MAKALAH IMUNOSEROLOGI

PEMERIKSAAN TPHA
(Treponema pallidum Haemaglutination Assay)

Oleh: Ayu Putu Astiti Natih Ayu Savitri Siakayani Ni Kadek Destari Dwi Wiantari Madya Mas Cista Hwardani Komang Jatmika (P07134011002) (P07134011004) (P07134011006) (P07134011008) (P07134011010)

KEMENTERIAN KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA POLITEKNIK KESEHATAN DENPASAR JURUSAN ANALIS KESEHATAN 2013
PRAKTIKUM VIII

PEMERIKSAAN TPHA (Treponema pallidum Hemagglutination Assay)

Hari/Tanggal Praktikum Tempat : : Rabu, 22 Mei 2013.

Laboratorium Patologi Klinik, Poltekkes Denpasar.

I.

TUJUAN Untuk mendeteksi adanya antibodi spesifik terhadap Treponema pallidum dalam serum/plasma pasien secara kualitatif dan semi kuantitatif.

II.

METODE Metode yang digunakan adalah Hemaglutinasi

III. PRINSIP Reaksi Hemaglutinasi secara imunologis antara eritrosit avian yang dilapisi oleh antigen Treponema pallidum (Nichols strain) pada reagen dengan antibodi spesifik terhadap Treponema pallidum pada sampel serum/plasma pasien. IV. DASAR TEORI IV.1 SIFILIS Sifilis atau yang disebut dengan Raja Singa, adalah penyakit menular seksual yang disebabkan oleh sejenis bakteri yang berbentuk spiral atau spirochete yang dikenal dengan Treponema pallidum. Bakteri yang berasal dari famili Spirochaetaceae ini, memiliki ukuran sangat kecil dan dapat hidup hampir di seluruh bagian tubuh. Spirochaeta penyebab sifilis ini dapat ditularkan dari satu orang ke orang lain melalui hubungan genito genital (kelamin kelamin) maupun oro genital (seks oral).

Infeksi ini juga dapat ditularkan oleh seorang ibu kepada bayinya selama masa kehamilan. Spirochaeta memperoleh akses melalui kontak langsung dari lesi bawah terinfeksi dengan setiap kerusakan walaupun mikroskopik, di kulit, atau mukosa pejamu. Sifilis dapat disembuhkan pada tahap tahap infeksi, tetapi bila dibiarkan, penyakit ini dapat menjadi sistemik dan kronik. Pada tahun 1905, penyebab sifilis ditemukan oleh Schauddin dan Hoffman yaitu Treponema pallidum, yang berordo Spirochaetales, familia Sprirochaetaceae, dan genus Treponema. Bakteri ini merupakan basil gram negatif yang panjang, tipis, bergulung secara heliks, berbentuk spiral, atau seperti pembuka tutup botol, panjangnya antara 6 15 m, lebar 0,15 m, terdiri atas delapan sampai dua puluh empat lekukan. Membiak secara pembelahan melintang, pada stadium aktif terjadi selama tiga puluh jam (Marwali, 1990). Pembentukkan pada umumnya tidak dapat dilakukan di luar tubuh. Di luar tubuh, kuman tersebut cepat mati, sedangkan dalam darah untuk tranfusi dapat hidup selama tujuh puluh dua jam (Marwali, 1990). Penyakit sifilis memiliki empat stadium yaitu primer, sekunder, laten dan tersier. Tiap stadium perkembangan memiliki gejala penyakit yang berbeda beda dan menyerang organ tubuh. 1. Stadium Dini ( Primer ) Tiga minggu setelah infeksi, timbul lesi pada tempat masuknya Treponema pallidum. Terjadi afek primer berupa penonjolan penonjolan kecil yang erosif, berukuran 1-2 cm, berbentuk bulat, dasarnya bersih, merah, kulit disekitarnya tampak meradang, dan bila diraba ada pengerasan. Dalam beberapa hari, erosi dapat berubah menjadi ulkus berdinding tegak lurus ( Anonim, tt ). 2. Stadium Sekunder Pada umumnya bila gejala sifilis stadium II muncul stadium I sudah sembuh. Waktu antara sifilis I dan II umumnya antara 6-8

minggu. Kadang kadang terjadi masa transisi, yakni sifilis I masih ada saat timbul gejala stadium II. Sifat yang khas pada sifilis adalah jarang ada rasa gatal. Gejala konstitusi seperti nyeri kepala, demam, demam, anoreksia, nyeri pada tulang, dan leher biasanya mendahului, kadang kadang bersamaan dengan kelainan pada kulit. Kelainan kulit yang timbul berupa bercak bercak atau tonjolan tonjolan kecil. Sifilis stadium II seringkali disebut sebagai The Greatest Immitator of All Skin Diseases karena bentuk klinisnya menyerupai banyak sekali kelainan kulit lain. Selain pada kulit, stadium ini juga dapat mengenai selaput lendir dan kelenjar getah bening di seluruh tubuh ( Anonim, tt ). 3. Stadium Laten Lesi yang khas adalah gumma yang dapat terjadi 3-7 tahun setelah infeksi. Gumma umumnya satu, dapat multipel. Gumma dapat timbul pada semua jaringan dan organ, termasuk tulang rawan pada hidung dan dasar mulut. Gumma juga dapat ditemukan padaorgan dalam seperti lambung, hati, limpa, paru paru, testis dan sebagainya. Kelainan lain berupa nodus di bawah kulit, kemerahan dan nyeri ( Anonim, tt ). 4. Stadium Tersier Termasuk dalam kelompok penyakit ini adalah sifilis kardiovaskuler dan neurosifilis Diagnosa Laboratorium a. Uji treponemal Uji treponemal merupakan uji yang spesifik terhadap sifilis, karena mendeteksi langsung Antibodi terhadap Antigen Treponema pallidum. Pada uji treponemal, sebagai antigen digunakan bakteri treponemal atau ekstraknya, misalnya Treponema Pallidum Hemagglutination Assay (TPHA),Treponema Pallidum Particle Assay (TPPA), dan Treponema Pallidum Immunobilization (TPI). Walaupun ( pada jaringan saraf ). Umumnya

timbul 10 20 tahun setelah infeksi primer ( Anonim, tt ).

pengobatan secara dini diberikan, namun uji treponemal dapat memberi hasil positif seumur hidup. (Aprianinaim,2011) b. Uji non-treponemal Uji non-treponemal adalah uji yang mendeteksi antibodi IgG dan IgM terhadap materi-materi lipid yang dilepaskan dari sel-sel rusak dan terhadap antigen-mirip-lipid (lipoidal like antigen) Treponema pallidum. Karena uji ini tidak langsung mendeteksi terhadap keberadaan Treponema pallidum itu sendiri, maka uji ini bersifat non-spesifik. Uji non-treponemal meliputi VDRL (Venereal disease research laboratory), USR (unheated serum reagin), RPR (rapid plasma reagin), dan TRUST (toluidine red unheated serum test). (Aprianinaim,2011) IV.2 Pemeriksaan TPHA (Treponema pallidum Hemagglutination Assay) Treponema pallidum Hemagglutination Assay (TPHA) merupakan suatu pemeriksaan serologi untuk sifilis. Untuk skirining penyakit sipilis biasanya menggunakan pemeriksaan VDRL atau RPR apabila hasil reaktif kemudian dilanjutkan dengan pemeriksaan TPHA sebagai konfirmasi. Selain itu TPHA merupakan tes yang sangat spesifik untuk melihat apakah adanya antibodi terhadap treponema. Jika di dalam tubuh terdapat bakteri ini, maka hasil tes positif. Tes ini akan menjadi negatif setelah 6 24 bulan setelah pengobatan. Bakteri-bakteri yang lain selain keluarga treponema tidak dapat membuat hasil tes ini menjadi positif. Manfaat Pemeriksaan TPHA ini adalah sebagai pemeriksaan konfirmasi untuk penyakit sipilis dan mendeteksi respon serologis spesifik untuk Treponema pallidum pada tahap lanjut/akhir sipilis. (Prodia,tt) Kelemahan pemeriksaan TPHA : 1. 2. Kurang sensitif bila digunakan sebagai skrining (tahap awal/primer) sipilis. Pada saat pengerjaan diperlukan ketrampilan dan ketelitian yang tinggi.

3.

Tidak dapat dipakai untuk menilai hasil terapi, karena tetap reaktif dalam waktu yang lama.

Kelebihan pemeriksaan TPHA : 1. 2. Teknis dan pembacaan hasilnya mudah Memiliki spesifisitas tinggi untuk mendeteksi adanya antibodi treponemal dan sensitivitas yang tinggi dimana kadar minimum antibodi treponemal yang dapat dideteksi adalah 0,05 IU/ml. 3. Hasil reaktif/positif dapat diperoleh lebih dini.

Hal-hal yang perlu diperhatikan 1. Semua komponen harus disuhu ruangkan terlebih dahulu sebelum digunakan. 2. Selalu perhatikan e.d reagen. 3. Suhu penyimpanan reagen adalah 2-80C dan tidak boleh dibekukan. 4. Sampel yang digunakan adalah sampel serum/plasma yang bebas dari sel darah, kontaminasi mikroba, tidak hemolisis dan tidak lipemik/ikterik. 5. Selalu menyertakan control positif dan control negative. 6. Proses penghomogenan harus dilakukan dengan tepat. 7. Ketepatan volume pemipetan sampel dan reagen perlu diperhatikan untuk memperoleh pengenceran yang sesuai. 8. Control cell harus selalu menunjukkan hasil negative pada proses pemeriksaan baik kualitatif maupun semi kuantitatif. 9. Waktu inkubasi tidak boleh lebih dari 60 menit dan bebas dari getaran.

V.

ALAT DAN BAHAN A. ALAT 1. Mikroplate 96 sumur (Format sumur U) 2. Mikropipet 10 L , 25 L , 75 L , 90 L , 100 L 3. White tip dan yellow tip B. BAHAN 1. Sampel serum/plasma pasien 2. Plasmatec TPHA Test Kit ( suhu penyimpanan : 2-80 C), terdiri dari : Reagen Diluent (Expired date : Desember 2013 ) Reagen Test Cell (Expired date : April 2013 ) Reagen Control Cell (Expired date : Juni 2013 ) Positif Control (Expired date : Januari 2014 ) Negatif Control (Expired date : Januari 2014 )

VI. CARA KERJA VI.1 Metode Kualitatif A. Pengenceran Sampel (1:20) 1. Semua komponen pemeriksaan disiapkan dan dikondisikan pada suhu ruang 2. Mikroplate diletakkan pada meja yang datar dan kering 3. Reagen Diluent dimasukkan sebanyak 190 L dengan mikropipet ke dalam satu sumur mikroplate. 4. Sampel serum/plasma ditambahkan sebanyak 10 L dengan mikropipet ke dalam sumur tersebut. 5. Campuran dihomogenkan NB : Kontrol positif dan negatif telah disediakan untuk siap digunakan tanpa memerlukan pengenceran

B. Test 1. Mikroplate (6 buah sumur uji) disiapkan 2. Pada sumur 1 dan 2 masing-masing ditambahkan 25 L sampel yang telah diencerkan (1:20) 3. Pada sumur 3 dan 4 ditambahkan 25 L control positif dan pada sumur 5 dan 6 ditambahkan 25 L control negative. 4. Pada sumur 1,3 dan 5 ditambahkan 75 L reagen Test Cell dan pada sumur 2,4 dan 6 ditambahkan 75 L reagen Control Cell serta dihomogenkan. Campuran ini disebut pengenceran 1:80. 5. Kemudian diinkubasi pada suhu 15-300 C selama 45-60 menit tanpa adanya getaran. 6. Hasil/reaksi yang terjadi diamati dan diinterpretasikan 7. Apabila hasil yang diperoleh positif maka dilanjutkan pada metode semi kuantitatif. Interpretasi Hasil Pemeriksaan Kualitatif Reaksi positif ditunjukkan dengan hemaglutinasi sel Reaksi negatif ditunjukkan dengan adanya pengendapan sel pada dasar sumur seperti titik.

+ +

VI.2 Metode Semi Kuantitatif A. Pengenceran Sampel (1:20)

1. Semua komponen pemeriksaan disiapkan dan dikondisikan pada suhu ruang. 2. Mikroplate diletakkan pada meja yang datar dan kering 3. Reagen Diluent dimasukkan sebanyak 190 L dengan mikropipet ke dalam satu sumur mikroplate 4. Sampel serum/plasma ditambahkan sebanyak 10 L dengan mikropipet ke dalam sumur tersebut 5. Campuran dihomogenkan NB : Kontrol positif dan negatif telah disediakan untuk siap digunakan tanpa memerlukan pengenceran B. Titrasi 1. Mikroplate (8 buah sumur uji) disiapkan 2. Sumur 1 dan 2 dibiarkan kosong. 3. Dari sumur 3 sampai sumur 8 dimasukkan sebanyak masingmasing 25 L reagen Diluent 4. Sebanyak 25 L sampel yang telah diencerkan (1:20) ditambahkan ke dalam sumur 1, 2 dan 3 kemudian dihomogenkan 5. Dari sumur 3 dipipet sebanyak 25 L dan dipindahkan ke sumur 4 kemudian dihomogenkan dan diulangi sampai sumur ke-8. Dari sumur 8 dipipet 25 L dan dibuang C. Test 1. Control cell dimasukkan sebanyak 75 L kedalam sumur uji 1. 2. Reagen Test Cell Sebanyak 75 L dimasukkan ke dalam masingmasing sumur yaitu dari sumur 2-8 (Campuran ini memiliki range pengenceran dari 1/80 1/5120). 3. Kemudian dihomogenkan 4. Mikroplate diinkubasi pada suhu 15-300 C selama 45 - 60 menit pada permukaan yang bebas dari getaran

5. Hasil / reaksi yang terjadi diamati dan dicatat titernya sebagai pengenceran tertinggi yang masih menimbulkan hemaglutinasi

Interpretasi Hasil Semi Kuantitatif Reaksi positif ditunjukkan dengan hemaglutinasi sel Reaksi negatif ditunjukkan dengan adanya pengendapan sel pada dasar sumur seperti titik. Gambar hasil yang masih menunjukkan hasil positif :

Gambar hasil yang menunjukan hasil +/-

Berikut ini ilustrasi dari hasil semi kuantitatif:

+/ -

CC

1 : 80 1 : 160 1 : 320 1 : 640 1 : 12801: 2560 1 : 5120

Titer : pengenceran terakhir yang masih menunjukkan hemaglutinasi.

DAFTAR PUSTAKA
Aprianinanim.2012. Uji TPHA. http://nillaaprianinaim.wordpress.com/2011/09/28/uji-tpha-ujitreponemal/ (Diakses : 18 Mei 2013) Anonim. tt. Gejala Sifilis. http://gejalasifilis.com/. Diakses pada tanggal 20 April 2013. Prodia.Tt. TPHA. http://prodia.co.id/imuno-serologi/tpha. (Diakses : 18 Mei 2013) Aji,dkk. 2011. 18 Mei 2013) Laporan Resmi Praktikum Imunoserologi II. http://id.scribd.com/doc/46539199/Laporan-Resmi-Imun-II . (Diakses :