EXTRACCIN DE ADN

Lic TM Arturo A. Rivas Crdenas

CIDOS NUCLEICOS

Los cidos nucleicos almacenan la informacin gentica de los organismos vivos y son los responsables de la transmisin hereditaria. Gran parte del desarrollo fsico de un organismo a lo largo de su vida esta programado en estas molculas. Las protenas que elaboraran sus clulas y las funciones que realizaran estn todas registradas en esta cinta molecular.

Existen dos tipos: el ADN y el ARN.

EL ADN Es una macromolcula muy larga , filamentosa y formada por desoxirribonucletidos, cada uno de ellos compuesto por una base nitrogenada, un azcar desoxirribosa y un grupo fosfato.

Hay 2 cadenas helicoidales de polinucletidos enrolladas a lo largo de un eje comn.

Estas cadenas permanecen unidas por puentes de hidrogeno entre los pares de bases.

EL ARN
El ARN tiene una sola hebra. La pentosa de los nucletidos constituyentes es ribosa.

Sus cuatro bases son: A, G, C, U.

Es la molcula que dirige las etapas intermedias de la sntesis proteica.

ARNm: Acta como molde y transporta la informacin para la sntesis protena.

TIPOS DE ARN

ARNt: transporta los aminocidos hacia los ribosomas para la sntesis proteica.
ARNr: Recibe la informacin gentica. Traduce las protenas. Se ubica en el ribosoma, organela donde se sintetiza las protenas.

EXTRACCIN DE CIDOS NUCLEICOS

HISTORIA
Dr Friedrich Miescher realiz la primera extraccin de ADN. Esperaba solucionar los principios fundamentales de la vida, para determinar la composicin qumica de las clulas.

1869

Utiliz los leucocitos obtenidos de la pus recogidos en vendajes quirrgicos y obtuvo mediante sus pruebas precipitado crudo de ADN.

La extraccin y purificacin de cidos nucleicos constituye la 1era etapa de la mayora de los estudios de BM as como de todas las tcnicas de recombinacin de ADN .

Permiten obtener Ac. N. purificados a partir de diversas fuentes para utilizar

la PCR en estudios moleculares.

La calidad y pureza de los Ac. N. son 2 de los elementos mas importantes en este tipo de anlisis .

Pueden ser aislados de cualquier material biolgico, tales como tejidos vivos o conservados, clulas, partculas de virus u otras muestras.

En el pasado el proceso de extraccin y purificacin consume tiempo, mano de obra y su rendimiento es limitado.

Actualmente existen muchos mtodos especializados que pueden ser utilizados para extraer biomolculas puras.

Estos mtodos permiten un alto rendimiento de la muestra y la velocidad, exactitud y fiabilidad de la prueba es mxima; y reduce la contaminacin cruzada.

TERMINOLOGA
Es un proceso por el cual tomos, iones o molculas son atrapadas o retenidas en la superficie de un material.

ADSORCIN:

AGENTE CAOTRPICO:

Es una sustancia que desorganiza la estructura tridimensional en macromolculas protenas, ADN o ARN se desnaturaliza.

CTAB (BROMURO DE HEXADECILTRIMETILAM Es una sal de amonio cuaternario ONIO):

LISIS CELULAR:

Es la rotura de la membrana celular.

TERMINOLOGA
Es una denominacin utilizada para referirse a pequeas porciones de material aglomerado o comprimido.

PELLET O PELET

SDS O NADS (DODECILSULFATO SDICO O LAURILSULFATO SDICO)

Es un compuesto tensoactivo inico

TUBOS EPENDORF

Es un tubo de microcentrfuga de forma de un pequeo contenedor cilndrico de plstico, con un fondo cnico y una tapa unida al cuerpo del tubo para evitar su desprendimiento.

Extraccin de DNA

Procedencia Calidad Mtodos Conservacin del DNA

TIPOS DE MUESTRAS
Sangre entera (EDTA) Plasma (EDTA) o suero Clulas aisladas (Mononucleares, en cultivo) Tejidos (Congelar en ntrgeno lquido lo ms rpido posible para evitar la degradacin del RNA o DNA) Lquidos biolgicos Orina o exudado cervical (C. trachomatis o N. gonorrhorae) Lquido amnitico para diagnstico prenatal LCR Lquido pleural para el diagnstico de metstasis cancerosas o enfermedades linfoproliferativas

Muestras de la pared bucal para obtener muestras de DNA

Mdula sea para dx de enf. Linfoproliferativas o la deteccin de metstasis cancerosas.

Esputo para la deteccin de Mycobacterium tuberculosis

Pus estudio de bacterias Tejidos parafinados o fijados. Muestras de sangre en papel Guthrie

CONSERVACIN DE MUESTRAS
Sangre entera Tejidos procesar rpidamente , si no sumergirlo 15- 20s en N lquido y

conservar a 70C hasta la extraccin de DNA. Si no tengo 70, lo corto en

pedacitos pequeos para asegurarme una rpida congelacin Plasma o suero congelar a 70 o 20 en alcuotas Orina estable para C. trachomatis y N. gonorreae por 4 das a 4C y 60 das si se congela

 Exudado cervical - en medio de transporte se conserva igual que orina. Bucal . En general estable a T ambiente, pero es conveniente realizar la extraccin lo antes posible por las bacterias contaminantes Lquido amnitico. Se procesa enseguida. Si no es posible, congelar el pellet celular .

 Mdula sea y lquido pleural. No debe congelarse (x hemo) se puede refrigerar a 4C por < de 72 horas pero lo ideal es procesarla enseguida Esputo guardar a 2-8 C hasta ser procesada pero debe hacerse dentro de las 24 horas de la recoleccin (decontaminacin y concentracin) . Pus, se puede refrigerar o congelar si no tiene hematies. Tejido fijado . Especmen de ltimo recurso.

Extraccin vs Purificacin

Extraccin: sacar los componentes desde un compartimento celular.

Involucra: Lisis de las clulas que contienen a los AN Inactivacin de nucleasas Clarificacin: separacin de los AN de los restos celulares (debris). Purificacin: Separacin de AN: De protenas solubles De otros AN no deseados

De Lpidos, carbohidratos
De sales y otros compuestos orgnicos

EL DILEMA
Aplicaciones que involucran manipulacin de ADN necesitan el estado puro Por qu purificar? 1. Nucleasas que se liberan al lisar las clulas degradan los cidos nuclicos. 2. Interferentes que inhiben a las enzimas que se usan en ingeniera gentica.

El desafo es separar los cidos nuclicos deseados desde una mezcla compleja, manteniendo la integridad de los mismos Contaminantes: Protenas, lpidos y carbohidratos, sales del medio, iones, etc.

Etapas bsicas de un procedimiento general para Extraccin y Purificacin de AN

Disgregacin o fragmentacin del tejido Estas etapas deben ir acompaadas de medidas o agentes que inactiven nucleasas celulares Durante todo el procedimiento se debe usar soluciones y material estril, adems de guantes

Lisis celular Clarificacin Purificacin Anlisis

Cualitativo: Anlisis electroforesis

Cuantitativo: Espectrofotometra UV

MTODOS DE EXTRACCIN DE CIDOS NUCLEICOS

MTODOS CONVENCIONALES
Tiocianato de guanidiniofenolcloroformo Extraccin alcalina

EXTRACCIN EN FASE SLIDA

Matrices de Slica Partculas de vidrio Tierra de Diatomeas Perlas Magnticas Material de intercambio aninico

Mtodo de Extraccin CTAB

Centrifugacin en gradiente de bromuro de etidiocloruro de cesio.

Etapas en la extraccin de ADN

1. Mtodos de fragmentacin y lisis celular para la extraccin de ADN El procedimiento ideal de lisis debe tener la fuerza necesaria para romper el material de inicio (clulas o tejido) y la delicadeza requerida para preservar

las molculas de inters (ADN o ARN).

Mtodos fsicos Homogenizacin mecnica, Homogenizacin en solucin Molienda manual en mortero Bolitas de vidrio Sonicacin

Mtodos qumicos - Detergentes

Mtodos enzimticos Lysozima: rompe enlaces -1.4- entre N-acetil murmico y N-acetil glucosamina de peptidoglicn de la pared celular de bacterias Lyticasa: rompe enlaces -1.3 de glucano de levaduras

Proteasas: rompe enlaces peptdicos de prot. de pared y membrana

plasmtica e interacciones clula-clula.

Las sales caotrpicas ayudan a romper la estructura tridimensional de

macromolculas como las protenas o los cidos nucleicos consiguiendo su

desnaturalizacin.

La adicin de un detergente como el SDS es necesaria a menudo para eliminar las membranas.

2. Degradacin de la fraccin proteica asociada al ADN.

Se consigue mediante la adicin de una proteasa. La fraccin proteica puede precipitarse mejor con la ayuda de sales como

el acetato de amonio o el acetato sdico.

3. Purificacin.

Consta de 3 fases:
Precipitacin del ADN. El ADN es insoluble en alcohol, por lo que se puede precipitar etanol fro o isopropanol y recuperar mediante una centrifugacin. El alcohol del sobrenadante se llevar las sales aadidas previamente.

 Lavado del pellet. Se realiza con alcohol fro volviendo a centrifugarse

Recuperacin. El sedimento se puede resuspender en agua o tampn Tris tras ser secado completamente.

La confirmacin de la presencia de ADN se lleva a cabo mediante electroforesis en un gel de agarosa, posterior tincin con bromuro de etidio y observacin con luz UV o directamente al espectrofotmetro mediante espectro de absorcin de 200 a 350 nm.

El ADN purificado se puede cuantificar con un espectrofluormetro mediante el uso de fluorforos especficos (Picogreen, Molecular Probes)

El paso 3 puede realizarse con la ayuda de minicolumnas equipadas con una

membrana de slica que retiene especficamente el ADN permitiendo el paso de las molculas y sales que acompaan la reaccin de lisis.

Finalmente se lava con alcohol y se eluye el contenido

Inhibidor Sales biliares Polisacridos complejos Colgeno Grupo hemo Melanina y eumelanina Mioglobina Heces

Origen Heces, material vegetal Tejidos Sangre Pelo, piel Tejido muscular

Proteinasas
Iones de calcio Urea Hemoglobina, Lactoferrina

Leche
Leche, huesos Orina Sangre

Inmunoglobina G (IgG)

Sangre

EXTRACCIN DE CIDOS NUCLEICOS POR MTODOS CONVENCIONALES

LOS PASOS GENERALES PARA LA EXTRACCIN Y PURIFICACIN DE ADN

EXTRACCIN: Lisis de las clulas que contienen a los AN Inactivacin de nucleasas Clarificacin: separacin de los AN de los restos celulares
PURIFICACIN: De otros AN no deseados De Lpidos, carbohidratos De sales y otros compuestos orgnicos

LISIS CELULAR
El procedimiento ideal de lisis celular debe tener la fuerza necesaria para romper el material de inicio (clulas o tejido) y la delicadez requerida para preservar las molculas de inters (ADN o ARN).

MTODOS DE FRAGMENTACIN Y LISIS PARA LA EXTRACCIN DE ACIDOS NUCLICOS

MTODOS MECNICOS

MTODOS NO MECNICOS

- MOLIENDA MANUAL EN MORTERO - CONGELACIN/DESCONGELACIN - ULTRASONIDO

- AGENTES QUMICOS Detergentes: CTAB , SDS

ENZIMTICOS - Proteasas: lisozima Gluconasas peptidasas - ARNasa

MTODOS CONVENCIONALES

1.- EXTRACCIN CON TIOCIANATO DE GUANIDINO FENOL CLOROFORMO (MTODO DE CHOMCZYNSKI):

Fundamento del mtodo: Extraccin de cidos nucleicos utilizando una solucin del agente caotrpico de Tiocianato de Guanidino que genera lisis celular y degradacin de protenas con la liberacin de los cidos nucleicos.

Posteriormente el uso de solventes orgnicos fenol- cloroformo que permiten su separacin de restos de protenas, lpidos y la posterior precipitacin de los cidos nuclicos usando etanol o isopropanol.

EXTRACCIN DE ADN CON SOLUCIN DE CHONCZYNSKI

Muestra
PULVERIZAR EN EL MORTERO

- LISIS DE MEM. CELULAR Y NUCLEAR - DEGRADACIN DE PROTENAS E INACTIVACIN DE ENDONUCLEASAS.

SOLUCIN DE TIOCIANATO DE GUANIDINO A pH BSICO < 11

CENTRIFUGA

FENOL CLOROFORMO

FASE ACUOSA
ADN , RESTOS DE PROTENAS Y LIPIDOS

ADN SUSPENSIN PROTENAS Y LPIDOS DISUELTOS

CENTRIFUGA

FASE SLIDA
RESTOS DE ALTO PESO MOLECULAR

ALCOHOL ETLICO PURO

CENTRIFUGA ADN EN FORMA DE FILAMENTOS PELLET DE ADN

EXTRACCIN DE ARN CON SOLUCIN DE CHONCZYNSKI

Homogenizado de muestra pulveriza previamente y conservada en nitrgeno lquido a -196C

SOLUCIN DE TIOCIANATO DE GUANIDINO A pH REDUCIDO ACETATO DE SODIO FENOL CLOROFORMO

CENTRIFUGACIN A 4C
ALCOHOL ISOPROPLICO

FASE ACUOSA
ARN TOTAL

FASE ACUOSA

FASE ORGNICA
ADN, PROTENAS Y
LIPIDOS DISUELTOS

PELLET DE ARN TOTAL

ARN TOTAL

2.- EXTRACCIN DE ADN PLASMDICO POR LISIS ALCALINA

Fundamento del mtodo: Se basa en las diferencias en la desnaturalizacin y renaturalizacin del ADN plasmdico y el ADN cromosmico al aplicar NaOH en presencia de un detergente fuertemente aninico como el Dodesilsulfato de Sodio (SDS) y Acetato de potasio. Se usa principalmente para extraccin de ADN plasmdico de E. coli.

EXTRACCIN DE ADN PLASMDICO POR LISIS ALCALINA

Crecimiento de Cultivo bacteriano de E. coli Cosecha de cultivo bacteriano Detergente SDS + NaOH
pH FUERTEMENTE ALCALINO DEL MEDIO pH NEUTRO DEL MEDIO

-Lisis celular -Desnaturaliza Protenas ADN cromosmico ADN plasmdico

Acetato de potasio

CENTRIFUGAMOS

-ADN plasmdico se mantiene en solucin

-Precipitacin: ADN cromosmico. protenas .

3.- MTODO DE EXTRACCIN CTAB

- Elaborado por Murray y Thompson en 1980. - Adecuado para extraer y purificar ADN de vegetales y especialmente indicado para eliminar los polisacridos y los compuestos polifenlicos que daaran al ADN.
Fundamento del mtodo:
Las clulas vegetales pueden lisarse con el detergente inico bromuro de cetiltrimetil amonio (CTAB), que forma un complejo insoluble con los cidos nucleicos en medio hiposalino. De ese modo, los polisacridos, los compuestos fenlicos y los dems

contaminantes permanecen en el sobrenadante y pueden eliminarse por lavado.

PASOS:
1.- Se debe moler la muestra despus de congelacin con Nitrgeno lquido 2.- Suspender la muestra en solucin tampn de extraccin, que contiene EDTA, Tris-HCl y CTAB.

3.-Centrifugo, elimino el sobrenadante y lavo.

ADN puro

5.-Aado etanol y ARNasa

4.- Incrementando la concentracin salina

EL CTAB CAPTURA LOS LPIDOS QUE INTEGRAN LA MEMBRANA CELULAR Y NUCLEAR

EL CTAB EN MEDIO HIPOSALINO FORMA UN COMPLEJO INSOLUBLE CON LOS CIDOS NUCLEICOS.

4.- CENTRIFUGACIN EN GRADIENTE DE BrEt - CsCl

- Tcnica usada para la Mini preparacin de ADN plasmdico .

- Requiere de cultivo bacterial a gran escala.

- Separa ADN plasmdico superenrrollado

del ADN plasmdico circular que est en estado relajado, concentrndolos por
Superenrrolado: Covalentemente cerrado y muy empacado. DNA circular. DNA que no se ha empacado.

centrifugacin
(BrEt CsCl.)

en

una

gradiente

de

Bromuro de Etidio Cloruro de Cesio

CENTRIFUGACIN EN GRADIENTE DE BrEt - CsCl

Fundamento del mtodo: El BrEt ingresa y se intercala en la cadena de ADN disminuyendo su densidad, pero lo hace en mayor cantidad en el ADN plasmdico en estado relajado que en el ADN plasmdico superenrrollado, pudindose separar por centrifugacin en el gradiente de densidad de CsCl.

CENTRIFUGACIN EN GRADIENTE DE BrEt - CsCl

GRADIENTES DE CLORURO DE CESIO + BROMURO DE ETIDIO

EL ADN SE SEDIMENTA FORMANDO UNA CAPA EN LA POSICIN DEL TUBO EN LA CUAL LA DENSIDAD DE LA SOLUCIN DE CsCl ES IGUAL A LA DEL ADN.

CENTRIFUGACIN EN GRADIENTE DE BrEt - CsCl

GRADIENTE DE DENSIDAD DE CsCl sin BrEt

GRADIENTE DE DENSIDAD DE CsCl y BrEt

GRADIENTE DE CENTRIFUGACIN CON BrEt - CsCl

EXTRACCIN DE CIDO NUCLEICO EN FASE SLIDA Logra una purificacin rpida y eficiente comparada con los mtodos convencionales. Los sistemas de Fase Slida absorbern los cidos nucleicos en el proceso de extraccin dependiendo del pH y contenido de sales del buffer.

La interaccin de los puentes de hidrgeno con una matriz hidroflica bajo condiciones caotrpicas

El proceso de absorcin est basado en los siguientes principios

Intercambio inico bajo condiciones acuosas por medio de un intercambio aninico

y mecanismos tamao.

de exclusin por afinidad y

PASOS PARA LA EXTRACCIN EN FASE SLIDA

1. se acondiciona la columna para la absorcin de la muestra. Esto puede ser hecho usando un tampn a un pH definido 2. Luego, convierte la superficie o grupos funcionales en el solido es decir en una forma particular de qumica
3. El cido nucleico deseado se absorber a la columna con la ayuda de un alto pH y concentracin de sal de la solucin enlazadora. 4. La muestra que fue degradada mediante el uso de solucin amortiguadora se aplica a la columna

5. Luego los cidos nucleicos se eluyen con un tampn de mxima salinidad

6. se precipita con isopropanol para lavar y eliminar todos los restos de impurezas

7. finalmente, se reconstituye el ADN de elevada pureza en un tampn de baja salinidad para su posterior utilizacin o almacenamiento

Gel de agarosa involucrado en el uso de sales caotrpicas facilitan el enlazamiento de ADN a vidrio comn de slice.
La absorcin de cido nucleico es el sustrato de vidrio ocurre debido al mecanismo y principio similar al de cromatografa de adsorcin.

Esta invencin ha descubierto que una mezcla de gel slice y partculas de vidrio puede ser usada para separar cido nucleico de otras sustancias en la presencia de soluciones de sales caotrpicas.

TIERRA DE DIATOMEAS (DIATOMITA)

Es una roca sedimentaria silcea formada por micro-fsiles de diatomeas, algas marinas unicelulares que secretan un esqueleto silceo llamado frstula.

Baja densidad. Alta porosidad. Dureza . Capacidad abrasiva suave. Conductividad trmica muy baja. Alta resistencia a la temperatura. Capacidad muy alta para absorber lquidos.

Filtro-ayuda

PRINCIPALES USOS

Porosidad y Poder Absorbente

Purificacin de ADN
La diatomita puede ser utilizado para la retirada del DNA en presencia del agente caotrpico altamente concentrado tal como el ioduro de sodio, guanidinium hydrochloride y guanidinium thiocyanate.

DIATOMITA

Quitan el DNA trenzada doble pero no el ARN o las protenas.

La diatomita tiene contenido de slice hasta en un 94%. Ha sido usado para filtracin y en cromatografas.

La diatomita resultante enlazada con el ADN es luego lavado con un tampn que contiene alcohol.

Este es luego dejado de lado y el ADN es eludo en un tampn bajo en sal o en agua destilada.

PURIFICACIN DE CIDO NUCLEICO BASADO EN PARTCULAS MAGNTICAS

La separacin magntica es una manera simple y eficiente el cual es utilizado actualmente en la purificacin de cido nucleicos.

Se utilizan transportadores magnticos.

Preparados

A partir de biopolmeros.

Materiales con una gran rea superficial , son preferidos para ser usados en la adherencia de cidos nucleicos.

Polmeros sinttico Vidrio poroso Basado en materiales magnticos inorgnicos

XIDO DE HIERRO

xido de hierro (II, III) u xido ferroso frrico (Fe3O4).

Magnetita

Los momentos magnticos de los distintos cationes de hierro del sistema se encuentran fuertemente acoplados.

Esta molculas van actuar como un imn.

Purificacin de cido nucleico basado en partculas magnticas

Uso de perlas magnticas cuya superficie tiene una carga que se puede cambiar basndose en el pH o tampn. A pH bajo, cargados positivamente, atraen a las molculas de ADN con carga negativa, permitiendo que las Prot y los contaminantes se eliminen mediante lavado.

Purificacin de cidos nucleicos en base a:microesferas magnticas . El cido nucleico es luego eludo de las partculas magnticas con un tampn de elucin.

Extraccin Fenol-Cloroformo: ADN y/o ARN

MUESTRA + Fenol equilibrado:Cloroformo (1:1) desproteiniza e inhibe nucleasas PH: reducido

FASE ACUOSA: ARN

FASE ORGANICA: ADN Y PROTEINAS

El ADN y las proteinas pueden ser aislada de la fase orgnica por precipitacin con etanol o isopropanol . ARN precipito a partir de la fase acuosa con isopropanol.

Sistema de extraccin automatica

Es un Sistema de instrumentacin muy grande, complejo y costoso, diseado para un alto volumen de procesamiento de muestras. El hecho de automatizar el proceso de extraccin de cidos nucleicos es beneficioso para una serie de razones: MagNA Pure LC 2.0

Reduce el tiempo de trabajo.

Disminuye los costos laborales.

Aumenta la seguridad de los trabajadores Aumenta la reproducibilidad calidad de los resultados. Sobre todo minimiza el riesgo de contaminacin cruzada.

sistema de manipulacin de partcula paramagntica para procesar la muestra y proporcionar un rendimiento constante y pureza ya que no hay detectable contaminacin cruzada, entre las muestras
El proceso de extraccin completo dura unos 20 minutos desde el comienzo hasta el final

Oprimir el botn de Inicio. El ADN es eludo en un tampn de elucin al final del proceso

Colocar el cartucho del reactivo dentro de la mquina.

Aadir la muestra lquida al cartucho del reactivo.

SE DAN POR TRES PASOS SENCILLOS

Magna pure

Pequeo tamao basado en el uso de partculas magnticas. El cido nucleico obtenido es altamente puro Ausencia de contaminacin cruzada mediante

filtros Hepa.
Descontaminacin por rayos uv Demora Mximo de 30 minutos

Es posible trabajar con un amplio rango de

muestras (sangre total, suero, plasma, tejidos, clulas en cultivo, etc.),

Roche Applied Science trabaja en el desarrollo de sistemas de alta tecnologa para aplicacin en Genmica y Protemica

MagNA Pure LC 2.0

Permite hasta 32 aislamientos de cidos nucleicos

(DNA, RNA, , mrna y cidos nucleicos totales)

Muestras (tejidos, sangre, suero, clulas perifricas mononucleadas, clulas blancas, tejidos vegetales Realiza labores de pre-pcr en distintos formatos

1 Unidad inicio

2 Unidad procesamiento

Unidad de elucin y post-elucin

La automatizacin ha ayudado en el aumento del rendimiento y mejora la fiabilidad del proceso

Por lo tanto las estaciones de trabajo robtico para extraccin de cidos nucleicos deben cumplir con una verdadera Walk-away , automatizacin, lo que significa un proceso totalmente automatizado

un sistema porttil de extraccin , ofrece varias ventajas , tales como la mano de obra reducida, reduccin de los residuos y aumento de la velocidad

conclusiones
Permiten adquirir mejores resultados

Cantidad de aplicaciones bioqumicas como son:

relaciones de parentesco, detectar enfermedades hereditarias conocer genes de una persona, clonacin, etc. Automatizacin de cido nucleico , Potencialmente beneficioso: Reducir el tiempo de trabajo, la mano de obra, costos Aumento de seguridad de los trabajadores Oportunidad en la reproducibilidad y la calidad de los resultados