Biotecnologia Examen

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BSICAS TECNOLOGAE INGENIERA CONTENIDO DIDCTICO DEL CUSO: 35689
9 BIOTECNOLOGA
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA

ESCUELA DE CIENCIAS BSICAS TECNOLOGA E INGENIERA PROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS
305689 - BIOTECNOLOGA FEDRA LORENA ORTIZ BENAVIDES (Director Nacional)
GLEATHER JHON FLOREZ Acreditador
PASTO 2010
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BSICAS TECNOLOGAE INGENIERA CONTENIDO DIDCTICO DEL CUSO: 35689 BIOTECNOLOGA
INDICE DE CONTENIDO
UNIDAD 1 : : ASPECTOS GENERALES DE BIOTECNOLOGA 4
CAPITULO 1. Contextualizacin de la Biotecnologa
Leccin 1. Definicin de Biotecnologa
Leccin 2: Historia de Biotecnologa
Leccin :3 Divisin y tipos de Biotecnologa
Leccin 4:
Impacto de la Biotecnologa en el contexto colombiano
Leccin 5: Tendencias de la Biotecnologa
CAPITULO 2 : BIOTECNOLOGA DE LAS FERMENTACIONES
13
Leccin 1: Nutricin microbiana
13
Leccin2: Metabolismo energtico
15
Leccin 3: Aspectos generales de los procesos biosintticos
19
Leccin 4 : Crecimiento microbiano
23
Leccin 5: Modelos matemticos que explican el crecimiento microbiano
23
CAPITULO 3 : SISTEMAS DE FERMENTACIN
23
Leccin 1: Tipos de fermentacin Leccin 2: Productividad y velocidad especfica de produccin
26 28
Leccin 3: Coeficientes de rendimiento
29
Leccin 4: Biorreactores
29
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BSICAS TECNOLOGAE INGENIERA CONTENIDO DIDCTICO DEL CUSO: 35689 BIOTECNOLOGA Leccin 5: Transferencia de O2 y fermentacin a gran escala 31
UNIDAD 2 : BIOCATALISIS E INGENIERA GENTICA APLICADA A LA BIOTECNOLOGA ALIMENTARIA
33
CAPITULO UNO : BIOTECNOLOGA ENZIMTICA
33
Leccin 1 : Las enzimas biocatalizadores de naturaleza proteica
37
Leccin 2: Naturaleza de las enzimas
40
Leccin 3: Clasificacin de enzimas segn la naturaleza de la reaccin y cofactores
41
Leccin 4: Cintica enzimtica
41
Leccin 5: Produccin de enzimas
43
CAPITULO DOS : PRINCIPIO DE INGENIERIA GENETICA APLICADO A LA BIOTECNOLOGA Leccin 1: Tcnicas utilizadas en la manipulacin gentica in vitro.
44
46
Leccin 2: Tecnologa del ADN recombinante
47
Leccin 3: La reaccin en cadena de polimerasa ( PCR)
47
Leccin 4: Mutagnesis , Mutagnesis dirigida por oligonucletidos
47
Leccin 5: Mutagnesis en casette o interrupcin gnica
47
CAPITULO 3 : APLICACIONES DEL ADN RECOMBINANTE EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA
49
Leccin 1: Animales transgnicos
50
Leccin 2: Plantas Transgnicas
51
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BSICAS TECNOLOGAE INGENIERA CONTENIDO DIDCTICO DEL CUSO: 35689 BIOTECNOLOGA Leccin 3: Alimentos genticamente modificados 54
Leccin 4: Alimentos funcionales
54
Leccin 5: Prebiticos
59
UNIDAD 3 : PRODUCTOS BIOTECNOLGICOS DE INTERES ALIMENTARIO
60
CAPITULO 1: APLICACIN DE LA BIOTECNOLOGA EN LA OBTENCIN DE PRODUCTOS DERIVADOS DEL METABOLISMO ENERGTICO POR VA FERMENTATIVA.
60
Leccin 1: Bebidas alcohlicas
61
Leccin 2: Biologa de las fermentaciones con levaduras y condiciones de la fermentacin
66
Leccin 3: Compuestos organolpticos
70
Leccin 4 : Alimentos basados en soja fermentada Leccin 5 : Productos crnicos fermentados
71 72
CAPTULO DOS: ALIMENTARIA
OTROS PRODUCTOS DE INTERS EN LA INDUSTRIA
78
Leccin 1: Produccin de levadura
Leccin 2 : Vinagre
81
leccin 3 : acido Lctico leccin 4: acido Actico
81 81
Leccin 5 : Produccin de acido ctrico
83
CAPITULO 3 : BIOPOLIMEROS MICROBIANOS
83
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BSICAS TECNOLOGAE INGENIERA CONTENIDO DIDCTICO DEL CUSO: 35689 BIOTECNOLOGA Leccin 1 : Polisacridos microbianos y PHAs 84
Leccin 2: Poli hidroxibutirato
86
Leccin 3: Los alginatosy Gelanos
88
Leccin 4: Xantano
88
Leccin 5: Dextranos
lEC
BIBLIOGRAFIA
104
LIISADO DE TABLAS Nombre Tabla 1 Tabla 2:

Productos derivados de la fermentacin Produccin total de una fermentacin continua Tamao de fermentadores para varios procesos Produccin de enzimas microbianas Enzimas utilizadas alimenticia en la Industria
Pgina 34 38
Tabla 3:
41
Tabla 4 Tabla 5
49 50
Tabla 6
Caractersticas de la industrial de cido ctrico
produccin
96
LISTADO DE GRFICOS Y FIGURAS

Tabla Figura 1 Figura 2 Figura 3 Figura 4 Figura 5 Figura 6 Nombre Fases del metabolismo microbiano Curva de crecimiento microbiano Fermentacin continua en quimiostato Efecto de la velocidad del flujo sobre la concentracin de sustrato Productividad total y productividad mxima Productividad en relacin a la concentracin de cidos grasos en un proceso de produccin de protena de origen unicelular Esquema de un reactor aerobio con agitacin mecnica Esquema de un reactor tipo Air lift Enzimas complejos Ejemplo de cofactor Enzimas de oxido-reduccin Transferasas Hidrolasas Liasas Ejemplo de isomerizacin Ligasas Cintica enzimtica Curva : Velocidad enzimtica/concentracin de la enzima Curva de enzimas alostricas Esquema para la produccin de enzimas por fermentacin Clasificacin deformas de obtencin de enzimas La separacin de los cidos nucleicos Procedimientos bsicos del ADN recombinante Replicacin del ADN, utilizando (PCR) Mutagnesis Mutagnesis dirigida Mutacin por casette Mejoramiento gentico en bovinos Ejemplo de plantas genticamente modificadas Alimentos basados en soja fermentada Ruta de la produccin de citrato Pgina 34 36 39
Figura 7 Figura 8 Figura 9 Figura 10 Figura 11 Figura 12 Figura 13 Figura 14 Figura 15 Figura 16 Figura 17 Figura 18 Figura 19 Figura 20 Figura 21 Figura 22 Figura 23 Figura 24 Figura 25 Figura 26 Figura 27 Figura 28 Figura 29 Figura 30 Figura 31
ASPECTOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL Y VERSIONAMIENTO
El contenido didctico del curso acadmico: Biotecnologa_305689 fue diseado inicialmente en el ao 2007 por FEDRA LORENA ORTIZ BENAVIDES, docente de la UNAD, ubicado en el CEAD de Pasto. Se ha desempeado como tutor de la UNAD desde el 2005 hasta el ao 2008, en este momento es Docente Auxiliar de la escuela de Ciencias Bsicas, tecnologa e Ingeniera y ha sido catedrtico de la Universidad de Nario. El contenido didctico ha tenido tres actualzaiciones: dos desarrolladas por la misma profesora Ortiz en los aos 2008 y 2009 El Doctor Gleather Jhon Flrez, tutor del CEAD Jos Celestino Mutis - Bogot, apoy el proceso de revisin de estilo del contenido didctico e hizo aportes disciplinares, didcticos y pedaggicos en el proceso de acreditacin del material didctico desarrollado en el mes de Julio de 2009.
INTRODUCCIN
Aunque la utilizacin de organismos vivos para obtener productos comerciales se remonta a la antigedad, cuando el hombre sin saberlo utilizaba microorganismos para obtener el vino, o pan, los acontecimientos cientficos en las ltimas dcadas han revolucionado el panorama industrial con productos de diversa ndole obtenidos a travs de la manipulacin o transformacin de los organismos vivos.
El desarrollo de la biologa en las ltimas cuatro dcadas, ha hecho posible el desarrollo de sofisticados, procedimientos para el aislamiento, manipulacin y expresin de material gentico, lo que ha llevado consigo al avance de una nueva disciplina: La
Bi ot ec nol og a. , la cual tiene aplicaciones tanto en la investigacin bsica, como en la
aplicada. Las tcnicas de esta ciencia se han utilizado para estudiar los mecanismos de la replicacin y expresin gnicas en procariotas, eucariotas y sus virus. Algunos de los ms importantes descubrimientos bsicos de la gentica se han realizado utilizando tcnicas ingenieriles. En cuanto a la investigacin aplicada, la Biotecnologa permite el desarrollo de cultivos microbianos capaces de fabricar productos valiosos, tales como la insulina humana, la hormona humana del crecimiento, interfern, vacunas y enzimas industriales. La aplicacin industrial de la Biotecnologa, parece tener un potencial ilimitado.
La Biotecnologa, se ha convertido en la herramienta para un nuevo desarrollo social, basado en el conocimiento del funcionamiento de la vida y sus posibilidades de manipularlo y transformarlo. Su impacto en la Medicina, la agricultura, el mejoramiento de las especies, la evolucin, la industria alimenticia y la farmacologa, dan muestra de la importancia que tiene esta disciplina, que se ha convertido sin lugar a dudas en la base de la revolucin tecnolgica que ha acaparado la atencin de los cientficos y gobiernos como posible estrategia para encontrar soluciones a los problemas que aquejan a la humanidad.
Nuestro pas, tiene un desafo de gran envergadura ante fenmenos tales como la globalizacin neoliberal, el deterioro ambiental, la crisis financiera y otras amenazas que
pueden afectar seriamente sus potencialidades de desarrollo futuro. Como una estrategia para hacer frente a los retos de la post - modernidad es necesario aprovechar los recursos naturales, utilizar racionalmente la biodiversidad y desarrollar proyectos productivos.
Las expectativas se centran en el acceso a nuevas fuentes de diversidad biolgica, con un suministro adecuado y oportuno de informacin sobre sus aplicaciones potenciales. Sin embargo, en la revista colombiana de Biotecnologa1se advierte de la urgencia de incorporar valor agregado a la biodiversidad mediante el conocimiento generado a travs de la investigacin, porque la oportunidad que nos da el hecho de ser un pas megadiverso va a desaparecer si no actuamos a favor de nuestro futuro. Es por eso que consideramos que este es un curso de gran importancia que sin lugar a dudas les brindara a los estudiantes de la UNAD, los conocimientos que los llevaran a la reflexin de utilizar nuestra diversidad como fuente de progreso y desarrollo individual y social.
En consecuencia, el programa de Biotecnologa pretende desarrollar en los estudiantes actitudes cientficas as como brindarles las bases conceptuales y procedimentales para hacer uso sostenible del potencial bitico que ostenta nuestro pas a lo largo y ancho de su geografa.
UNIDAD 1
CAPITULO 1. CONTEXTUALIZACIN DE LA BIOTECNOLOGA 4
Leccin 1. Definicin de Biotecnologa
Leccin 2: Historia de Biotecnologa
Leccin :3 Divisin y tipos de Biotecnologa
Leccin 4:
Impacto de la Biotecnologa en el contexto colombiano
Leccin 5: Tendencias de la Biotecnologa
CAPITULO 2 : BIOTECNOLOGA DE LAS FERMENTACIONES
13
Leccin 6: Nutricin microbiana
13
Leccin 7: Metabolismo energtico
15
Leccin 8: Aspectos generales de los procesos biosintticos
19
Leccin 9 : Crecimiento microbiano
23
Leccin 10: Modelos matemticos que explican el crecimiento microbiano
23
CAPITULO 3 : SISTEMAS DE FERMENTACIN
23
Leccin 11: Tipos de fermentacin
26
Leccin 12: Productividad y velocidad especfica de produccin
28
Leccin 13: Coeficientes de rendimiento
29
Leccin 14: Biorreactores
29
Leccin 15: Transferencia de O2 y fermentacin a gran escala
31
UNIDAD 1: ASPECTOS GENERALES DE BIOTECNOLOGA.
Introduccin: La siguiente unidad ha sido dividida en tres captulos: en el primero, se pretende que los estudiantes se apropien del concepto de biotecnologa, los fundamentos bsicos que caracterizan esta disciplina para luego identificarlos y diferenciarlos de otros procesos. En el segundo captulo, se pretende que los estudiantes a travs del conocimiento bsico del metabolismo celular sean capaces de proponer el mejor ambiente para que la respuesta celular sea la ms eficiente para la obtencin de productos y o servicios en la industria alimentaria. Por ltimo en el tercer captulo se hace una introduccin sobre sistemas de fermentacin que les permita conocer a los estudiantes las tcnicas, procesos y procedimientos que se realizan a nivel industrial para la obtencin de un producto derivado de la fermentacin.
Objetivos de la unidad Contextualizar el estudio de la Biotecnologa alimentaria analizar su impacto en la sociedad contempornea y
Consolidar conceptos bioqumicos esenciales para aproximarse y comprender la complejidad de reacciones metablicas que se traduce en la produccin de biomasa en la sntesis de sustancias Adquirir bases tericas que respaldan los procesos de produccin de biomasa y metabolitos. Estudiar dispositivos empleados en la produccin de biomasa y metabolitos Obtener bases tericas para produccin y purificacin de enzimas microbianas de aplicacin comercial. Obtener una visin de la importancia del control de la produccin para asegurar calidad de los productos
CAPITULO 1. CONTEXTUALIZACIN DE LA BIOTECNOLOGA. Leccin 1. Definiciones de Biotecnologa Existen diversas definiciones de Biotecnologa provenientes de diversos enfoques y puntos de vista, que van desde conceptos ms generales hasta particulares. Por ejemplo: La biotecnologa, se ha definido como la aplicacin de organismos, componentes o sistemas biolgicos para la obtencin de bienes y servicios. Sin embargo, se considera que este enunciado es muy amplio y engloba todas las operaciones de la biologa aplicada desde la agricultura hasta la ciencia culinaria.
En un sentido mucho ms estrecho, la palabra biotecnologa se refiere a veces, para definir la utilizacin de la manipulacin gentica con el fin de obtener la expresin correcta a altos niveles de un gen clonado en clulas husped. As como tambin la aplicacin de la biologa molecular en direcciones que se esperan sean de utilidad como el uso de marcadores moleculares para identificar microorganismos de importancia agrcola. Este enfoque, supone confundir los aspectos de moda con los principios de la biotecnologa y se debe ms a la filosofa de las agencias de publicidad y medios de comunicacin que a la industria.
Segn la OTA-USA (1981), la OECD (1982) y la CEPA-Canad (1985), la biotecnologa es la aplicacin de la ciencia y la ingeniera en el uso directo o indirecto de organismos vivos o parte de ellos, en sus formas naturales o modificadas, en una forma innovadora para la produccin de bienes y servicios o para la mejora de procesos industriales existentes. Desde este punto de vista se evidencia una integracin entre las ciencias bsicas con las ciencias aplicadas puesto que se pretende emplear de forma controlada y deliberada agentes biolgicos sencillos como clulas vivas o muertas, o componentes celulares en operaciones tcnicamente beneficiosas, bien sea de fabricacin de productos o como operaciones de servicios. Para responder a los planteamientos de la anterior definicin la biotecnologa debe considerarse como un rea del conocimiento intensamente interdisciplinar, caracterizada por la reunin de conceptos
y metodologas procedentes de numerosas ciencias para aplicarlas tanto a la investigacin bsica como a la resolucin de problemas prcticos y la obtencin de bienes y servicios. Algunas de las ramas de conocimiento implicadas en la biotecnologa son: La Microbiologa, Embriologa, Bioqumica, Gentica, Biologa celular, Qumica, Mecnica, Electrnica, Informtica. Entre otras. En conclusin, la biotecnologa surge como un espacio de recombinacin de conocimiento de diversas reas del conocimiento que pretende dar soluciones a los problemas relacionados con la medicina, la agronoma, zootecnia, la agroindustria, la ingeniera de alimentos, problemas ambientales, entre otros campos. Es as entonces, que el aporte de la biotecnologa se produce en dos etapas, en la primera, segn Cruz Lage (2004) la investigacin cientfica bsica que se coloca por delante de la innovacin tecnolgica, exponiendo todo su valor predictivo y transformador, adems de su capacidad explicativa. No hay desarrollo en esta rama sin investigacin cientfica. La segunda fase, se caracteriza por el desarrollo de un sistema estandarizado de mtodos secuenciales entre los cuales se identifican claramente las relaciones y procedimientos operacionales que condicionan el xito del proceso.
AUTOEVALUACIN.
Realice un mapa conceptual sobre el concepto de Biotecnologa
Leccin 2: Historia de la biotecnologa La Biotecnologa como ciencia interdisciplinar, surge desde diversas reas del conocimiento y de la aplicacin espontnea para la obtencin de bienes y servicios desde sus primeras pocas, por lo tanto mucho de su desarrollo est ntimamente ligado con el desarrollo e historia de las Ciencias. Como La biologa, la microbiologa, la bioqumica y obviamente al desarrollo tecnolgico. Si bien es cierto, en las primeras etapas de la historia de la humanidad se utilizaron los seres vivos o productos derivados de ellos para atender las necesidades del hombre tales como el vino y el pan, entre otros; estos productos no pueden considerarse como un resultado de procesos biotecnolgicos, puesto que en este estadio de desarrollo las fermentaciones son procesos naturales que no involucran la
manipulacin de los sistemas biolgicos para modificar o controlar las propiedades del producto obtenido. Sin embargo, esta es una larga etapa de prembulo caracterizada por las ideas vitalistas o animistas que desde un enfoque dialctico motivan el desarrollo de mtodos experimentales que buscan predecir, explicar y transformar los fenmenos biolgicos para obtencin de bienes y servicios, que finaliza con la consolidacin de la moderna Biotecnologa en el siglo XX I.
Para comprender la historia de la Biotecnologa es preciso dividirla en cuatro fases. Primera poca o era precientfica: corresponde a la poca anterior a Pasteur y sus comienzos se confunden con los de la humanidad. En esta poca, se realizan prcticas empricas de seleccin de plantas y animales y sus cruzas, y fermentaciones como un proceso para preservar y enriquecer el contenido protenico de los alimentos. Este perodo se extiende hasta la segunda mitad del siglo XIX y se caracteriza como la aplicacin artesanal de una experiencia resultante de la prctica diaria. Era tecnologa sin ciencia subyacente en su acepcin moderna. Como ejemplos concretos cabe mencionar las aplicaciones en : La domesticacin de plantas y animales ya comenz en el perodo Neoltico. Las civilizaciones Sumeria y Babilnica (6000 aos a.C.) ya conocan cmo elaborar cerveza. Los egipcios ya saban fabricar pan a partir del trigo hacia el 4000 a.C. Antes de la escritura del libro del Gnesis, se disfrutaba del vino en el Cercano Oriente: recurdese que, segn la Biblia, No "sufri" (o disfrut) accidentalmente los efectos de la fermentacin espontnea del mosto de la uva (primera borrachera con vino) Se podra afirmar que esta era pre-cientfica termina en el siglo XVIII cuando cobra cuerpo la idea de que la materia viva puede ser estudiada como la materia inanimada, es decir, usando el mtodo experimental, con lo que se inicia el lento declive de las ideas vitalistas (creencias errneas de que "la vida depende de un principio vital irreducible a otras ramas de la ciencia"), que an daran sus ltimos estertores casi al final del siglo XIX.
Segunda poca El trabajo preliminar de los primeros microscopistas, como van Leeuwenhoek y Hooke (siglo XVII), facilit un par de siglos ms tarde, la comprensin, de la verdadera importancia de las clulas procariticas y eucariticas, en procesos relacionados con la fermentacin y en el origen de las enfermedades infecciosas. Un segundo factor contribuyente al nacimiento de la ciencia microbiolgica fue el establecimiento de la relacin que une ciertas transformaciones qumicas que se dan en las infusiones con el crecimiento de los grmenes en ellas existentes. Cagniard-Latour en 1836, y Schwann y Ktzing en 1837 haban sugerido que las levaduras eran las causantes de la fermentacin alcohlica por la que el azcar pasa a alcohol etlico y dixido de carbono, pero se encontraron con la crtica adversa de los grandes qumicos de la poca (Berzelius, Wohler y Liebig). Liebig, hacia 1840, haba realizado importantes confirmaciones a la "teora mineral" sobre la nutricin de las plantas, enfrentndose a la "teora del humus" sostenida por Thaer, asestando un golpe a las ideas vitalistas heredadas de Leibniz. Puesto que se consideraba a las levaduras como plantas microscpicas, se supona que los procesos de fermentacin y putrefaccin se deban a fenmenos qumicos de descomposicin y muerte encuadrables en el marco de la teora mineral de la fisiologa vegetal. Su convencimiento de que toda actividad vital se poda explicar en trminos de qumica y fsica retras por algn tiempo la adscripcin de estos fenmenos a clulas vivas. Fue Pasteur (que, desde sus primeros estudios sobre las propiedades pticas de los cristales de tartrato, vena suponiendo que estos compuestos tenan un orgen orgnico) quien de nuevo intervino en el debate de forma decisiva. En 1857 demostr que los agentes de la fermentacin lctica eran microorganismos, trabajando sobre un problema que haba surgido entre los destiladores de Lille cuando en sus cubas la fermentacin alcohlica se vio sustituida por una indeseable fermentacin lctica. Este fue el inicio de una larga serie de estudios que habra de durar hasta 1876, en los que Pasteur identific distintos microorganismos responsables de diferentes clases de procesos fermentativos. As, en 1860 adscribe inequvocamente la fermentacin alcohlica a ciertos tipos de levaduras, y en 1866, en sus tudes sur le vin resume sus hallazgos al respecto, inaugurando la Microbiologa Aplicada, una de las primeras derivaciones prcticas no empricas emanadas de la Biologa. A finales del siglo XIX eminentes bilogos como Hansen, en Copenhague, y Beijerink, en Delft, desarrollaban su actividad en industrias y destileras.
Trabajando sobre los agentes de la fermentacin butrica, Pasteur descubri la presencia de microorganismos que se desarrollaban en ausencia de oxgeno, lo cual desmenta la creencia de que todas las formas de vida necesitan aire para crecer. Acu los trminos aerobiosis y anaerobiosis para denominar, respectivamente, a la vida en presencia y en ausencia de oxgeno. Tras el descubrimiento de la anaerobiosis, el mismo Pasteur comprendi las distintas implicaciones energticas subyacentes a la utilizacin de sustratos orgnicos en presencia y en ausencia de oxgeno, demostrando que, en el segundo caso el rendimiento (medido como crecimiento microbiano) era siempre menor, al no poder realizarse la degradacin total de las correspondientes sustancias. Una profundizacin en los fenmenos de fermentacin lleg cuando en 1897 Buchner obtuvo, a partir de levaduras, una preparacin enzimtica (zimasa) que era capaz de realizar la misma transformacin de "fermentacin" que las clulas vivas. Este descubrimiento, que evocaba las propuestas de Berzelius y Liebig, supuso en realidad la confluencia de los enfoques qumico y biolgico: las fermentaciones eran procesos qumicos catalizados por enzimas presentes dentro de clulas vivas, que podan ser estudiados extracelularmente. De esta forma, la Bioqumica, nacida como una rama de la qumica fisiolgica, que se vena especializando en la enzimologa, encontr una alianza fructfera y duradera con la joven Microbiologa, estableciendo las bases enzimticas y metablicas de muchos procesos de fermentacin. De esta forma se desarrollaron procedimientos industriales para producir enzimas (invertasa, proteasas, amilasas, etc.). y el siguiente descubrimiento por parte de Buchner de la capacidad de las enzimas, extradas de las levaduras, de convertir azcares en alcohol.
Tercera poca En la historia de la biotecnologa se caracteriza por desarrollos en cierto sentido opuestos, ya que por un lado la expansin vertiginosa de la industria petroqumica tiende a desplazar los procesos biotecnolgicos de la fermentacin, pero por otro, el descubrimiento de la penicilina por Fleming en 1928, sentara las bases para la produccin en gran escala de este antibitico con el fin de satisfacer las demandas generadas en la II Guerra Mundial, en esa poca, la produccin de penicilina es el resultado de avances importantes en tcnicas de esterilizacin a gran escala, mejora de las instalaciones de fermentacin, comprensin y control de procesos de fermentacin (incluyendo temperatura, pH,
aireacin), entre otros. A partir de entonces se disearon estrategias para mejorar genticamente las cepas microbianas industriales. Desde esa poca, las tcnicas de ingeniera qumica, aliadas a la microbiologa y a la bioqumica, permiten la produccin masiva de antibiticos, cidos orgnicos, esteroides, polisacridos y vacunas.
Estos desarrollos dieron un gran impulso a la aplicacin de las tcnicas de fermentacin en la industria alimenticia y al desarrollo industrial de productos como las levaduras, los cidos ctricos y lcticos y, finalmente, al desarrollo de una industria qumica para la produccin de acetona, "butanol" y glicerol, mediante el uso de bacterias. Las dcadas de los 60 y 70 vieron la mejora de procesos de obtencin de pequeos metabolitos como nuclesidos, aminocidos y vitaminas.
Los procesos de fermentacin experimentaron mejoras con las tcnicas de inmovilizacin de clulas y enzimas en soportes, y con la fermentacin continua para obtener protena de clulas sencillas (biomasa microbiana). As mismo los polmeros microbianos como xantanos y dextranos se obtuvieron industrialmente, con aplicaciones en el campo de la alimentacin (como aditivos). Y se abri la posibilidad de cultivar cada cepa microbiana sin mezclas con otras: cultivos puros en medios de cultivo de laboratorio Cuarta poca. Es la actual. Se inicia con el descubrimiento de la doble estructura axial del cido "deoxi-ribonucleico" (ADN) por Crick y Watson en 1953, seguido por los procesos que permiten la inmovilizacin de las enzimas, los primeros experimentos de ingeniera gentica realizados por Cohen y Boyer en 1973 y aplicacin en 1975 de la tcnica del "hibridoma" para la produccin de anticuerpos "monoclonales", gracias a los trabajos de Milstein y Kohler.(1983). Estos importantes descubrimientos han dado lugar a numerosos trabajos de mejoramiento gentico tanto en plantas como animales; el cultivo de tejidos vegetales y animales a partir de clulas madre, y el importante acontecimiento de la aparicin de la oveja Dolli en el contexto cientfico, que dio un vuelco total al concepto de Biotecnologa.
Autoevaluacin: La Biotecnologa evidencia como una integracin

entre las ciencias bsicas con las ciencias aplicadas puesto que se pretende emplear de forma controlada y deliberada agentes biolgicos sencillos como clulas vivas o muertas, o componentes celulares en operaciones tcnicamente beneficiosas, bien sea de fabricacin de productos o como operaciones de servicios. Segn lo anterior: Se puede afirmar, qu la fabricacin de vino en la poca antigua es Biotecnologa? Cules son los ejes tericos que sustentan la Biotecnologa.
La obtencin de azcar a partir de la caa, se podra considerar un proceso de Biotecnologa? Cules seran los puntos a tener en cuenta para considerar esta
Leccin 3:
Divisiones y tipos de la Biotecnologa
En la historia de la Biotecnologa se puede apreciar que las tcnicas y procedimientos utilizados han tenido una aplicacin rpida en reas tan diversas como la agricultura, la industria alimenticia, la farmacutica, los procesos de diagnstico y tratamiento mdico, la industria qumica, la minera y la informtica, Como se puede apreciar existe una amplia gama de campos de aplicacin y en todos ellos se han generado un amplio nmero de productos y servicios. Sin embargo, es de sealar que todos los procesos de innovacin tecnolgica se caracterizan generalmente por presentar tres ncleos cientficos John Smith (1996): 1. obtencin del mejor catalizador biolgico para una funcin o proceso especfico: En la mayora de los casos, el catalizador biolgico son clulas vivas, sobre todo microorganismos. Por ello, uno de los pilares de la biotecnologa es precisamente la microbiologa (entendiendo esta en sentido amplio de biologa microbiana). Parte de lo que hemos aprendido sobre el manejo de microorganismos se puede aplicar, con modificaciones, al manejo de clulas de animales y plantas, que cada vez son ms importantes en la biotecnologa. Varias son las caractersticas que hacen atractivos a los microorganismos:
2. obtener el mejor ambiente para la funcin de ese catalizador biolgico, mediante una serie de diseos tcnicos en los que es fundamental la ingeniera qumica El segundo componente o ncleo de las biotecnologas estriba en el entorno industrial en que ponemos a funcionar las clulas o las enzimas. Esto nos lleva al concepto de biorreactor, un entorno cerrado y controlado para que nuestros catalizadores biolgicos hagan lo que queremos con la mxima eficiencia. En esta parte de la biotecnologa se requiere la colaboracin estrecha entre los bilogos y los ingenieros de bioprocesos, incluyendo los ingenieros qumicos. Se trata de disear biorreactores o fermentadores, especies de cubas cerradas diseadas para controlar diversos parmetros que condicionan la buena produccin: temperatura, aireacin, pH, etc
3. procesamiento del material, consistente en separar y eventualmente purificar el material biolgico producido: quizs esta es el rea ms desconocida y compleja, el procesamiento de la biomasa o de la sustancia producida: separacin de las clulas respecto del medio acuoso en que han funcionado, recuperacin eficiente del producto buscado, purificacin, entre otros procedimientos. Atendiendo a los planteamientos anteriores la biotecnologa la podemos clasificar bajo dos enfoques, el primero, de acuerdo con el nivel de tecnologa utilizado en la obtencin de productos, y el segundo, segn el campo de aplicacin del producto o servici De acuerdo al primer enfoque, las nuevas biotecnologas generalmente se agrupan en tres categoras bsicas: Tcnicas para el cultivo de clulas y tejidos. Procesos biotecnolgicos, fundamentalmente de fermentacin, y que incluyen la tcnica de inmovilizacin de enzimas. (Osorio M. 2005) Tcnicas para la manipulacin, modificacin y transferencia de materiales genticos (ingeniera gentica). Aunque estos tres grupos se complementan entre s, existe una diferencia fundamental entre los dos primeros y el tercero. Los primeros se basan en el conocimiento de las caractersticas y comportamiento de
los microorganismos y en el uso deliberado de estas caractersticas (de cada organismo en particular), para el logro de objetivos especficos como la obtencin de nuevos productos o procesos. La enorme potencialidad del ltimo grupo se deriva de la capacidad de manipular, las caractersticas estructurales y funcionales de los organismos y de aplicacin prctica de esta capacidad para superar ciertos lmites naturales en el desarrollo de nuevos productos o procesos.
A diferencia de la primera clasificacin, que seala las tcnicas propiamente tales, la segunda se refiere tambin a las actividades econmicas en las que se hace uso de dichas tecnologas. La nueva biotecnologa crea nuevos procesos y nuevos productos en diversas reas de la economa. Como estos procesos se basan en los mismos principios, ya sea que se apliquen en un sector econmico o en otro, ello introduce cierto grado de flexibilidad, ya que permite la movilidad entre diferentes sectores. Por ejemplo, los procesos de fermentacin pueden
aplicarse para la produccin, en gran escala, de alcohol o de antibiticos como la penicilina, o en escalas menores para la produccin de aminocidos en la industria farmacutica. Esto facilita la, movilidad de factores productivos y tiene impacto sobre la calificacin de la mano de obra, la cual, aun cuando deber adaptarse a este nuevo perfil tecnolgico (tanto en trminos, cuantitativos como cualitativos) posiblemente logre al mismo tiempo una mayor facilidad de empleo.
Tipos de Biotecnologa: Dependiendo del campo de aplicacin del servicio o producto obtenido la biotecnologa se ha clasificado en: Biotecnologa Microbiana: La biotecnologa microbiana o como se llamaba anteriormente microbiologa industrial se refiere a los procesos donde participan los microorganismos para la obtencin de productos o metabolitos de inters humano. La microbiologa industrial comenz con los procesos de fermentacin alcohlica por ej. La fermentacin del vino y de la cerveza. Ms tarde se desarrollaron los procesos microbianos para la produccin de agentes farmacuticos como los antibiticos, la produccin de aditivos alimentarios como los amino cidos, para la produccin de enzimas y sustancias qumicas industriales como el butanol, el acido ctrico, entre otros.
En la actualidad estamos en una nueva era de la tecnologa microbiana con el advenimiento de la tecnologa de genes. La tecnologa gentica permite que un microorganismo procesado genticamente fabrique sustancias que normalmente no sera capaz de producir, es as como utilizando ingeniera gentica se ha podido producir insulina por una bacteria introduciendo el gen de la insulina humana en la bacteria Escherichia coli. Podemos dividir a la biotecnologa microbiana en dos fases distintas: 1) La tecnologa microbiana tradicional, que implica la fabricacin a gran escala de productos que los microorganismo son capaces de fabricar normalmente. En este caso la tarea del microbilogo consiste en modificando el organismo o el proceso para aumentar el rendimiento del producto deseado. 2) La tecnologa microbiana con organismos alterados mediante procesos de ingeniera, es decir microorganismos en los cuales se ha insertado genes extraos. En esta nueva tecnologa el microbilogo industrial trabaja estrechamente asociado con el ingeniero gentico en el desarrollo de un organismo adecuado que no solo produzca el producto de inters, sino que tambin pueda ser cultivado en la escala necesaria para su explotacin comercial. (Brook y Scaligan ,2002) Biotecnologa Agrcola vegetal: Con las tcnicas de la biotecnologa moderna, es posible producir ms rpidamente que antes, nuevas variedades de plantas con caractersticas mejoradas, produciendo en mayores cantidades, con tolerancia a condiciones adversas, resistencia a herbicidas especficos, control de plagas, cultivo durante todo el ao. Problemas de enfermedades y control de malezas ahora pueden ser tratados genticamente en lugar del uso de qumicos. Una planta modificada por ingeniera gentica, que contiene ADN de una fuente externa, es un organismo transgnico. Un ejemplo de planta transgnica es el tomate que permite mantenerse durante ms tiempo en los almacenes evitando que se reblandezcan antes de ser transportados Algunos pases desarrollados como Estados Unidos y a sus multinacionales, defienden el uso de la biotecnologa y pone de relieve la importancia de su industria, que crea nuevos puestos de trabajo y fomenta la innovacin tecnolgica y podra acabar con el hambre del mundo. En Europa, los casos de Soja y Maz transgnicos resultan de especial relevancia. La soja se utiliza en un 40 a 60% de los alimentos procesados: aceite, margarina, alimentos dietticos e infantiles, cerveza, etc. Espaa importa de EEUU 15 millones de toneladas, el cuarto pas importador detrs de Japn, Taiwan y Holanda.
La comercializacin del maz transgnico est autorizada en EEUU, Canad, Japn y tambin en la Unin Europea desde Enero de 1997. China planea plantar tomates, arroz, pimientos y patatas por lo menos en la mitad de todas sus tierras de labor (500.000 kilmetros cuadrados) en el plazo de cinco aos. Sus investigadores analizaron el efecto de los pimientos y los tomates transgnicos en ratas de laboratorio, comparando el peso y el estado de los mismos con los de otros no alimentados, y no observaron diferencias significativas. Para profundizar en este tema haga clic aqu: alimentacin y la agricultura La biotecnologa en la
Biotecnologa animal: Esta ha experimentado un gran desarrollo en las ltimas dcadas. Las aplicaciones inciales se dirigieron principalmente a sistemas diagnsticos, nuevas vacunas y drogas, fertilizacin de embriones in vitro, uso de hormonas de crecimiento, entre otros procedimientos. Los animales transgnicos como el "ratn oncognico" han sido muy tiles en trabajos de laboratorio para estudios de enfermedades humanas.
Existen tres reas diferentes en las cuales la biotecnologa puede influir sobre la produccin animal: -El uso de tecnologas reproductivas -Nuevas vacunas y -cultivos celulares que producen hormonas. En animales tenemos ejemplos de modelos desarrollados para evaluar enfermedades genticas humanas, el uso de animales para la produccin de drogas y como fuente donante de clulas y rganos, por ejemplo el uso de animales para la produccin de protenas sanguneas humanas o anticuerpos. Para las enfermedades animales, la biotecnologa provee de numerosas oportunidades para combatirlas, y estn siendo desarrolladas vacunas contra muchas enfermedades bovinas y porcinas, que en los ltimos tiempos han hecho mella en estos animales. Biotecnologa Humana Las tcnicas del ADN estn siendo utilizadas para determinar relaciones familiares en litigios de paternidad, para confrontar donantes de rganos con receptores en programas de
trasplante, unir sospechosos con la evidencia de ADN en la escena del crimen (biotecnologa forense). El desarrollo de tcnicas para el diagnstico de enfermedades infecciosas o de desordenes genticos es una de las aplicaciones de mayor impacto de la tecnologa de ADN. Al utilizar las tcnicas de secuenciacin de ADN los cientficos pueden diagnosticar infecciones vricas, bacterianas o mapear la localizacin especfica de los genes a lo largo de la molcula de ADN en las clulas. El primer tratamiento exitoso en terapia gnica fue en 1990, cuando se trat una enfermedad del sistema inmune de nios llamada "Deficiencia de ADA". Clulas sanguneas con los genes correctos de ADA fueron inyectadas al cuerpo del paciente donde produjeron suficientes clulas normales que permitieron mejorar el sistema inmune. Hoy, la terapia gnica esta tratando enfermedades tales como tumores cerebrales malignos, fibrosis qustica y HIV. Con esta tcnica se pretende tambin reparar rganos, como por ejemplo un hgado cirrtico a partir de las pocas clulas sanas que le quedan, un par de ventrculos nuevos para reemplazar los efectos devastadores de un infarto, la regeneracin de una mano amputada o disponer de una fuente inagotable de neuronas para corregir los efectos de enfermedades tan graves como el Alzheimer o el mal de Parkinson. Leccin 4. colombiano. Impacto de la Biotecnologa en el contexto
Su impacto ha alcanzado varios sectores productivos: agricultura, industria de alimentos, industria farmacutica, bioindustria, entre otros. Aumentando la productividad y la competitividad con la generacin de nuevos productos, por lo cual se han convertido en parte clave del crecimiento de la economa en la mayora de los pases industrializados y algunos pases en desarrollo. En general, el alto valor agregado que se genera con la moderna Biotecnologa, particularmente a nivel farmacutico, est determinado por su novedad y especificidad de uso en consumo humano. Osorio, (1995) En Colombia el avance de la moderna biotecnologa en los ltimos diez aos ha comenzado a generar algunos productos, particularmente en el sector agrcola. Existen cerca de 70 instituciones entre estatales y privadas, que involucran biotecnologa en sus procesos de investigacin y/o produccin. En el sector agrcola se ha avanzado en tcnicas de cultivo de tejidos vegetales in vitro, en el estudio y uso sostenible de microorganismos
con el fin de buscar alternativas de control biolgico de enfermedades y plagas y se estn realizando algunos trabajos en mejoramiento gentico de plantas de papas, pasifloras, entre otros basados en el ADN recombinante. Se observan trabajos escasos a nivel de estudios de diversidad gentica en especies silvestres del pas, los cuales se desarrollan para identificar nuevos genes tiles en el mejoramiento de variedades comerciales y para aumentar la eficiencia y calidad de los bancos de germoplasma existentes en el pas. En el sector pecuario, la aplicacin de la biologa se limita a la produccin de vacunas y a la bsqueda de razas mejoradas mediante la implantacin de embriones. Actualmente se estn realizando trabajos de investigacin en la estandarizacin de kits de diagnstico de enfermedades serolgicas y moleculares, vacunas sintticas y aplicacin selectiva de microorganismos relacionados con la nutricin animal mejorada. A nivel de diversidad gentica de especies nativas los trabajos son discontinuos y aislados. En el sector de la salud humana se desarrollan proyectos de investigacin con produccin de kits serolgicos y moleculares para el diagnstico rpido de enfermedades tropicales y se estudian los espectros de variabilidad existentes por ejemplo, enfermedad de Chagas. En el sector agroindustrial y de la alimentacin animal, la Biologa es aplicada para generar productos lcteos, bebidas fermentadas, destilacin de fermentaciones etanlicas para la elaboracin de licores, produccin de levaduras por fermentacin y produccin de materias primas como cido ctrico y solventes orgnicos. Este sector utiliza fundamentalmente mtodos biotecnolgicos tradicionales. En el sector del medio ambiente se han iniciado algunos trabajos a nivel del tratamiento de aguas residuales industriales como lodos activados y biofiltros, mtodos de descontaminacin de los derramamientos de petrleo mediante el uso de microorganismos nativos o transformados genticamente. Algunos trabajos de investigacin cientfica se estn realizando sobre biodigestores de alta calidad. Sin embargo, el desarrollo nacional en este sector es todava discreto.
La diversidad biolgica de Colombia es una ventaja comparativa que al ser usada sosteniblemente puede apoyar el desarrollo del sector productivo. As mismo constituye una respuesta a problemas de seguridad alimentaria, sostenibilidad de aguas, suelos y aire, as como un elemento de negociacin poltica internacional y fortalecimiento de la
soberana. Por estas razones, su conocimiento, conservacin y uso sostenible es prioritario. Sin embargo, como se observa con el estado de la biotecnologa en Colombia, los avances en estos campos son muy pequeos comparativamente con otros pases de Amrica Latina como Costa Rica, Brasil y otros del mundo . Con relacin a los bio-recursos, Colombia es un pas privilegiado ya que se encuentra entre uno de los pases de mayor diversidad biolgica del planeta por rea. Sin embargo, para aprovechar ese potencial, el pas debe desarrollar la capacidad cientfica y tcnica que le permita explorar, conocer, estudiar, investigar, valorar, conservar y desarrollar esos biorrecursos como un patrimonio altamente productivo y no simplemente como una diversidad ecolgica, social y econmicamente improductiva. Leccin 5: Tendencias de la Biotecnologa A nivel mundial el inters por la biotecnologa es indudable, como se ve a travs del, frecuente abordaje de tales temas en los peridicos, libros y medios de comunicacin. Algunos descubrimientos tiles sern una consecuencia directa del uso de las tcnicas de ingeniera gentica que logren transferir determinados genes (a veces incluso genes humanos) a un determinado microorganismo apropiado, para hacer el producto que es precisamente requerido en el mercado. Determinadas protenas humanas y algunos enzimas requeridos en Medicina se conseguirn de esta forma, en el futuro. Otros muchos beneficios, sern el resultado de la fabricacin mediante tcnicas de fermentacin, de anticuerpos especficos para, fines analticos y teraputicos. Estos anticuerpos monoclonales se producirn mediante el uso de microorganismos en grandes fermentadores, como por ejemplo la produccin de antibiticos como la penicilina. Se estn desarrollando en la actualidad, importantes descubrimiento y aplicaciones comerciales en cada uno de los campos de la Biotecnologa, incluyendo las que tienen lugar en las industrias de fermentacin, la biotecnologa de los enzimas y clulas inmovilizadas, el tratamiento de residuos y la utilizacin de subproductos. Aquellos procesos que resulten productivos sern tiles a la sociedad, atractivos para la industria por motivos comerciales y en algunos casos recibirn el apoyo de los respectivos gobiernos.
Una gran potencialidad de la biotecnologa se da en el campo de la investigacin y el desarrollo cientfico, ya que proporciona herramientas que permiten una mejor comprensin de los procesos fisiolgicos, por ejemplo, del sistema inmuno-defensivo, o que reducen, en forma considerable, los plazos de la I y D, facilitando as los procesos de innovacin tecnolgica. A su vez, con el advenimiento de nuevas tcnicas en el campo biolgico, la actividad de la I y D en este campo tiende a hacerse cada vez ms cientfica y menos emprica, acentundose as las caractersticas de intensidad cientfica propias de la biotecnologa. Resulta claro que siendo la biotecnologa un sistema de diversas innovaciones cientfico-tecnolgicas interrelacionadas, no todas ellas evolucionan al mismo ritmo. Las condiciones de mercado, las expectativas de beneficios, aspectos organizativos y de gestin, entre otros, favorecen la rpida puesta en marcha y difusin de algunas de estas tecnologas, relegando a otras. La literatura sobre la innovacin tecnolgica acostumbra distinguir entre aquellas innovaciones que surgen como respuesta a una situacin de mercado, y a expectativas de beneficios econmicos, de aqullas que se originan en el rea de I y D como resultado de un proceso continuo y acumulativo de desarrollo cientfico-tecnolgico. En el primer caso se habla de "demand or marketpull" y en el segundo, de "technological-push". Ha sido frecuente, en los ltimos tiempos, sealar el lser y la biotecnologa como ejemplos del segundo tipo de innovacin. Es decir, descubrimientos cientficos a los que se arriba sin una aplicacin especfica predeterminada en mente, pero que luego encuentran una gama considerable de aplicaciones prcticas.
Sin embargo, pareciera ms correcto considerar ambos actores, el inherente proceso cientfico-tecnolgico y aqul que corresponde a incentivos econmicos, como complementarios. As, en el caso de la biotecnologa, aun cuando sta nace e el mbito de la I y D, de las muchas aplicaciones posibles, las que se desarrollan primero son aquellas que ofrecen expectativas de importantes beneficios econmicos en un plazo ms menos breve.
En la agricultura, la biotecnologa se orienta a la superacin de los factores limitantes de la reduccin agrcola a travs de la obtencin de variedades de plantas tolerantes a condiciones ambientales negativas (sequas, suelos cidos), resistentes a enfermedades y pestes, que permitan aumentar el proceso fotosinttico, la fijacin de nitrgeno o la
captacin de elementos nutritivos. Tambin se apunta al logro de plantas ms productivas y/ o ms nutritivas, mediante la mejora de su contenido protenico o aminocido.
Un desarrollo paralelo es la produccin de pesticidas (insecticidas, herbicidas y fungicidas) microbianos. Las tcnicas que ya se emplean, o que estn desarrollndose, van desde los cultivos de tejidos, la fusin protoplasmtica, el cultivo in vitro de "meristemas", la produccin de ndulos de "rhizobium" y "micorizas", hasta la ingeniera gentica para la obtencin de plantas de mayor capacidad fotosinttica, que puedan fijar directamente nitrgeno, resistentes a plagas y pestes, etc. El cultivo de tejidos consiste en la regeneracin de plantas completas a partir de una masa amorfa, de clulas, que se denomina "callo". En su forma ms general, se aplica a todo tipo de cultivo "in vitro", desde simples unidades indiferenciadas hasta complejos multicelulares y rganos. El proceso consiste en la incubacin, en condiciones controladas y aspticas, de una clula o parte de un tejido vegetal (hoja, tallo, raz, embrin, semilla, "meristema", polen, etc.) en un medio que contiene elementos nutritivos, vitaminas y factores de crecimiento (Osorio, 2005)
La magnitud del mercado potencial agrcola para la biotecnologa es, en gran medida materia de especulacin debido precisamente a la falta de un conocimiento detallado de muchas de estas condiciones locales. En este campo, la biotecnologa est orientada a la utilizacin en gran escala de "biomasa" para la produccin de materias primas orgnicas, que actualmente se obtienen mediante procesos qumicos convencionales. Las ventajas son que la "biomasa" es un recurso altamente subutilizado y relativamente barato., ya que en gran parte esta constitudo por residuos y desechos de plantaciones forestales y de cultivos en gran escala. Es adems un recurso renovable. Las principales fuentes potencialmente disponibles para la produccin tanto de etanol como de otros productos qumicos a granel son (aparte de las melazas de la caa) cultivos como la yuca, el sorgo, las papas y el maz; los sueros de la industria de la leche; los residuos de las plantaciones de caf y, en general, todo tipo de residuo celuloso.
Actualmente la biotecnologa est siendo aplicada en gran escala en la produccin de alcohol (etanol), como combustible sustituto del petrleo,
fundamentalmente en el Brasil y en menor medida en Estados Unidos y la India. En el Brasil, la produccin se logra a partir de melazas de la caa de azcar, mientras que en Estados Unidos se usa el maz. Otro producto importante es el cido ctrico. Los principales productores son los Estados Unidos, Italia, Blgica y Francia que utilizan como materia prima melazas de remolacha. La importancia que tiene cada una de las aplicaciones mencionadas es incuestionable desde el punto de vista econmico. A pesar que en el siglo XX, cuando la Gentica haba resuelto el misterio de la naturaleza del material de la herencia, las posibilidades que haba para actuar sobre dicho material eran limitadas: cruces entre plantas y animales de la misma especie (o de especies similares), seleccin de los individuos con rasgos deseados, retrocruzamientos (un proceso largo y lento), mutaciones con agentes fsicos (rayos UV, rayos X) o qumicos, con ulterior bsqueda (seleccin o rastreo -screening) de alguna variante de inters (algo tedioso y frecuentemente infructuoso), etc. Debimos esperar a la dcada de los 70 para que surja un conjunto de tcnicas de laboratorio revolucionarias que por primera vez permiten "tocar" de modo racional el sancta sanctorum de la vida. Son tcnicas y herramientas con las que se puede modificar el ADN de acuerdo a diseos previos y objetivos concretos (de ah el nombre popular de Ingeniera Gentica). La Ingeniera Gentica (I.G.), mejor llamada tecnologa del ADN recombinante in vitro, se caracteriza por su capacidad de cortar y empalmar genes o fragmentos de ADN de organismos distintos, creando nuevas combinaciones no existentes en la Naturaleza, combinaciones que ponemos a trabajar en el interior de una variedad de organismos hospederos, para nuestro provecho. Teniendo en cuenta lo anterior se puede inferir que las tendencias cientficas mundiales a todos los niveles y clasificacin de la Biotecnologa, se han concentrado en seis aspectos: Cultivos de tejidos y clulas para: la rpida micropropagacin "in vitro" de plantas, la obtencin de cultivos sanos, el mejoramiento gentico por cruza amplia, la preservacin e intercambio de "germoplasma", la "biosntesis" de "metabolitos" secundarios de inters econmico y la investigacin bsica.
Metabolomica La manipulacin del metabolismo para inhibir unas rutas biosinteticas o favorecer otras sin afectar la economa celular
con el propsito de obtener una mayor produccin del producto de inters.
El uso de conservacin determinados separacin de
enzimas o fermentacin microbiana, para la de materia primas definidas como sustratos en productos, la recuperacin de estos productos, su los caldos de fermentacin y su purificacin final.
Tecnologa del "hibridoma", que se refiere a la produccin, a partir de "clones", de anticuerpos de accin muy especfica que reciben el nombre de anticuerpos "monoclonales". Ingeniera de protenas Proteomica, que implica la modificacin de la estructura de las protenas para mejorar su funcionamiento o para la produccin de protenas totalmente nuevas. Ingeniera gentica o tecnologa del "ADN", que consiste en la introduccin de un "ADN" hbrido, que contiene los genes de inters para determinados propsitos, para capacitar a ciertos organismos en la elaboracin de productos especficos, ya sean estos enzimas, hormonas o cualquier otro tipo de protena u organismo. Bioinformtica, que se refiere a la tcnica basada en la utilizacin de protenas en aparatos electrnicos, particularmente sensores biolgicos y "bioships"; es decir, "microchips" biolgicos, capaces de lgica y memoria.
A todo esto tenemos que aadir que un factor importantsimo en el desarrollo de la biotecnologa es la evaluacin de la seguridad del producto, sometida a controles rigurosos segn normativas nacionales e internacionales. De hecho este factor es tan importante que se puede convertir en limitante, de modo que las regulaciones estrictas desincentivan ciertos desarrollos biotecnolgicos. Por todo ello, es importante que tales regulaciones sean realistas, y no exijan ms de lo que la evidencia cientfica sugiere, manteniendo en todo momento la preservacin de la salud y el medio ambiente. A su vez, las regulaciones reflejan la percepcin pblica de los riesgos y promesas de la biotecnologa. Por ejemplo, hoy en Europa la percepcin pblica ha logrado prcticamente una parada en las plantas transgnicas, a pesar de los informes cientficos que dicen que en la mayor parte de los casos, sus riesgos son similares a las plantas convencionales. La creacin o elaboracin de este tipo de alimentos depende del nivel de desarrollo del pas, de los intereses polticos del mismo y del grado de presin que
ejerzan las grandes industrias privadas del sector. Hay un gran debate en torno a la conveniencia o no de este tipo de organismos. Habr que llegar a un dilogo racional entre los diversos actores (cientficos, empresas, consumidores, ecologistas, entre otros) para asegurar el correcto empleo de estas tecnologas, que por un lado no impida aplicaciones benficas sin riesgos, y por otro regule adecuadamente aquellos mbitos donde las dudas razonables hagan recomendables ms restricciones. El ideal sera permitir todo aquello que aporte beneficios sin aumentar riesgos, pero no caer en el error de prohibir usos positivos solo bajo vagas ideas de riesgos no sustanciados, en buena parte imaginaciones y tergiversaciones de grupos de presin que pueden esconder agendas polticas ocultas.
ACTIVIDADES DE AUTOEVALUACIN Lectura 1. Aplicando el mtodo de Lectura Auto regulada IPLER; Realice un ensayo de la siguiente lectura. Los beneficios de la biotecnologa alimentaria La biotecnologa ya nos est ayudando de muchas maneras: Proteccin del medio ambiente. Los cientficos lograron que algunos alimentos, como la papaya y la papa, sean ms resistentes a las plagas. Estos cultivos necesitan ahora menos productos qumicos para estar protegidos de insectos o virus dainos, lo que es mucho mejor para el agua y la vida silvestre. Otros cultivos estn protegidos de los herbicidas que se usan para controlar a las malezas. El mejor control de las malezas permite que los agricultores conserven el suelo ya que no tienen que arar la tierra con tanta frecuencia. Mayores rendimientos. Los agricultores tambin usan la biotecnologa para ayudar a las plantas a sobrevivir. Por ejemplo, las nuevas variedades de maz y algodn rechazan a los insectos dainos, y la soya mejorada puede tolerar los herbicidas. Los agricultores pueden esperar mayores rendimientos de la cosecha en estas plantas ms resistentes. Alimentos con mejor sabor y ms frescos. Pimientos ms dulces y tomates que maduran ms despacio son slo dos ejemplos de cmo la biotecnologa puede producir alimentos ms frescos y de mejor sabor. El futuro de la biotecnologa En el futuro, la biotecnologa podr ayudarnos a:
Cultivar ms alimentos en menor superficie. En la actualidad hay 6,000 millones de personas viviendo en la Tierra. Para el ao 2050, seremos 9,000 millones. Al usar la biotecnologa, los agricultores podrn producir mayores cosechas en la misma superficie que utilizan en la actualidad. Si podemos obtener los alimentos que necesitamos de estos cultivos, ya no tendremos que destinar ms superficie al cultivo. Los pases en desarrollo sern los que ms se beneficien con esta tecnologa moderna ya que en ellos se producir el mayor crecimiento de la poblacin. Mantener alimentos que sean seguros para comer. Los cientficos podrn detectar con mayor precisin cules son los virus y bacterias dainas que pueden hallarse en los alimentos. Por lo tanto, correremos menos riesgos de contraer enfermedades transmitidas por los alimentos. Obtener alimentos ms saludables. Mejorar algunos alimentos por medio de la biotecnologa nos podr ayudar a disminuir nuestro riesgo de contraer enfermedades crnicas como el cncer y afecciones cardacas. Por ejemplo: o Algunas frutas y verduras contendrn ms antioxidantes, Vitamina C y Vitamina E. o Los aceites para cocinar se obtendrn de plantas que contendrn menos grasas saturadas. o Los cacahuates podrn contener menos cantidad de las protenas que causan alergias. Mantener seguros los alimentos para los animales. Algunos tipos de hongos que se hallan en las sustancias que libera el maz pueden daar a los animales que lo consumen. Estas sustancias ya estn reguladas en los Estados Unidos y la biotecnologa representa otra herramienta que ayudar a reducir la cantidad de estas sustancias presentes en el maz. Elecciones: Arroz enriquecido Muchas de las personas que viven en los pases en desarrollo raramente consumen las vitaminas que necesitan. Por lo tanto, es posible que tengan problemas de salud. Por ejemplo, la falta de Vitamina A causa ceguera, y la falta de hierro puede ser daina para la salud de las mujeres y los nios. Sin embargo, gracias a la biotecnologa, los cientficos han descubierto una manera de agregar mayores cantidades de Vitamina A y hierro al arroz. En los pases en que el arroz es uno de los alimentos principales de la dieta, esta nueva variedad del cereal puede llegar a proteger a la poblacin de la ceguera y de otros problemas de salud.
La seguridad de la biotecnologa alimentaria La Administracin de Alimentos y Frmacos (FDA) revisa la seguridad de todos los alimentos que estn en el mercado. La FDA, la Agencia de Proteccin Ambiental (EPA), el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) y la comunidad cientfica en general estn de acuerdo en afirmar que los alimentos producidos aplicando la biotecnologa son seguros. Los alimentos producidos utilizando mtodos biotecnolgicos o convencionales deben satisfacer los mismos estndares de seguridad. La FDA regula los alimentos desarrollados utilizando la biotecnologa de la misma manera en que regula los alimentos producidos por otros mtodos. La FDA garantiza la seguridad de estos alimentos y requiere un etiquetado especial si es que el contenido nutricional del alimento se modifica o si se adiciona una sustancia que puede causar alergias. El Departamento de Agricultura de los Estados Unidos y la EPA tambin ayudan a regular la biotecnologa agrcola para garantizar la seguridad. Adems, despus de una completa revisin de la ciencia en 2002, la Sociedad de Toxicologa lleg a la conclusin de que los alimentos producidos aplicando mtodos biotecnolgicos son tan seguros como los alimentos tradicionales. Elecciones: Maz seguro para el medio ambiente El maz mejorado biotecnolgicamente para que contenga menos fitato, uno de sus componentes del mas, ayudar a reducir el impacto que tienen los animales de granja en el medio ambiente. El maz con bajo contenido de fitato puede reducir la cantidad de fsforo no deseado en las deposiciones de los animales, lo que representa una potencial amenaza para la calidad del agua. Para ms informacin: Usted puede obtener ms informacin sobre los alimentos y cmo se producen de los profesionales de la salud, dietistas, nutrilogos, agentes de informacin, agricultores locales y programas universitarios que se dedican a estos temas.En los sitios de Internet que se mencionan a continuacin hallar la informacin que necesita: Servicio de Inspeccin de Salud de Animales y Plantas, Servicios Regulatorios de Biotecnologa del Departamento de Agricultura de los Estados Unidoshttp://www.aphis.usda.gov/brs/
Centro de Seguridad de los Alimentos y Nutricin Aplicada de la FDAhttp://www.cfsan.fda.gov/ Agencia de proteccin ambiental (EPA) http://www.epa.gov La Asociacin Diettica de los Estados Unidos http://www.eatright.org Consejo de Ciencia y Tecnologa Agrcola http://www.cast-science.org Instituto de Tecnlogos de Alimentos http://www.ift.org Sociedad de Toxicologa http://www.toxicology.org/ IFIC Foundation http://ific.org/food/biotechnology
CAPITULO 2: BIOTECNOLOGA DE LAS FERMENTACIONES
Leccin 6: Nutricin microbiana. Las clulas contienen grandes cantidades de pequeas molculas as como de macromolculas. La clula puede obtener la mayora de las pequeas molculas que necesita del exterior o sintetizarlas a partir de molculas ms simples. Las macromolculas, por el contrario, son siempre sintetizadas en la clula.
Las sustancias que son tomadas de medio externo las cuales son utilizadas con fines energticos o plsticos se denominan como nutrientes, en cualquier caso, los nutrientes deben suministrase en los diferentes medios de cultivo. Los nutrientes pueden ser divididos en dos clases: (1) macronutrientes, los que son requeridos en grandes cantidades; (2) Micronutrientes, y (3) factores de crecimiento que lo son solamente en pequeas cantidades.
Empezaremos nitrgeno
por
los
macronutrientes
mayoritarios:
carbono
Macronutrientes: Prcticamente la totalidad de la masa celular est formada por sustancias con cuatro tipos de tomos: Carbono, oxgeno, hidrgeno y nitrgeno. Estos cuatro elementos constituyen el esqueleto de las macromolculas as como las molculas orgnicas pequeas. La mayora de los procariotas requieren un compuesto orgnico de algn tipo como fuente de carbono. Estudios nutricionales han demostrado que muchas bacterias pueden asimilar varios compuestos de carbono orgnico y utilizarlos para fabricar material celular. Un incontable nmero de compuestos tales como animocidos, cidos grasos, y compuestos aromticos pueden ser usados por una bacteria u otra. En peso seco, una clula tpica consta de aproximadamente 50% de carbono y a su vez este es el elemento mayoritario de las
macromolculas.
Despus del carbono, el siguiente elemento ms abundante en la clula es el nitrgeno. Una bacteria tpica contiene aproximadamente el 12% de nitrgeno (peso seco) y a su vez el nitrgeno es un componente mayoritario de protenas, cidos nucleicos y otros constituyentes celulares. El nitrgeno se encuentra en la naturaleza tanto en forma orgnica como inorgnica. Sin embargo, la globalidad del nitrgeno utilizable est en forma inorgnica, bien como amonaco (NH3), nitrato (NH3-) N2. La mayora de las bacterias pueden utilizar amonaco y muchas adems nitrato. El nitrgeno molecular (gas), sin embargo, puede ser fuente de nitrgeno para un reducido grupo de bacterias (bacterias fijadoras de nitrgeno). Otros macronutrientes: P,S,K,Mg,Ca,Na,Fe
El fsforo acontece en la naturaleza en forma de fosfatos orgnicos o inorgnicos y es requerido por la clula para la sntesis de cidos
nuclecos y fosfolpidos. El azufre es fundamental por ser un elemento estructural en los aminocidos cistena y metionina y porque est presente en vitaminas tales como la tiamina, biotina, cido lipoico as como coenzima A. El potasio es necesario en todos los organismos. Una gran diversidad de enzimas, incluyendo varias implicadas en la sntesis de protenas, lo requiere especficamente. El magnesio estabiliza los ribosomas, las membranas celulares, los cidos nucleicos y se requiere tambin para la actividad de muchas enzimas. El calcio (que no es
nutriente esencial para el crecimiento de muchos microorganismos ),ayuda a estabilizar la pared celular bacteriana y juega un papel fundamental en la termorresistencia de la endospora bacteriana. El sodio es requerido por algunos, pero no todos, microorganismos y cuando lo es, es debido a la naturaleza qumica de su hbitat. El hierro es requerido por las clulas en mayores cantidades que otros metales traza y por ellos debe ser considerado como un macronutriente. El hierro juega un papel fundamental en la respiracin celular, siendo un componente clave de los citocromos, y de las protenas que contiene hierro y azufre implicadas en el transporte de electrones. Debido a que la mayor parte de las sales inorgnicas son altamente insolubles, muchos microorganismos producen agentes que unen el hierro de una manera muy especfica, denominados siderforos, que solubilizan las sales de hierro trasportndolo al interior celular. Micronutrientes (elementos traza) Aunque los micronutrientes son requeridos en muy pequeas
cantidades son, sin embargo, tan importantes como los macronutrientes para la funcin celular. Los micronutrientes son metales, muchos de los cuales forman parte de enzimas que son los catalizadores celulares.
Entre los micronutrientes ms importantes de sistemas vivos, que son necesarios para el funcionamiento de enzimas estn: Cromo, Cobalto, Cobre, Manganeso, Molibdeno, Nquel, Selenio, Tungsteno, Vanadio, Zinc, Hierro. Factores de crecimiento Estos son compuestos orgnicos que, como los micronutrientes, son requeridos en muy pequeas cantidades y slo por algunas clulas. Los factores de crecimiento incluyen vitaminas, aminocidos, purinas y pirimidinas. Aunque la mayora de los microorganismos son capaces de sintetizar estos compuestos, otros microorganismos requieren tomar
uno o ms compuestos preformados del medio ambiente. Medios de cultivo En microbiologa industrial se usan dos grandes grupos de medios de cultivo: Los qumicamente definidos y los indefinidos (complejos). Los medios qumicamente definidos se preparan aadiendo al agua destilada cantidades precisas de compuestos orgnicos o inorgnicos altamente purificados. Por ellos se conoce la composicin qumica exacta .En muchos casos, sin embargo, el conocimiento exacto de la
composicin qumica no es crtico. En estas ocasiones los medios complejos pueden ser suficientes, e incluso presentar ventajas sobre los definidos. Los medios complejos emplean lisados de casena (protena de la leche), de carne, de soja, de levadura o cualquier otra sustancia altamente nutritiva (qumicamente indefinida): Tales lisados estn disponibles comercialmente en forma de polvo y pueden ser pesados rpidamente y disueltos en agua destilada para dar lugar a un medio. Sin embargo, cuando se utilizan medio complejos hay que tener en cuenta que no se conoce la composicin de nutrientes.
El metabolismo es la suma de transformaciones de la materia que ocurre en el interior de la clula y que da lugar a la sntesis de material celular a partir de sustancias nutritivas. El metabolismo puede dividirse, para su mejor estudio, en tres aspectos diferentes pero ntimamente ligados (figura 1) : el catabolismo (Metabolismos energtico) que es la suma de reacciones exergnicas que permiten liberar la energa contenida en los nutrientes o estratos y ser acumulada en forma de ATP u otros compuestos, el anfibolismo o metabolismo intermediario, que es el conjunto de reacciones en que los productos de hidrlisis del catabolismo y algunos nutrientes son transformados en cidos orgnicos , esteres fosfricos y otros compuestos como aminocidos; el anabolismo o metabolismo biosinttico que es la parte del metabolismo implicado en la sntesis de macromolculas-cidos nucleicos, protenas sustancias de reserva y otros . Martinez, 1998: Madigan et al, 1999
Figura 1: Diferentes fases del metabolismo microbiano:
Leccin 7: Metabolismo energtico
Es tradicional agrupar a los microorganismos en clases metablicas dependiendo de la fuente de energa que utilicen. Todos los trminos utilizados para describir estas clases emplean la terminacin trofo que deriva del griego y significa alimentarse. As, lo organismos que utiliza luz como fuente de energa se llaman fototrofos (foto es luz en griego) y los organismos que utilizan productos qumicos como fuente de energa se denominan quimiotrfos. La mayor parte de los organismos que estudia la microbiologa utilizan compuestos orgnicos como fuente de energa; pertenecen por tanto a los quimiotrfos y se denominan quimiorganotrofos. Los organismos capaces de utilizar compuestos inorgnicos como fuente de energa se denominan quimiolitotrofos
Los mecanismo por los que se sintetiza ATP como resultado de reacciones de oxidacin reduccin que implican compuestos orgnicos, pueden contemplarse en dos grandes grupos: (1) Fermentacin, en que los procesos de oxido reduccin ocurren en ausencia de aceptores terminales de electrones aadidos; y (2) respiracin, en que el oxgeno molecular u otros oxidantes sirven como aceptores terminales de electrones. Naturaleza de la fermentacin: La fermentacin es el mecanismo ms simple y quizs el ms antiguo desde el punto de vista evolutivo, de los procesos de obtencin de energa. Se suponen que en las condiciones del mundo primitivo, donde no exista oxgeno libre, ni los rayos del sol llegaban a su superficie, los primero organismos solo podan obtener la energa a partir de la contenida en los compuestos orgnicos. Se puede definir entonces, la fermentacin como el proceso metablico de generacin de ATP, en el cual los donantes y los aceptores de
electrones
son
molculas
orgnicas.
(Martinez,
J;
1995)
Los
compuestos que llevan acabo estas dos funciones son usualmente dos metabolitos diferentes derivados de un sustrato fermentable simple (como azcar, por ejemplo). En la fermentacin el sustrato da lugar a una serie de compuestos, unos ms oxidados y otros ms reducidos; en el proceso fermentativo mantiene un estricto balance O-R. El nivel de oxidacin promedio de los productos finales es muy cercano al del sustrato. De ah que la generacin de ATP asociada a la fermentacin se denomina fosforilacin a nivel de sustrato. la fermentacin posee tres caractersticas: 1. En la fermentacin, tanto donantes como aceptores de electrones son molculas orgnicas; en ocasiones es la misma molcula la que se oxida y se reduce. 2. El proceso ocurre en ausencia de oxigeno 3. Existe un riguroso balance de C, O e H entre los sustratos y los productos
Un ejemplo de fermentacin es el catabolismo de la glucosa por una bacteria del cido lctico:
Glucosa
2 lactatos +2 H+
(C6H12O6)
2(C3H4O3- + 2CO2)
Ntese que sta es una reaccin balanceada y que los productos, lactato ms protones, tienen la misma proporcin de tomos de hidrgeno y oxgeno que la glucosa. Esta reaccin puede analizarse desde tres
puntos de vista: Termodinmicamente, por la energa de enlace y por el metabolismo intermediario. Desde el punto de vista termodinmico, las fermentaciones se caracterizan por ser una suma de reacciones, al final de las cuales los productos poseen un contenido energtico menor que el inicial. Si analizamos la fermentacin a travs de la energa de enlace, tendremos que en ella se producen reordenamientos moleculares en los que se pasa de funciones de mayor contenido a funciones de menor contenido energtico. As, en la mayora de las fermentaciones se pasa de grupos carbonilo e hidroxilo a grupos carboxilo de menor contenido energtico. Existen tres rutas bsicas empleadas por los microorganismos para el aprovechamiento energtico de los sustratos. La va fructosa difosfato (FDP) tambin conocida como gliclisis o va de Embden-Meyerhof La va de las pentosas fosfato (PP) o de Warburg-Dickens Horecker La va de Entner-Doudorff p KDPG
Cada una de estas vas tiene funciones y unidades especficas para los microorganismos. Las dos primeras vas son comunes tanto a organismos respiratorios como fermentativos, procariontes o eucariontes. La tercera se halla restringida a procariontes. Al existir diferentes vas de fermentacin se obtienen tambin diferentes productos: Algunos productos derivados de la fermentacin se observan en la siguiente tabla:
Tabla 1. Productos derivados de la fermentacin
Tipo de fermentacin Fermentacin lctica Fermentacin alcohlica Fermentacin mixta Fermentacin cida- Etanol, Lactato etanol, CO2
Producto(s)
succinato,
acetato,
formiato,
lactato, CO2, H2 Butilnglicol, CO2
butilngliclica Fermentacin butrica aceto- Acetato, acetona, butirato, butanol,
etanol, CO2, H2
Fuente: Martnez, J. 1995
Naturaleza de la respiracin: La respiracin es un mecanismo metablico de generacin de ATP en el que, a diferencia de la fermentacin, sirven como donantes de electrones tanto compuestos orgnicos como
inorgnicos (oxidndose). Generalmente el aceptor electrnico final es el oxigeno molecular. A diferencia de la fermentacin, los electrones son transferidos a travs de una cadena transportadora de electrones al final de la cual existe un aceptor exgeno oxidado (A), que se reduce. Si el aceptor final es el O2, hablamos de respiracin aerobia; Si el aceptor final es distinto del O2 (nitrato, sulfato, etc.), respiracin anaerobia. En ambos casos, la transferencia se da ordenadamente, en la direccin de mayor potencial redox positivo, con la consiguiente liberacin de energa libre. Como veremos enseguida, esta energa libre se va a traducir en un potencial electroqumico de protones, cuya disipacin a travs de ATP-asas de membrana origina ATP, conocindose este proceso como fosforilacin oxidativa
Leccin 8: Aspectos generales de los procesos biosnteticos Diversas reacciones catablicas producen unidades para la biosntesis, pero otras pueden ser tomadas desde exterior y un tercer grupo de
unidades, al igual que las coenzimas, son el resultado de las vas biosintticas que han sido denominadas reacciones metablicas.
Finalmente, en la sntesis de macromolculas los productos mayoritarios son protenas y cidos nucleicos. Tambin son importantes, e incluso pueden ser mayoritarios otros tipos de molculas de gran tamao, entre los que se encuentran los polisacridos y lpidos complejos. El tipo de estructura de estos dos ltimos variar mucho de un organismo a otro, y tiene especial inters en las bacterias.
La mayor parte de peso seco de la bacteria est constituidos por macromolculas de cuatro tipos: cidos nucleicos, protenas,
polisacridos y lpidos complejos. Estas macromolculas son polmeros formados por unidades estructurales de bajo peso molecular que tiene que formarse como precursores. Ya sabemos que las subunidades estructurales de los cidos nucleicos son 8 tipos distinto de nucletidos, las de las protenas 20 aminocidos diferentes, las de los polisacridos, unos 15 azucares diferentes, y que para la formacin de los lpidos se requieren cidos grasos, polialcoholes, azcares, aminas y aminocidos que constituyen tambin unos 20 tipos diferentes de molculas orgnicas. Adems se requieren sintetizar unas 20 coenzimas y transportadores de electrones.
Un tipo ms interesante y bastante ms complejo de proceso microbiano industrial es aquel en el que el producto deseado no es producido durante la primera fase de crecimiento, sino poco despus que se inicie la fase estacionaria. Metabolitos producidos durante la fase estacionaria son llamados metabolitos secundarios y son algunos de los ms comunes e importantes metabolitos de inters industrial. Los mejor
conocidos y el ms extensamente estudiados metabolitos secundarios son los antibiticos.
Se han reconocido las siguientes caractersticas de los metabolitos secundarios: Cada metabolito secundario se forma nicamente a partir de relativamente pocos organismos. La formacin de metabolitos secundarios es sumamente
dependiente de las condiciones de crecimiento, en particular de la composicin del medio. Es frecuente la represin de la formacin de metabolitos secundarios. Los metabolitos secundarios no son indispensables para el crecimiento y la reproduccin. Los metabolitos secundarios se suelen producir como un grupo de sustancias estrechamente relacionadas. Por ej. una sola cepa de Streptomyces ha llegado a producir 32 antibiticos de antraciclina diferentes, pero relacionados.
Leccin 9: Crecimiento Bacteriano Se suele definir el crecimiento de cualquier sistema biolgico como el incremento ordenado de todos los elementos componentes de ese sistema, lo cual implica un aumento de la masa celular que
eventualmente conduce a la multiplicacin celular. En organismos pluricelulares dicha multiplicacin se traduce en un aumento del tamao del individuo, mientras que en unicelulares que se dividen por fisin o por gemacin, lo que ocurre es un aumento de la poblacin. En los
microorganismos cenocticos (en los que la duplicacin del genoma no se acompaa de divisin celular) el crecimiento se traduce en aumento de tamao de la colonia cenoctica. El crecimiento bacteriano podemos estudiarlo desde dos puntos de vista: a escala individual y a escala poblacional. Para efectos prcticos, esta seccin nos centraremos al estudio del crecimiento poblacional. El cual en cultivo cerrado atraviesa por las siguientes fases: Fases del crecimiento en un sistema cerrado en medio lquido: En sistema de produccin cerrado, en el cual la adicin de sustancias y microorganismos solo se realizan al inicio de la fermentacin se pueden identificar 6 fases de crecimiento. (Figura 2)
Figura 2: Curva de crecimiento microbiano
Como se puede constatar en el anterior grfico, el crecimiento en un sistema cerrado consta de varias fases, que pasamos a comentar: 1) Fase de latencia: Es el perodo de tiempo durante el que el inoculo se adapta a las condiciones del medio fresco sobre el que se ha
sembrado. Se trata de un perodo de ajuste metablico. Su duracin depende de varios factores: Tamao del inoculo Estado fisiolgico del inoculo: Si las clulas estn daadas por algn agente, la fase de latencia tambin es larga, ya que necesitan un tiempo para la reparacin de los daos. Si las clulas del inoculo se tomaron de un cultivo previo en fase exponencial,la fase de latencia es ms corta. Medio de cultivo del que procede el inoculo: Si el medio es similar al medio fresco, la fase de latencia es ms corta; Si el medio del inculo era un medio rico y el medio fresco es ms pobre, la fase de latencia se hace ms larga, porque las bacterias necesitan un tiempo adicional para activar la sntesis de las enzimas biosintticas que estaban reprimidas en el medio rico. 2) Fase de transicin, de crecimiento acelerado, que conduce a la siguiente fase 3) Fase de crecimiento exponencial. Durante esta fase se produce un crecimiento balanceado no restringido durante unas pocas
generaciones (normalmente menos de 10). El tiempo de generacin (g) es caracterstico para cada especie o cepa, en cada medio concreto: El valor del tiempo de generacin (g) depende de: composicin del
medio, temperatura, pH, osmolaridad (tonicidad), etc. Los microorganismos hetertrofos suelen crecer ms rpidamente en los medios complejos, ricos, que en los medios sintticos, y dentro de estos
ltimos, mejor con glucosa que con otras fuentes de carbono. Algunos microorganismos tienen, a su temperatura ptima tiempos de
generacin muy cortos (15, 20 min), mientras que otros tienen crecen ms lentamente, con tiempos de generacin que pueden ser de varias horas o incluso das. 4) Fase de aceleracin negativa, de crecimiento desequilibrado, que conduce a 5) Fase estacionaria: Esta fase se caracteriza porque el coeficiente neto de crecimiento se hace nulo ( = 0), pero an existe crecimiento. Lo que ocurre es que el crecimiento bruto se equilibra con las muertes celulares. En este perodo se agotan nutrientes especiales y se acumulan sustancias de desecho. Incluso el pH del medio empieza a hacerse inadecuado para el crecimiento celular. Si la bacteria crece en un medio complejo, la fase 4 de transicin (de aceleracin negativa) puede ser relativamente larga, debido a que va recurriendo a fuentes alternativas (p. ej., puede recurrir a aminocidos como fuente de C una vez agotados los hidratos de carbono). 6) Fase de muerte exponencial: Se da muerte y lisis masiva, exponencial, del cultivo. Se debe a agotamiento de reservas de energa. Algunas veces las clulas aparecen grandes, hinchadas, distorsionadas (formas fantasmas, ghost). La pendiente de esta parte de la curva depende de las especies (por ejemplo, en bacterias entricas es suave, mientras que en Bacillus es ms acentuada) Leccin 10: Modelos Matemticos del crecimiento microbiano
Para muchos propsitos en biotecnologa microbiana es necesario conocer el nmero de generaciones, la poblacin de bacterias con el fin de estimar el estado fisiolgico de la poblacin microbiana y establecer relaciones con los sustratos del medio de cultivo o los productos de biosntesis.
En los organismos unicelulares la clula se divide por fisin binaria dando lugar a dos clulas hijas, cada una de las cuales se divide nuevamente produciendo dos clulas nuevas, por lo que en cada periodo e divisin la poblacin se duplica. Esta multiplicacin representa una progresin geomtrica en la cual hay una relacin directa entre el nmero de clulas iniciales y la cantidad de clulas en otro tiempo
determinado. La expresin matemptica que representa esta relacin es: N = No2n Donde: N= numero final de clulas, No = nmero inicial de clulas N = nmero de generaciones
Para explicar la anterior ecuacin en trminos de n transformacin logartmica cuyo resultado es:
se aplica una
El tiempo de generacin (G) de la poblacin es:
donde, t = horas o minutos de crecimiento exponencial
Una expresin alternativa del crecimiento se deriva de asumir que la velocidad de incremento en la masa celular o densidad celular (dx/dt) en un tiempo (t) es proporcional a la densidad celular en dicho tiempo. Por consiguiente:
de donde:
x = nmero de clulas o algn componente (protena)constante de velocidad de crecimiento instantneo Integrando se obtiene: ln X1 = ln Xo + t Tomando el antilogaritmo a cada lado se obtiene
X1 = Xo
e t
Considerando que despus de un tiempo la poblacin se duplica (td) entonces: X1 = 2Xo por tanto, la duplicacin de la poblacin celular se puede expresar as: X1/Xo = 2 reordenando los valores en la penltima ecuacin se obtiene: 2 = et aplicando antilogaritmo a cada lado se obtiene:
Entonces:
Ejemplo explicativo:
= 0.693/td
A continuacin se muestran los datos de un experimento de crecimiento bacteriano de E. colli el cual se realizo durante 5 horas. El numero de celulas fue cuantificado por unidades formadoras de colonia por cajas petri. Con los datos de la tabla calcular el numero de generaciones, el tiempo generacional y la velocidad especifica de crecimiento ().
Debido a que el crecimiento bacteriano es una progresin geomtrica, existe una relacin directa entre el nmero de clulas presente en el momento inicial y el habido en un momento determinado del crecimiento exponencial de modo que:
N= N2n
Donde N = nmero final de clulas, No= nmero inicial de clulas y n = numero de generaciones, por tanto despejando la ecuaciones anteriores tenemos que:
n= ( logN-logNo) / log 2 n =( log N log No ) / 0,301; remplazando tenemos n= log 108 log (2 x 107 ) / 0.301, resolviendo : n= (8 7,301) /0,301 n = 2,32 G = t/n G= 5hr/2.32 generaciones G= 2.15 horas
= ln 2 /td = 0.693/td = 0.6931/ 2.15 = 0.3223
Una aplicacin especialmente importante de la constante de velocidad instantnea, es el quimiostato, el cual es un dispositivo de cultivo
continuo donde el Volumen es constante y el nutriente entra con la misma velocidad con la que sale. En este equipo el tamao de la poblacin y la velocidad de crecimiento pueden mantenerse constantes, puesto que la velocidad de crecimiento es una funcin de la
concentracin de nutrientes. Monod propuesto la siguiente ecuacin para representar esta relacin:
Donde mx. es la velocidad de crecimiento a saturacin de nutriente, S es la concentracin de nutriente, y K es una constante de saturacin que es numricamente igual a la concentracin de nutriente a la que = de max La ecuacin anterior es formalmente equivalente a la ecuacin de Michaelis- Mente usada en el anlisis de la cintica enzimtica. La determinacin de los parmetros desconocidos max y Ks se puede hacer representando 1/sobre el eje y frente a 1/S sobre el eje X. Se obtendr una lnea recta que corta al eje Y, y el valor en el punto de intervenciones 1/ max .La pendiente de la recta es Ks/mx y como se conoce bajos. Capitulo 3: SISTEMAS DE FERMENTACIN
mx
se puede calcular Ks. En general los valores de Ks son muy
Leccin 11: Tipos de fermentacin 1) Fermentacin discontinua Una fermentacin discontinua (en batch) puede ser considerada como un sistema cerrado. A tiempo cero t = 0, la solucin esterilizada de nutrientes se inocula con microorganismos y se permite que se lleve a cabo la incubacin en condiciones ptimas de fermentacin. A lo largo de toda la fermentacin no se aade nada, excepto oxgeno (en forma de aire), un agente antiespu-
mante y cidos o bases para controlar el pH. La composicin del medio de cultivo, la concentracin de la biomasa y la concentracin de metabolitos cambia generalmente en forma continua como resultado del metabolismo de las clulas. Despus de la inoculacin de una solucin nutritiva estril con microorganismos y su cultivo en condiciones fisiolgicas se observan cuatro fases tpicas de crecimiento: fase de latencia, fase logartmica, fase estacionaria y fase de muerte
2) Proceso de fermentacin alimentada (fed-batch) En los procesos convencionales discontinuos que acabamos de describir, todos los substratos se aaden al principio de la fermentacin. Una mejora del proceso cerrado discontinuo es la fermentacin alimentada, que se utiliza en la produccin de substancias como la penicilina. En los procesos alimentados los substratos se aaden escalonadamente a medida que progresa la fermentacin. La formacin de muchos metabolitos secundarios est sometida a represin catablica por altas concentraciones de glucosa, por otros carbohidratos, o por compuestos nitrogenados. Por esta razn en el mtodo alimentado los elementos crticos de la solucin de nutrientes se aaden en pequeas
concentraciones al principio de la fermentacin y continan aadindose a pequeas dosis durante la fase de produccin.
Puesto que generalmente no es posible medir la concentracin del substrato directa y continuamente durante la fermentacin a fin de controlar el proceso de alimentacin, tienen que ser medidos
parmetros indirectos que estn correlacionados con el metabolismo del substrato crtico. Por ejemplo, en la produccin de cidos orgnicos, el valor del pH puede ser utilizado para determinar la velocidad de
alimentacin de la glucosa. En fermentaciones con valores osmticos crticos la alimentacin puede ser regulada controlando el valor de pO2 o el contenido en CO2, en los gases que se liberan.
3) Fermentacin continua. En la fermentacin continua se establece un sistema abierto. La solucin nutritiva estril se aade continuamente al biorreactor y una cantidad equivalente de solucin utilizada de los nutrientes, con los
microorganismos, se saca simultneamente del sistema. Entre las distintas clases de fermentaciones continuas pueden ser distinguidos dos tipos bsicos: a. Birreactor mezclado homogneamente. Este es utilizado como un quimiostato o como un turbidostato. En el quimiostato en estado de equilibrio, el crecimiento de las clulas se controla ajustando la concentracin de un substrato (Fig. 3.A). cualquier substrato que se requiera (carbohidrato, compuesto nitrogenado, sales, a,) puede ser utilizado como substrato limitante. En el turbidostato el crecimiento de las clulas se mantiene constante utilizando la turbidez para controlar la concentracin de biomasa y la velocidad de alimentacin de la solucin de nutrientes se ajusta de forma apropiada (Fig. 3).
Figura 3: Fermentacin continua en quimiostato A), Turbidostato B) y Fermentador de flujo de tapn
Fuente: Crueger y Crueger, Manual de Microbiologa industrial. 1993
b. Reactor de flujo de tapn. En este tipo de fermentacin continua la solucin de cultivo fluye a travs de un reactor tubular sin mezclado. La composicin de la solucin de nutrientes, el nmero de clulas, la transferencia de masa (suministro de O2) y la productividad varan en distintas posiciones dentro del sistema (Fig. 3C). A la entrada del reactor las clulas deben aadirse continuamente junto con la solucin de nutrientes (generalmente como un flujo que revierte de una desviacin desde la salida del fermentador o desde una segunda fermentacin continua). En un proceso continuo en condiciones de equilibrio la prdida de clulas debida al fluido que sale debe ser balanceada por el crecimiento del microorganismo
La velocidad de flujo D se define corno la velocidad de flujo volumtrico (que entra y sale) a travs del volumen del fermentador. Utilizando la ecuacin de Monod que describe la dependencia de la velocidad especfica de crecimiento sobre la concentracin de substrato limitante pueden ser determinados en el biorreactor la constante de rendimiento biomasa/substrato (Y la concentracin de substrato (S).
X/S),
la densidad de las clulas (X) y
A velocidad ms baja de flujo el substrato es casi completamente agotado por las clulas (S O). La concentracin de clulas es entonces X = So/Y. Si D aumenta, X desciende lentamente, al principio en forma lineal y luego a D = m cae bruscamente hasta O. S aumenta lentamente al principio y se aproxima a So a D = m. Cuando X es cero en la ecuacin que explica el sustrato (S), se alcanza el punto de lavado Dm.
Por encima de Dm no es posible un estado de equilibrio. Si la velocidad de flujo es slo ligeramente ms baja que D" el sistema es muy sensible a las influencias externas. Pequeas desviaciones en la alimentacin pueden originar cambios extremos en la biomasa o en la separacin de las clulas. La Figura 4 muestra la interdependencia de la velocidad de flujo, la concentracin de substrato, la concentracin de clulas y la velocidad de formacin de clulas (m = 1 h-1 Ks = 0,2 g/l Y = 0,5).
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BSICAS TECNOLOGAE INGENIERA CONTENIDO DIDCTICO DEL CUSO: 35689 BIOTECNOLOGA Figura 4. Efecto de la velocidad de flujo sobre la concentracin de substrato (5), la concentracin de clulas (X). Tiempo de duplicacin (1,) y velocidad de fermentacin de clulas (D * X)
Fuente: Crueger y Crueger, 1993 Manual de Microbiologa industrial
La velocidad
especfica mxima
de crecimiento
en los procesos
industriales se escoge de forma que se obtenga el rendimiento ms alto en el volumen ms pequeo de fermentador y en el tiempo ms corto. El modelo de Monod no es generalmente aplicable a la fermentacin continua a velocidades muy bajas o muy altas de dilucin. A velocidades medias de dilucin la relacin molar entre la biomasa producida y el CO2 que se desprende es constante. A bajas velocidades de dilucin la proporcin de CO2 se hace ms grande. Esto se debe a que se utiliza ms fuente de energa para el mantenimiento de la estructura celular, para la regulacin osmtica o para la motilidad. Por otra parte, a velocidades altas de flujo una parte del carbono aadido es oxidado incompletamente (a productos como piruvato, acetato o cidos
tricarboxlicos) y de esta forma se reduce la productividad. A bajas velocidades de flujo, con nitrgeno como substrato limitan te, se forman
materiales de reserva, como polisacridos, lo que resulta en un aumento en el tamao de la clula y por tanto de la biomasa. Leccin 12: Productividad y velocidad especfica de produccin La productividad de una fermentacin se define como Productividad P = Concentracin de producto / I = unidades Tiempo de fermentacin hxL
Para evaluar la economa de un proceso deben ser considerados varios factores, el tiempo de produccin de la fermentacin, el tiempo requerido para limpiar y poner a punto el fermentador, el tiempo de esterilizacin y la duracin de la fase de latencia. En la Figura 5 la pendiente de la tangente de la curva de formacin del producto es una medida de la productividad mxima y la pendiente de la lnea recta, al final de la curva de formacin de producto, indica la productividad total. Que el proceso de fermentacin termine al tiempo de la productividad mxima o ms tarde depende de los costes de operacin, que incluyen la energa, gastos generales, costes de mano de obra, gastos en personal y la capacidad del sistema. Utilizando una grfica como la de la Figura 5 se puede hacer una estimacin de como optimizar el proceso. En fermentaciones a tiempo corto (8-70 h) el tiempo para la puesta a punto es significativo, mientras que en fermentaciones largas (>3 das) el tiempo de puesta a punto es menos crucial. Las condiciones de fermentacin afectan directamente la productividad. La Figura 6 muestra la productividad de un proceso para la obtencin de protena de origen unicelular en relacin al contenido del substrato (hidrocarburo). Existe un aumento lineal de [a productividad a medida que el contenido del substrato aumenta, hasta que se alcanza la concentracin a la que el hidrocarburo se convierte en la fase continua (aceite y agua no son miscibles). Por encima de esta concentracin la productividad decrece.
Figura 5. Productividad total y productividad mxima
En fermentaciones continuas la productividad puede ser expresada como: P = D * X (g/l *h) Cuando se utiliza la relacin de la ecuacin sobre sustrato (S) resulta la siguiente ecuacin P=D*Yx/y (S0 D*Ks/m-D)
Figura 6. Productividad en relacin a la concentracin de cidos grasos en un proceso de produccin de protena de origen unicelular.
En fermentaciones continuas la productividad mxima es igual a la productividad total ya que el tiempo de establecimiento y la fase de latencia pueden ser despreciados. Por ejemplo, si el tiempo inicial de puesta a punto requiere 24 h Y la propia fermentacin continua funciona durante 24 horas con una velocidad de flujo de O,1 h-l, 24 h con 0,15 hl Y al menos 72 h con 0,2 h-l, la productividad total para el producto X se calcula como se muestra en la Tabl
Tabla 2: Productividad total de una fermentacin Periodo de tiempo: h 0-24 24-48 48-72 >72 300 1000 5000 Velocidad de flujo : h-1 Discontinuo 0,1 0,15 0,2 0,2 0,2 0,2 Productividad total X(g/l). D(h-1) -X .0,05 X.0,08 X X.0,171 X.0,191 X.0,198
Fuente: Cruger y Cruger. Manual de Microbiologa industrial. 1993
La velocidad especfica de produccin qp deriva de la ecuacin 1 de la siguiente forma:
El valor P1 es la concentracin de producto y la velocidad especfica de produccin qp es equivalente a la velocidad especfica de crecimiento en la ecuacin 1. Sin embargo, en los procesos de tipos II y IlI no hay correlacin directa entre y qp Leccin 13: Coeficientes de rendimiento Monod defini originalmente el coeficiente de rendimiento Y como la relacin de clulas producidas a substrato consumido:
Hoy
los
coeficientes
generales
de
rendimiento
se
utilizan
para
caracterizar los procesos de fermentacin, es decir las relaciones de las clulas producidas a los substratos individuales convertidos o a la energa liberada o energa consumida. Sin embargo, los coeficientes de rendimiento no son constantes, ya que dependen de parmetros biolgicos (X, ) y de parmetros qumicos (pO2 relacin C/N, y contenido en fsforo del medio. Los coeficientes de rendimiento han sido clasificados en tres grupos. El primer grupo de coeficientes (Ys Y02 Ykcal) da informacin acerca de los procesos tcnicos y por tanto acerca de la economa. El segundo grupo (Yc Yp YN Yave) describe el catabolismo, anfibolismo y anabolismo.
El tercer grupo incluye YATP un coeficiente que describe las relaciones de energa de las clulas (Tempest y Neijssel, 1984). Algunos autores utilizan otros coeficientes de rendimiento que deben ser propiamente designados, como muestra:
Leccin 14: Biorreactores Como ya se dijo, el equipo donde se realiza el proceso se denomina biorreactor o fermentados. El mismo provee todos los servicios que son necesarios para el cultivo, tales como mezclado, termostatizacin, suministro de oxgeno, entradas para adicin de nutrientes, control del pH, etc. Por otra parte, cuando se habla de sistemas de cultivo o, tambin, mtodos de cultivo, se hace referencia al modo de operar el biorreactor, esto es en forma continua o discontinua. En esta fase nos ocuparemos de los birreactores.
El biorreactor, es sin duda, uno de los equipos fundamentales de la microbiologa industrial. Es el recipiente donde se realiza el cultivo, y su diseo debe ser tal que asegure un ambiente uniforme y adecuado para los microorganismos. Las "tareas" que realiza el biorreactor pueden resumirse del siguiente modo: Mantener las clulas uniformemente distribuidas en todo el volumen de cultivo a fin de prevenir la sedimentacin o la flotacin. Mantener constante y homognea la temperatura.
Minimizar los gradientes de concentracin de nutrientes. Suministrar oxgeno a una velocidad tal que satisfaga el consumo El diseo debe ser tal que permita mantener el cultivo puro; una vez que todo el sistema ha sido esterilizado y posteriormente sembrado con el microorganismo deseado. Para satisfacer los cuatro primeros puntos es necesario que el biorreactor est provisto de un sistema de agitacin, a dems para el punto d) se requiere de un sistema que inyecte aire en el cultivo.
Describiremos brevemente dos tipos de biorreactores de uso muy difundido: el tanque agitado y al "air lift". En el primero de ellos (Figura 7) la agitacin se realiza mecnicamente mediante un eje provisto de turbinas accionado por un motor.
Figura 7. Esquema de un reactor aerobio con agitacin mecnica
Fuente: De Chisti y Moo-Young, 1993
El aire se inyecta por la parte inferior del tanque y es distribuido por una corona que posee pequeos orificios espaciados regularmente. El chorro de aire que sale de cada orificio es "golpeado" por las paletas de la turbina inferior generndose de este modo miles de pequeas burbujas de aire, desde las cuales difunde el O2 hacia el seno del lquido. El sistema de agitacin se completa con cuatro o seis deflectores que tienen por finalidad cortar o romper el movimiento circular que imprimen las turbinas al lquido, generando de este modo mayor turbulencia y mejor mezclado. El tanque est rodeado por una camisa por la que circula agua, lo que permite controlar la temperatura. Para tanques mayores que 1000 2000 litros este sistema ya no es eficiente y es reemplazado por un serpentn que circula adyacente a la pared interior del tanque. Debe tenerse en cuenta que a medida que es mayor el volumen de cultivo tambin lo es la cantidad de calor generado, por lo que se hace necesario una mayor rea de refrigeracin. Los tanques son
de acero inoxidable y estn pulidos a fin de facilitar la limpieza y posterior esterilizacin.

Figura 8. Esquema de un reactor tipo Air lift.
Fuente: De Chisti y Moo-Young, 1993
El aire que ingresa al biorreactor debe estar estril, lo que se consigue hacindolo pasar por un filtro cuyo dimetro de poro es de 0,45 micrones, que impide el paso de microorganismos y esporas. En los reactores de tipo "air lift" (Figura 8) es el mismo aire inyectado al cultivo lo que promueve la agitacin. Bsicamente consiste en dos cilindros concntricos y por la base de uno de ellos, por ejemplo el interior, se inyecta aire. De este modo se genera una circulacin de lquido ascendente en el comportamiento interno y descendiente en el externo, lo que favorece el mezclado.
Leccin 15: Transferencia de O2
Fermentacin en gran escala. R02, desde el seno de la fase
La velocidad de transferencia de 02,
gaseosa (burbujas) hasta la fase lquida est dada por la siguiente ecuacin:
Donde KLa es el coeficiente volumtrico de transferencia de oxgeno, C la concentracin de 02 disuelto en el seno del lquido y C* la concentracin de 02 disuelto que estara en equilibrio con la presin parcial de oxgeno de la fase gaseosa. El KLa depende del diseo del biorreactor, de las condiciones de operacin (caudal de aire, agitacin) y de la viscosidad del cultivo. A mayor viscosidad menor K La. El KLa es una medida de la capacidad que posee un biorreactor para sumnistrar O2 y el rango de valores usuales est comprendido entre 50 h-1 y 1000 h. Es til en este punto retomar el ejemplo visto al final del y calcular el KLa necesario para que la velocidad de transferencia de 02 sea igual a la de consumo; esto significa que R02 deber ser igual a 1,526 mg 1-1 h1. Asumiendo que C* = 7,8 mg 1 -1 y C = 0,5 mg 1 -1, resulta Por tanto valores de KLa iguales o superiores al calculado asegurarn, que el cultivo no est limitado por 02. Cuando la velocidad de consumo del oxgeno vara con el tiempo, como ocurre por ejemplo en un cultivo "batch", el clculo de KLa necesario se realiza empleando el mximo valor de RO2 esperado, a fin de asegurar un adecuado suministro de 02 durante todo el cultivo.
Caractersticas de la Fermentacin en gran escala. El fermentador donde se lleva a cabo los procesos industriales pueden variar en tamao de la escala pequea de laboratorio 5-10 litros a la enorme escala industrial de 400.000 litros. Las dimensiones dependen del proceso y de cmo opera. Los procesos manejados en lote o batch requieren fermentadores ms grandes que los manejados en forma continua o semicontinua.
Tabla 3. Tamao de fermentadores para varios procesos Tamao del fermentador (litros) 1-20.000 Enzimas sustancias molecular Producto para diagnstico, para biologa
40-80.000 100- 150.000
Algunas enzimas, antibiticos Penicilina, antibiticos aminoglicsidos, proteasas, amilasas, transformaciones de esteroides, amino cidos Amino cidos ( cido glutmico)
450.000
Fuente: Cruger y Cruger. Manual de Microbiologa industrial. 1993
11.1 Control y monitoreo del proceso. Debido a los elevados costos de produccin, los fermentadores industriales estn cuidadosamente controlados. No solo se necesita
controlar el crecimiento y la formacin del producto, sino que se deben controlar otros factores ambientales a medida que el proceso se efecta. Los factores ambientales controlados ms frecuentemente son: la concentracin de oxgeno, pH, masa celular y concentracin del producto. Tambin es necesario en muchos casos controlar la espuma dentro del fermentador y ajustar la temperatura. En la actualidad se utilizan computadoras para controlar los procesos de fermentacin ya sea en la obtencin de datos que reflejen los cambios que tienen lugar durante el proceso de fermentacin o en el control de varios factores ambientales que se deben ajustar o alterar durante la fermentacin. La obtencin de datos a medida que el proceso de fermentacin tiene lugar se llama adquisicin inmediata y tiene un valor especial cuando estos datos se puedan procesar para convertirlos en cifras que puedan interpretarse computadoras en trminos microbiolgicos graficar o los bioqumicos. datos Las
tambin
permiten
obtenidos
permitiendo al operador del fermentador tener una representacin visual del progreso de la fermentacin. Finalmente la computadora nos permite almacenar los datos en forma legible de modo que estos datos se puedan traducir a otro sistema, o analizar en forma mas sofisticada.
Un uso ms sofisticado de las computadoras es el control inmediato del proceso de fermentacin por ej. cambiando los parmetros ambientales a medida que la fermentacin progresa o agregando un nutriente a la velocidad de equilibrio exacto del crecimiento, en esta forma el nutriente es aadido cuando se necesita evitando en algunos casos que el mismo sea metabolizado a productos indeseables.
Finalmente, las computadoras pueden ayudar a modular los procesos de fermentacin, para ello se debe desarrollar un modelo matemtico del proceso de fermentacin, el cual incorpora ecuaciones diferenciales para describir el crecimiento microbiano y la formacin del producto. El valor del uso de una computadora para modelar el proceso de fermentacin es que se puede ensayar el efecto de varios parmetros sobre el crecimiento y sobre la formacin del producto en forma rpida e interactivamente, y entonces hacer modificaciones en los parmetros para ver como afectan al proceso. De esta forma se pueden estudiar con gran economa muchas variaciones de la fermentacin en la Terminal de la computadora y no en forma ms costosa en la planta piloto o en la planta industrial. Escalamiento del proceso de fermentacin. Uno de los aspectos ms importantes y complicados de la microbiologa industrial es la transferencia de un proceso del equipo de laboratorio a pequea escala, al equipo comercial a gran escala, procedimiento que se llama escalamiento. Es sumamente importante comprender los problemas del escalamiento ya que es raro que un proceso microbiano se comporte de la misma forma en fermentadores a gran escala que en un equipo de laboratorio a pequea escala. La mezcla y la aireacin son mucho ms eficientes en el matraz de laboratorio pequeo que en el fermentador industrial grande. A medida que cambia el tamao del equipo, cambia la relacin superficie/volumen. El fermentador tiene un volumen mucho mayor para un rea superficial determinada. Como la transferencia del gas y la mezcla dependen de la superficie expuesta ms que del volumen del fermentador, es obvio que sea ms difcil mezclar el contenido del tanque grande que del matraz pequeo. Como la mayor parte de las fermentaciones industriales son aerbicas, es indispensable una transferencia efectiva del oxigeno. Con el medio de cultivo rico que se utiliza en los procesos industriales se obtiene una alta biomasa, que
origina una gran demanda de oxigeno. Si se reduce la aireacin, aun durante un periodo parcial, corto, con el cultivo puede experimentar en trminos una de
anaerobiosis
serias
consecuencias
rendimiento del producto. El escalamiento en el fermentador industrial es la tarea del ingeniero bioqumico, quien esta familiarizado con la transferencia de gases, la dinmica de fluidos y la termodinmica. El papel del microbilogo industrial en el proceso de escalamiento es trabajar estrechamente con el ingeniero bioqumico para asegurar que se han abarcado los parmetros necesarios para una fermentacin exitosa y que se dispone de las cepas microbianas apropiadas para una fermentacin en gran escala. Las distintas etapas que deben realizarse para llegar de un proceso de laboratorio a un proceso industrial son las siguientes: 1) Experimentos en el matraz de laboratorio que son generalmente la primera indicacin que es posible un proceso de inters industrial. 2) El fermentador de laboratorio, un fermentador a escala pequea, generalmente de vidrio y de 5 a 10 litros de capacidad. En el fermentador de laboratorio es posible ensayar variaciones en el medio de crecimiento, temperatura, pH, etc., ya que los costos son bajos tanto en el equipo como en los medios de cultivo. 3) La etapa en planta piloto, que se suele llevar a cabo en equipos de 300 a 3000 litros. Aqu las condiciones se acercan mas a la escala industrial, pero el costo no es aun un factor de importancia. En el fermentador de una planta piloto es deseable una cuidadosa
instrumentacin y un control con computadora, de modo que las condiciones que se obtengan sean lo ms similares a las del
fermentador industrial.
Actividades: Investigue en su localidad los sustratos o subproductos que pueden utilizarse como fuente de Carbono, nitrgeno y fsforo. Enuncie sus caractersticas relacionadas en cuanto a produccin mensual del
sustrato, estabilidad del sustrato y concentracin de los nutrientes. Investiga sobre mtodos de cuantificacin del crecimiento microbiano, realiza un foro con tus compaeros y compara las diferentes tcnicas. Establece las ventajas e inconvenientes de la produccin de metabolitos intracelulares con los metabolitos extracelulares. Bibliografa:
1. Aiba S., Humphrey A. E. And Millis N. F. (1973) Biochemical Engineering, 2da edition, Academic Press, New York.
2. Biochemical engineering in biotechnology. Moo-Young M and Chisti Y, Pure & Appl. Chem., 66(1): 117-136 (1994). 3. Chisti Y and Moo-Young M, Bioprocess intensification through bioreactor engineering. Trans Inst. Chem. Eng., 74A: 575-583 (1996). 4. Chisti Y and Moo-Young M. Aeration and mixing in vortex fermenters. J. Chem. Technol. Biotechnol., 58: 331-336 (1993).
5. Chisti, Y., Airlift Bioreactors, Elsevier, London, 1989, pp. 355. 6. Chisti, Y., Moo-Young, M., in Biotechnology: The Science and the Business, Moses, V., Cape, R. E., eds, Harwood Academic Publishers, New York, 1991, pp. 167-209. Fermentation technology, bioprocessing, scale-up and manufacture.
7. Choi KH, Chisti Y and Moo-Young M, Split-channel rectangular airlift reactors: Enhancement of performance by geometric modifications. Chem. Eng. Commun., 138: 171-181 (1995). 8. Wenge F, Chisti Y and Moo-Young M .A new method for the measurement of solids holdup in gasliquid-solid three-phase systems., Ind. Eng. Chem. Research, 34: 928-935 (1995). Organizacin de Estados Amricanos, OEA. Biotecnologa. 2002
UNIDAD 2
CAPITULO CUATRO : BIOTECNOLOGA ENZIMTICA
Leccin 16 : Las enzimas biocatalizadores de naturaleza proteica
Leccin 17: Naturaleza de las enzimas
Leccin 18: Clasificacin de enzimas segn la naturaleza de la reaccin y cofactores
Leccin 19: Cintica enzimtica
Leccin 20: Produccin de enzimas
CAPITULO CINCO : PRINCIPIO DE INGENIERIA GENETICA APLICADO A LA BIOTECNOLOGA
Leccin 21: Tcnicas utilizadas en la manipulacin gentica in vitro.
Leccin 22: Tecnologa del ADN recombinante
Leccin 23: La reaccin en cadena de polimerasa ( PCR)
Leccin 24: Muta gnesis , Muta gnesis dirigida por oligonucletidos
Leccin 25: Muta gnesis en casette o interrupcin gnica
CAPITULO SEIS : APLICACIONES INDUSTRIA ALIMENTARIA
DEL
ADN
RECOMBINANTE
EN
LA
Leccin 26: Animales transgnicos
Leccin 27: Plantas Transgnicas
Leccin 28: Alimentos genticamente modificados
Leccin 29: Alimentos funcionales
Leccin 30: Prebiticos
UNIDAD 2: BIOCATALISIS E INGENIERA GENTICA APLICADA A LA BIOTECNOLOGA INTRODUCCIN: La siguiente unidad ha sido dividida en tres captulos: en el primero, se pretende que los estudiantes se apropien del concepto de biocatlisis, los fundamentos bsicos que caracterizan esta disciplina para luego identificarlos y diferenciarlos de otros procesos. En el segundo captulo, se pretende que los estudiantes a travs del conocimiento bsico de biologa molecular sean capaces de identificar los procesos biolgicos ambiente para que la respuesta celular sea la ms eficiente para la obtencin de productos y o servicios en la industria alimentaria. Por ltimo en el tercer captulo se hace un anlisis del impacto de la utilizacin de estas tcnicas en la Industria alimentaria.
Objetivos Consolidar conceptos de Biologa molecular esenciales para aproximarse y comprender las transformaciones genticas en los seres vivos que se pueden traducir en la obtencin de nuevos alimentos mejoramiento de procesos de inters en la industria alimentaria. Adquirir bases tericas que respaldan los procesos de ingeniera gentica aplicada a la industria alimenticia. Analizar y discutir las oportunidades y desventajas que ofrece la Biotecnologa en la alimentacin mundial Obtener una visin holstica del debate que se ha planteado a cerca de las ventajas y desventajas sobre la introduccin de alimentos transgnicos en la alimentacin mundial. Capitulo CUATRO: BIOTECNOLOGA ENZIMTICA Leccin 16: Las enzimas biocatalizadores de naturaleza proteica El choque entre dos molculas produce energa que puede ser absorbida por las molculas mismas, o puede ser disipada bajo forma de calor en el medio. Si la energa absorbida por el substrato (S) es suficiente para franquear la barrera de potencial, llamada energa de activacin, el substrato se
puede transformar y conducir a la formacin de un producto (P), es decir llegar a un estado final, diferente del estado inicial. Esta energa de activacin generalmente es elevada y no es compatible con las condiciones del medio en el cual se deben desarrollar las reacciones del metabolismo de los organismos vivientes: pH vecino de la neutralidad, temperatura comprendida entre O y 40C, presin vecina a la presin atmosfrica. Por tanto, la realizacin de esas reacciones necesita de catalizadores bioqumicos, las enzimas cuya accin consiste, como la de todo catalizador abatir la energa de activacin lo que tiene
por efecto acelerar la reaccin, cuya velocidad se encuentra multiplicada por un factor del orden de 1012-1020. Al final de cada ciclo de reaccin, la enzima permanece inalterada. E+S ES E+P
Las enzimas son pues, catalizadores biolgicos de naturaleza protdica que intervienen en todas las reacciones metablicas energticamente posibles, que ellas aceleran por activacin especfica. Permiten alcanzar rpidamente el estado de equilibrio de la reaccin sin modificarlo. Son las llaves tiles de la biotecnologa y de la bioindustria. Son ellas las que en la ingeniera microbiolgica, catalizan las reacciones metablicas puestas en juego y aseguran su regulacin. Son ellas igualmente las que conducen la ingeniera gentica para realizar las modificaciones del equipamiento enzimtico de ciertos microorganismos con vista a hacerlos aptos para la biosntesis de metabolitos interesantes El conocimiento de las enzimas, de su naturaleza y de sus propiedades, as como de la cintica de las reacciones que catalizan es fundamental en biotecnologa Leccin 17: Naturaleza de las enzimas Todas ellas son macromolculas que corresponden a la clase de las protenas globulares. Algunas son holoprotenas constituidas nicamente por un encadenamiento de cidos aminados; otras son heteroprotenas, que poseen una parte no protenica, el cofactor, necesario para la actividad cataltica y asociado ms o menos fuertemente a la protena. Especificidad de la catlisis enzimtica sitio activo:
Una de las caractersticas ms importantes de la catlisis enzimtica reside en su especificidad, mucho ms marcada que la especificidad de la catlisis qumica. Esta especificidad presenta un doble aspecto:
Especificidad de reaccin. Una enzima no puede catalizar sino un solo tipo de reaccin, por ejemplo: hidrlisis de enlaces glucosdicos o hidrlisis de enlaces steres (liplisis), etc. Esta especificidad sirve de base a la clasificacin de estos catalizadores bioqumicos. Especificidad en cuanto al substrato. Esta propiedad resulta delhecho, plenamente establecido, de que toda reaccin enzimtica implica la fijacin del substrato en puntos bien precisos de la protena enzimtica. Esta fijacin se hace por el establecimiento de enlaces de tipo del de hidrgeno, hidrfobos o de Van der Waals.
La conformacin de la protena enzimtica es tal, que no reconoce sino un tipo de substrato. Ciertas enzimas presentan una especificidad estricta y son capaces de asociarse a un nico substrato; ste es el caso de la fumarasa (EC. 4.2.1.2) que transforma el L-malato en fumarato y que no tiene accin sobre el D-malato o sobre ningn otro compuesto relacionado. Otras enzimas, por el contrario, se pueden fijar a substratos diferentes, pero de la misma naturaleza y provocar un mismo tipo de reaccin qumica. La enzima, despus de haber fijado el substrato, lo transforma en seguida. Para esto, su estructura espacial es tal, que en la vecindad y a las distancias adecuadas se encuentran grupos funcionales en donde las acciones diferentes y complementarias realizan la reaccin. La pequea porcin de la enzima, implicada en la fijacin y posicionamiento del substrato, as como en la reaccin de catlisis, delimita un volumen denominado "sitio activo". En las enzimas holoprotenicas, stos son principalmente los agrupamientos funcionales libres situados en los radicales de algunos cidos aminados que intervienen al nivel del sitio activo (funcin OH de la serina, ncleo imidazol de la histidina, funcin fenol de la tirosina, funcin COOH de los cidos asprtico o glutmico, funcin tiol de la cistena).
En lo que concierne a las enzimas del tipo heteroprotenico, la fijacin al substrato se hace sobre la parte protenica, la apoenzima, mientras que la catlisis de la reaccin es hecha por la parte no protenica, el grupo prosttico o el cosubstrato. La parte "apoenzima" de la molcula enzimtica que lleva el sitio de fijacin al substrato es por consiguiente responsable de la especificidad en cuanto al substrato de esa enzima. Pero tambin puede intervenir en la especificidad de la reaccin e inducir un tipo particular de reaccin. As es, por ejemplo, que en el metabolismo de los cidos aminados, el fosfato depiridoxal puede, de acuerdo a la apoenzima con la cual est combinado, catalizar reacciones, sean de transaminacin, sean de descarboxilacin, de desaminacin, o de racemizacin. La actividad de las enzimas es funcin directa de su estructura terciaria o de la cuaternaria. En estas condiciones, todo tratamiento que modifique la conformacin de la enzima (calentamiento, modificacin del pH), es decir estorbando o impidiendo, la fijacin del substrato a la enzima o cambiando la estructura del sitio activo, alterar las propiedades catalticas de la enzima y por tanto su funcin.
Grfico 9:
Enzimas complejos
Fuente: http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/enzimas/conceitos-e-funcoes1.php
Leccin 18: Clasificacin de enzimas segn la naturaleza de reaccin y cofactores Las enzimas heteroprotenicas utilizan diversos tipos de cofactores: algunos son iones metlicos (Mg++, Fe++, eu++, Mo+++, Zn++), Fig. otros cofactores son orgnicos (heme, nicotinamida, flavina, coenzima A, fosfato de piridoxal, tiamina, etc.). Este tipo de enzima adopta
diversas formas de funcionamiento, lo que con frecuencia entraa una confusin en la terminologa de estos cofactores. En efecto, algunos estn combinados fuertemente a la apoenzima por intermedio de enlace covalente; son parte integrante de la enzima y no se le separan: se les designa con el nombre de grupos prostticos. Otros, por el contrario, son co-substratos; se fijan en un primer tiempo sobre la apoenzima, provocando la transformacin del substrato sufriendo una modificacin en su estructura qumica; despus se separan de la apoenzima: se les denomina coenzimas. Regresan a su estado inicial en el transcurso de una segunda etapa enzimtica fijndose sobre otra apoenzima. Para ilustrar esta distincin, tomemos el caso de dos enzimas responsables de la oxidacin de cidos aminados: la L-aminocido-oxidasa y la glutamato deshidrogenada. La primera (EC. 1.4.3.2) es una flavoprotena en la cual el cofactor, la flavina adenosina dinucletido (FAD) se comporta como un grupo prosttico. Permaneciendo fija a la apoenzima provoca la oxidacin por deshidrogenacin y desaminacin del cido aminado y se reduce a F ADH:z. La enzima regresa a su estado inicial cediendo los dos hidrgenos, fijados transitoriamente, a un segundo substrato, oxidante ms potente, que provoca la reoxidacin del F ADH:z a F AD. A la inversa, la glutamato deshidrogenasa (EC. 1.4.1.2) cataliza una reaccin del mismo tipo, la oxidacin del cido glutmico a cido 2oxoglutrico con ayuda de la coenzima nicotinamida adenina dinucletido (NAD). Esta se encuentra reducida. Abandona la superficie de la apoenzima. En seguida ser reoxidada a expensas de otro substrato que es reducido por otro sistema enzimtico del medio. El NAD se comporta en estas dos reacciones sucesivas como un substrato.
Figura 10: Ejemplo de cofactor
Fuente: http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/enzimas/conceitos-efuncoes1.php, 2007
La nomenclatura y la clasificacin de las enzimas han sido normalizadas por la Comisin sobre Enzimas de la Unin Internacional de Bioqumica, creada en 1955 antes de solucionar la confusin que haba y el-riesgo de que la situacin se agravara con el rpido progreso del conocimiento acerca de las enzimas. Los objetivos que fueron asignados a esa Comisin sobre Enzimas desde su creacin fueron: Hacer un inventario de las enzimas identificadas y caracterizadas, precisando para cada enzima la naturaleza exacta de la reaccin catalizada. Establecer, a partir de este inventario, una clasificacin de las enzimas. Definir, con base en esta Clasificacin, reglas de nomenclatura que permitan designar, sin ambigedad, a una enzima dada, proporcionando la mayor informacin posible sobre la naturaleza de la reaccin catalizada.
Para cada enzima es preciso: La reaccin catalizada. Su nombre sistemtico en nomenclatura normalizada. Y sobre todo su nmero de identificacin que define sin ninguna ambigedad, el lugar de la enzima en la clasificacin normalizada. Este I nmero contiene 4 cifras o nmeros, separados por puntos, cada uno de ellos corresponde a los elementos siguientes: a) La primera cifra indica la clase a la cual pertenece la enzima. Estas clases, en nmero de 6 se definen de acuerdo a la naturaleza general de la reaccin catalizada. Hay: loxidorreductasas, 2-Transferasas, 3-Hidrolasas, 4-Liasas, 5Isomerasas, 6-Ligasas (o sintetasas). I b) La segunda y la tercera cifras designan la subccase y la subsub- I clase, definiendo en cada clase, segn ciertos criterios que se precisarn ms adelante. c) La cuarta cifra da el nmero de orden de la enzima en la subclase considerada
La regla general adoptada para designar a una enzima de acuerdo a la nomenclatura sistemtica es que el nombre de una enzima se forme de dos partes: La primera lleva el nombre del substrato; o en el caso de reacciones bimoleculares, los nombres de los dos substratos separados por "dos puntos". La segunda parte indica la clase a la cual pertenece la enzima; el nombre de la clase puede. Precisarse por un prefijo que precede al tipo exacto de reaccin catalizada. OXIDORREDUCTASAS: Catalizan las reacciones de oxido-reduccin: transferencia de hidrgeno o de electrn(es) de un donador, que est oxidado, a un receptor, que est reducido.(Fig. 5) En esta clase, que lleva la cifra, se reagrupan todas las enzimas llamadas: oxidasas, reductasas, deshidrogenasas y peroxidasas. Los nombres comunes que se han retenido son del tipo "donador: deshidrogenasa" o "receptor: reductasa". El trmino oxidasa no se ha conservado salvo cuando el receptor es el oxgeno.
Fig. 11. Enzimas de oxido reduccin
Fuente: http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/enzimas/conceitos-e-funcoes1.php . 2007
TRANSFERASAS Catalizan las reacciones de transferencia de radicales o de agrupamientos (metilo, hidroximetilo, carboxilo, acilo, glucosilo, amino, etc.). En esta clase, que lleva la cifra 2, se reagrupan las transferasas, fosforilasas, cinasas, entre otras Las sub-clases se definen por la
naturaleza del agrupamiento que es transferido (agrupamientos de un carbono, de dos carbonos, nitrogenados, etc.). El nombre sistemtico est formado segn el modelo: donador: receptor o grupo transferido: transferasa.
Fig. 12: TRANSFERASAS
Fuente: http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/enzimas/conceitos-e-funcoes1.php
HIDROLASAS Provocan la hidrlisis de diversos tipos de enlaces: ster, acetal (osdico), amida (peptdico), (Fig. 13) Las subclases son definidas por la naturaleza general del enlace que es hidrolizado. El nombre sistemtico se forma de acuerdo al modelo "substrato hidrolasa", un prefijo que precisa la naturaleza del grupo eliminado cuando la enzima es especfica para este enlace. El nombre comn que se recomienda es, en la mayor parte de los casos, formado por el nombre del substrato al cual se adiciona el sufijo "asa". En general las hidrolasas son holoprotenas. Algunas pueden tener un grupo prosttico, por ejemplo el fosfato de piridoxal.
Fig.13 HIDROLASAS
LIASAS Son enzimas que rompen los enlaces C - C, C - O, C - N u algn otro, por medios diferentes a la hidrlisis o a, la oxidacin, con formacin de un doble enlace en alguno de los dos fragmentos. Cuando ellas actan en sentido inverso -condensacin de dos molculas con desaparicin de un doble enlace se les designa con el nombre de sintetasas. Las subclases son definidas por la naturaleza del enlace roto y las sub. clases precisan la identidad de la fraccin eliminada: CO2, aldehdo, amoniaco, etc. El nombre sistemtico se forma de acuerdo al modelo, substrato: fraccin eliminada-liasas.
Fig. 14: Liazas. Condensacin de molculas con desaparicin de doble enlace
ISOMERASAS Catalizan las reacciones de isomerizacin: racemizacin, epimerizacin, isomerizacin cis-trans, o tambin originan modificaciones intramoleculares tales que transfieren un agrupamiento o producen oxidorreduccin. Para su nomenclatura se retiene el principio "substrato. . .asa", pero el trmino isonerasa se reserva a ciertas subclases; un prefijo hace precisa la naturaleza de la isomerizacin, por ejemplo cis-trans isomerasa.
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BSICAS TECNOLOGAE INGENIERA CONTENIDO DIDCTICO DEL CUSO: 35689 BIOTECNOLOGA Fig. 15: Ejemplo de Isomerizacin
LIGASAS O SINTETASAS Son enzimas que catalizan la reaccin de unin de dos molculas, acopladas a la ruptura, sin intervencin del agua, de un enlace pirofosfrico en el ATP o eventualmente en un nucletido trifosfrico del mismo tipo. Las subclases corresponden al tipo de enlace que se establece (C - , C S, C - N, C - C) y la sub-subclases se refieren a la naturaleza del producto formado (amida, pptido, etc.) o a la reaccin que es catalizada. El nombre sistemtico es formado de acuerdo al modelo, " X: Y ligasa (formando ADP), X Y , son los dos substratos que se condensan; el producto formado a partir del nucletido trifosfrico implicado .en la reaccin (ADP o AMP) se indica entre parntesis. Para darle nombre comn se utiliza, en general, el nombre del producto formado seguido del trmino "sintetasa".
Fig. 16: Ligazas
Leccin 18:
Cintica enzimtica
El objeto de la cintica enzimtica es el estudio de las enzimas en su funcionamiento. Se propone, en particular, establecer las relaciones que existen entre la velocidad de la reaccin enzimtica y las concentraciones del substrato (S) y de la enzima (E), as como la influencia de algunos factores: pH, temperatura, presencia de efectores y eventualmente, actividad del agua. La Comisin sobre Enzimas ha definido una unidad internacional de actividad enzimtica, el katal, cantidad de enzima que transforma un mol de substrato por segundo bajo las condiciones experimentales estndar. Esta es una unidad de valor elevado: por ello se utilizan ms corrientemente sub. mltiplos de ella: microkatal (JLkat), nanokatal (nkat) y picokatal (pkat), que valen, respectivamente 10-6, 10-9 y 1012 katal (kat). Las enzimas se pueden presentar bajo la forma pura, o bajo la forma de preparaciones enzimticas, ms o menos purificadas. Con frecuencia es interesante determinar la actividad enzimtica de una cantidad unitaria de preparacin enzimtica no purificada o de una enzima purificada. Se refiere entonces la actividad, sea a 1 kilogramo de protena, sea a una molcula gramo, as se define una actividad especfica, katal por kg de protenas y una actividad molar, katal por mol de enzima.
Enzimas Michaelianas Principales hechos experimentales: Debemos subrayar, como un prembulo, la necesidad absoluta de que las enzimas sean puras y desprovistas de actividad parsita. Los tres hechos experimentales principales, en que se basan las leyes generales de la cintica enzimtica son: a) El substrato, S, forma con la enzima, E, un complejo intermediario transitorio ES. Este complejo resulta de una complementaria de la estructura entre el sitio activo de la enzima y la molcula del substrato. b) La velocidad de la reaccin en el tiempo t, es decir la velocidad de dS/dP desaparicin del substrato, o de aparicin del producto, dt/dt que se representa por la pendiente de la tangente a la curva, P o S =
f(t) no es constante para las concentraciones dadas en enzima o en substrato (fig.9), y disminuye en funcin del tiempo debido a la desaparicin del substrato en el curso de desarrollo de la reaccin. Siempre, al principio de la reaccin, se puede considerar que la tangente a la curva se confunde con aqulla en que la velocidad permanece constante. Los estudios de cintica enzimtica corresponden siempre a esta parte lineal de la curva; lo que implica el trabajar a velocidades inciales. En estas condiciones, al principio de la reaccin, la concentracin en producto es muy dbil; puede despreciarse, as como la reaccin inversa de transformacin del producto en substrato. Entonces se puede escribir k1 E + S ES k2 k3 E + P
Figura 17:
Cintica enzimtica
Fuente: Scriban, Biotecnologa, 1992
c) Por otra parte, para una concentracin dada de substrato, el estudio de las variaciones de la velocidad inicial de reaccin en funcin de la concentracin de enzima (fig. 18) muestra que esta variacin no es lineal. La curva presenta un trazo hiperblico correspondiente al hecho de que para una cierta concentracin de enzima, la totalidad del substrato se encuentra bajo la forma de complejo enzima-substrato; lo que resulta que la velocidad inicial, funcin de la concentracin de este complejo, permanece constante. Para los estudios cinticos, es
necesario situarse en las condiciones que corresponden al principio de la curva, donde es lineal, es decir a concentraciones bajas de enzimas.
Fig. 18. Curva que representa la velocidad enzimtica en funcin de la concentracin de la enzima
Fuente: Scriban, Biotecnologa, 1985
En otros trminos, la cantidad de enzima debe ser pequea en comparacin a la concentracin del substrato, de tal manera, que la formacin del complejo enzima-substrato, ES, no modifica, o modifica poco la concentracin del substrato,
Hiptesis de Michaelis-Menten: Al establecer la ecuacin de la velocidad, Michaelis y Menten toman como principio de que la velocidad de transformacin del complejo ES en E + P es muy lenta, con relacin a la velocidad de la ruptura del complejo que vuelve a dar E + S. Esta hiptesis significa que k3 ~ k2 Y que E y ES estn en equilibrio, sea:
Hiptesis del estado estacionario de Briggs y Haldane: Estos autores consideraron que la hiptesis de Michaelis-Menten es demasiado
restrictiva y que es preferible postular un estado estacionario, estado para el cual la velocidad de formacin del complejo ES es igual a su velocidad de descomposicin en todas las direcciones (formacin de productos y aumento del substrato). Velocidad de formacin de ES = k1 [E] [S] Velocidad de desaparicin de ES = k2 [ES] + k3 [ES] = (k2 + k3) [ES] El estado estacionario se describe entonces:
Al escribir que la cantidad de enzima que se ha puesto en el medio de reaccin [ET] se reparte en una fraccin libre [E], y una fraccin que forma un complejo [ES], se tiene: [ET] = [E] + [ES] Al sustituir E por su valor, se obtiene:
La velocidad de formacin del producto est dada por: v = k3 [ES], la ecuacin general es de la forma:
Ecuacin de Michaelis-Menten: Cuando la concentracin en substrato cambia al infimito; la velocidad inicial tiende hacia k3 [Er], o sea hacia la velocidad mxima V m; toda la enzima se encuentra entonces bajo la forma ES. La ecuacin es en su forma ms simple:
Esta es la ecuacin de Michaelis-Menten, segn la cual la velocidad de la reaccin enzimtica es una funcin hiperblica de la concentracin del substrato. Los resultados experimentales en el caso de las enzimas michaelianas con un solo substrato corroboran la validez de esta ecuacin. Significacin de Km Y de Vm: Vm representa la velocidad mxima que puede alcanzar la reaccin: toda la enzima se encuentra bajo la forma compleja ES. Cuando la velocidad de la reaccin alcanza la mitad de la velocidad mxima, v = 1/2 Vm, Km es entonces igual a (S]. Si kz > k3, Km = kz/k1 que es la hiptesis de Michaelis-Menten : [E] + [S] y [ES] estn en equilibrio y la formacin del producto representa una ligera fuga. En este caso, Km puede ser asimilada a la inversa de la afinidad de las enzimas por el substrato. Mientras ms pequea sea Km, mayor ser la afinidad y viceversa. Si kz < k3, la hiptesis de Michaelis-Menten no tiene validez y Km ya no tiene relacin con la afinidad de la enzima por el substrato. Tambin es preferible considerar Km como una constante emprica igual a la concentracin del substrato para la cual la velocidad inicial es igual a V m/2en las condiciones experimentales definidas. Reversibilidad y relacin de Haldane: En distintos puntos de la curva las reacciones enzimticas son reversibles, es decir las enzimas pueden catalizar la reaccin inversa:
Keq = constante de equilibrio de la reaccin global. Como se explica en la siguiente grfica: Representacin grfica de la cintica michaeliana de un substrato: La representacin de Michaelis-Menten, v en funcin de S.
Figura 11: Representacin grfica de Michaelis-Menten
Fuente: Scribian, Biotecnology, 1990
Esta relacin resalta la interdependencia de la constante de equilibrio y de los parmetros cinticos de una reaccin enzimtica reversible y muestra que no es posible olvidar la reaccin inversa en la que los productos se acumulan. Enzimas alostricas Las enzimas con mltiples subunidades tienen estructura cuaternaria. Una consecuencia de las subunidades mltiples es que cada subunidad cataltica individual tiene su propio centro activo. Esto significa que una enzima con estructura cuaternaria puede unir ms de una molcula de sustrato. Alostrico significa "forma diferente". Las enzimas alostricas cambian de forma entre las formas activas e inactivas como resultado de la unin de los sustratos en el centro activo y de las molculas reguladoras en otros sitios. En el caso simple de una enzima alostricas con una forma activa e inactiva, el cambio en la velocidad de reaccin con el incremento de la concentracin de sustrato es tpicamente una curva de forma "S". El significado de la curva de forma S para una enzima alostricas A bajas concentraciones de sustrato, la enzima est en la forma inactiva (conformacin inactiva). Cuando la concentracin de sustrato aumenta, el sustrato se une a la enzima y provoca un cambio de conformacin a la forma activa de la enzima. Despus de que el primer sustrato este unido, la segunda y siguientes molculas de sustrato se unen con mayor afinidad. Este fenmeno es lo que se llama "cooperatividad", y la forma S de la curva indica la unin cooperativa del sustrato. El resultado del cambio a la forma activa es un fuerte incremento en la unin de los otros sustratos, y como resultado, la velocidad de reaccin aumenta muy rpidamente en un estrecho margen de concentracin de sustrato. Cuando todos los centros activos de una enzima alostricas estn ocupados con sustrato, la velocidad de la reaccin es constante y se alcanza la meseta de la Vmax.
Figura 19: Curva de enzimas alostricas
Leccin 20: Produccin de enzimas La produccin mundial de enzimas representa una cifra anual de 1.5 millares de millones de dlares, 60% de ellos con utilizacin en las industrias agroalimentarias. Las enzimas que se utilizan en procesos agroalimentarios son objeto de una reglamentacin estricta, en lo que concierne a su produccin, su pureza qumica y microbiolgica. En su presentacin comercial, sea bajo la forma ms o menos diluida, fijada sobre soportes inertes, o diluyentes estn tambin igualmente reglamentadas. Las enzimas, biocatalizadores utilizados en la bioindustria o en otras diversas industrias (farmacia, textiles, pieles...) pueden provenir de varias fuentes, especialmente: De origen vegetal, de origen animal y de origen microbiano. Cada una de estas fuentes se estudiar tomando en cuenta slo algunos ejemplos. Enzimas de Origen Vegetal Las enzimas de origen vegetal y especialmente las proteasas son por orden decreciente de inters tecnolgico, una de las ms importantes enzimas vegetales de uso industrial se encuentran: la papana que proviene de una planta ecuatorial y tropical (Carica papaya L.), la bromelina, extrada de la pifia (Ananas comosus Merr) y la ficina proveniente del higo (Ficus carica).
La preparacin de papana industrial ms pura (papana refinada) ha sido desarrollada en 1969 por Baudard en Zaire (Jones y Mercier, 1974). El ltex fresco es guardado en fro, agitado, diluido, centrifugado, filtrado sobre kieselgur y a travs de placas esterilizantes, a fin de eliminar toda impureza y finalmente atomizada al vaco a 50C. Se debe obtener un polvo blanco y evitar por un lado cualquier obscurecimiento debido a la oxidacin y el empleo de temperaturas anormales, adems evitar toda infeccin microbiolgica (Escherichia co/i, Salmonella, . . .). El ltex fresco contiene alrededor de 12% en peso de papana.
Son numerosas las aplicaciones de la papana industrial (alrededor de 300 ton.), de las cuales se usa 75% en la industria cervecera para la estabilizacin coloidal de la cerveza; 10% en la industria de la carne (ablandamiento), 5% en la fabricacin de hidrolizados de pescado destinados a la alimentacin animal, 2% en la industria farmacutica,
entre otros. La tasa de utilizacin puede variar seriamente en funcin de la legislacin alimentara de cada pas. El desarrollo de la papana industrial es ciertamente interesante de seguir, pues puede sufrir fluctuaciones por razones diversas (produccin, acontecimientos polticos, cambios de tecnologas). En los ltimos aos se han introducido exigencias muy estrictas sobre la calidad del producto. Enzimas de origen animal Un ejemplo importante de este tipo de enzimas en la pepsina, esta enzima es producida industrialmente a partir de la mucosa gstrica del cerdo donde se encuentra en forma de un precursor, el pepsingeno, de una masa molecular de 42,000. La preparacin industrial de la pepsina se puede hacer de acuerdo a varios mtodos: en general se practica la auto digestin de mucosas gstricas de cerdo, raspadas y trituradas, en medio acuoso. acidificado con cido clorhdrico, en presencia de cloroformo. Despus de flltracin se efecta una concentracin por liofilizacin. La pepsina purificada es blanquecina y soluble en agua. Su actividad enzimtica es ms elevada entre pH 1 Y 4 con un mximo a valores de 1.8 y vara segn la naturaleza del substrato; es termosensible en solucin arriba de los 55C, lo que limita su utilizacin en tecnologa. Sin embargo, puede ser utilizada en bebidas refrescantes, en cervecera en el transcurso de la estabilizacin coloidal durante la pasteurizacin en botellas (Trolle, 1949) en razn de su actividad en medio cido (pH de la cerveza = 4 a 4.5). Tiene, como la papana, la propiedad de precipitar las protenas o los polipptidos en medio lquido (leche, cerveza.) (efecto "coagulante "). Finalmente es necesario advertir que la pepsina puede provocar la hidrlisis de enzimas como las amilasas, la tripsina, la papana industrial, lo que debe tenerse en cuenta para su uso tecnolgico ocasional. Enzimas de Origen Microbiano Desde que el desarrollo de la microbiologa ha permitido comprender mejor los sistemas que condicionan la sntesis de enzima s en los microorganismos, la produccin industrial de enzimas se ha orientado hacia los procesos de fermentacin. Las principales ventajas de las enzimas en la fermentacin con relacin a las enzimas en la extraccin son las siguientes:
- Una produccin independiente de restricciones estacinales o geogrficas. - La posibilidad de utilizacin de materias primas de fcil adquisicin. - Los rendimientos en la produccin se pueden aumentar en proporcin importante al mejorar las capas microbianas y aplicar las pti mas condiciones de fermentacin. Por otro lado, las enzimas de origen microbiano presentan propiedades y especificidades diversas. Estas ventajas predominan sobre los inconvenientes propios de las industrias de fermentacin (fuertes inversiones, consumo de energa, riesgos de contaminacin...) y en el transcurso de los ltimos treinta aos se han desarrollado un nmero importante de fermentaciones productoras de enzimas. Las principales producciones se presentan en la Tabla 1.
Tabla 4: Produccin de enzimas microbianas
Enzima
Toneladas de enzima pura/ao
PROTEASA
500
GLUCOAMILASA
300
AMILASA
300
GLUCOSA ISOMERASA
50
AMILASA FNGICA
10
PECTINASA
10
PROTEASA FNGICA
10
RENINA MICROBIANA
10
Fuente: Aunstrup y col., (1979)
La fundamentacin de la produccin de enzimas microbianas exocelulares es muy simple: un microorganismo es cultivado en un medio apropiado, a partir del cual es extrada la enzima (para las enzimas endocelulares es necesario Un tratamiento previo de la biomasa). Los problemas radican en los detalles de proceso. En la Industria alimentara, existe una gran variedad de enzimas de mucha importancia. En el cuadro (2) se muestran algunos ejemplos: Produccin Industrial de enzimas En la produccin industrial de las enzimas se consideran las siguientes etapas. (Scriban, 1985) A. Definicin de la enzima que se busca La produccin de una enzima industrial que responda, en principio, a una exigencia potencial de quienes la pueden utilizar, hace necesario determinar las propiedades que esta enzima pueda tener. Prioritariamente, de acuerdo a Sicart (1980): - La especificidad: Aunque en la industria las enzimas sean utilizadas para la hidrlisis de macromolculas complejas en las cuales los sitios de acoplamiento con, frecuencia se desconocen, el efecto global que se busca involucra, generalmente, la utilizacin de un tipo preciso de enzima. En ciertos casos, como sucede con la pectinasa, una enzima asocia tres actividades diferentes, y se debe precisar estrechamente la relacin entre estas tres actividades de acuerdo al producto que se vaya a tratar.
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BSICAS TECNOLOGAE INGENIERA CONTENIDO DIDCTICO DEL CUSO: 35689 BIOTECNOLOGA Tabla 5: Enzimas utilizadas, en la industria alimenticia.
Fuente: http://www.porquebiotecnologia.com.ar/educacion/cuaderno/ec_54.asp, (2008)
- El valor ptimo de pH: Este factor tiene una influencia variable segn las enzimas; algunas de ellas, como la proteasa alcalina an son activas a pH = 10, en tanto que las enzimas fngicas funcionan an a pH = 3. - El valor ptimo de temperatura: Generalmente, quienes utilizan enzimas se interesan en poder disponer de enzimas que soporten temperaturas elevadas, ya que estas temperaturas conservan en parte la esterilidad del medio de fermentacin. Despus, es necesario definir el sistema que se adoptar para medir su actividad, pero conviene disociar la nocin de actividad que se aplica a la cantidad de enzima presente en una preparacin, la que se puede determinar mediante un mtodo de laboratorio, de la nocin de eficacia que caracteriza el comportamiento de la misma preparacin colocada en las condiciones industriales en las que vaa utilizarse. (Sicart, 1980).
B. Seleccin de una cepa microbiana
Los microorganismos que son capaces de producir enzimas de degradacin de ciertos compuestos se localizan generalmente en donde abundan esas substancias. Por ejemplo, los microorganismos que secretan celulosas son numerosos en el suelo de los bosques. Inicialmente, las cepas se han aislado del suelo o de elementos naturales.
Los mtodos de aislamiento que se utilizan son los mtodos clsicos, el ms importante es el cultivo de enriquecimiento, seguido de un sub cultivo en un medio selectivo. En el medio selectivo ideal, el substrato de la enzima es la nica fuente de uno de los elementos vitales. Por ejemplo, el almidn como nica fuente de carbono. para aislar a los microorganismo s que tienen una amilasa. Las tcnicas de difusin en agar se han desarrollado para la deteccin de la actividad enzimtica. Esta prueba, en las condiciones estndar, puede dar informacin de orden cualitativo. Para que la cepa aislada sea retenida definitivamente debe presentar algunas caractersticas, de acuerdo a Aunstrup y col. (1979) y Sicart (1980):
- Desarrollarse sobre un medio sencillo fcilmente asequible. - Producir el menor nmero posible de metabolitos secundarios, como antibiticos, por ejemplo. - Excretar la enzima en forma que se facilite su separacin y su purificacin. . - No originar contaminantes diversos - No ser patgena ni producir compuestos txicos. Con los progresos de la gentica, las posibilidades de mejoramiento de las cepas son, tericamente, ilimitadas; por una 'parte por una mutacin, por otra parte, mediante la nueva va de la ingeniera gentica. En cualquier forma, la gentica de los microorganismos que se utilizan en la produccin industrial de enzimas (Bacillus, Aspergillus) an est mal conocida para que puedan realizarse las aplicaciones de la ingeniera gentica y son las mutaciones las ms utilizadas.
Las cepas industriales deben ser protegidas contra la degeneracin, la prdida de viabilidad y las contaminaciones. Los medios ms seguros son la liofilizacin o la conservacin a temperatura del nitrgeno lquido. Estas tcnicas permiten conservar las cepas casi indefinidamente.
C. Produccin industrial de la enzima Tradicionalmente, las enzimas microbianas eran producidas por cultivo en superficie, en una delgada capa de medio lquido o de medio semislido. Esta tcnica es an utilizada para algunas producciones, en particular de enzimas de origen fngico, tales como las amilasas de Aspergillus, las proteasas de Aspergillus y de Mucor o las pectinasas de Penicillium. Pero existen varios problemas en el control de la temperatura, de la aireacin y de la humedad, por ello se prefieren los cultivos sumergidos a los cultivos en superficie. Los cultivos en medio lquido, profundos, agitados, son mejor adaptados a los diferentes controles mediante mtodos modernos y reducen los riesgos de contaminacin. Adems se prestan mejor a las operaciones de extrapolacin y de optimizacin necesarias para el paso del fermentador piloto de laboratorio al fermentador industrial. Preparacin del inculo En esta etapa de preparacin del inoculo, la capacidad de produccin de la cepa debe conservarse y eliminarse todo riesgo de contaminacin. Para ello es necesario evitar que haya un nmero excesivamente grande de cultivos sucesivos. Es preferible el sembrar directamente un matraz de medio gelosado, a partir de la cepa liofilizada, despus, a partir de este cultivo se sembrar un nico fermentador que servir el mismo de inculo para el fermentador industrial. El volumen del inoculo representa generalmente de 3 a 10% del volumen del fermentador de produccin y la composicin del medio para la preparacin del inculo se aproxima bastante a la del medio de produccin. El tiempo de permanencia en el fermentador vara de 10 a 80 horas segn el procedimiento, la cepa, las condiciones de cultivo, . . . (Aunstrup y col., 1979) D. Composicin del medio de cultivo El medio de cultivo debe contener la fuente de carbono, la fuente de nitrgeno y los principales factores de crecimiento necesarios para la cepa microbiana. Se pueden adicionar ciertos factores para abreviar la fase de latencia. De todas formas, la produccin de enzima puede no
tener lugar a pesar de que el medio sea el conveniente para un buen desarrollo. Hay que tomar en cuenta la necesidad de un inductor, de las represiones posibles debida a algn componente del medio, de la represin catablica producida por la glucosa. Esta represin puede ser evitada reemplazando la glucosa por glcidos fermentables lentamente o por almidn parcialmente hidrolizado. Para aumentar la productividad, se utilizan medios concentrados, pero esta concentracin puede igualmente -ser causa de aumento en la presin osmtica y dificultar la aireacin. A menudo se adicionan sales para complementar la cantidad de nitrgeno en el medio E. Fermentacin y equipo necesario Vincent y Priestley (1975) han detallado las condiciones de fermentacin que deben mantenerse para producir una enzima. Los fermentadores utilizados habitualmente contienen volmenes de 100 a 200 m3. Deben estar equipados de un sistema de agitacin de gran potencia, capaz de agitar medios relativamente viscosos, ya que pueden contener hasta 350 g/lt. de materia seca (Sicart, 1980). Los fermentadores estn equipados de una corona clsica de aereacin, ya que la mayor parte de las fermentaciones productoras de enzimas tienen una fuerte demanda de oxgeno. Generalmente, estas fermentaciones son conducidas en condiciones limitadas de oxigenacin. Para la glucoamilasa, la productividad est limitada a la transferencia de oxgeno (Aunstrup y col., 1979). Los equipos de medicin y de control del fermentador permiten seguir y regular los parmetros del cultivo. Los controles se ejercen generalmente sobre el pR, la temperatura, el oxgeno disuelto, la espuma y la evolucin de la concentracin de ciertos nutrientes. Adems la medicin de la aparicin de la actividad enzimtica se efecta a intervalos regulares por el laboratorio de control. An no existen reguladores que permitan hacer esas mediciones en forma continua. (Sicart, 1980). Esta medicin es importante porque de ella depende la decisin de detener la fermentacin. Para la produccin de enzimas, son necesarias condiciones rigurosas de asepsia, por una parte para obtener un buen rendimiento, por otra parte para no tener el riesgo de secrecin de substancias txicas como contaminantes. Esta asepsia es difcil de mantener, siendo el medio muy rico y el pH cercano a la neutralidad.
Se necesita tomar precauciones a nivel de la construccin del fermentador y para la eleccin de las instalaciones y los equipos colaterales. Durante toda la fermentacin, una ligera supresin de aire en el fermentador impide la penetracin de contaminantes, esta precaucin la refuerzan las protecciones de vapor en todos los puntos de comunicacin con el exterior (fig. 20). An no se ha establecido el modelo cintico general para la sntesis de enzimas, pero, ya se ha estudiado la regulacin de la formacin de algunas enzimas. Algunas enzimas se forman durante la fase exponencial de crecimiento, pero la mayor parte aparecen en la fase postexponencial. Segn sean las enzimas y los procedimientos, la fermentacin dura de 30 a 150 horas. La cantidad de protena -enzima en el medio, al final de la fermentacin, representa de 1 a 5% de la materia seca inicial, en tanto que la biomasa celular puede alcanzar de 2 a 10%. La calidad de las enzimas producidas est en estrecha relacin a la forma en que se condujo la fermentacin. La seleccin de las materias primas, el mtodo de esterilizacin, el procedimiento para regular la formacin de espuma, la aireacin y la agitacin, as como la duracin de la fermentacin afectan, no solamente al rendimiento y al costo de produccin, sino tambin al color, olor y a la estabilidad de la enzimas
Fig. 20: Esquema para una produccin de fermentacin para la produccin de enzimas
Fuente: Aunstrup, 1979
Utilizado este biocatalizador. En la prctica, la mayor parte de las operaciones industriales se realizan de forma discontinua, en lotes, con la renovacin de la enzima al principio de cada ciclo. Para los enzimlogos, la fijacin sobre un soporte realiza un modelo cercano a las condiciones de la clula viviente, en donde las enzimas se encuentran con frecuencia asociadas a la membrana a organelos intracelulares. Desde 1916, Nelson y Griffin haban demostrado que la invertasa adsorbida sobre carbn activo, conservaba su actividad. Pero de cualquier modo hubo que esperar hasta la dcada de los 50's para que aparecieran las primeras aplicaciones de esta tcnica, en particular con los trabajos de Grubhofer y Schleith. Despus de 1960, las investigaciones se han intensificado y bajo el impulso de los equipos de Katchalski en Israel y de Manecke en Alemania, se han multiplicado las utilizaciones potenciales de las enzimas inmovilizadas. En1969 Chibata y sus colaboradores desarrollaron en Japn el primer reactor industrial con enzima fijada, una L-aminocidos a partir de la correspondiente mezcla racmica. Esta tcnica permitira, segn los autores, disminuir el precio de costo a menos del 40% con relacin al procedimiento convencional. En la actualidad, se han desarrollado numerosos mtodos de fijacin de inters para ms de 100 enzimas, tanto en la etapa de laboratorio como en escala piloto y se ha abierto un campo de experimentacin, despus de algunos aos, para la inmovilizacin de clulas intactas, vivas o muertas. Esta multiplicacin de trabajos ha dado lugar a una abundante literatura cientfica. Inmovilizacin de enzimas La actividad de las enzimas est ligada al mantenimiento de la integridad de su conformacin temaria, en particular al nivel de su sitio activo. Los procedimientos de inmovilizacin deben, por consiguiente, ser mtodos suaves, bien regulados, que respeten la estructura nativa de la protena, que los enlaces que se crean entre el soporte y la enzima, excluyan los cidos aminados involucrados directamente en la reaccin cataltica.. Se han propuesto diversos tipos de mtodos y en 1971, en la primera conferencia de Ingeniera Enzimtica de Henniker (E.U.A.) se defini una clasificacin de enzimas inmovilizadas, segn el mtodo de fijacin utilizado.
Figura 21: Clasificacin de formas de obtencin de enzimas
En esta clasificacin, las enzimas inmovilizadas se consideran como un caso particular de las enzimas modificadas. Despus apareci la tcnica de reticulacin (enlazamiento cruzado) en el cual las molculas enzimticas son polimerizadas por intermedio de un ligando polifuncional. - Propiedades de las enzimas inmovillzadas Los efectos de la inmovilizacin sobre la actividad de las enzimas resultan de la interaccin de diferentes factores: a) Modificaciones de la estructura tridimensional de la enzima, a causa de tensiones durante la fijacin. b) Modificaciones electrostticas. del microambiente: pH local, interacciones
c) Fenmenos disfusionales en el interior del complejo. d) Impedimentos estricos. Este conjunto de factores juega un papel determinante en la actividad y la estabilidad de la enzima. - Medicin de la actividad
Las condiciones ptimas de accin de las enzimas inmovilizadas difieren a menudo de las de las enzimas en solucin y deben ser perfectamente conocidas para evitar todo riesgo de error de interpretacin. As para la ureasa, fijada sobre bentonita, la actividad de pH 7.7 no alcanza sino a 75% de la actividad de la enzima libre mientras que es de 100% a pH 7.1.17 La Comisin Internacional de Hennicker en 1971,ha propuesto caracterizar la actividad de los complejos por la velocidad inicial de reaccin expresada en microkatales (JIkat): cantidad de producto formado en micromoles por segundo y por mg (materia seca) o por unidad de superficie del soporte; precisando las condiciones de determinacin de la materia seca, el tenor en protenas fijadas y la actividad especfica de la enzima antes de la inmovilizacin. Con las reservas antes dichas, parece que la inmovilizacin entraa con frecuencia una prdida de actividad, muy variable segn sea la naturaleza de la enzima y el modo de fijacin; pero tambin se han sealado algunos casos en los que hay aumento de actividad. Estas variaciones en un sentido o en otro podran explicarse por una modificacin estrica del sitio activo de la enzima bajo el efecto de un cambio de conformacin de la cadena polipeptdica. Gracias a la gran especificidad en su accin, las enzimas constituyen una herramienta de fabricacin y de anlisis indispensable en numerosos sectores de la investigacin, del control y de la produccin industrial. La introduccin de las tcnicas de insolubilizacin de los biocatalizadores suscita un inters considerable en razn de las ventajas que presenta: tratamientos en continu, control automatizado, mejoramiento de los rendimientos por unidad de enzima, obtencin de derivados ms puros, disminucin de requerimientos energticos. . . y los recientes desarrollos de los mtodos de inmovilizacin de clulas enteras han abierto nuevas perspectivas. A pesar de los numerosos trabajos de investigacin, las instalaciones de produccin industrial son an muy limitadas. Es necesario buscar la causa en la complejidad del funcionamiento de los reactores, en donde la matriz es a menudo muy delicada y en la gran inestabilidad de los catalizadores biolgicos; sin olvidar las limitaciones debidas a regulaciones legales. La obtencin de nuevas fuentes de enzimas ms estables, el desarrollo de sistemas multienzimticos, la recuperacin y la re utilizacin de
cofactores de. Las enzimas son las vas de investigacin susceptibles de ampliar el campo de las aplicaciones actuales: AUTOEVALUACIN 1. Realice un Glosario, del captulo estudiado: 2. Realice una investigacin bibliogrfica sobre las enzimas ms importantes en la industria alimenticia, escoja una de ellas y realice un diagrama de flujo para la produccin de la misma. 3. Para mayor comprensin lea el articulo de Miguel Arroyo en el siguiente link: Inmovilizacin de enzimas: Fundamentos, mtodos y aplicaciones. Y realice una comparacin de los diferentes mtodos teniendo en cuenta sus ventajas y desventajas.
CIBERGRAFIA: http://www.arrakis.es/~lluengo/enzimas.html. Sitio que informacin acerca de las enzimas, su funcin y caractersticas. incluye
http://minnie.uab.es/~veteri/21264/t4_els_enzims.pdf. Las enzimas en los alimentos Biotecnologa de los alimentos. Introduccin. ILSI International Life Sciences Institute. Serie de monografas concisas de ILSI Europa. http://www.ilsi.org/ y en Argentina http://argentina.ilsi.org/ Alimentos y tecnologa de modificacin gentica. Salud y seguridad en el consumidor. ILSI International Life Sciences Institute. Serie de monografas concisas de ILSI Europa. http://www.ilsi.org/ y en Argentina http://argentina.ilsi.org/
CAPTULO 11: PRINCIPIO DE INGENIERIA GENETICA APLICADO A LA BIOTECNOLOGA
El principal objetivo de la ingeniera gentica en el campo de la Biotecnologa es alterar la composicin gentica de los seres vivos de importancia industrial, con el fin de incrementar la eficiencia global del proceso para el que se emplea dicho ser vivo. Aunque el objetivo principal es incrementar el rendimiento de un producto especfico, es interesante tener en cuenta otros parmetros, particularmente los que se refieren a las mejoras en las caractersticas de crecimiento y la eliminacin de subproductos perjudiciales. (Wiseman, A,1986)
El desarrollo de organismo sper productores, se considera el principal objetivo de este campo de la biotecnologa, aunque se podran aadir otros dos: en primer lugar, la obtencin de nuevas especies que produzcan productos nuevos o modificados y en segundo lugar, el conocimiento de las rutas biosintticas que conducen a la produccin de metabolitos de inters comercial, as como mecanismos de control que regulan estas rutas. (Wiseman, A. 1986) La estructura y funcin bsica de los genes se conoca desde finales de los aos sesenta. Ms an, la labor de los bioqumicos haba producido un gran cmulo de conocimientos respecto de los conjuntos de reacciones qumicas que ocurren dentro de los seres vivos. Las vas metablicas fundamentales para la generacin de energa y la biosntesis de la mayora de los compuestos esenciales para la vida ya estaban establecidas. (Saberon, 1997) Este conocimiento se basaba en la aplicacin inteligente de mtodos de ensayo y purificacin de enzimas clave, y de la identificacin y anlisis de sus sustratos y productos. Al mismo tiempo, otras disciplinas como la inmunologa y la gentica, realizaban avances y eran actividades de gran complejidad y finura. La biologa molecular, sin embargo, se encontraba en un punto en el que su desarrollo se haba hecho muy lento. Una vez sentadas las bases fundamentales de la replicacin y expresin de la informacin gentica, el siguiente paso era desentraar; en forma detallada, los mecanismos de regulacin de la expresin gentica.
Todas las vas metablicas, la expresin de anticuerpos, la actividad de los virus, en fin, todas las manifestaciones del fenmeno viviente, estn, en ltima instancia, orquestados por la expresin ordenada y regulada de los genes, por medio de la produccin de protenas especficas. El extraordinario proceso por el cual una sola clula, el huevo fecundado, da origen a un organismo complejo, es decir; las etapas de diferenciacin celular; constitua un reto extremadamente atractivo, pero a la vez formidable. Un descubrimiento clave inici el cambio dramtico que conocemos hoy como ingeniera gentica o ADN recombinante: en 1970 Hamilton Smith y Daniel Nathans descubren una enzima capaz de reconocer y cortar el ADN en secuencias especficas, que les vali el Premio Nobel de fisiologa o medicina, compartido con Werner Arber, en 1978. Este descubrimiento (consecuencia de un hallazgo accidental, en el que los investigadores profundizaron con gran sentido) dio origen a una sucesin de nuevos descubrimientos y potenci el desarrollo de toda una serie de otras disciplinas y metodologas. En este captulo revisaremos los fundamentos de algunas de las ms importantes.
Leccin 21: TCNICAS UTILIZADAS EN LA MANIPULACIN GENTICA IN VITRO.
Muchos microorganismos producen enzimas que modifican y digieren o rompen el ADN. Estos sistemas, llamados de modificacin-restriccin, son anlogos a un sistema inmune, los cuales probablemente evolucionaron como un mecanismo de proteccin de los microorganismos contra infecciones virales. En efecto, las bacterias, por ejemplo, son infectadas por virus, llamados bacterifagos, que inyectan su propio ADN en la clula bacteriana para despus controlar su maquinaria celular y redirigirla hacia la sntesis de sus propios componentes, dando como resultado final la ruptura de la clula y la liberacin de cientos o miles de nuevos virus. En algunas bacterias el ADN propio est modificado en ciertas secuencias. Una enzima de modificacin se desliza sobre la hebra de ADN, y cada vez que se topa con su secuencia blanco, por ejemplo GAATTC, introduce un pequeo grupo qumico en la adenina (A) central. Otra enzima, la enzima de restriccin, tambin se desliza en la hebra de ADN, y si encuentra la secuencia GAATTC, corta el ADN en esa posicin. La enzima, sin embargo, no corta el ADN modificado, por lo que efectivamente es
capaz de degradar el ADN extrao que puede entrar a la clula, sin alterar el ADN propio.
Hoy en da se conoce miles de diferentes enzimas de restriccin, provenientes de otros tantos distintos microorganismos. Ms de cien distintas secuencias pequeas de ADN pueden ser rotas, especficamente, por medio del uso de la adecuada enzima de restriccin. Otra interesante propiedad de las enzimas de restriccin es que, en general, reconocen secuencias palindrmicas, es decir; secuencias que son iguales si se leen en una direccin, o en la direccin contraria. Por ejemplo: 5GAATTC3 3CTTAAG5
Es una secuencia palindrmica. Cuando acta la enzima que reconoce y corta esta secuencia, llamada EcoRI, genera segmentos de ADN con extremos que se proyectan fuera de la doble cadena: 5G AATTC3 3CTTAA G5 Estos extremos se denominan cohesivos o pegajosos, porque tienden a aparearse o hibridarse nuevamente. En realidad, cualquier extremo de ADN generado por un corte con EcoRI puede hibridarse o aparearse con otro extremo generado por la misma enzima. Los descubridores de las primeras enzimas de restriccin pronto se dieron cuenta de que su accin sobre el ADN (comnmente llamada "digestin") produca un conjunto definido de diferentes segmentos. Sbitamente, el ADN dej de ser una sustancia montona y frgil, donde purificar un segmento especfico resultaba una tarea ardua o imposible. Al poder generar segmentos especficos, con las enzimas de restriccin, la molcula de la vida qued a merced del bilogo molecular y por lo tanto nos facilit el camino para manipular la secuencia del ADN, de cualquier especie. Este, entonces se convirti en la nueva herramienta de la Biologa moderna y por lo tanto de la BIOTECNOLOGA.
Figura 22. La separacin de los cidos nucleicos Cuando se utiliza la electroforesis, es posible visualizar la accin de las enzimas de restriccin. Si se colocan muestras que contienen ADN de diversos tamaos en los pozos de un gel en forma de placa, y se aplica corriente elctrica, la diferencia de velocidad de migracin de estas molculas las distribuir, por separado, al cabo de un tiempo, dentro del gel. Si despus se agrega una sustancia que se hace luminosa al interaccionar con el ADN y baarse con luz ultravioleta, directamente se puede observar el patrn de distribucin de las bandas constituidas por las molculas de diversos tamaos, por medio del cual es factible deducir sus respectivas dimensiones Al usar diferentes enzimas de restriccin, se generan diferentes segmentos. Por ejemplo, si la secuencia reconocida por la enzima Sall aparece en la molcula del ejemplo una vez, cortara el segmento en dos partes. Si la secuencia reconocida por EcoRI, aparece dos veces, generara tres pedazos. Al usar las dos enzimas simultneamente, se produciran cuatro segmentos.
Fuente: Saberon Maneiro, 1997
Leccin 22: Tecnologa del ADN recombinante. Como se menciono anteriormente, los fragmentos generados por las enzimas de restriccin tienen adems la propiedad de reasociarse unos con otros, por medio de sus extremos cohesivos. La importancia de manipular este procedimiento(tambin conocido como tecnologa del ADN recombinante) es la que nos permite en primer lugar evitar los mltiples mecanismo que restringen la transferencia de genes entre organismos no relacionado y, en segundo lugar, que se lleven a cabo manipulaciones precisas y sutiles aprovechando estas caractersticas del proceso de recombinacin Este procedimiento consite, entonces, en cortar el ADN en fragmentos especficos utilizando enzimas llamadas endonucleasas de restriccin y ligar los fragmentos a un vector, es decir, una molcula de ADN que es capa de ser incorporada y replicada por la clula hospedadora.. En resumen, los elementos esenciales de la recombinante (vase la figura 2): son los siguientes tcnica de ADN
1. Obtencin de restriccin).
fragmentos
especficos
de
ADN
(enzimas
de
2. Ligacin (o reasociacin covalente) de las molculas para obtener hebras continas de ADN (enzima ligasa). 3. Mecanismo para introducir al interior de clulas vivas el ADN recombinante (transformacin). 4. Mecanismo para asegurar la replicacin e identificacin de la molcula recombinante dentro de la clula (vehculo molecular). El primer experimento en el que se puso en prctica este concepto, realmente simple, que se conoce como clonacin molecular se logr al utilizar plsmidos bacterianos como vehculos y ADN, tambin bacteriano, como pasajero. (Fig.23) El producto de la digestin del ADN con endonucleasas de restriccin est constituido por muchos fragmentos especficos, cuyos extremos son compatibles o cohesivos unos con otros. Estos fragmentos se ligan despus a un segmento especial de ADN, el vehculo de donacin (usualmente un plsmido), que fue cortado con la misma enzima. Las molculas recombinantes resultantes contienen un ADN vehculo o vector y un ADN pasajero, constituyendo una nueva molcula circular continua. Estas molculas se introducen a clulas bacterianas y se seleccionan por medio de "genes marcadores" presentes en el vehculo de donacin. Dentro de su secuencia de ADN los vehculos de donacin contienen seales que inducen la replicacin del ADN, y otras que producen, tpicamente, resistencia a algn antibitico. As, las clulas que reciben una molcula recombinante la perpetan en su interior, y se pueden detectar porque sta confiere a la clula la capacidad de sobrevivir en presencia del antibitico
Fig. 23. Los procedimientos bsicos del ADN recombinante
Fuente: Raven, J. 2002
A. Corte y ligadura del ADN Hasta el momento hemos mencionado a la ADN ligasa, una importante enzima que permite ligar o unir molculas de ADN. La investigacin sobre la fisiologa de los cidos nucleicos ha proporcionado, adems, una serie de enzimas que se utilizan ampliamente para manipular los cidos nucleicos en el tubo de ensayo, y que forman parte importante de las herramientas del ADN recombinante. Cada una de estas enzimas, al igual que las endonucleasas de restriccin, cumple un papel dentro de la clula viva, para alterar el material gentico (por ejemplo, para
repararlo, replicarlo, degradarlo, recombinarlo, etc.). en el laboratorio se pueden usar estas enzimas, despus de purificarlas de sus fuentes naturales, para efectuar transformaciones tiles a los propsitos del experimentador. Por ejemplo, la enzima transcriptasa reversa, que naturalmente producen ciertos virus para invadir el genoma de sus clulas blanco, se utiliza ampliamente para clonar genes a partir de sus ARN mensajeros Dado que el propio desarrollo del ADN recombinante , ha potenciado, a su vez el desarrollo de herramientas moleculares, hoy en da contamos con un enorme nmero de enzimas y reactivos que permiten gran versatilidad en la manipulacion del ADN.
B- SECUENCIACIN DEL ADN Una consecuencia inmediata de la clonacin molecular es que permite disponer de cantidades ilimitadas de cantidades especficos de ADN pasajero se encuentra formando parte de un plsmido, es factible separarlo fcilmente del resto del ADN celular, que se encuentra en el cromosoma bacteriano, una molcula mucho ms grande. A partir de un cultivo de E. coli, se puede separar suficiente ADN plasmdico para caracterizarlo. Una vez que se dispuso de genes individuales purificados, el escenario estaba listo para la siguiente etapa. Walter Gilbert, en la Universidad de Harvard, y Frederic Sanger, en Cambridge, Inglaterra, se dieron a la tarea de desarrollar tcnicas para determinar la ms importante caracterstica del ADN, su secuencia de bases. Pocos aos despus lograron su objetivo, y compartieron el Premio Nobel de qumica en 1980. Las tcnicas de secuenciacin actuales (vase el recuadro II.5) son usadas abundantemente e, inclusive, han sido automatizadas. A la fecha, genes de las ms diversas fuentes han sido secuenciados, acumulando una base de datos que representa cientos de millones de nucletidos: Esta cantidad crece a paso inexorable y se espera que lo haga cada vez ms aceleradamente .
C. Vectores para el clonaje Adems de las enzimas que hacen posible la transformacin y manipulacin del DNA, hay otro elemento indispensable para el trabajo del ingeniero gentico: los vectores. Los vectores no son ms que los portadores del fragmento de DNA que se quiere aislar o clonar.
Se usan tres tipos de vectores diferentes: Plsmidos Fagos Csmidos Plsmidos: Son molculas de DNA circular de doble cadena extracromosomales presentes en bacterias que son capaces de autoreplicarse. Fueron descubiertos en bacterias, quienes adems de sus cromosomas principales de 4x 106 bp, poseen estos elementos de pequeo tamao (~103 bp). Ellos fueron descubiertos como elementos portadores de la resistencia a antibiticos. El hecho de que estos genes de resistencia a antibiticos fueran hallados en plsmidos no fue una casualidad ya que la resistencia a antibiticos requiere de grandes cantidades de enzima que neutralice quimicamente los antibiticos. Al estar presentes en un No. De copias mayor que lo que estuvieran representados en el cromosoma principal. En la naturaleza existen una amplia diversidad de estas molculas. Ellos especifican: Resistencia a antibiticos Resistencia a metales pesados Sensibilidad a mutgenos Sensibilidad o resistencia a fagos Produccin de enzimas de restriccin Produccin de aminocidos raros Catabolismo de sustancias complejas La replicacin de los plsmidos puede o no requerir de protenas codificadas por ellos y puede o no estar sincronizada con la del cromosoma bacteriano. Ya en la dcada de los 70, en los primeros trabajos de Biologa Molecular y de I.G. se construyeron muchos plsmidos naturales para ser usados como vectores
Todos los plsmidos que se usan como vectores poseen tres caractersticas comunes: 1. Un sitio replicador 2. Un marcador de seleccin 3. Un sitio de clonaje (Polylinker o Multiple cloning site)
Sitio replicador: El replicador es el segmento de DNA que contiene el sitio a partir del cual se comienza a replicar el DNA usualmente llamado origen de replicacin: ORI. Este sitio incluye los genes que codifican para las protenas y RNAs que se requieren para la replicacin. El nmero de copias de un plsmido puede ser alto o bajo en dependencia del control al que estn sometido los replicadores. Este control puede ser de dos tipos: relajado o restringido Control relajado: La replicacin del plsmido no depende de las protenas sintetizados al comienzo del ciclo celular bacteriano: protenas de la iniciacin de la replicacin. Por tanto estos plsmidos se pueden amplificar aun cuando se trate la cepa bacteriana con inhibidores de la sntesis de protenas (cloranfenicol). Produce un nmero de copias alto del plsmido (>20 copias por clula en condiciones determinadas) Control restringido: La replicacin precisa de la sntesis de protenas inestables que participan en la iniciacin de la replicacin y por tanto est sincronizada con el ciclo celular o sea con la replicacin del cromosoma bacteriano. Produce un bajo nmero de copias (<20 copias por clula)
Marcadores de Seleccin: Los marcadores de seleccin ms usados sobre todo en bacteria son genes que codifican para la resistencia a determinados antibiticos. Los antibiticos son sustancias qumicas que producen la muerte de los microorganismos pero son relativamente poco txicos a las clulas eucariticas. Los vectores plasmdicos o de fagos portan genes para la resistencia a estos antibiticos. Estos genes son normalmente dominantes y por lo tanto las clulas que los contengan pueden ser identificadas por su capacidad de crecer y formar colonias en
presencia del antibitico. Los plsmidos que contienen tales genes le confieren a las clulas donde son isertados la capacidad de vivir en presencia de tales sustancias. Los antibiticos se aaden usualmente a medio slido recin autoclavado antes que la temperatura haya disminuido por debajo de 50 oC. En casos de emergencia se pueden aadir directamente a placas ya preparadas, dando tiempo para que el antibitico pueda difundir (~60 min). Se deben guardar a 4 oC pues los antibiticos pierden potencia a RT. Algunos como la Tet y la Rifampicina deben guardarse en la oscuridad pues son sensibles a la luz En levaduras se emplea la auxotrofia a determinados aminocidos como marcadores de seleccin. Sitio de Clonaje: Es una regin donde un nmero diverso de enzimas de restriccin tienen sitios de reconocimiento y por tanto pueden insertarse el DNA forneo sin causar interferencias ni con la habilidad del plsmido de replicarse ni con su capacidad de conferirle a la cepa hospedera la resistencia a antibiticos. Usualmente se le conoce con el nombre de Multiple Cloning Site o Polylinker
Leccin 23: La Reaccin en cadena de Polimerasa (PCR)
Otro de los avances metodolgicos ms importantes es la reaccin en cadena de polimerasa (PCR, siglas en ingles polymerase chain reaction). Este procedimiento constituye un ejemplo sumamente interesante de la importancia de la metodologa en el desarrollo cientfico. Tambin ilustra la manera como ocurren muchos de los descubrimientos: a partir de intuiciones que integran conocimientos que han estado disponibles durante cierto tiempo. En efecto hacia 1985 con el ADN recombinante ya plenamente establecido como una tcnica aplicada rutinariamente por cientos de laboratorios en el mundo, Kary Mullis, quien a la sazn trabajaba para la compaa Cetus, en San Francisco, California, tuvo una sbita inspiracin mientras manejaba su auto y se diriga hacia una cabaa en la que se dispona descansar el fin de semana. Como muchos otros investigadores, Mullis se encontraba desarrollando aplicaciones para los oligos sintticos. Concibi entonces la idea de que combinando el uso de los oligos con varios ciclos de replicacin in vitro se poda amplificar, es
decir; obtener en gran cantidad, un segmento de ADN especfico (por ejemplo, un gene en particular). En esencia la idea consiste en que la enzima ADN polimerasa participa en la replicacin del ADN (Ver fig. 3) . Para convertir una molcula de ADN de doble cadena en dos molculas idnticas, la enzima requiere que las cadenas de la molcula inicial se separen, para as tener un molde disponible. Adems, la enzima requiere un segmento de ADN con un extremo libre, que sirve para cebar o iniciar la reaccin de replicacin y los nucletidos precursores. Si se colocan estos sustratos en un tubo de ensayo, la ADN polimerasa puede incorporar uno por uno los nucletidos correspondientes, es decir, frente a una A en el molde, adicionar T en la cadena creciente; frente a G, C, etc. En realidad, ste concepto era perfectamente conocido y aplicado desde mucho antes de que se concibiera la tcnica de la PCR. Lo original de la idea de la concepcin de Mullis fue pensar qu sucedera si se aplica este procedimiento en ciclos sucesivos, en una reaccin en cadena. Los oligos sintticos, en virtud de su propiedad de hibridacin de los cidos nucleicos, definen los puntos de partida para el copiado de las cadenas de ADN. Si se colocan dos oligos cuya secuencia define los extremos de un segmento determinado de ADN, se hacen hibridar con las hebras del molde, previamente separadas, y se someten a una reaccin con ADN polimerasa, de lo que resultarn dos molculas cuyos extremos estn definidos por los oligos y que corren en sentido opuesto. Las cadenas resultantes son complementarias entre si: existen ahora el doble de molculas con la secuencia que demarcan los oligos. , por lo tanto s el proceso se replica cclicamente entonces, la replicacin del ADN, ser exponencial. En el siguiente ciclo de separacin de cadenas, hibridacin con los oligos y reaccin con ADN polimerasa, se obtendrn cuatro molculas de la regin entre los oligos. Los ciclos subsiguientes generarn 8, 16, 32, 64 molculas, y as sucesivamente. (Fig. 24 )
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BSICAS TECNOLOGAE INGENIERA CONTENIDO DIDCTICO DEL CUSO: 35689 BIOTECNOLOGA Fig. 24: Replicacin del ADN, utilizando (PCR)
Fuente: Raven, J. 2002
As, con la tcnica de la PCR se pueden amplificar segmentos especficos de ADN para crear muchos millones de molculas a partir de unas cuantas, o incluso de una sola. Para esto se requiri adaptar el concepto bsico haciendo uso de ADN polimerasas provenientes de microorganismos termfilos (que crecen a temperaturas de ms de 70
grados en manantiales termales). De otra manera, la enzima se inactivaba cada ciclo, pues se requiere aplicar calor para separar las molculas del ADN molde. Hoy da un ciclo puede tomar cinco minutos o menos, por lo que el proceso de amplificacin se lleva a cabo en menos de dos horas (normalmente 20 o 30 ciclos son suficientes). La aplicacin de la PCR, en s misma, constituye revolucionario en la investigacin biolgica moderna. un avance
Leccin 24: Mutagnesis La tecnologa del DNA recombinante ha abierto todo un nuevo campo de mutagnesis. Mientras que los mutgenos convencionales actan al azar, mediante el uso de DNA sinttico y las tcnicas del DNA recombinante es posible introducir mutaciones en sitos determinados con toda precisin en los genes. Este proceso se denomina mutagnesis dirigida. Es de esperar que las protenas fabricadas a partir de cepas que cuyas mutaciones tengan propiedades diferentes de las protenas de las cepas silvestres, propiedades que pueden predecirse al conocerse la estructura de la protena. A continuacin se esquematiza los procedimientos bsicos utilizados en esta tcnica (Fig. 25)
Figura 25: Mutagnesis
Leccin 24: Mutaciones Dirigidas por Oligonucleotidos Consiste en sintetizar un corto oligo desoxirribonucleotido que contenga el cambio de bases deseado y dejar que se hibride con un ADN monocatenario que contenga el gen de inters.
Fig. 26 Mutagnesis dirigida, utilizando cortos fragmentos de oligo desoxirribonucetido
El procedimiento completo de mutagenesis dirigida, ha sido modificado continuamente, encaminadas a incrementar la tasa de mutantes obtenido, se debe empezar con el gen de inters clonado en un ADN monocatenario. Un vector ampliamente utilizado para la mutagnesis dirigida es el bacterifago M13que tiene propiedades tiles en la tecnologa del ADFN recombinante. El AFN diana se clona en M13. Como las clulas infectadas con este fago permanece viva, se dispone de una fuente continua de ADN
Esta tecnologa puede utilizarse para obtener un gen completo. Insertado en la localizacin deseada. Aunque es difcil sintetizar el gen de una sola pieza, se lo puede obtener por partes y luego unirlo para producir el gen completo. Aadiendo sitios adecuados en los extremos del gen, ste puede unirse luego a un vector y ser clonado. Las posibilidades de este mtodo son prcticamente ilimitadas.
Fuente: Brock, Biologa de los microorganismos, 1998
Leccin 25: Mutagnesis en Casette o interrupcin gnica

Fig. 27 Interrupcin de un gen utilizando la mutacin por casette: (a) Un plasmado que contiene una copia clonada del gen X del tipo silvestre se corta con la enzima de restriccin EcoRi u se mezcla con un fragmento de ADN (la casette dela kanamicina y que se ha obtenido utilizando la misma enzima de restriccin. Se ligan el plsmido cortado y la casete. (b) El producto dela unin es un plsmido que ahora contiene la casette de la kanamicina como una mutacin por insercin dentro del gen X. (c) La clula transformada contiene el plsmido linealizado con un gen X interrumpido y su propio cromosoma con una copia del gen del tipo silvestre.
Fuente: Brock, Biologa de los microorganismos, 1998
CAPITULO 6: APLICACIONES DEL ADN RECOMBINANTE:
Sin lugar a dudas, estas tcnicas han revolucionado la forma obtener productos y su comercializacin, sin embargo existen todava muchos inconvenientes de costos y ticos que aun no se han resuelto. Una de las mayores controversias se ha suscitado ha raz de la obtencin de animales y vegetales transgnicos con fines teraputicos y /o alimenticios.
Leccin 26: Animales Transgnicos Las investigaciones con sistemas de microinyeccin y cultivo de embriones, en la actualidad, permiten introducir genes a varias especies en forma estable, entre las que se encuentran entre otros animales como las ovejas.. A partir de las ovejas se obtienen grandes cantidades de leche, rica en protenas. En efecto, en la medida que sabemos acerca de la expresin de los genes de la glndula mamaria, podemos pensar en manipular este sistema para que se elaboren en ella productos diferentes. Utilizando estos conceptos, ya existen los primeros animales transgnicos que producen protenas de inters mdico. La posibilidad de utilizar "granjas moleculares" en las que los animales producen leche protenas de altsimo valor y utilidad es realmente un triunfo maysculo de la biotecnologa moderna.( Fig7). Con gran seguridad, en pocos aos los enfermos con deficiencias de alguna de estas protenas, por ejemplo los hemoflicos, dispondrn de una fuente relativamente barata para conseguirlas. Recientemente se anunci ya la obtencin de vacas transgnicas. Los animales transgnicos tambin pueden usarse para muchos otros propsitos.
Fig.28. Mejoramiento gentico de bovinos
Fuente: Raven, J. Biology, 2002
Leccin 27: Plantas transgnicas Las posibilidades de beneficiarnos a travs del mejoramiento gentico de las plantas ya existentes por medio del trasplante de genes es enorme, puesto que uno de los problemas que se han generado a partir del cultivo intensivo es el uso exagerado de fertilizantes y pesticidas. Debido a esto, el desarrollo de bioinsecticidas ha recibido importante atencin en los ltimos tiempos. En particular, el microorganismo, Bacillus thuringiensis, que naturalmente produce una protena txica (toxina BT) para diversas especies de artrpodos (insectos y arcnidos, por ejemplo). Estas bacterias pueden ser cultivadas y administradas a los cultivos, y constituyen un insecticida biodegradable y seguro. El paso siguiente consisti en introducir el gene que codifica para esta toxina a una planta de tabaco (por supuesto fusionado a una regin regulatoria que permitiera su expresin en la planta, particularmente en las hojas). Las plantas transgnicas resultantes son inmunes a las larvas de palomillas que normalmente merman este cultivo. Al cabo de consumir un poco de la hoja, la larva se vuelve inactiva y muere, envenenada por la toxina BT. Es importante resaltar que esta toxina es completamente inocua para otros animales, incluido, desde luego, el ser humano. Una caracterstica muy interesante del reino de las plantas es que para vivir se han adaptado a ambientes extremos, ya que no pueden huir de ellos. As, encontrarnos plantas capaces de vivir en condiciones de sequa, salinidad, etc. Tambin los vegetales han desarrollado funciones para defenderse de ser ingeridas indiscriminadamente. Cada especie animal gusta slo de ciertas plantas y las puede comer sin enfermarse.( Por encima de todo esto, los seres humanos tendemos a ser muy selectivos en nuestra alimentacin. Algunos de nosotros slo compramos frijol "flor de mayo", sin importarnos si nos resulta un poco ms caro, o si sus propiedades alimenticias no son tan buenas como las de alguna otra variedad. As que no todas las caractersticas apreciadas se encuentran juntas en la misma planta. Tpicamente encontraremos que unas variedades son sabrosas, otras son nutritivas, otras ms, resistentes a las inclemencias del clima, etctera.) La nueva biotecnologa de plantas permitir ir introduciendo, al principio uno por uno, los genes que se vayan identificando como responsables de conferir ciertas caractersticas atractivas a las variedades de plantas que son ms tiles. (Fig. 29)
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BSICAS TECNOLOGAE INGENIERA CONTENIDO DIDCTICO DEL CUSO: 35689 BIOTECNOLOGA Fig. 29 .Ejemplo de plantas genticamente modificas
Fuente: Wisseman A, Principios de Biotecnologa .1886
Leccin 28: Alimentos genticamente modificados La demanda de alimento global ha aumentado la necesidad de cultivos mejorados. la biotecnologa ofrece la tecnologa necesaria para producir alimentos ms nutritivos y de mejor sabor, rendimientos ms altos de cosecha y plantas que se protegen naturalmente contra enfermedades, insectos y condiciones adversas. esto permite efectuar la seleccin de un rasgo gentico especfico de un organismo e introducir ese rasgo en el cdigo gentico del organismo fuente del alimento, por medio de tcnicas de ingeniera gentica. esto ha hecho posible que se desarrollen cultivos para alimentacin con rasgos ventajosos especficos u otros sin rasgos indeseables. Resumiendo, se puede decir que la biotecnologa tiene un amplsimo rango de aplicacin en la industria alimenticia, ofreciendo los medios para producir alimentos de mejor calidad en forma ms eficiente y segura para la salud y el medio ambiente. una de las promesas de la biotecnologa es generar innovaciones y mejoras en los alimentos conduciendo a prcticas agrcolas ms ecolgicas, contribuyendo a una
agricultura sustentable que utiliza con respecto los recursos del medioambiente. El rea de mayor aplicacin de la biotecnologa en alimentos y la ms antigua, corresponde a las fermentaciones, de gran importancia dentro de la tecnologa de alimentos y que abarca varios campos, como fermentaciones alcohlicas, fermentaciones crnicas y fermentaciones lcticas. El rea ms reciente y de mayor proyeccin dentro de la biotecnologa de alimentos est en el desarrollo de alimentos genticamente modificados o transgnicos, cuyas principales ventajas se ven en mejoras nutricionales, mayor productividad de cosechas y mayor proteccin medioambiental. Adems, alimentos gm poseen hoy en da gran importancia en las soluciones de graves problemas de escasez de alimentos, desnutricin y problemas de salud pblica en general del mundo en vas de desarrollo. Leccin 29: Alimentos funcionales El concepto de alimento funcional se emplea para describir a aquellos alimentos adicionados con ingredientes de diversas clases y orgenes que pueden ejercer efectos beneficiosos sobre quien los ingiere. Este concepto surgido en Japn ha ido popularizndose y expandindose hacia otros continentes como Europa fundamentalmente debido a la preocupacin sobre la nutricin, la dieta y la salud de la sociedad actual. Los pro biticos representan una gran rea dentro de los alimentos funcionales y se ha intensificado la investigacin para desarrollar productos pro biticos y profundizar en el conocimiento de los efectos sobre la salud humana. Los pro biticos se definen como "suplementos alimentarios microbianos vivos que afectan de forma ventajosa al animal husped mejorando su equilibrio intestinal microbiano". Son microorganismos que estimulan las funciones protectoras del tracto digestivo, y tambin son conocidos como bioteraputicos, bioprotectores o bioprofilacticos, ya que se utilizan para prevenir las infecciones entricas y gastrointestinales. Un microorganismo prebitico efectivo debe poseer una serie de caractersticas: no ha de ser no patgeno ni toxico, debe ejercer efectos beneficiosos sobre la salud de quien lo ingiere, tener origen humano, ha de ser tecnolgicamente utilizable, ha de presentar un elevado porcentaje de clulas viables, debe ser capaz de sobrevivir a la flora intestinal, ha de permanecer viable durante su almacenamiento en refrigeracin, y tener capacidad de adherirse a la superficie mucosa, etc. El establecimiento de criterios de seleccin y controles de calidad para productos pro bitico se considera una prioridad debido a la rpida
incorporacin de estos productos en el mercado y su distribucin en el mbito internacional sin la existencia previa de una normativa comnmente aceptada. En los ltimos aos ha aumentado el inters por los productos elaborados con microorganismos pro bitico, perteneciente a los gneros Lactobacillus y Bifidobac.
Por otra parte, los prebiticos son ingredientes no digeribles que afectan benficamente al hospedero estimulando selectivamente a un nmero limitado de bacterias del colon promoviendo el crecimiento, la actividad o los dos aspectos en estas poblaciones microbianas. Los dos prebiticos ms estudiados son los fructo-oligosacaridos o FOS conocidos como oligofructosa e inulina. Otras de las sustancias ms comercializadas estn: Fructooligosacaridos-Suntory(Japn), Isomaltooligosacarido, Showa Sangyo(Japn) Oligomate(galactooligosacaridos) Yakult(Japn) Palatinosa-Sudzucker(Alemania) polidextrosa .Estos carbohidratos presentes en vegetales como ajo, cebolla, puerros, esparrago, alcachofas, tomates, pltanos, entre otros. Leccin 30: Probiticos: es de origen griego y significa "a favor de la vida este trmino se utiliza para bacterias benficas que viven en el cuerpo de los animales o del hombre trabajando en simbiosis con el hospedero. Entre las bacterias que presentan esta caracterstica se puede mencionar a Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis Este tipo de microorganismos se consideran como la primera lnea de defensa de nuestro cuerpo contra los microorganismos potencialmente patgenos que se inhalan o ingieren. Estas bacterias estn presentes en la piel, la boca, el sistema digestivo y la mucosa vaginal, donde realizan numerosas e indispensables funciones para proteger al cuerpo y los rganos contra las bacterias patgenas. Entre los mecanismos por los cuales actan estas bacterias se pueden mencionar: primero, la transformacin de la lactosa en acido lctico, este ultimo compuesto
funciona como un antisptico del sistema digestivo, segundo, el acido lctico facilita la absorcin del calcio y fosforo contenido en la leche, tercero, el aumento de la poblacin bacteriana benfica suministrada en alimentos, incrementa la produccin de vitamina B6 potenciando y fortaleciendo el sistema inmunolgico. Cuarto, Al mismo tiempo minimizan la proliferacin de agentes patgenos peligrosos responsables de graves enfermedades seguidas de muerte compitiendo por alojamiento o espacio fsico en las paredes intestinales. Quinto, los microorganismos prebiticos pueden sintetizar bacteriocinas, las cuales son sustancias que inhiben el crecimiento de bacterias patgenas. Un producto para que sea considerado como pro bitico debe reunir las siguientes caractersticas:
Contienen microorganismos vivos que pueden estar refrigeradas o en estado fresco o en productos fermentados, pueden estar en alimentos, capsulas o pldoras) Mejoran la salud y el bienestar de animales (Contribuyen al crecimiento de los animales) y humanos
Pueden afectar todas las superficies mucosas del hospedero incluyendo la boca y el tracto gastro intestinal, el tracto respiratorio superior o el tracto urogenital A los alimentos que contienen estos microorganismos se los denomina como alimentos funcionales. Los cuales tienen una amplia aceptacin en la poblacin de los pases desarrollados, lo que ha generado una contribucin significativa a la expansin de estos productos en el mercado. El trmino alimento funcional se origina en la dcada de los 80s en el Japn, donde los alimentos se suplementaban con otros ingredientes que beneficiaban la salud del consumidor. Las definiciones de alimento funcional varan considerablemente a lo largo de los aos debido al gran desarrollo de este sector, los ingredientes de los alimentos funcionales incluyen los pro biticos, prebiticos, vitaminas, y minerales.
AUTOEVALUACIN Realice un Glosario de la Unidad estudiada. Recuerde que para ello es necesario sacar palabras o conceptos que encuentran en el texto; organizarlos por orden alfabtico y definirlos de acuerdo a las caractersticas esenciales de cada uno.
Realice un mapa conceptual sobre las diferentes tcnicas de ingeniera gentica aplicadas a la industria alimentaria. Para ello, tenga en cuenta, las caractersticas y procedimiento de cada una. Organice un foro con sus compaeros sobre las ventajas y desventajas de los alimentos Gm en la alimentacin mundial, saque las conclusiones correspondientes y presntelas en un informe. Para ello busque informacin en pginas Web.
UNIDAD 3
CAPITULO 7: APLICACIN DE LA BIOTECNOLOGA EN LA OBTENCIN DE PRODUCTOS DERIVADOS DEL METABOLISMO ENERGTICO POR VA FERMENTATIVA.
Leccin 31: Bebidas alcohlicas
Leccin 32: Biologa de las fermentaciones con levaduras fermentacin
y condiciones de la
Leccin 33: Compuestos organolpticos
Leccin 34 : Alimentos basados en soja fermentada
Leccin 35 : Productos crnicos fermentados
CAPTULO OCHO: OTROS PRODUCTOS DE INTERS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA
Leccin 36: Produccin de Biomasa
Leccin 37 : Vinagre
leccin 38 : acido Lctico
leccin 39: acido Actico
Leccin 40 : Produccin de acido ctrico
CAPITULO NUEVE : BIOPOLIMEROS MICROBIANOS
Leccin 41 : Polisacridos microbianos y PHAs
Leccin 42: Poli hidroxibutirato
Leccin 43: Los alginatosy Gelanos
Leccin 44: Xantano
Leccin 45: Dextranos
UNIDAD 3: PRODUCTOS ALIMENTARIO
BIOTECNOLGICOS
DE
INTERES
INTRODUCCIN Los microorganismos han sido utilizados durante siglos para modificar los alimentos, y tanto stos como las bebidas fermentadas constituyen un sector primario y extremadamente importante de la industria aumentara. En esta Unidad se describirn algunos procesos para la obtencin de compuestos derivados del metabolismo energtico (fermentacin), metabolismo intermedio y biosntesis: Objetivos de la Unidad Estudiar diferentes procedimientos Biotecnolgicos obtencin de productos de inters alimentario utilizados en la
Identificar los diferentes microorganismos y condiciones de cultivo en cada unos de los bioprocesos utilizados para la obtencin de productos de inters alimentario Brindarle a los estudiantes herramientas tecnolgicas que les permita desarrollar productos Biotecnolgicos de inters alimentario
Capitulo 7: APLICACIN DE LA BIOTECNOLOGA EN LA OBTENCIN DE PRODUCTOS DERIVADOS DEL METABOLISMO ENERGTICO POR VA FERMENTATIVA. Leccin 31: Bebidas alcohlicas Las bebidas alcohlicas se producen a partir de diversas materias primas, pero especialmente a partir de cereales, frutas y productos azucarados. Entre ellas hay bebidas no destiladas, como la cerveza, el vino, la sidra y el sake, y destiladas, como el whisky y el ron, que se obtienen a partir de cereales y melazas fermentadas, respectivamente, en tanto que el brandy se obtiene por destilacin. del vino. Otras bebidas destiladas, por ejemplo el vodka y la ginebra, se elaboran a partir de bebidas alcohlicas neutras obtenidas por destilacin de melazas, cereales, patatas o lactosuero Fermentados. Adems tambin se obtienen una gran variedad de vinos de alta graduacin mediante adicin de alcohol destilado a los vinos normales con objeto de elevar su contenido alcohlico hasta el 15 o el 20 %; entre stos se incluyen productos tan notables como el jerez, el aporto y el madeira.
Un detalle comn importante en la produccin de todas estas bebidas alcohlicas es el empleo de levaduras para convenir los azcares en etanol. Por consiguiente, la primera parte de esta seccin se concentrar en la biologa de las fermentaciones de levaduras y seguidamente se discutirn los procesos concretos de obtencin de la cerveza, el whisky y el vino. Leccin 32: Biologa de las fermentaciones con levaduras Aproximadamente el 96 % de la fermentacin del etanol se lleva a cabo mediante cepas de Saccharomyces cerevisiae o especies relacionadas, particularmente S. uvarum. El etanol se produce en la ruta de EmbdenMeyerhof-Parnas (EMP), en la que el piruvato producido durante la glicosilacin se convierte en acetaldehdo y etanol. La reaccin global es la siguiente: Glucosa + 2ADP-2 Etanol + 2CO~ + 2ATP El rendimiento terico de 1 g de glucosa es de 0,51 g de etanol y 0,49 g de CO2. Sin embargo, en la prctica, aproximadamente el 10 % de la glucosa se transforma en biomasa y el rendimiento en etanol y CO2 alcanzan el 90 % del valor terico. El ATP formado se utiliza para las necesidades energticas de la clula. La envoltura de la clula de levadura incluye una membrana plasmtica, un espacio periplsmico y una pared celular constituida principalmente por polisacridos y una pequea cantidad de pptidos. La pared tiene una estructura semirrgida permeable al soluto que proporciona a las levaduras una considerable fuerza compresional y tensil. Los grupos carboxilo de los pptidos de la pared celular confieren a las levaduras utilizadas en la elaboracin de cerveza una capacidad de floculacin importante, lo que facilita la separacin slido-lquido despus de la fermentacin. Se cree que la floculacin se debe a la formacin de puentes salinos entre los iones calcio y estos grupos carboxilo de la pared celular. Condiciones de la fermentacin En la fermentacin las levaduras utilizadas para la elaboracin de cerveza (S. cerevisiae) utilizan los azcares sacarosa, fructosa, maltosa y maltotriosa en este orden. La sacarosa es hidrolizada primeramente por la invertasa localizada en el espacio periplsmico extracelular. Los azcares son transportados a travs de la membrana celular por transporte activo o pasivo mediado por permeasas producidas constitutivamente o inducibles. La maltosa y la maltotriosa son hidrolizadas intracelularmente por la -glucosidasa, Saccharomyces
uvarum (S. car/sbergensis) se distingue taxonmicamente del S. cerevisiae en que tambin Utiliza melibiosa. El Kluyveromyces fragilis y Kluyveromyces lactis, que a diferencia de S: cerevisiae pueden fermentar la lactosa, tienen un sistema lactosa-permeasa para transportar la lactosa dentro de la clula, donde se hidroliza a glucosa y galactosa, que entran en la gliclisis. Excepto los Saccharomyces diasraucus, que no son adecuadas para la elaboracin de cerveza todas las levaduras Saccharomyces son incapaces de hidrolizar el almidn y las dextrinas, y por consiguiente, el empleo de materiales basados en almidn para la fermentacin alcohlica requieren la accin de enzimas exgenos como las y -amilasas de la malta o enzimas microbianos como a-amilasa, amiloglucosidasa (glucoamilasa) y pululanasa. Los azcares mayoritarios del mosto son la glucosa y la fructosa y puesto que el S. cerevisiae metaboliza preferencialmente la glucosa; el azcar no fermentado que permanece en el vino resultante es la fructosa. Por el contrario, las levaduras del vino de Saurernes fermeman la fructosa ms rpidamente que la glucosa. El mosto de cerveza producido a partir de malta contiene 19 aminocidos adems de otros nutrientes. Estos aminocldos son asimilados a distintas velocidades durante la fermentacin. Un aminocido permeasa general (GAP puede transportar todos los aminocidos bsicos y neutros excepto la prolina. En las levaduras existen al menos otros 11 sistemas de transpone de aminocidos ms especficos. La proln permeasa es inhibida por otros aminocidos: por el amonaco. Aunque !as fermentaciones alcohlicas son en gran medida anaerbicas. las levaduras necesitan algo de oxgeno para sinterizar algunos esteroles y cidos grasas insaturados componentes de la membrana. El mosto de la cerveza contiene normalmente niveles subptimos de esteroles y cidos grasos insaturados. pero cuando el medio se suplementa con cido oleico u oleanoico, la necesidad de oxgeno desaparece. Muchas cepas de S. cerevisiae pueden producir concentraciones de etanol de hasta el 12-14 Existe un cierto inters en el empleo de levaduras tolerantes de cantidades elevadas de alcohol en los procesos de fabricacin de cerveza con gravedad elevada y la produccin de alcohol para la destilacin con vistas a incrementar la productividad de la planta y disminuir los costos de destilacin. Existen cepas seleccionadas capaces de producir hasta un 18-20 % de alcohol, aunque la velocidad de fermentacin se ve fuertemente reducida cando la concentracin de etanol aumenta. Los mostos con un contenido muy elevado de azcares fermentan nicamente con levaduras osmoflicas como Saccharomyces rouxii y S. bailli, que poseen una gran capacidad para fermentar la fructosa.
La composicin en fosfolpidos de la membrana plasmtica es importante para la tolerancia del etanol, observndose un incremento de sta cuando el contenido de cidos grasos insaturados aumenta. La tolerancia alcohlica puede elevarse suplementando el medio de crecimiento con cidos grasos insaturados, vitaminas y protenas. Los factores fisiolgicos tales como la forma de aporte del substrato, la acumulacin de etanol intracelular, la presin osmtica y la temperatura influyen en la tolerancia de las levaduras al etanol. Los enzimas glicolticos de las levaduras, hexoquinasa, gliceraldehdo-3fosfato deshidrogenasa y piruvato decarboxilasa son sensibles a la concentracin de etanol. . En las levaduras, los valores de pH comprendidos entre 3 y 6 son la mayora de las veces favorables al crecimiento y actividad fermentara; esta ltima es mayor cuanto mayor sea el pH y se produce una cada notable a valores de pH de 3-4. El pH influye en la formacin de subproductos; por ejemplo, a valores de pH elevados se incrementa la formacin de glicerol. El pH del mosto de uva est generalmente comprendido entre 3 y 3,9 debido a su elevado contenido de cidos (5-15 g/I), principalmente tartrico y mlico, de forma que, como la mayora de las bacterias, con excepcin de las bacterias del cido actico y lctico prefieren pH ms neutros, la susceptibilidad del mosto de vino a la contaminacin bacteriana es reducida. Las temperaturas ptimas de la fermentacin, la respiracin de las levaduras y el crecimiento celular son claramente diferentes. La velocidad de fermentacin aumenta. generalmente con la temperatura entre los 15 y los 35C y los niveles de glicerol, acetona, buteno-2,3diol, acetaldehdo, piruvato y 2-cetoglutarato se elevan en los caldos de fermentacin. La formacin de niveles elevados de alcohol tambin depende de la temperatura. En los vinos blancos, la menor temperatura de fermentacin da lugar a vinos ms frescos y afrutados, y el riesgo de infeccin bacteriana y de produccin de cidos voltiles como resultado es reducido. Para la produccin de vino tinto se utilizan temperaturas ms elevadas, de 22 a 30oC, y la fermentacin con los hollejos conduce a la intensificacin del color y a la produccin de un rico aroma.
Leccin 33: organolpticos:
Compuestos
En la produccin de bebidas alcohlicas deben controlarse las fermentaciones de forma que, por un lado se asimilen los carbohidratos y otros nutrientes y se conviertan en alcohol y en compuestos con
aromas caractersticos y deseables, y por otro lado, se minimice la formacin de aromas y sabores indeseables. Entre los componentes del aroma y sabor se encuentran otros alcoholes diferentes del etanol, steres, compuestos carbnicos, cidos orgnicos, compuestos azufrados, aminas y fenoles. Cuantitativamente, y en funcin de su papel en el aroma y sabor, los componentes ms importantes presentes en las bebidas alcohlicas son los alcoholes superiores, denominados tambin alcoholes de fusel o aceites de fusel, entre los cuales los ms significativos en la cerveza Y el vino son el alcohol amlilico, el isoamlico y el 2-fenoetanol. El vino tinto tiene una concentracin mayor de estos compuestos que el vino blanco. Las bebidas destiladas tienen un espectro bastante diferente de alcoholes superiores, que incluyen butanoles y pemanoles. El glicerol, alcohol polihdrico, est presente en casi todas las bebidas alcohlicas. En el vino, el glicerol se encuentra a concentraciones de hasta el 1 % (peso/volumen) y confiere cuerpo a esta bebida. En muchas bebidas y licores, los steres constituyen un grupo importante de compuestos voltiles debido a su penetrante aroma afrutado. Entre ellos, el acetato de etilo est presente en muchas bebidas a concentraciones organolpticamente importantes. Otros steres importantes incluyen el formiato de etilo y el acetato de isoamilo. El acetaldehido, con propiedades organolpticas indeseables, se produce como un compuesto intermedio durante las fermentaciones alcohlicas, obtenindose niveles altos por tasas de levaduras elevadas o excesiva aireacin. El diacetilo y la pentano-2,3-diona, formados fuera de las clulas de la levadura por decarboxilacin oxidativa del -acetolato y el -cetohidroxibmirato, tienen aromas y sabores indeseables caractersticos. Las levaduras pueden reducir el diacetilo y la pentano2,3-diona. La presencia de exceso de diacetilo en la cerveza se produce cuando el -acetolactato aparece en una etapa en la que las levaduras ya han sedimentado o han perdido su capacidad para reducir el diacetilo a acetona o el exceso de diacetilo en la cerveza tambin puede deberse a fa presencia de organismos que la deterioran, como Pediococcus y Lacrobacillus. Durante la fermentacin primaria del mosto de la cerveza se producen cantidades considerables de SH2 provenientes de la reduccin de los compuestos azufrados. Aunque en la cerveza pueden ser aceptables cantidades pequeas de compuestos azufrados, y en la cerveza normal el SO2 est usualmente presente a concentraciones por debajo de su umbral de sabor, el exceso produce aromas y sabores. desagradables. El dixido de azufre influye positivamente en la fermentacin alcohlica,
puesto que se une al acetaldehido y adems inhibe algunas de las reacciones de oxidacin indeseables. En el mosto del vino, el SO2 inhibe algunos microorganismos indeseables, entre ellos las bacterias del cido lctico y cido actico, as como algunas levaduras naturales que producen un exceso de cidos voltiles, piruvato y -cetoglutarato. Adems la produccin del desagradable sabor del cido actico tambin inhibe las fermentaciones de levaduras, particularmente combinado con el etanol, Saccharomyces cerevisiae es ms susceptible a esta inhibicin que Saccharomycoides ludwigii, Schizosaccharomyces pombe. En los mostos cuya acidez total es baja, es muy til emplear S02 para inhibir la fermentacin malo-Ictica por las bacterias del cido lctico, impidiendo la disminucin posterior del nivel de cido. Una concentracin elevada de S02 puede retrasar el comienzo de la fermentacin. El bajo pH del mosto y del vino suministran un medio selectivo para el crecimiento de las bacterias del cido actico y del cido lctico, aunque la supervivencia de !as primeras sea usualmente corta debido a las propiedades reductoras del medio. Las bacterias lcticas del vino son anaerobias facultativas u organismos microflicos que son homofermentivos (todas las Pediococcus y algunos Lactobacillus producen cido lctico a partir de glucosa) y heterofermentivos (todos los Leuconostoc y algunos Lactobacillus producen cido lctico, etanol y CO2 a partir de la glucosa). Las bacterias lcticas pueden metabolizar los cidos mlico y tartrico presentes en el vino a concentraciones elevadas, as como al cido ctrico, presente en cantidades ms bajas. Existen mtodos qumicos para reducir la acidez. La reduccin de los cidos puede impedir el deterioro de los vinos de pH elevado. A pH 3,33,4, los Leuconostocoenus fermentan el cido mlico aunque los Pediococcus no lo hacen. Los Lellconosto se adaptan bien a los pH bajos y generalmente se prefieren siempre que se desee una fermentacin malo-Ictica. Una fermentacin malo-lctica por Pediococcus va con frecuencia acompaada de la formacin de diacetilo e histamina, indeseables. Leccin 34: Alimentos basados en soja fermentada Las fermentaciones de productos a base de saja y otras materias primas relacionadas se llevan a cabo desde hace muchos siglos, especialmente en Oriente. Entre las fermentaciones ms importantes se encuentran los procesos de produccin de salsas de saja, misa y tempeh, ilustrados en la Figura 30
Fuente: Crueger, Manual de Microbiologa industrial, 1989
Aunque existen diversos tipos de salsas de soja, la producida predominantemente en Japn, denominada koikuchi, se obtiene por fermentacin de una mezcla de saja y trigo, que da lugar a una salsa con fuerte aroma y color marrn-rojizo oscuro. El proceso consiste inicialmente en una fermentacin primaria de una mezcla al 50 010 de saja cocida al vapor, empapada y trigo tostado y triturado, con un nivel de humedad del 27 al 37 %, que se extiende en bandejas y se incuba con Aspergillus oryzae, que tiene actividad amiloltica y proteoltica elevada, durante 2 3 das a 25-30 oC. Despus de adherirle agua salada, para hacer que el contenido de sodio alcance el 18 %, la masa o moromi se transfiere a tinas grandes donde se produce la fermentacin secundaria, con bacterias holoflicas y levaduras osmoflicas; el proceso tiene lugar a una temperatura de 35-40 oC, con agitacin intermitente, y el tiempo de fermentacin oscila entre 2 y 12 meses. Al finalizar esta fermentacin secundaria, se recupera la salsa lquida y se pasteriza. Los enzimas producidos en la fermentacin primaria o fermentacin koji hidrolizan las protenas a pptidos y
aminocidos libres y convierten el almidn en azcares simples. Estos productos de ruptura son a su vez metabolizados por otros microorganismos, produciendo diversos compuestos aromatizantes y saborizantes. Utilizando inculos de levaduras, bacterias y hongos puros el proceso de fermentacin se controla mejor y se obtiene un producto de calidad, aroma y sabor consistentes. En Oriente, las pastas de soja fermentada se preparaban tradicionalmente en casa para su utilizacin en sopas y salsas. En Japn, el producto, denominado misa, se elabora en la actualidad a gran escala, mediante un proceso que implica inicialmente la fermentacin koji del arroz empapado al vapor (o cebada, o soja, con menor frecuencia), que despus se extiende en bandejas, se inocula con cepas seleccionadas de A. oryzae y se incuba a 28-35 oC durante aproximadamente dos das. A continuacin el material se mezcla en recipientes con soja empapada y cocida al vapor en una relacin 1:2, y se aade cloruro de sodio para dar una concentracin del 4 al 13 %, La mezcla se inocula con bacterias y levaduras y se deja fermentar entre 1 y 52 semanas. Finalmente, el producto se amasa y se pasteriza, pudiendo obtener distintos tipos de miso con diferentes grados de dulzura, salinidad y color, variando la materia prima koji, el contenido de sal, los edulcorantes y la duracin de la fermentacin. La produccin de tempeh se basa en una fermentacin en bandejas de soja remojada cocida al vapor inoculada con Rhizopus oligosporus, e incubada a 30-38 oC durante 24 horas. El producto, que usualmente se corta en rebanadas, se sala y se consume frito, tiene una vida corta.
Leccin 35: Productos crnicos fermentados La mayora de los productos crnicos fermentados consisten en fiambres (secos o semiseco), con una relacin humedad-protena que oscila entre 1,5 y 3 a 1. En general, la etapa de fermentacin microbiana tiene lugar a una temperatura ptima, previa a la de calentamiento y/o secado. La fermentacin microbiana, que da lugar a la formacin de cido, ayuda al procesado de muy distintas formas, puesto que contribuye a la estabilidad y alarga la vida del producto, facilita la posterior eliminacin de humedad y genera aromas y sabores caractersticos. Generalmente se recomienda que el pH del producto sea inferior a 5,3, basados en la creencia de que dicho valor sirve para controlar los Staphylococcus aureus. El proceso de fermentacin para reducir el pH por debajo de 5,3 deber ajustarse a las normas de seguridad temperatura/tiempo especificadas, comprendidas entre 23,9 y 43 oC durante un perodo de
incubacin de entre 80 y 18 horas. Con frecuencia se utilizan inculos comerciales, como los Pediococcus, que tienen una buena capacidad para producir cido lctico. Los Staphylococcus carnosus, especies inocuas coagulasa negativas, se emplean de forma rutinaria en la produccin de embutidos secos. Los nitritos influyen positivamente en la conservacin de la carne, puesto que controlan el desarrollo de Clostridium botulinum. Las especies de Micrococcus capaces de reducir los nitratos a nitritos, de forma controlada, contribuyen a la curacin de la carne as corno al control de los e boculinum. Tambin pueden utilizarse cultivos startem en el procesado del bacon, con objeto de eliminar cualquier nitrito residual presente, disminuyendo o anulando la formacin de nitrosaminas, carcingenos, durante la fritura. Se puede predecir que a partir del mayor empleo de los inculos comerciales, los procesos de fermentacin de los productos crnicos se caracterizarn por su elevado nivel de control del proceso, lo que dar lugar a productos de calidad y consistencia reproducibles y manteniendo siempre las mayores condiciones de seguridad. Capitulo 8: Otros productos de inters alimentarios Leccin 37: Vinagre El vinagre es una solucin acuosa de cido actico, se obtiene mediante la fermentacin por oxidacin de una solucin diluida de etanol. El proceso metablico se basa en la conversin del etanol, bajo la accin del alcohol deshidrogenasa, en acetaldehdo y del acetaldehdo hidratado en cido actico por la accin de la acetaldehdo deshidrogenasa:
C2H5OHCH3CHO+H2OCH2CH OH2CH3COOH+H2O La materia prima de la fermentacin del vinagre de alcohol (white spirit) consiste usualmente en etanol purificado diluido. Los vinagres de vino, sidra, malta y arroz se obtienen por fermentacin alcohlica de zumos de uva, manzana, cebada malteada y arroz, respectivamente. La fermentacin del vinagre requiere tambin una fuente de nitrgeno y una combinacin apropiada de minerales y con frecuencia es necesaria la suplementacin con nutrientes. Las modernas fermentaciones de vinagre consisten en procesos sumergidos muy aireados. El acetator Frings (Fig. 7.8), muy utilizado en la produccin comercial de vinagre, es un fermentador provisto de deflectores, cuyo fondo contiene una turbina de cuerpo hueco que gira a 1.450-1.750 rpm, cuya rotacin hace
que el aire sea succionado a travs del rotar hueco y se distribuya radialmente a lo largo de toda la seccin trasversal del fermentador. Los procesos comerciales tpicos, que producen cido actico del 12 al 15 OJo, se llevan a cabo de forma semicontinua. Las concentraciones de alcohol y de cido actico al comienzo del ciclo son del 7-10 % y del 5 1110 respectivamente; la fermentacin se efecta entre 27 y 32 e hasta que la concentracin de alcohol desciende al 0,1-0,3 %, momento en el cual se descarga una parte del vinagre (aproximadamente la tercera parte) y el recipiente se vuelve a llenar con una mezcla que contiene del O al 2 % de cido actico y del 12 al 15 % de etanol y el ciclo se repite. Un alcalgrafo mide la concentracin de etanol y hace que las operaciones de descarga y llenado se puedan llevar a cabo automticameme, sin interrupcin del proceso de aireacin/mezclado de forma que impida el agotamiento total del etanol en el caldo de fermentacin. El mezclado rpido continuo es esencial para minimizar los gradientes de concentracin. Los tiempos del ciclo varan de 24 a 48 horas.
Las bacterias acidoacticas, que oxidan el etanol a cido actico y pueden existir a valores bajos de pH, pertenecen a los gneros Acetobacter y Gluconobacter, estrechamente relacionados. Los cultivos puros de estos organismos se caracterizan por su alto grado de variabilidad y en las fermentaciones industriales se pueden desarrollar posteriormente cultivos mezclados a partir de cultivos puros. Los cultivos industriales se seleccionan en funcin de que toleren una acidez elevada y de que las velocidades de produccin de acetato sean altas. Estas bacterias son extremadamente sensibles y se mueren en ausencia de oxgeno y etanol y tambin resultan daadas a gradientes de concentracin de etanol y acetato. La sensibilidad a la falta de oxgeno aumenta a medida que lo hace la concentracin total de cido actico ms etanol. No obstante, con una aireacin suficiente, puede conseguirse una utilizacin del 80 % de oxgeno sin producir efectos adversos en la fermentacin. La sobreoxidacin, esto es la conversin de cido actico en CO2 y H20 puede impedirse manteniendo la concentracin de cido actico por encima del 6 % e impidiendo el agotamiento total del etanol.
Leccin 38: cido Lctico Aproximadamente la mitad de la demanda mundial de cido lctico se obtiene mediante fermentacin. Sus principales usos industriales son como acidulante alimentario (50 % del mercado), y para la manufactura de estearoil-2-lactilato (20 %) as como en la industria farmacutica y en otras aplicaciones. El cido L-( + )-lctico se obtiene por fermentacin anaerobia con Lactobacillus de/bruckii y cepas homofermentativas relacionadas. El medio contiene aproximadamente un 15 % de sacarosa o dextrosa y nitrgeno en forma compleja. El pH se controla en fa regin de 5,0 a 6,5 mediante neutralizacin con CaCO3 o Ca(OH)2. la temperatura se mantiene entre 45 y 60 C y el tiempo de fermentacin es de 3 a 4 das. con lo que se obtiene un rendimiento en cido lctico del 90 al 95 %, basado en el contenido inicial de azcar. El proceso de fermentacin se basa en la conversin de hexosa en piruvato por la ruta de EmbdenMeyerhof-Parnas y su conversin en L-( + )-lactato por el enzima L-lactato deshidrogenasa
Leccin 39: Acido Actico El mercado mundial anual del acetato es de unos 2,5 millones de Tm. Desde 1950 los mtodos sintticos han proporcionado la mayor parte del suministro mundial de cido actico, pero, como el etileno es la principal materia prima utilizada y su precio se ha incrementado de 6 centavos/Kg a 30 centavos/Kg desde 1970 a 1980. han ido ganando en importancia distintas rutas de produccin alternativas, incluyendo los mtodos biolgicos. Brasil produce cido actico por conversin qumica de etanol, obtenido nicamente a partir de biomasa. Tambin tienen aplicacin potencial los mtodos de fermentacin para la produccin de acetato como materia prima qumica. En este mismo captulo ya se ha descrito el proceso aerobio para la produccin de vinagre. En las fermentaciones acidognicas anaerobias se producen una gran variedad de cidos grasas voltiles. El cido actico constituye el componente mayoritario de la mezcla, aunque tambin se producen cantidades significativas de cido propinico y butrico. Los Clostridium butyricum producen una mezcla de cido actico y butrico a partir de glucosa. Los Clostridium thermocel/um y e thermoaceticum fermentan la glucosa y la fructosa casi estequiomtricamente a acetato. En la acidognesis, es imperativo suprimir los metangenos, asociados frecuentemente con los formadores de cido en los cultivos mixtos, ya que convertiran el cido en metano y C02.
Aunque en el proceso aerobio pueden obtenerse concentraciones de acetato ms elevadas, el rendimiento terico en el proceso de acidognesis anaerobio es de 1.0 comparado con el 0,66 de aquel. Las dos molculas de C02 producidas durante la conversin de piruvato en acetil CoA se asimilan justificando la tercera molcula de acetato formada a partir de glucosa . Adems, las necesidades energticas para el proceso anaerobio son menores y tambin es menor el valor de los substratos, puesto que pueden emplearse desechos de destilera y desechos de plantas de celulosa. En consecuencia., las fermentaciones acetognicas anaerobias pueden llegar a ser el mtodo de eleccin para la produccin de acetato destinado a la industria qumica.
Leccin 40: Produccin de acido ctrico El cido ctrico, ampliamente distribuido en la naturaleza, se utiliza desde hace tiempo en la manufactura de bebidas refrescantes como acidulante, como auxiliar en la fabricacin de mermeladas y como aditivo general en las industrias de repostera. Inicialmente se extrajo del zumo de limn, posteriormente se sintetiz a partir de glicerol y de otros compuestos qumicos y finalmente, desde 1923, se obtiene por fermentacin industrial. En 1933, la produccin mundial anual super las 10.000 Tm, de las cuales, ms del 80 % se obtuvieron por fermentacin. Con la substitucin de los polifosfatos por el citrato de so dio en los detergentes en 1970, el mercado anual creci rpidamente y actualmente se estima que se producen exclusivamente por fermentacin unas 300.000 Tm. Inicialmente se utilizaron mtodos de cultivo en superficie con Aspergillus niger; despus de la segunda guerra mundial se introdujeron procesos de cultivo sumergidos tambin con A. niger y aproximadamente en 1977 se comercializ un' proceso de cultivo sumergido con levaduras del gnero Candida.
En la Tabla 6 se muestran las principales caractersticas de los procesos industriales empleados en la produccin de cido ctrico. Actualmente an se utiliza ampliamente el cultivo en superficie con A. niger, puesto que, aunque es un proceso que requiere ms trabajo que el de cultivo sumergido, las necesidades energticas son menores. En los procesos sumergidos se prefieren fermentadores agitados por aire, que permiten utilizar recipientes de mayor tamao, ya que este producto es de un volumen de produccin alto entre los obtenidos por fermentacin. La materia prima ms utilizada para la produccin de citratos son las
melasas, cuyo mayor problema consiste en la gran variabilidad del material. En las fermentaciones sumergidas con A. niger las concentraciones elevadas de azcar estimulan la produccin de citrato obtenindose rendimientos bajos cuando la concentracin de azcar es inferior a 140 kg m - 3. En general, se suministra nitrgeno a una concentracin de 0,1-0,4 g 1 - l. La adicin de NH4- durante la fermentacin aumenta la produccin de citrato.
Tabla 6: Caractersticas de la produccin industrial de Acido ctrico
La produccin de cido ctrico con A. niger es extremadamente sensible a la concentracin de iones Mn2+, de forma que su produccin se \'e ya drsticamente reducida a un nivel de manganeso del orden de 3 mg 1- 1. Por tanto, es necesario pretratar las molasas con agentes que acomplejen o precipiten este metal. por ejemplo con hexacianoferrato (HCF) o con cobre, que contrarresta el efecto del manganeso al inhibir su absorcin por las clulas. Las condiciones deficientes en manganeso tambin favorecen la produccin de pequeos grnu los micelianos con superficies lisas y compactas, caractersticos de las buenas fermemaciones fngicas de citrato. Cuando la concentracin de
manganeso aumenta, la morfologa fngica se vuelve fijamentosa, incrementando drsticamente la viscosidad del cultivo y disminuyendo rpidamente de forma concomitante la tensin del oxgeno disuelto. Como la produccin de cido ctrico necesita oxgeno, la velocidad de produccin de cido aumenta a medida que aumenta la cantidad de oxgeno disuelto. Adems, una corta interrupcin del suministro d~ oxgeno puede conducir al cese irreversible de la produccin de citrato. Para la biosntesis de citrato es esencial mantener el pH por debajo de 2.0, puesto que a pH superiores, el A. niger acumula cido glucnico en vez de citrato. La produccin de citrato con Candida gullermondi difiere en varios aspectos del proceso sumergido con A. niger. Por ejemplo, la deficiencia de manganeso no es un prerrequisito, siendo innecesaria una etapa de pre tratamiento para eliminar este metal del medio; el citrato se produce a un pH superior (3,5-5,0). Adems, la limitacin de nitrgeno provoca la acumulacin de cido. La principal ventaja del proceso que emplea Candida respecto al que emplea A. niger consiste en que la productividad global de la fermentacin es superior, ya que se pueden utilizar concentraciones de azcar ms altas debido a la naturaleza ms osmotolerante de los organismos y adems la fermentacin es ms rpida.
- Bioqumica de la produccin de citrato con A. niger El proceso metablico que conduce a la acumulacin de citrato implica (a) la descomposicin de las hexosas a piruvato y acetil CoA, (b) la formacin anaplertica de oxalacetato a partir de piruvato y CO2 y (c) la acumulacin de citrato dentro del ciclo del cido tricarboxliico. En este esquema no debera eliminarse CO2 durante la produccin de ctrato, puesto que el CO2 liberado en la decarboxilacin oxidativa del piruvato a acetil-CoA debera utilizarse en la conversin de piruvato en oxalacetato. El enzima clave que cataliza esta reaccin, la piruvato carboxilasa, lo producen intrnsecamente las especies AspergiIlus. Las concentraciones elevadas de azcar aumentan adems la actividad de este enzima as como la de los enzimas glicoliticas y pueden inhibir algunos de los enzimas del ciclo del cido tricarboxilico. Para que se acumule citrato es necesario que al menos uno de las enzimas de este ciclo resulte inhibido. Las evidencias recientes sugieren que la principal etapa reguladora es la de la excetoglutarato deshidrogenasa, etapa limitante de la velocidad en el ciclo y la nica reaccin irreversible. Este enzima se inhibe al incrementar las concentraciones fisiolgicas de oxalacetato y NADH durante la produccin de citrato. La fosfofructoquinasa es inhibida por el citrato, aunque esta inhibicin puede contrarrestarse con concentraciones intracelulares elevadas de NH4+
La deficiencia de manganeso reduce la actividad de algunos de los enzimas de la ruta de la pentosa fosfato (que podran desviar las hexosas de la glicolisis y la produccin de citrato) y tambin inhibe el ciclo del cido tricarboxilico, y adems perjudica el metabolismo anablico en general, incluyendo el recambio de las protenas y los cidos nuclecos. Durante estas deficiencias, se forma una proteasa cida y la reserva intracelular de cidos nuclecos y protenas disminuye con la produccin concomitante de pptidos, aminocidos y niveles elevados de NH4+. Por tanto, en conclusin, el principal efecto de la deficiencia de manganeso es su impacto en el recambio proteico, haciendo que la concentracin de iones amonio se incremente en tanto que contrarreste la inhibicin de la fosfolactoquinasa por el citrato. Para la re oxidacin metablica del NADH durante la produccin de cido ctrico se necesita oxgeno. Durante la acumulacin de citrato, un sistema respiratorio alternativo sensible al cido salicilhidroxmico (SHAM), mantiene el sistema respiratorio con la re oxidacin del NADH, aunque sin produccin concomitante de ATP (Fig.31). El hecho de que la acumulacin de cido ctrico est fuertemente inhibida por el SHAM indica la importancia de este sistema. La respiracin sensible al SHAM depende de una tensin elevada de oxgeno y el sistema se inactiva por una corta interrupcin de la aireacin. La produccin de cido glucnico con A. niger est catalizada por una glucosa oxidasa extracelular, parcialmente unida al micelio, que se inactiva a pH inferiores a 2,0. A pH superiores, se produce cido glucnico a partir de glucosa mediante la accin de A. niger. La glucosa induce este enzima a pH superiores a 4,0, lo que hace necesario mantener en las fermentaciones para la produccin de citrato un pH inferior a 2,0.
En resumen, la produccin de citrato por A. niger se caracteriza por: Una actividad elevada de los enzimas glicolticos y de la piruvato carboxilasa inducida por los carbohidratos que conducen a la sntesis de citrato.
La inhibicin de un enzima del ciclo del cido tricarboxlico que podra causar la descomposicin del citrato. La produccin mediada por una deficiencia de manganeso de una concentracin elevada de NH: intracelular que contrarresta la inhibicin de la fosfofructoquinasa por el citrato.
Una tensin de oxgeno elevada y el suministro continuo de oxgeno para mantener activa la respiracin sensible al SHAM para la re oxidacin del NADH. Un pH bajo para inactivar la glucosa oxidasa.
Figura 31: Ruta de la produccin de citrato por Asspergillus Nger
Capitulo nueve: Biopolimeros microbianos A travs de procesos derivados de la fermentacin es posible obtener un numero amplio de compuestos orgnicos derivados del anabolismo entre estos se destacan los Biopolmeros que son aplicados en diferentes campos de la actividad humana por ejemplo: protena unicelular, enzimas, dextrano, pululano y polihidroxialcanoatos entre otros. Para fines prcticos en esta leccin nos centraremos en los polisacridos y en polihidroxialcanoatos (PHAs). Leccin 41: Polisacridos Microbianos y PHAs Tradicionalmente, los polisacridos industriales se obtenan a partir de plantas y algas marinas. Los polisacridos microbianos son una alternativa viable para substituir algunos de los productos derivados de las plantas o de las algas pero tambin para utilizar las en un amplio rango de nuevas aplicaciones industriales. La ingeniera gentica de
algunos de estos organismos productores y/o la regulacin de las condiciones medioambientales en las que se lleva a cabo la fermentacin brindan la posibilidad de manipulacin de las propiedades y caractersticas del producto, ampliando por tanto la diversidad de biopolmeros disponibles. Leccin 42: POLI - HIDROXIBUTIRATO (PHB) La principal aplicacin potencial del poli--hidroxibutirato (PHB) es como substituto de los plsticos en casos en los que sus propiedades de biodegradabi!idad representen una ventaja. La capacidad de las bacterias para reoxidar el NADH llega a ser limitante a concentraciones bajas de oxgeno, y entonces la reoxidacin da lugar a productos como el PHB, el etanol o el butano!. De esta forma el PHB es acumulado como material de reserva por una amplia variedad de bacterias entre ellas Alcaligenes eutrophus, que puede llegar a almacenar el 70-80 % de su biomasa como PHB. En el PHB la unidad repetitiva o monmero, el -hidroxibutirato, se sintetiza a partir de dos unidades de acetil CoA; el peso molecular ideal del polmero oscila entre 200.000 y 300.000. La sntesis de PHB, adems de estar influida por la concentracin de oxgeno, se ve favorecida por la limitacin del nitrgeno o el fsforo. El proceso de fermentacin para la produccin comercial de PHB debera consistir probablemente en dos etapas, una de crecimiento, sin limitacin de oxgeno o substrato, que acumule concentraciones altas de biomasa, y otra de formacin de producto en condiciones ptimas de limitacin de nutrientes o Aunque la glucosa es Utilizada comnmente como substrato por los A. eutrophus, comercialmente sera deseable la posibilidad de Utilizar substratos ms baratos que redujesen de forma significativa los costos de produccin. Leccin 43: Los alginatos se obtienen a partir de algas marinas, aunque como esta fuente est sujeta a una gran variabilidad, se ha considerado interesante a nivel industrial el substituirlos por polisacridos similares obtenidos por fermentacin, por ejemplo el polisacrido de Azotobacter vinelandii. Entre otros polisacridos microbianos de inters comercial se incluyen el pululano, producido por Aureobasidium pullulans, el seleroglucano, producido por especies de Selerotium y el gelano, producido por Pseudomonas elodea. Los procesos destinados a la produccin de exopolisacridos microbianos se caracterizan por la elevada viscosidad del medio de fermentacin. Las bajas concentraciones de producto obtenidas y los cambios
conformacionales del polmero ocurridos durante la fermentacin. El control de los constituyentes del medio as como de otros parrnetros de la fermentacin es crtico para conseguir las velocidades de sntesis deseadas. Los estudios limitados realizados indican que la modificacin del exopolisacrido mediante manipulacin del medio de cultivo parece influir en el grado de polimerizacin ms que en la estructura real y en la composicin de la unidad repetitiva. Leccin 44: La goma Xantano Es el nico polisacrido microbiano obtenido por la fermentacin que representa una parte significativa del mercado mundial. Su unidad repetitiva bsica consiste en un pentasacrido que contiene glucosa, manosa, cido glucurnico, acetato y piruvato. Esta goma tiene una viscosidad elevada a concentraciones bajas, que es estable en un amplio rango de pH y es independiente de la temperatura y de la presencia de cationes. En solucin acuosa y combinada con polisacridos de las plantas forma geles estables, por lo que se utiliza como estabilizante de suspensiones y para controlar la viscosidad. Debido a sus propiedades pseudoplsticas, combinadas con su estabilidad frente a la temperatura ya los cationes, se emplea como lubricante. Tambin se utiliza junto con surfactantes e hidrocarburos para mejorar la recuperacin de aceites. En el caso de la produccin de goma xantano, el contenido de piruvato como substityete se puede hacer variar del O al 75 % mediante una seleccin adecuada de la cepa y el medio, lo que puede influir en las propiedades reolgicas del polmero, cuando la concentracin del polmero cambia o cuando se alteran la fuerza inica o la temperatura del medio. Algunos medios de crecimiento para la produccin de xantano dan lugar a la formacin de mutantes 'que no producen polisridos, aunque esto puede evitarse mediante una eleccin adecuada del medio limitando la cantidad de nutriente para el crecimiento. En general, en la produccin de polisacridos microbianos cargados debe controlarse el pH; por ejemplo, el pH ptimo para la produccin de xantano es de 7.0 cesando el crecimiento y la formacin de producto a un pH de 5,5. A lo largo de la fermentacin, las propiedades del caldo cambian, pasando de ser un fluido newtoniano con viscosidad baja a ser un fluido no newtoniano con viscosidad alta, a medida que la concentracin de exopolisacrido aumenta. Estos cambios influyen profundamente en el mezclado yen la transferencia de masa y calor en la fermentacin, por lo que el diseo y las condiciones de operacin del fermentador deben optimizarse ajustndose a estas condiciones reolgicas. La concentracin final de xantano en los caldos de los fermentadores es de unos 50 g. 1 - 1 Y los rendimientos, basados en la glucosa consumida, son del 50 al 60 %.
La mayora de las sntesis de exopolisacridos bacterianos se producen intracelularmente, mediante la va de los azcares, activados con un nucletido. Los azcares se transfieren desde el nucletido a un lpido transportador, activado por transferencia inicial de un azcar fosfato, dando lugar a la formacin de la unidad repetitiva de azcar. El mtodo exacto de elongacin de la cadena y de extensin del polisacrido es desconocido. Leccin 45: Los dextranos Son polisacardos de elevado peso molecular, que consisten en unidades de -D-glucose ligadas predominantemente por enlaces glicosdicos 1-6. Los dextranos son formados a partir de la sacarosa durante el crecimiento de bacterias pertenecientes a los gneros Leuconostoc, Streptococcus y Lactobacillus, todas pertenecientes a la familia Lactobacillacea. La mayora de los dextranos son, entretanto, sintetizados por la bacteria de la especie Leuconostoc mesenteroides. Los dextranos son neutros, solubles en agua, fcilmente filtrables, biocompatibles y biodegradables. Aplicaciones:
Aplicaciones biomdicas (agentes de contraste para imagiologia mdica, sntesis de hidrogeles) Industria farmacutica (en colirios, anticoagulantes, complejos con hierro) Industria fotogrfica (emulsiones de plata) Uso veterinario Industrias alimentarios
El mayor productor mundial de dextrano es Pharmacia (Suecia), sin embargo, existen otros tales como: Fisons (Reino Unido), Meito (Japn), Pfeiffer & Langen y UEB Sermwerke (Alemania), Polfa (Polonia), Pharmacia (EEUU y Suecia), Knoll/Schiwa (Alemania), Abbott (EEUU), Travenol (EEUU) y Fisons (Reino Unido). Actividades Investiga los procesos de produccin de cerveza y vino. Realice comparaciones relacionadas con: Tipo de Microorganismos utilizados, Substratos y Procesos.
Investiga sobre metabolitos derivados del metabolismo intermedio y su aplicacin en la Industria alimenticia. Elabore un mapa conceptual que permita visualizar las diferentes aplicaciones de la Biotecnologa en la industria alimenticia Consulte un proceso Biotecnolgico, y realice un estudio de casos, a partir del proceso que se desarrolla y sustntelo ante sus compaeros.
BIBLIOGRAFIA BSICA
1. AYALA FRANCISCO. Evolucin molecular, Edicin Omega, Barcelona 1980 2. BURGES A. Biologa del suelo. Edicin Omega S.A. Barcelona 1971 3. BYONG H. Lee Fundamentos de Biotecnologa de los alimentos Editorial Acribia, Zaragoza. (1996). 4. CAMACHO RUBIO y otros, Hidrolizados enzimticos de inters en la I.A.A.(II) Hidrolizados enzimticos de protenas. Alimentos, Equipos y Tecnologa. XI.10.1992 5. CRUGER Y CRUGER. Biotecnologa: Manual de Microbiologa Industrial. Editorial Acribia S.A. Zaragoza, Espaa. 1989 6. CRUZ L. Revista Ciencia. Impacto social de la Biotecnologa. El desafio cubano. Cdigo ISPN de la Publicacin: EPAVAPVEKLDMNMTNRV, Publicado Wednesday 22 de September de 2004 7. DE CHISTI y MOO-YOUNG, in Biotecnologie di Base, Ratledge, C., Kristiansen, B., editors, Cambridge University Press, 1993 8. GALINDO FENTANES, E. Seleccin y diseo de fermentadores a varias escalas. Departamento de Bioingeniera. Instituto de Biotecnologa. UNAM. Cuernavaca Mxico 1995 9. GARCA, N Noguera BIOTECNOLOGA, 2005 .Aspectos legales de la Biotecnologa.
10. MADIGAN y otros. Biologa de los Microorganismos, Brook. Prentice Hall Internacional. Espaa 1997 11. MARTINES JORGE, Microbiologa Industrial. Una experiencia Cubana. Editorial: El pueblo. Universidad de la Habana. 1997 12. MONTOYA DOLLY- Las fermentaciones como soporte de los procesos biotecnolgicos. Universidad Nacional de Colombia. Bogot, D.C. 1989 13. OEA .Organizacin industrial, 2000 de Estados Americanos.: Microbiologa
14. OSORIO, M. Biotecnologa, Eds. Echenique,V.; Rubinstein, C. y Mroginski L. INTA. Buenos Aires, Argentina 15. OWEN P Word. Biotecnologa de la Fermentacin. Editorial Acribia. Zaragoza 1979 16. RAVEN, J. Biology, 2002. Second Edition. is published by Princeton University Press and copyrighted, 2007, 17. SCRIBAN Ren. Biotecnologa. UNAM. Editorial Manual Moderno. Mxico D.F. 1985 18. SMITH, J.E. (1996): Biotechnology (3 edicin). Cambridge: Cambridge University Press (ISBN: 0-521-44911-1). 19. SOBERON, M La ingeniera gentica y la nueva tecnologa, Fondo de cultura econmica. Mxico, 1996 20. WISEMAN, A.; Principios de biotecnologa; Acribia, Zaragoza, 1985.
CIBERGRAFA Fundamentos de Ingeniera Bioqumica http://www.csic.es/mostrar/instalaciones/area7/iata1/planta. htm Planta piloto de Biotecnologa Alimentaria http://tamarugo.cec.uchile.cl/~btcursos/fermentacion/clases.h tml Material de asignatura, Universidad de http://instruct1.cit.cornell.edu/courses/biomi290/ Departamento de Microbiologa, Universidad de http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/ Base de datos con temas relacionados. http://www.verema.com/opinamos/tribuna/articulos/levadura s01.htm Levaduras y fermentacin alcohlica. http://www.np.edu.sg/~deptbio/questions/fermentation_4/fer mentation_4.htm Test en lnea sobre reactores bioqumicos. http://userpages.umbc.edu/~gferre1/outline.html Review sobre cultivos fed-batch. http://www.unavarra.es/genmic/micind-0.htm Microbiologa industrial. http://www.ehu.es/biomoleculas/ENZ/ENZ.htm Chile.
Cornell.
Enzimas. http://www.science.oas.org/espanol/publica_bio.htm Textos en formato electrnico en el rea de la biotecnologa alimentaria (OEA) FAO: www.fao.org/biosecurity/ Bayer: www.bayervet.net/bs_index.html Nieser: www.nieser.com.ar/esp/bioseguridad.asp Biotecnologa de los Alimentos: IATA www.iata.csic.es/iata/dbio Biotecnologa en Alimentacin y Agricultura www.fao.org/biotech/index.asp?lang=es CENTRO BIOINFO MONSANTO: www.biotechknowledge.monsanto.com/ DIVERSIDAD BIOLGICA: www.fao.org/biodiversity/index.asp?lang=es GLOSARIO BIOTECNOLOGA: www.monsanto.es/biotecnologia/glosario.html www.fao.org/biotech/find-formalpha-n.asp

Biotecnologia Examen

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Biotecnologia Examen

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BSICAS TECNOLOGAE INGENIERA CONTENIDO DIDCTICO DEL CUSO: 35689

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA

305689 - BIOTECNOLOGA FEDRA LORENA ORTIZ BENAVIDES (Director Nacional)

GLEATHER JHON FLOREZ Acreditador

CAPITULO 1. Contextualizacin de la Biotecnologa

Leccin 1. Definicin de Biotecnologa

Leccin 2: Historia de Biotecnologa

Leccin :3 Divisin y tipos de Biotecnologa

Impacto de la Biotecnologa en el contexto colombiano

Leccin 5: Tendencias de la Biotecnologa

CAPITULO 2 : BIOTECNOLOGA DE LAS FERMENTACIONES

Leccin 1: Nutricin microbiana

Leccin2: Metabolismo energtico

Leccin 3: Aspectos generales de los procesos biosintticos

Leccin 4 : Crecimiento microbiano

Leccin 5: Modelos matemticos que explican el crecimiento microbiano

CAPITULO 3 : SISTEMAS DE FERMENTACIN

Leccin 1: Tipos de fermentacin Leccin 2: Productividad y velocidad especfica de produccin

Leccin 3: Coeficientes de rendimiento

UNIDAD 2 : BIOCATALISIS E INGENIERA GENTICA APLICADA A LA BIOTECNOLOGA ALIMENTARIA

CAPITULO UNO : BIOTECNOLOGA ENZIMTICA

Leccin 1 : Las enzimas biocatalizadores de naturaleza proteica

Leccin 2: Naturaleza de las enzimas

Leccin 3: Clasificacin de enzimas segn la naturaleza de la reaccin y cofactores

Leccin 4: Cintica enzimtica

Leccin 5: Produccin de enzimas

Leccin 2: Tecnologa del ADN recombinante

Leccin 3: La reaccin en cadena de polimerasa ( PCR)

Leccin 4: Mutagnesis , Mutagnesis dirigida por oligonucletidos

Leccin 5: Mutagnesis en casette o interrupcin gnica

CAPITULO 3 : APLICACIONES DEL ADN RECOMBINANTE EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA

Leccin 1: Animales transgnicos

Leccin 2: Plantas Transgnicas

Leccin 4: Alimentos funcionales

UNIDAD 3 : PRODUCTOS BIOTECNOLGICOS DE INTERES ALIMENTARIO

Leccin 1: Bebidas alcohlicas

Leccin 2: Biologa de las fermentaciones con levaduras y condiciones de la fermentacin

Leccin 3: Compuestos organolpticos

Leccin 4 : Alimentos basados en soja fermentada Leccin 5 : Productos crnicos fermentados

CAPTULO DOS: ALIMENTARIA

OTROS PRODUCTOS DE INTERS EN LA INDUSTRIA

Leccin 1: Produccin de levadura

leccin 3 : acido Lctico leccin 4: acido Actico

Leccin 5 : Produccin de acido ctrico

CAPITULO 3 : BIOPOLIMEROS MICROBIANOS

Leccin 2: Poli hidroxibutirato

Leccin 3: Los alginatosy Gelanos

LIISADO DE TABLAS Nombre Tabla 1 Tabla 2:

Caractersticas de la industrial de cido ctrico

LISTADO DE GRFICOS Y FIGURAS

ASPECTOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL Y VERSIONAMIENTO

Leccin 1. Definicin de Biotecnologa

Leccin 2: Historia de Biotecnologa

Leccin :3 Divisin y tipos de Biotecnologa

Impacto de la Biotecnologa en el contexto colombiano

Leccin 5: Tendencias de la Biotecnologa

CAPITULO 2 : BIOTECNOLOGA DE LAS FERMENTACIONES

Leccin 6: Nutricin microbiana

Leccin 7: Metabolismo energtico

Leccin 8: Aspectos generales de los procesos biosintticos

Leccin 9 : Crecimiento microbiano

Leccin 10: Modelos matemticos que explican el crecimiento microbiano

CAPITULO 3 : SISTEMAS DE FERMENTACIN