FILME LIPIDICE MODELE ARTIFICIALE PENTRU MEMBRANE BIOLOGICE COMPONENA LIPIDIC A MEMBRANELOR BIOLOGICE Din punct de vedere biologic

c n opinia actual este acceptat consideraia c membrana biologic este format dintr-o matrice bilamelar de lipide n care sunt asociate integral sau periferic proteine. Modelul mozaic fluid formulat mai sus, susine, n parte, c lipidele i proteinele constituente sunt mobile n structur ca urmare a naturii fluide a suprafeei bilamelare. n lumina unor studii mai recente este clar c micarea relativ a moleculelor variaz foarte mult de la o membran la alta. Cu alte cuvinte, fluiditatea membranelor morfologic distincte variaz de la aranjamente cu mobilitate foarte mare la structuri rigide n care micarea molecular este foarte constrns. Aceast proprietate este atribuit nu numai constituenilor lipidici, dar, dup cum s-a dovedit prin numeroase metode fizice, este n mare msur efectuat de proteinele membranei i de colesterol. Avnd n vedere faptul c membranele biologice pot fi izolate cu un grad de puritate satisfctor i innd cont de progresul considerabil fcut n domeniul metodelor analitice, se poate spune c se dein n prezent informaii din ce n ce mai precise asupra constituenilor mambranari. Se disting astfel trei calse de componeni: lipidele, proteinele i glucidele. Lipidele formeaz liantul arhitecturii membranare. Exist dou clase principale de lipide: fosfolipidele (glicerofosfolipidele i sfingolipidele) i sterolii (colesterol i ergosterol). Chiar dac se prezint sub forma unor numeroase specii moleculare, aceti compui membranari sunt relativi uor de descris, i proprietile lor fizico-chimice, dependente de natura lor amfifil, sunt n legtur direct cu structura chimic a componenelor lor: capetele lor polare i acizii grai. n membranele biologice ntlnim o mare varietate de substane lipidice. Multe dintre ele se gsesc sub form de urme i rolul lor nu este structural. Astfel, de exemplu, este cazul intermediarilor metabolici i al hormonilor. Marea varietate de lipide ce se gsesc n diferite sisteme de biomembrane este att din punct de vedere al claselor de lipide, ct i al proporiilor. Aceast heterogenitate conduce la ntrebarea dac varietatea de lipide din biomembrane este cerut pentru a ndeplini funcii specialzate, sau

chiar funcii mai generale sau dac reprezint pur i simplu suma total de procese responsabile pentru biosinteza lipidelor membranare? Sunt puine exemple calre de cereri speciale de lipide n funcii biochimice, dei se pare c majoritatea proteinelor intrinseci membranei cer lipide care formeaz suprafee bilamelare pentru a susine funciile biochimice. Deoarece aceast cerere minimal poate fi satisfcut cu lipide simple, este greu de explicat de ce exist o asemenea diversitate i dac este sau nu necesar pentru funciile membranei. Din numeroasele studii reiese clar c membranele biologice difer considerabil dup fluiditatea lor. Acest parametru este o proprietate a suprafeei bilamelare de lipide i depinde de tipurile de lipide i mai ales de substituenii asociai hidrocarburilor. Fluiditatea este deasemenea modelat de prezena sterolilor, proteinelor (att proteinelor extrinseci ct i intrinseci membranei) i ionilor. Exist numeroase dovezi experimentale c moleculele membranei pot s difuzeze lateral i s se roteasc n jurul unei axe perpendiculare pe planul membranei. S-a artat c rata acestei micri variaz considerabil de la o membarn la alta i este calr c o stare uniform de fluiditate nu este cerut ca o proprietate general a membranelor biologice. Studii ale factorilor biochimici, genetici i de mediu nconjurtor, care afecteaz fluiditatea membranelor biologice au artat c sunt procese de reglare n cadrul celulelor, care ajut la meninerea strii fizice a suprafeei bilamelare de lipide n limite bine definite. Principalele propieti fizico-chimice ale lipidelor membranare sunt legate de faptul c acestea sunt amfifile. Ele aparin unei categorii speciale, inclus ntre, pe de-o parte, compuii care sunt nc incapabili s structureze apa i pe de alt parte detergenii care disocaiz structurile membranare. Una din caracteristicile eseniale ale sistemelor amfifile-ap este aceea c prezint o suprafa de contact considerabil ntre structura format i ap. Suprafaa de contact, denumit interfaa lipid-ap este n realitate o interfa de grupri polare-ap; este n consecin hidrofil. Caracteristicile acestei zone interfaciale stau n mare parte la originea proprietilor funcionale numite de contact ale membranelor (de exemplu activarea enzimelor, fenomenele de recunoatere), n timp ce regiunea hidrocarbonat, nepolar, contribuie mai degrab la ceea ce putem numi proprieti de suport i de barier selectiv i de asemenea de fluiditate, care contribuie la reglarea proceselor precedente. Structura acestei interfee este dominat de gradul de ionizare al gruprilor polare i de stare lor de hidratare.

n general, se consider c prezena colesterolului n suprafeele bilamelare ale fosfolipidelor tinde s extind suprafaa gruprilor polare, el ndeprtnd gruprile polare, terminale ale fosfolipidelor unele de altele, crend astfel mai mult spaiu pentru orientarea moleculelor de ap ce le hidrateaz. Studii ulterioare au dovedit c prezena colesterolului n sistemul lipidic determin apariia clar a mezomorfismului liotrop i termotrop. Mixturile acid gras colesterol sufer un proces de topire prin care moleculele se transform dintr-o structur strns mpachetat (close-pocket), imobil (cristalin sau tip gel), ntr-o faz lichid dezordonat nu direct, ci n mod cooperativ, trecnd prin faza de cristal lichid. Se tie din studii de dispersie a unui ir de fosfolipide aride sintetice c temperatur de tranziie de faz i cooperativitatea tranziiei pot fi influenate de natura sarcinii electrice a gruprilor marginale. Se poate spune deci c strea electric intern a membranei are o responsabilitate major n funcionarea specific a ei. Fosfolipidele sunt electrolii, de cele mai multe ori amfoteri. La pH=7, ele prezint o sarcin negativ datorat radicalului fosforil. Lecitinele caracterizate de gruparea lor colin, purttoare a unui ion amoniu cuaternar avnd pH n jurul valorii 13 sunt zwitterioni ntre pH 2 i 13. Gruparea fosforil-colin se comport deci ca un dipol neutru din punct de vedere electric. Prezena acestor sarcini electrice confer stratului bimolecular o densitate de sarcin superficial mai mare sau mai mic n funcie de natura fosfolipidului i de condiiile de mediu. Aceast suprafa poate deasemenea fixa ioni, n special ioni bivaleni. n plus, interacii electrostatice directe se vor putea stabili cu proteinele, nu numai cu acelea care sunt parial n soluie n mediul apos nconjurtor dar i cu cele incluse n cuc. Toate aceste fenomene descrise au consecine importante, att structurale ct i funcionale. Din punct de vedere electric, sistemele lipidice formate din acizii grai: arahidic, lauric, elaidic butiric, arahidonic, precum i mixturile lor cu colesterolul au comportament de dielectrici. MODELE ARTIFICIALE DE MEMBRANE BIOLOGICE Studiul fazelor mezomorfe formate de lipide este fundamental pentru nelegerea aprofundat a organizrii moleculare i al proprietilor funcionale ale membranelor biologice. n acest scop numeroase metode sunt utilizate. Unele dintre ele aduc informaii de ordin structural (difracia de raze X i cea a neutronilor, microscopia electronic); alte metode, cum ar fi calorimetria

diferenial cu baleiajul temperaturii msoar parametrii termodinamici caracteristici ascociaiilor moleculare. Alte metode aduc informaii asupra dinamicii moleculare a sistemelor fosfolipidice (RMN, RES, fluorescena). Toate modelele obinuite pentru membranele biologice utilizeaz conceptul fundamental al unui bistrat lipidic (Gorter and Grendel 1925, Davson and Danielle 1935). O alt trstur a acestor modele include proteine imersate n membran (intrinsec) sau adiacent (extrinsec) i existena porilor, canalelor i purttorilor n membran. Este deci posibil s se nceap cu conceptul bistratului lipidic (lipid bilayer) i s se construiasc toate modelele din acest punct de nceput. Experimental sunt dou tipuri generale de sisteme membranare bistrat care pot fi folosite. Acestea sunt membranele n strat negru (black lipid membrans-BLM), (Mueller 1962) i lipozomii (Bangham, 1968). Un BLM este bistrat palnar format ntr-o mic gaur perforat ntr-o bucat subire de teflon. Dispersia fosfolipidelor n ap formeaz cu uurin structuri veziculare nchise, numite lipozomi. Lipozomii sunt obiectul unui mare numr de studii, deoarece ei constituie modele de membrane biologice foarte interesante i se caut o modalitate de utilizare a lor ca sisteme vectoare a diverselor substane (medicamente, acizi nucleici). BLACK LIPID MEMBRANES (BLM) BLM plane ce separ dou faze pot fi formate utiliznd o tehnic de injectare. O soluie de lipid corespunztoare este aplicat ntr-o apertur observat printr-un stereomicroscop de joas putere. Apertura este fcut ntr-un septum ce separ dou faze apoase n care pot fi utilizate o varietate de condiii ale fazei apoase: pH, temperatur i compoziie. n scurt timp (de ordinul minutelor) are loc un drenaj rapid al excesului de lipid n vas i apar culori strlucitoare de interferen. Subsecvent apar suprafee negre din punct de vedere optic i acestea devin confluente. n multe cazuri ele implic cea mai mare parte a suprafeei membranare. Avantajele sistemului BLM constau n potenialul lor de a realiza caracterizri electrice precise ale membranelor i ale mecanismelor de membran. Schimbri foarte mici (subtile) n capacitana electric i conductivitatea membranei pot fi determinate cu precizie. Aplicarea unui potenial electric variabil specific de-a lungul unei membrane date permite identificarea efectelor care pot fi asociate cu natura ncrcrii electrice a gradienilor ionici de concentraie. Gradienii tranzitorii, n

potenial i curent sunt uor de aplicat i analizat. Stabilirea unor compleci tranzitorii donor-acceptor la interfaa ap-membran i analiza unor caracteristici electrice (Ulrich i Kuhn, 1972), reprezint un potenial instrument n descifrarea reaciilor analoage potenialului receptor primar. ntre trsturile caracteristice unice ale sistemelor BLM distingem caracteristicile fizice care permit analizarea efectelor fluxurilor chimice i fizice a gradienilor ntr-o membran specific. Msurtorile efectuate (Jain 1972) au demonstrat c anumite propieti fizice i chimice ale BLM sunt analoage bistraturilor lipidice biologice. Exist diferene semnificative n conductivitate, permeabilitate specific i n alte proprieti. Aceste diferene sunt parial explicate de faptul c membranele biologice conin proteine i o distribuie specific de componente lipidice. Dezavantajul major al BLM ca model pentru membrane biologice l reprezint o caracteristic a metodei de formare a filmului lipidic. Componentele lipidice care vor trebui s devin o parte din membran sunt dizolvate ntr-un solvent corespunztor cum ar fi cloroform sau metanol. Msurtori experimentale au artat faptul c i n cazul formrii celor mai extinse arii bistrat, cantiti semnificative de solvent rmn nc n membran (Pagano, 1972). Acesta reprezint efectul principal al BLM. Compoziia exact a membranei n orice experiment nu este cunoscut cu precizie i relaia dintre compoziia membranei format n soluie i a compoziiei propriu-zise a membranei nu este clar. Atunci cnd moleculele de solvent sunt prezente n membran este dificil de descris proprietile specifice ale moleculelor lipidului. Problemele majore ale BLM sunt n legtur cu stabilitatea reproductibilitii cu perioade lungi de timp, prezena solvenilor n bistrat i aria suprafeei mic pentru a msura rata difuziei i a reaciilor chimice n general. Aceste dezavantaje pot fi nlturate n marea lor parte prin utilizarea lipozomilor i pot fi suplinite prin realizarea practic i studierea experimental a celulelor de tip sandwich i a filmelor subiri de tip Langmuir-Blodgett. Exist de asemenea numeroase studii pe sisteme free-standing i floating. PREPARAREA PROBELOR Celule sandwich S-au preparat probe din acizi grai constitueni sau precursori ai unor componeni de membrane . S-au obinut probe n straturi subiri avnd grosimi

n circa 20-30 m cu acizii grai nesaturati arahidonic, elaidic si linoleic .n acest scop a fost necesar s se prepare mai multe probe experimentale . n vederea efecturii experimentelor s-a ales pentru toate probele o geometrie plan de dispozitiv. Un astfel de dispozitiv conine substana de investigat (acid gras simplu sau n mixtur cu alte substante), delimitat n straturi subiri (de circa 20-24 m) de ctre electrozi semitranspareni (SnO2(Sb)) depui pe plci de sticl cu rol de suport. Pentru realizarea probelor necesare s-a avut n vedere o tehnologie flexibil, n funcie de natura i starea fizic a fiecrei substane la temperatura camerei, care presupune urmtoarea succesiune de operaii: alegerea plcuelor cu rol de suport, tierea i prelucrarea fizic a acestora pentru a le aduce la forma i dimensiunile dorite; realizarea de electrozi semitranspareni pe fiecare pereche de plcue suport; alegerea, decuparea i plasarea corect a distantorului de grosime convenabil, care ncadreaz stratul subire de substana activ (acid gras simplu sau n mixtur ) ntre cele dou plcue suport; umplerea efectiv a probei cu substana necesar de studiat, utilizndu-se procedee convenabile de lucru; nchiderea ermetic a probelor realizate; prinderea comod i sigur a unor contacte care faciliteaz legtura dintre terminale i dispozitivul propri-zis. Cu privire la umplerea efectiv a probei se poate proceda diferit de la un tip de substan la altul. Astfel, de exemplu: pentru o substan n stare lichid, la temperatura camerei umplerea probei se realizeaz prin tragerea direct a acesteia; pentru o substan n stare solid, la temperatura camerei umplerea probei se realizeaz cu granule fine, ce urmeaz a fi aduse n stare lichid pe cale termic; n raport cu grosimea i suprafaa stratului subire de substan util, restul de material suplimentar se ndeprteaz pn se atinge grosimea stabilit. Se studiaz comportarea unor acizi grai care sunt constitueni sau precursori ai unor constitueni din membranele celulare. Referitor la investigarea acestor substane (compui lipidici relativ simpli), ele se pot depune n straturi subiri la suprafaa apei fiind preparate din soluii ale acizilor grai din solveni organici, cum ar fi: eter etilic, eter de petrol, toluen, benzen, cloroform, tertraclorur de carbon cu diferite concentraii. La prepararea unui strat lipidic se poate proceda astfel: n cuve din sticl cu pereii plan-paraleli, avnd la baz un strat de ap cu grosimea de 2-3 mm, se

pipeteaz controlat o cantitate de 1-1,5 ml de soluie care conine acid gras solvent organic. Se obine astfel soluia cu concentraia dorit, n care partea hidrofob a moleculelor se aeaz spre suprafaa liber (avnd aspect caracteristic de cristal lichid), iar partea hidrofil apare ca un sistem de fibre ndreptate spre interfaa cu ap. PROCEDEUL EXPERIMENTAL Studiile cu temperatur se fac n cuptoare de cupru (4C - 150C). La acidul arahidonic care este lichid se merge pn cnd i modific structura. Acizii grai solizi se nclzesc i se face analiza optic n lumin alb. Aceast stare de cristal lichid este studiat n lumin polarizat ntre nicoli ncruciai i se vede doar dac este cristal lichid (mediu anizotrop). Dup ce se clarific starea sistemului (cristal lichid), se determin dependena intensitii curentului prin prob de tensiune aplicat I(U) la T=constant. Se constat c la tensiuni de ordinul volilor sistemului rspunde la fel i modificrile nu mai sunt eseniale.