTP 0.3 0.3 0.3 0.5 0.4 VTC -0.1 0 -0.1 0.2 0 moles de urea hidrolizadas -5 0 -5 10 0

V / moles mL-1

12 10 8 6 4 2 0 -2 -4 -6 t/min 0 10 20 30 40 50 60

Grfica 3. Velocidad de reaccin en funcin del tiempo. Ya que el grafico no presenta el comportamiento correcto, se retiraran los datos (30,-0.5) y (50,0) y posteriormente se tratara el anlisis de esta grafica; por el momento se indicara que el retirar los datos es incorrecto pero se har con fines de anlisis de resultados.
V / moles mL-1 12 10 8 6 4 2 0 -2 -4 -6 t/min 0 10 20 30 40 50

Grfica 4. Velocidad de reaccin en funcin del tiempo corregida.

Tabla 3. Efecto de la temperatura sobre la velocidad de la reaccin. Tubo 1 2 3 4 5 T/C 0 26 50 70 90 VTC 0.2 0.3 0.6 0.2 0.1 moles de urea hidrolizadas 10 15 30 10 5

V / moles mL-1

35 30 25 20 15 10 5 0 0 20 40
Topt

60

80

100 T/C

Grfica 5. Velocidad de reaccin en funcin de la temperatura. De acuerdo a la grfica se pudo obtener la temperatura ptima de trabajo, es decir, la temperatura a la cual la enzima tiene su mayor actividad cataltica siento este valor de 50C. Para el efecto de la concentracin de sustrato, primeramente se calcularon los micromoles de urea iniciales por mL para cada tubo tomando en cuenta que cada mL de solucin 0.25M de urea contiene 250 micromoles/mL as como el volumen total en cada tubo. El clculo de los micromoles hidrolizados se realizo de la manera anteriormente mencionada. Por ejemplo para el primer tubo que contena 0.5mL de urea 0.25M y un volumen total de 10mL el clculo de los micromoles iniciales es de la siguiente manera: ( )( )

Tabla 4. Efecto de la concentracin de sustrato sobre la velocidad de la reaccin. Tubo 1 Concentracin inicial de urea en moles/mL en el medio 12.5 VTC 0.8 moles de urea hidrolizadas 40

2 3 4 5

25 50 125 187.5

1.2 1 1 1

60 50 50 50

V / moles mL-1

70 60 50 40 30 20 10 0 0
KM=7.5
1/2 Vmx=25

Vmx = 50

50

100

150

200

[S]i / moles mL-1

Grfica 6. Velocidad de reaccin en funcin de la concentracin de sustrato inicial. Aunque el grafico anterior no presenta el comportamiento correcto, se determino el valor de KM caracterstico de esta enzima, siendo es de 7.5 moles/mL. Ya que estos valores no son del todo correctos por el mal comportamiento del grafico, con fines de obtener mayor utilidad de estos datos, se procedi a realizar un grafico de dobles reciprocos (ecuacin de Lineweaver-Burk), donde la expresin es la ecuacin de una lnea recta: ( ) [ ] Tabla 5. Valores de 1/[S] y 1/V. 1/[S] 1/V 0 0 0.08 0.025 0.04 0.01666667 0.02 0.02 0.008 0.02 0.00533333 0.02

1/V

0.03 0.025 0.02 0.015 0.01 0.005 0 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 1/[S]

Grfica 7. Grfica de dobles recprocos. El comportamiento no es el esperado, y por lo tanto no se puede obtener de manera consistente valores para Vmx y KM.

Discusin de resultados.
Primeramente, las enzimas son sensibles al pH; esta dependencia del pH se debe, normalmente, a la presencia de uno o ms aminocidos cargados en el sitio activo de la enzima o del propio sustrato. Como se podra esperar, la dependencia del pH de una enzima normalmente refleja el medio ambiente en el cual la enzima esta activa, es decir, existe un valor de pH en donde la enzima presenta su actividad mxima, se le conoce como pH optimo, as que por debajo o por encima de este valor de pH la enzima se inactiva. De acuerdo a esto, el valor obtenido experimentalmente corresponde a un valor de pH de 7.2, esto es corroborado con la literatura y por lo tanto, el efecto del pH sobre la actividad de la ureasa es notorio en la velocidad de reaccin para valores de pH mayores y menores de 7.2, su mxima actividad cataltica es a este valor de pH. Con respecto al efecto del tiempo en la velocidad de reaccin, experimentalmente no se obtiene el resultado esperado ya que el grafico no presenta el comportamiento caracterstico, el cual debi haber sido parecido al de la grfico 4 supuestamente corregida, pero como se menciono anteriormente, esa correccin es errnea ya que no se estn tomando casi la mitad de datos y se est forzando a tomar la tendencia esperada. La tendencia correcta (Grfica 4) es vlida para cuando la concentracin de sustrato es mayor que la concentracin del enzima, esto porque a mayor concentracin del sustrato la enzima se cubre de en su totalidad por este haciendo que la actividad de la enzima se lleve a cabo en su totalidad. La desaparicin de sustrato por la accin de la enzima es una funcin lineal del tiempo, esta velocidad alcanza un lmite de acuerdo a la naturaleza de la enzima y del sustrato.

Ahora, porque no se obtuvo una lnea recta parecida a la mostrada en la figura 7, esto error puede radicar en la temperatura en la que se trabajo, es decir, que por alguna razn esta haya excedido los 50C y la enzima al sobrepasar esta temperatura se inactiva, y que de acuerdo a los datos experimentales, los cuales algunos presentan signo negativo significara que la enzima no existe en el sistema. Otra posible respuesta a esto conlleva a un error experimental, que no se hayan tenido los cuidados pertinentes y que antes de la valoracin hubiera existido una confusin entre muestra problema y muestra blanco y esto se vea reflejado en los signos negativos que se obtuvieron. Justificacin para esto podran existir ms pero lo antes mencionado es lo que consideramos razonable para este problema.

Con respecto al efecto de la temperatura, la velocidad de reaccin catalizada por una enzima aumenta con la temperatura, ya que el incremento en la energa cintica de las molculas de la enzima y del sustrato, conduce a un mayor nmero de colisiones facilitando la unin correcta al sustrato. Sin embargo se llega un punto en el que el aumento en la temperatura es desfavorable porque la enzima se comienza a desnaturalizar. Por lo tanto se alcanza una temperatura en donde la enzima presenta su actividad mxima y que por debajo de esta la reaccin se lleva a menor velocidad y por arriba de esta la enzima se inactiva. Experimentalmente el valor obtenido de temperatura ptima de trabajo es a 50C, dato que se corrobora con la literatura, siendo esta temperatura a la cual la ureasa presenta su mayor actividad y como se menciono anteriormente, el sobrepasar de esta temperatura pudo haber provocado que la enzima se inactivara y as hubieran existido errores experimentales. Por ltimo, la velocidad de una reaccin catalizada enzimticamente, aumenta con la concentracin de sustrato pero de tal forma que cada incremento adicional de sustrato, da como resultado un aumento menor de la velocidad de reaccin. De manera ms precisa, se alcanzara un punto en donde ya no se observara ningn cambio en la velocidad de reaccin. Al alcanzar este punto, sin importar el incremento en la concentracin de sustrato, la velocidad de reaccin permanecer constante, a este punto se le conoce como velocidad mxima (Vmx). Esta relacin corresponde al modelo empleado por Michaellis-Menten que se puede ejemplificar de la siguiente manera:

Figura 7. Relacin entre velocidad de reaccin y concentracin de sustrato.

Experimentalmente no se obtuvo una tendencia de este tipo (grfica 6), pero con fines de enriquecer este anlisis, se procedi a determinar Vmx y Km. Se obtuvo un valor de 50 moles/mL como Vmx, para determinar el valor de Km, se consideraro:

Y aplicando interpolacin se obtuvo dicho valor, siendo este de 7.5 moles/mL, tericamente el valor de Km es de 2.5x10-2 M es decir 25 moles/mL, por lo que el resultado obtenido no es el correcto, esto puede ser justificado por qu no existi la tendencia esperada en este grafico (grfica 6). Ya que el primer grafico 6 no es congruente y no se obtuvieron resultados favorables se procedi a realizar el grafico de dobles recprocos (modelo Lineweaver-Burk), en este tipo de grafico se obtiene una funcin lineal, la cual es un arreglo al modelo empleado por Michaellis-Menten. El grafico terico presenta la siguiente tendencia.

Figura 8. Representacin del modelo de Lineweaver-Burk. De nueva cuenta, experimentalmente, no se obtiene el resultado esperado (grfica 7) y por esta razn, y como se menciono anteriormente, no se pueden obtener valores para Vmx y Km. De haberse propuesto la obtencin de estos valores, habran sido errneos con la justificacin del mal comportamiento de dicha grfica pero esta dems determinarlos.

Conclusiones.
Se extrajo uresa apartar del frijol de soya aplicando homogeneizacin mecnica con un mortero y empleando el mtodo de centrifugacin, en donde el sobrenadante contena esta enzima. Dicha enzima fue empleada para la hidrlisis de la urea.

En la hidrlisis se analizaron diversos factores que pueden modificar la velocidad de esta reaccin, entre ellos, el pH, la temperatura, el tiempo y la concentracin de sustrato. A partir de esto se obtuvieron las condiciones ptimas de trabajo de la enzima, las cuales son: pH=7.2 T=50C

Estas condiciones, fueron corroboradas con las reportadas en la literatura, siendo correctas. No se obtuvo la linealidad esperada con respecto al tiempo, en donde se planteo como justificacin un incremento en dicha temperatura, el cual pudo propiciar la desnaturalizacin de la enzima o bien, un error en cuanto a la metodologa a seguir. A partir del efecto propiciado por la concentracin de sustrato se espero determinar el valor de Vmx y de Km; experimentalmente se obtuvo una Vmx de 50moles/mL y un valor de Km de 7.5moles/mL, este ltimo no corresponde con el valor terico reportado, el cual es de 25 moles/mL. Asimismo se comprendi la relacin que existe entre los factores antes mencionados y la velocidad de reaccin de una reaccin catalizada enzimticamente as como la modificacin de esta, por la sensibilidad a dichos factores.

Referencias.
BECKER. W.M. (2012). Biologa celular y molecular. Primera edicin, Editorial Pearson Educacin, Mxico. Pags. Consultadas: 176-187. LEHNINGER. A. L. (1985). Curso breve de Bioqumica. Primera edicin, Editorial Omega, Barcelona. Pags. Consultadas: 74-77. LAGUNA. J y PIA E. (1995) Bioqumica. Primera edicin, editorial ciencia y cultura latinoamericana, Mxico. Pags. Consultadas: 60-72. Valor de Km de la ureasa. [en lnea]. Recuperado el 28 de Abril de 2012, de http://books.google.com.mx/books?id=r5bedH_aST0C&pg=PA495&lpg=PA495&dq=valor+de+km+ de+la+ureasa&source=bl&ots=RlgOjTwaO8&sig=nYoU3iALgm8r0x5nSNPTt2AvzRY&hl=es&sa=X&ei =6lmfT9GC8W42wWzxvHOAg&ved=0CDkQ6AEwBA#v=onepage&q=valor%20de%20km%20de%20la%20ur easa&f=false