MODULO 1 FERRAME TAS DE GE TICA MOLECULAR: MA IPULAO DO D A

1.1. Composio Qumica e Estrutura do D A: Nas molculas de DNA os componentes so: acar (desoxirribose), bases nitrogenadas (Purinas: adenina e guanina/ Pirimidinas: timina e citosina) e grupo fosfato. As bases nitrogenadas ligam-se ao carbono 1 do acar, por ligao covalente. Um acar mais uma base ligada a ele constituem um nucleosdeo. Um nucleosdeo com um grupamento fosfato ligado ao seu carbono 5` constitui um nucleotdeo, que a unidade bsica de repetio dos cidos nuclicos. Para a formao da molcula de DNA necessrio que ocorra a ligao entre os nucleotdeos. Os nucleotdeos esto ligados covalentemente por ligaes fosfodister formando entre si pontes de fosfato (figura). O grupo hidroxila do carbono-3 da pentose de um nucleotdeo se liga ao grupo fosfato ligado ao carbono-5 da pentose do nucleotdeo adjacente atravs de uma ligao fosfodister. Devido a esta formao a cadeia de DNA fica com uma direo determinada, isto , em uma extremidade temos livre a hidroxila do carbono-5 da primeira pentose e na outra temos livre a hidroxila do carbono-3 da ltima pentose. Isto determina que o crescimento do DNA se faa na direo de 5' para 3'

Visualizao da ligao fosfodister entre os nucleotdeos de uma molcula de DNA.

A molcula do DNA formada pela unio de duas cadeias helicoidais, enroladas ao longo de um mesmo eixo, formando uma dupla hlice. As duas fitas de DNA esto em direo opostas, ou seja, uma das fitas tem a direo exata da sua sntese (5' 3') enquanto que a outra est invertida (3'5'). Com base na estrutura de dupla hlice do DNA e nas caractersticas de hidrofobicidade das molculas, a estrutura do DNA fica da seguinte forma: O grupo fosfato e o acar (parte hidroflica) - esto localizados na parte externa da molcula. As bases nitrogenadas (parte hidrofbica) - esto localizadas na parte interna da molcula.

O pareamento das bases de cada fita se d de maneira padronizada, sempre uma purina com uma pirimidina, especificamente: adenina com timina e citosina com guanina. A proximidade destas bases possibilita a formao de pontes de hidrognio, sendo que adenina forma duas pontes de hidrognio com a timina e a citosina forma trs pontes com a guanina. A dupla hlice mantida unida por duas foras: Por pontes de hidrognio formadas pelas bases complementares Por interaes hidrofbicas, que foram as bases a se "esconderem" dentro da dupla hlice.

1.2. Propriedades do D A: 1.2.1. Desnaturao do D A: Em temperaturas elevadas, as estruturas tridimensionais tanto das protenas quanto dos cidos nucleicos so rompidas. Uma macromolcula em um estado rompido, no qual sua conformao praticamente aleatria, dita DESNATURADA; o estado ordenado, que supostamente o originalmente presente na natureza, chamado de NATIVO. Uma transio do estado nativo para o desnaturado chamada de DESNATURAO. Quando uma dupla hlice de DNA ou DNA nativo aquecida, as focas das ligaes dentro dos filamentos e entre eles so rompidas, e os dois filamentos podem se separar. Assim, o DNA desnaturado unifilamentar. A desnaturao do DNA pode ser detectada atravs da observao do aumento da habilidade de uma soluo de DNA em absorver a luz ultravioleta, no comprimento de onda de 260nm. Uma medida-padro de tal absoro a proporo logartmica de luz transmitida e luz incidente chamada de ABSORBNCIA A; em 260nm, isto escrito A260. As bases dos cidos nucleicos absorvem fortemente luz 260nm, e a quantidade de luz absorvida por um determinado nmero de bases depende de sua proximidade uma da outra. Quando as bases ao altamente ordenadas (muito prximas umas das outras), como no DNA bifilamentar, A260 menor que a para o estado menos ordenado no DNA unifilamentar. Em particular, se uma soluo de DNA bifilamentar tem um valor de A260 = 1,00; uma soluo de DNA unifilamentar na mesma concentrao tem um valor de A260 = 1,37. Esta relao geralmente descrita, dizendo que uma soluo de DNA bifilamentar torna-se HIPERCRMICA quando aquecida. O valor correspondente para bases livres 1,60, de modo que a absorbncia tambm pode ser utilizada para medir a degradao dos cidos nucleicos. Se uma soluo de DNA lentamente aquecida, e A260 medida em vrias temperaturas, obtida uma curva de dissociao. Nesta curva possvel verificar diferentes estgios: (1) Antes que a subida comece, a molcula totalmente bifilamentar; (2) Na regio da subida, os pares de bases de vrios segmentos da molcula so rompidos. Este nmero varia gradualmente; (3) Na parte inicial do plat superior, alguns pares de bases ainda permanecem unidos at que uma temperatura critica seja atingida, na qual o ltimo par de bases se rompe e os dois filamentos se separam completamente. Durante a dissociao toas as ligaes covalentes, incluindo as fosfodister, permanecem intactas. Apenas as pontes de hidrognio e as interaes de empilhamento so rompidas. Um parmetro conveniente para caracterizar uma transio de dissociao a temperatura na qual a subida de A260 a metade completa. Esta temperatura chamada de TEMPERATURA DE DISSOCIAO; designada como Tm. Um grande nmero de informaes obtido observando como a Tm varia com a composio de bases e condies experimentais. Por exemplo, foi observado que a TM aumenta com a porcentagem de G + C, que foi interpretada em termos do maior nmero de pontes de hidrognio em um par G-C (trs) do que um par A-T (duas). Isto , necessria uma temperatura mais alta (mais energia) para romper uma dupla C-G do que uma A-T, porque a estrutura da dupla hlice est estabilizada, pelo menos em parte, por pontes de hidrognio. 1.2.2. Renaturao do D A: Uma soluo de DNA desnaturado pode ser tratada de tal modo que o DNA nativo reconstitudo. Este processo chamado de RENATURAO ou REELICOIDIZAO, e o DNA reconstitudo chamado de DNA RENATURADO. Aps a desnaturao, a soluo de DNA composta de uma mistura de filamentos essencialmente unifilamentares. Para se renaturar, o fragmento deve encontrar seu parceiro complementar na soluo. Se as concentraes do fragmento e de seu parceiro complementar na soluo forem baixas, eles levaram muito mais tempo para se encontrar um com o outro do que se os fragmentos estiverem em altas concentraes. A renaturao pode ser acompanhada observando a absorbncia da soluo a 260nm, pois durante a renaturao as bases se organizam e a A260 ir diminuir como tempo. A velocidade de diminuio a taxa de renaturao, que est relacionada concentrao de fragmentos individuais na soluo (Co). Isto significa que o DNA resfriado sofre renaturao, mas a freqncia de reassociao depende no apenas do tempo (t) mas tambm da concentrao inicial (Co) de uma dada seqncia (Cot). O valor de A260 na soluo pode ser usado para avaliar a concentrao geral de DNA. A cintica de renaturao oferece um instrumento poderoso para a anlise da presena de seqncias repetidas em uma amostra. O resultado desta anlise permite avaliar qualitativamente a soluo de DNA, ou seja, a presena de vrias seqncias de DNA: (1) seqncia de cpia nica (levam mais tempo para renaturar); (2) levemente repetidas (1 a 10 cpias); (3) medianamente repetidas (10 a vrias centenas de cpias); e (4) altamente repetitivas (vrias centenas a vrios milhes de cpias).

1. 2.3.Hidrlise de cidos uclicos: Uma variedade de enzimas chamadas de NUCLEASES hidrolisa os cidos nuclicos. Elas em geral apresentam especificidade qumica e so classificadas como desoxirribonucleases (DNAse) ou ribonucleases (RNAses). Alm disso, as nucleases que atuam apenas na ponta de um cido nuclico, removendo um s nucleotdeo por vez, so chamadas de EXONUCLEASES, e tambm podem ser especficas para as pontas 3` ou 5`do filamento. A maioria das nucleases atua dentro do filamento e so denominadas de ENDONULCEASES; algumas delas so ainda mais especficas, pois cortam apenas entre determinadas bases.

1.3. Tipos de D A: DNA cpia nica referem-se a seqncias de DNA que so encontradas apenas uma vez (ou possivelmente poucas vezes) no genoma. O DNA de cpia nica compreende cerca de 45% do genoma, e inclui os genes que codificam protenas. Entretanto, o DNA que codifica protena representa apenas uma pequena proporo de todo o DNA de cpia nica, a maior parte do qual encontrado em ntrons ou em seqncias de DNA situadas entre os genes. DNA repetitivo 55% do genoma consistem em DNA repetitivo, que so seqncias que aparecem de modo repetido no genoma. Existem duas classes principais de DNA repetitivo: o DNA repetitivo disperso (45% do genoma) tendem a estar espalhadas individualmente por todo o genoma; elas no ocorrem em tandem. Uma caracterstica marcante das seqncias LINE e SINE, que algumas delas podem gerar cpias de si mesmas, as quais podem ento ser inseridas em outras partes do genoma. Essa insero pode, algumas vezes, interromper um gene codificante de uma protena, causando um distrbio gentico. Elementos intercalantes curtos ou SINEs variam em tamanho de 90 a 500pb. Um dos tipos mais importantes de SINEs denominado repetio Alu. Essas unidades repetitivas, que medem ~300pb, contm uma seqncia de DNA que pode ser cortada pela enzima de restrio Alu. Elementos intercalantes longos ou LINEs variam em tamanho em at 7.000pb. o DNA satlite (10% do genoma) apresentam-se agrupadas em certos locais do cromossomo, onde ocorrem em tandem (isto , o comeo de uma repetio encontra-se imediatamente adjacente ao final da outra). O DNA minissatlite e microssatlite so de especial interesse para a gentica humana porque variam em comprimento entre os indivduos, o que os torna extremamente teis para o mapeamento gnico. DNA -satlite repeties em tandem de uma seqncia de 171pb ou mais, situadas prximo aos centrmeros. DNA minissatlites repeties em tandem de uma seqncia de 4 a 500pb. DNA microssatlite repeties em tandem de seqncias com 2-4pb de comprimento.

1.4. Replicao do D A: Durante o processo de sntese do DNA (replicao do DNA), as duas fitas de DNA de cada cromossomo so desenroladas pela enzima helicase, e cada uma deles dirige a sntese de uma fita complementar a si. Disso resultam dois dplices de DNA filhos, cada um dos quais idntico molcula parental. Como cada dplice filho contem uma fita da molcula parental e outra recm-sintetizada a partir dele, diz-se que o processo de replicao semiconservativo. A enzima DNA polimerase catalisa a sntese de novas fitas de DNA usando os quatro desoxinucleotdeos trifosfatados (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) como precursores de nucleotdeos. A replicao do DNA inicia em pontos especficos, que so denominados origens de replicao. Iniciando em uma dessas origens, o comeo da replicao do DNA resulta em uma forquilha de replicao em que o duplex de DNA parental se bifurca em dois novos dplices-filho. Como as duas fitas do duplex parental de DNA possuem polaridades opostas, mas agem individualmente como moldes para a sntese de uma fita-filha antiparalela complementar, as duas fitas-filhas tambm devem ter direes opostas (i.e., a direo do crescimento da cadeia tem de ser 5 3 para uma das fitasfilhas, a fita lder; e 3 5 para a outra fita-filha, a fita de crescimento lento). As reaes catalisadas pela DNA polimerase incluem a adio de substrato de dNMP, fornecido pelo dNTP precursor (os dois resduos distais de fosfatos do dNTP (resduos e ) so clivados e descartados), ao grupamento livre hidroxila 3da cadeia de DNA crescente. Esse requisito introduz uma assimetria no processo de replicao do DNA: somente a fita lder possuir o grupamento 3-OH livre no ponto de bifurcao. Isso lhe permitir uma adio continuada de nucleotdeos e um alongamento contnuo na mesma direo em que a forquilha de replicao se move. A sntese da fita descontnua, porm precisa ser realizado por meio de uma srie progressiva de pequenos fragmentos (100 a 1.000 nucleotdeos de comprimento), denominados fragmento de Okazaki. Uma vez que s a fita-lder sintetizada de forma contnua, diz-se que a sntese das fitas de DNA semidescontnua. Cada fragmento da fita atrasada sintetizado na direo 5 3, que oposta direo em que se move a forquilha de replicao> As extremidades dos fragmentos, que so sintetizados em sucesso, ligam-se covalentemente, sendo que a enzima DNA-ligase garante o crescimento da cadeia na mesma direo do movimento da forquilha de replicao. Nos cromossomos de mamferos, a replicao do DNA bidirecional, formando-se bolhas de replicao a partir dos mltiplos pontos de iniciao. A distncia entre origens de replicao adjacentes de cerca de 50 a 300kb. O incio da replicao do DNA, na fase S do ciclo celular, d-se em momentos diferentes nas diversas origens, mas, eventualmente, bolhas de replicao adjacentes podem fundir-se.
Enzimologia da replicao do DNA Incio da Replicao (Primossoma): o Topoisomerase (DNA girase > desenrola o DNA) o Helicase (separa as fitas do DNA) o SSBP (ptn que se liga ao DNA fita simples e serve para estabiliz-lo) o RNA Primase (faz primer com ~30 nucleotdeos) Alongamento - Replissoma (sntese no sentido 5>3): o PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) liga-se as DNAs polimerases; o DNA polimerase - DNA polymerase - sntese e iniciao da fita atrasada - DNA polimerase - reparo do DNA - DNA polimerase - sntese da fita lder e atividade 3> 5 exonuclease - DNA polimerase - reparo do DNA e atividade 3> 5 exonuclease Nucleotdios (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) Fita de crescimento contnuo no sentido (5> 3) Fita de crescimento lento no sentido 3> 5 Fragm. de Okazaki. Trmino: o Nucleases reparadoras retiram os seguimentos de primer; o DNA polimerase b - reparo no DNA e preenchimento de brechas o DNA ligase une trechos de DNA; o Telomerase sntese dos telmeros.

o o o

1.5. Ferramentas da Gentica Molecular Humana para Triagem de Mutaes: Um dos principais objetivos da gentica molecular humana moderna caracterizar as variaes polimorficas envolvidas com o desenvolvimento de doenas genticas, para compreender o modo pelo qual estas mutaes afetam a sade e utilizar esta informao para melhorar o seu diagnstico e

tratamento. Os avanos na nossa compreenso da gentica molecular levaram ao desenvolvimento de tecnologias, que possibilitam uma anlise detalhada tanto dos estados normal e anormal dos genes quanto da expresso de milhares de genes nos estados normal e patolgico.

1.5.1. Hibridizao em Southern Blot: Nesta aplicao, o DNA genmico fragmentado utilizando-se enzimas de restrio e os fragmentos so separados por eletroforese em gel de agarose de alta resoluo. Posteriormente os fragmentos de DNA so transferidos a uma membrana de nylon e hibridizados com sondas marcadas que contem seqncias complementares ao loco gnico a ser estudado. Os fragmentos hibridizados so identificados por autorradiografia ou outro sistema de deteco. As aplicaes desta tcnica so: (1) deteco direta de mutaes pontuais patognicas por mapeamento de restrio; (3) deteco de RFLP convencionais; (3) deteco de VNTR; (4) deteco de delees/inseres gnicas por mapeamento de restrio.

1.5.2. Eletroforese em Gel com Gradiente de Desnaturao (DGGE): A triagem de mutaes por DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) um mtodo no qual a dupla fita de DNA submetida eletroforese em gel de poliacrilamida em que utiliza um gradiente de agente desnaturante (uria ou formamida) ou de temperatura. Nestas condies, ocorre a separao das molculas de DNA de acordo com sua temperatura de desnaturao ou Tm, em segmentos denominados domnios. A dissociao das fitas de DNA em tais domnios resulta em diminuio da mobilidade eletrofortica. A diferena de 1 par de bases entre as fitas de DNA (homoduplex) pode alterar a temperatura de desnaturao em 1 C ou mais. A falta de complementaridade de bases entre as fitas de DNA (heteroduplex) leva a significante desestabilizao desses domnios, resultando em diferenas na Tm entre homo e heteroduplex acima de 6 C. Por esta razo, heteroduplex formadas entre fragmentos de alelos comuns e mutantes so geralmente utilizados para a triagem de mutaes de ponto. Para deteco no DGGE, os produtos da PCR so marcados com substncias radioativas. Atualmente, esse sistema foi substitudo por colorao dos produtos com brometo de etdeo ou nitrato de prata. O tamanho do produto da PCR submetido ao DGGE de aproximadamente 1000 pares de bases. Com o aumento do nmero de domnios, a mobilidade diminui, por isto, a frao de mutaes detectadas diminui com o aumento do tamanho do fragmento.

1.5.3. Polimorfismo de Conformao de Fita Simples (SSCP): O SSCP (Single-Strand Conformation Polymorphism) um mtodo de triagem de mutaes que permite detectar alteraes na mobilidade eletrofortica de fitas simples de cidos nuclicos em condies no-desnaturantes. As fitas simples de cidos nuclicos formam estruturas secundrias em soluo que dependem da composio/seqncia de bases e do tamanho da fita simples. Mudana em uma base na seqncia do cido nuclico amplificado pela PCR pode ser detectada por SSCP. Os perfis de SSCP podem ser detectados por autorradiografia marcando-se os produtos da PCR com substncias radiativas. Atualmente so utilizados os sistemas de deteco por colorao dos gis de eletroforese com nitrato de prata. As mutaes detectadas por SSCP devem ser confirmadas por sequenciamento de DNA. A sensibilidade de deteco de mutaes por SSCP maior quando os tamanhos dos produtos da PCR so de 150 a 200 pb, e em condies timas, 80 a 90% de mutaes so detectveis.

1.5.4. Polimorfismo de Tamanhos de fragmentos de Restrio (RFLP): O RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphysm) um mtodo que utiliza enzimas de restrio para deteco de polimorfismos genticos. As enzimas de restrio reconhecem stios especficos na seqncia do DNA que clivada somente quando o stio est presente, gerando fragmentos de vrios tamanhos que so separados e analisados por eletroforese. Quando as mutaes ou polimorfismos no esto presentes em stios de restrio, podem ser criados stios artificiais utilizando-se oligonucleotdeos modificados na PCR. Esta estratgia denominada mutagenese sitio-dirigida mediada pela PCR. Os fragmentos gerados no RFLP podem ser detectados por eletroforese e transferncia de DNA como o Southern blot. No caso da PCR-RFLP, os fragmentos so separados por eletroforese em gel de agarose ou acrilamida e detectados diretamente pela colorao com brometo de etdeo ou outro corante fluorescente como o SYBR Green ou ainda por colorao com nitrato de prata. A especificidade do mtodo de 100% quando a enzima de restrio apropriada utilizada. Para o controle de qualidade, amostras de DNA contendo alelos mutantes e comuns devem ser includos na anlise.

1.5.5. mero Varivel de Repeties em Tandem (V TR): Os VNTRs, um enfoque similar ao usados para os RFLPs convencionais, visa explorar os minissatlites existentes no genoma. O DNA digerido com uma enzima de restrio, e os fragmentos so submetidos a eletroforese. A diferena principal que sondas especiais so usadas para se hibridizar apenas com uma determinada regio de minissatlite. Enquanto que os RFLPs revelam polimorfismos devido a presena ou ausncia de um stio de restrio, os VNTRs revelam polimorfismos devido a nmeros diferentes de repeties situadas entre dois stios de restrio. O numero destas repeties pode variar consideravelmente nas populaes: uma regio de minissatlite pode ter apenas duas ou trs repeties, ou at 20 ou mais. Do mesmo modo que as regies de minissatlites podem variar de tamanho, os microssatlites tambm podem variar em comprimento como resultado de nmeros diferentes de repeties. Cada repetio de microssatlite substancialmente menor que uma repetio de minissatlite (2-4pb). Elas so chamadas de repeties de dinucleotdeos, trinucleotdeos e tetranucleotdeos, respectivamente. Uma repetio de microssatlite pode ocorrer em tandem at vrias centenas de vezes, e este nmero varia consideravelmente entre as pessoas. Estes polimorfismos de repetio de minissatlites diferem dos VNTRs em termos de seus tamanhos, e tambm porque no so definidos por stios de restrio que flanqueiam a regio de repetio. A tcnica de PCR usada para isol-las.

1.5.6. PCR-HRM (melt de alta resoluo): A anlise de melt de alta resoluo (HRM) um aprimoramento das antigas anlises de dissociao de DNA (ou melting). Este tipo de anlise usado para caracterizao de amostras de DNA de acordo com seus comportamentos de dissociao durante sua transio de DNA dupla fita para DNA fita simples com o aumento da temperatura (Figura).

Fundamentos de um grfico de HRM tpico. A curva de melt (verde) ultrapassa a transio entre alta fluorescncia da fase inicial (pr-melt) atravs da fase de melt (melt phase) para nveis de baixa fluorescncia at a basal da fase ps-melt. A fluorescncia diminui medida que o corante intercalante liberado do DNA duplafita enquanto este se dissocia em fitas simples. O ponto central da fase de melt, no qual a proporo de mudana de fluorescncia maior, define a temperatura de melting (TM) de um determinado fragmento de DNA em estudo.

Antes de realizar uma anlise de HRM, uma seqncia alvo deve ser amplificada por meio de PCR na presena de um corante intercalante a DNA dupla fita. O corante no interage com DNA fita simples mas se intercala ativamente ao sulco menor do DNA e fluoresce fortemente quando assim ligado.Essa mudana na fluorescncia pode ser usada primeiramente para medir o aumento da concentrao do DNA durante a fase de amplificao pr-HRM e depois sim, para medir a dissociao do DNA induzida por temperatura (HRM).Inicialmente a fluorescncia alta em uma anlise de melt

porque o DNA est na forma de dupla hlice, entretanto, essa comea a decair a medida que a temperatura aumentada e o DNA se dissocia em fitas simples. O comportamento de melting observado caracterstico de cada amostra de DNA em particular. O mtodo de PCR-HRM pode ser usado para: detectar variaes de base nica tais como SNPs (single nucleotide polymorhphisms) ou descobrir mutaes genticas desconhecidas, identificar genes candidatos de pr-disposio, estudos de associao (comparando casos e controles, gentipo fentipo), determinao de prevalncia de alelos dentro de uma populao ou grupo, anlises de metilao de DNA, entre outros.

1.5.7. Arranjos de D A por PCR em Tempo Real: As anlises das atividades gnicas e a identificao de mutaes e polimorfismos so realizadas de forma sistematizada usando o princpio da hibridizao de DNA. As seqncias de genes que contem mutaes conhecidas so fixadas na matriz de vidro (sondas de captura). Produtos da PCR so gerados utilizando-se iniciadores especficos marcados com fluorforos. A seguir os produtos da PCR so hibridizados com as sondas capturadas na matriz de vidro e os arranjos de sinais fluorescentes so medidos utilizando-se um sistema ultra-rpido de deteco de fluorescncia e a intensidade de cada ponto determinada. A localizao do ponto associado com a sua intensidade determina a seqncia e a quantidade de material presente na amostra. Estes dados so processados por programas sofisticados de computadores que possibilitaro a anlise refinada dos resultados. A possibilidade de se colocar milhares de seqncias em uma nica lmina de arranjo possibilita a obteno de informaes do genoma inteiro em um nico ensaio, identificando milhes mutaes e polimorfismos simultaneamente. Comercialmente j esto disponveis, em bioships, conjuntos de polimorfismos e ou mutaes para fins de estudos farmacogenticos do sistema citocromo P450 para cada grupo de frmacos potencialmente importantes, assim como para diagnstico de alteraes genticas de utilidade teraputica na clinica mdica.

1.5.8. Sequenciamento do D A pelo mtodo dideoxi ou enzimtico: O mtodo dideoxi para sequenciamento de DNA baseado na sntese in vitro de uma fita de DNA complementar, realizado na presena dos dideoxinucleotdeos trifosfatos, derivados dos deoxinucleotdeos trifosfatos normais que no tm o grupo hidroxil 3. O protocolo bsico consiste em sintetizar in vitro molculas de DNA a partir de uma mistura contendo: (1) molculas de fitas simples do DNA a ser seqenciado; (2) a enzima DNA polimerase; (3) um iniciador curto de DNA, que permite que a DNA polimerase inicie a sintese de DNA, e (4) os quatro deoxinucleotdeos trifosfatos (dATP, dTTP, dGTP, dCTP). Se um dideoxinucleotdeo (ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP) tambm est presente na reao de sequenciamento, ele pode ser incorporado em uma cadeia crescente de DNA. Como esta cadeia agora no tem o grupo OH 3, a adio do prximo nucleotdeo bloqueada, e a cadeia de DNA termina neste ponto. O ddNTP compete com o excesso de dNTP presente no tubo de reao, de maneira que o ddNTP incorporado de maneira aleatria , em uma fita de DNA crescente. Essa mistura ir produzir, eventualmente, um conjunto de DNAs de diferentes comprimentos, complementares ao DNA-molde que est sendo seqenciado e terminando em cada um dos seus diferentes ddNTPs. O comprimento exato dos produtos de sntese de DNA pode ser utilizado para determinar a posio de cada um dos quatro tipos de nucleotdeos na cadeia crescente. Para determinar a seqncia completa de um fragmento de DNA, o DNA fita dupla primeiramente separado em fita simples, e uma das fitas utilizada como molde para o sequenciamento. Quatro ddNTPs so utilizados em quatro reaes de sntese de DNA separadas com cpias da mesma fita simples de DNA molde. Cada reao produz um conjunto de cpias de DNA que terminaram em pontos diferentes na seqncia. Os produtos dessas quatro reaes so separados por eletroforese em quatro canaletas paralelas de um gel de poliacrilamida. Os novos fragmentos sintetizados so detectados por um marcador (radioativo ou fluorescente) que foi incorporado no iniciador ou em um dos deoxinucleotdeos trifosfatos utilizados para estender a cadeia de DNA. Em cada canaleta, as bandas representam os fragmentos que foram terminados em um dado nucleotdeo, mas em diferentes posies no DNA. Fazendo a leitura das bandas em ordem, iniciando no final do gel e trabalhando atravs de todas as canaletas at o topo, a seqncia de DNA da nova fita sintetizada poder ser determinada. A seqncia idntica da fita 5-3da molcula de DNA fita dupla original. Sequenciamento Automtico do D A O sequenciamento automtico utiliza o princpio bsico do mtodo de Sanger e seus ddNTPs terminais de reao. O maior avano relacionado ao sequenciamento automtico a utilizao do laser e programas de computadores especficos que permitem a deteco e identificao dos vrios fragmentos de DNA que so produzidos. Alm disso, cada ddNTP marcado com uma molcula fluorescente, que quando excitada pelo laser, emite uma fluorescncia em comprimentos de onda especfico para cada uma das quatro bases. Dessa forma, no h a necessidade de fazer quatro reaes independentes para cada fragmento de DNA a ser seqenciado, uma vez que cada ddNTPs emite fluorescncia com comprimento de onda especfico, os quatro ddNTPs podem ser misturados na mesma reao e o sequenciador detecta o sinal que analisado por programas especficos de bioinformtica resultando na seqncia de DNA.

MDULO 2 - EXPRESSO E REGULAO DA EXPRESSO G ICA: MA IPULAO DE R A E PROTE AS

2.1. Estrutura e Tipos de R A: O RNA uma molcula unifilamentar formada por ribose, grupo fosfato e quatro tipos de bases nitrogenadas. Os diferentes tipos de molculas de RNA, existentes no interior da clula, podem ser agrupados de acordo com a sua funo: RNA transportador (tRNA): molcula responsvel por transportar aminocidos, dispersos no citosol, para o ribossomo. Cada molcula de tRNA apresenta uma extremidade que se liga a diferentes tipos de aminocidos e uma regio com uma seqncia de trs nucleotdeos, o anticdon, que pode parear com um dos cdons do RNAm; RNA ribossomal (rRNA): molculas, que juntamente com protenas ribossmicas, formam as sub-unidades ribossomais; RNA mensageiro (mRNA): molcula responsvel por levar a informao gentica contida no DNA para ser traduzida em protena; RNA nuclear de pequeno tamanho (snRNA): atuam no processamento do mRNA; Micro RNA (miRNA): VERIFICAR A SUA FU O

2.2. Transcrio do R A: 2.2.1. Dogma Central: De modo geral, em todas as clulas, a expresso da informao gentica um sistema de uma via: o DNA especifica a sntese do RNA e o RNA especifica a sntese de polipeptdios que, subseqentemente, formam as protenas. Por sua universalidade, o fluxo DNARNAPTN da informao gentica descrito como DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR. O primeiro passo, a sntese de RNA, por meio de uma RNApolimerase dependente de DNA, descrito como TRANSCRIO e ocorre no ncleo das clulas eucariticas. O segundo passo, a sntese de polipeptdios, descrito como TRADUO e ocorre nos ribossomos. Embora o DNA seja o material hereditrio de todas as clulas atuais, muito provvel que, nos primrdios da evoluo, o RNA tenha exercido tal funo. As molculas de RNA podem auto replicarem-se, como as do DNA. Porm, o grupo hidroxila, presente no carbono 2 da ribose, torna as ligaes fosfodister acar-fosfato instveis, enquanto que no DNA, este mesmo carbono s apresenta ligaes com tomos de hidrognio. Desse modo, o DNA muito mais adequado do que o RNA como portador estvel da informao gentica. Entretanto, muitas classes virais possuem o RNA como molcula da hereditariedade, no lugar do DNA. Nestes casos, o RNA replica-se por meio de um DNA intermedirio, usando uma transcriptase reversa (DNA polimerase dependente de RNA). Recentemente, tornou-se claro que as clulas de mamferos contem seqncias de DNA cromossmicos no-viral que codificam transcriptases reversas celulares. Sabendo-se que algumas seqncias de RNA no-viral funcionam como molde para a sntese de DNA celular, o princpio do fluxo unidirecional da informao gentica no mais estritamente vlido. 2.2.2. Unidades de Transcrio: Somente uma pequena poro do DNA transcrita (unidades de transcrio ou genes). Entretanto, a maior parte do DNA jamais transcrita, em qualquer clula. Esta parte no transcrita composta principalmente por pseudogenes, DNA repetitivo e seqncias regulatrias. Alm de o genoma humano possuir uma pequena poro de unidades de transcrio, apenas uma pequena poro deste total traduzida em ptn, isto porque: (1) grande parte dos RNA no do tipo mensageiro (mRNA); (2) os transcritos primrios sofrem reduo em seu tamanho, durante o seu processamento; e (3) apenas uma parte central do mRNA maduro traduzida, isto porque as suas terminaes no so traduzidas. 2.2.3. Transcrio: A sntese de RNA executada pela RNA polimerase, tendo o DNA como molde. O RNA sintetizado como fita nica, e a direo da transcrio 5 3`. O alongamento da cadeia feito pela adio de resduos de AMP, GMP, UMP e CMP ao grupamento hidroxila 3livre na extremidade 3da cadeia crescente de RNA. Esses nucleotdeos resultam da eliminao de um resduo de pirofosfato (PPi) do trinfosfato ribonucleosdeo (rNTP) precursor apropriado. Isso significa que o nucleotdeo localizado na ponta 5` (ribonucleotdeo iniciador) diferente dos demais devido a presena do grupamento trifosfato 5`. Para a transcrio, somente uma das fitas do DNA utilizada como molde para a sntese de RNA. Neste caso, a fita-molde denominada de fita antesenso, enquanto que a outra (no-molde) chamada de fita senso. Ao documentar seqncias gnicas, costume apresentar apenas a fita senso. Geralmente, a orientao das seqncias em relao a uma seqncia gnica ditada pela fita senso e pela direo da transcrio (p. ex., a extremidade 5de um gene refere-se as seqncias localizadas na extremidade 5de sua fita seno, e as seqncias a montante ou a jusante de um gene referem-se a seqncias que flanqueiam esse gene, respectivamente, pela extremidade 5 e pela extremidade 3de sua fita senso). Nas clulas eucariticas, so necessrias trs molculas diferentes de RNA polimerase para sintetizar os vrios tipos de RNA: RNA polimerase I: atua somente na transcrio do rRNA 45S; RNA polimerase II: atua na sntese de mRNA e da maioria dos genes de snRNA; RNA polimerase III: atua na sntese de tRNA, 5S rRNA. 2.2.4. Fatores de Transcrio: As RNAs polimerases no possuem autonomia para iniciar a transcrio. Para que este processo se realize necessrio que a combinao de elementos de curta seqncia (fatores cis-atuantes [tabela]), adjacentes ao gene, atue como sinais de reconhecimento para que os fatores de transcrio (fatores trans-atuantes) possam ligar-se ao DNA para guiar e ativar a RNA polimerase. Freqentemente, este conjunto de seqncias curtas fica agrupado a montante da seqncia codificadora de um gene, constituindo coletivamente, o promotor. Depois que vrios fatores comuns de transcrio se ligam a regio promotora, uma RNA polimerase se une ao complexo dos fatores de transcrio e ento ativada para iniciar a sntese de RNA a partir de um nico ponto.
Tabela 2: Caractersticas dos Elementos Cis-atuantes Elementos Cis Comentrios CG box Situado a -200pb a montante do gene. TATA box Situado a -25pb a montante do gene. Pouco freqente, inclusive nos promotores de genes de manuteno. CAAT box Localizado a 80pb do incio da transcrio. o maior determinante da eficincia do promotor. Alm do promotor, existem outros elementos cis que atuam potencializando a transcrio (acentuadores ou enhancers) ou inibindo-a (silencidores). Ambos so elementos regulatrios, porm esto situados bem distantes dos pontos de incio da transcrio.

2.2.5 Expresso Tecido-Especfica: A expresso gnica tecido-especfica envolve a ativao seletiva de genes especficos (denominados: genes com expresso tecido-especfica). Alm deste grupo, observa-se que um nmero razovel de genes que esto ativos em toda e qualquer clula. Tais genes so essenciais para a manuteno das atividades gerais da clula, e por isso so denominados de GENES DE MANUTENO. Parte dos genes para mRNA TECIDO-ESPECFICO, enquanto que todos os genes de rRNA, tRNA e alguns de mRNA so genes de manuteno. A distino entre as regies do DNA de uma clula que esto transcrevendo e as que esto inativas reflete-se na estrutura da cromatina. A cromatina inativa apresenta uma conformao altamente condensada e frequentemente relacionada s regies do genoma que sofrem replicao tardia, durante

a fase S do ciclo celular. O DNA ativo na transcrio, por sua vez, apresenta uma conformao mais aberta e costuma replicar-se logo no incio da fase S. Ele se caracteriza por uma ligao relativamente fraca com as molculas de histonas H1 e pela ampla acetilao dos quatro tipos de histonas que compem o nucleossomo. Alm disso, na cromatina ativa, as regies promotoras no costumam apresentar metilaes.

2.3. Processamento do R A: O transcrito de RNA da maioria dos genes eucariticos sofre uma srie de reaes de processamento. Freqentemente, isso envolve a remoo de segmentos internos indesejveis e a reunio de segmentos remanescentes (encadeamento do RNA). No caso de transcritos resultantes da RNA polimerase II, um nucleotdeo especializado (trifosfato 7 metilguanosina) ligado a extremidade 5`do transcrito primrio (Capeamento), 2.3.1. Encadeamento: (Obs: no mR A, este evento s ocorre aps a adio das extremidades 5`e 3`modificadas) As seqncias codificadores da maioria dos genes, tanto dos que codificam polipeptdeos quanto os que codificam outras molculas de RNA, so divididas em seguimentos codificadores (os exons), que so separados por seqncias intercalantes no-codificadoras (os introns). A transcrio consiste na produo de uma seqncia de RNA complementar ao comprimento total do gene, abrangendo exons e introns. Freqentemente, entretanto, o transcrito de RNA sofre o encadeamento do RNA, uma srie de reaes de processamento atravs das quais os introns so removidos e descartados enquanto que os exons so unidos ponta com ponta (encadeamento) para obter-se como produto um RNA mais maduro. O mecanismo de encadeamento do RNA dependente da identidade das seqncias de nucleotdeos nos limites exon/intron (juno de encadeamento). Ele particularmente sensvel ao que tem sido denominado de regra GU-AG: os introns quase sempre comeam com GU e terminam com AG. Embora os dinucleotdeos conservados GU e AG sejam de importncia crucial para o encadeamento, eles no so suficientes para indicar a presena dos introns. Atualmente, sabe-se que as seqncias adjacentes aos dinucleotdeos GT e AG so consideravelmente conservadas. Alm disso, h uma terceira seqncia conservada nos introns que funcionalmente importante para o encadeamento. o chamado stio de ramificao, quase sempre localizado perto do final do intron, mais de 40 nucleotdeos entre o dinucleotdeo terminal AG.

RNA splicing involves endonucleolytic cleavage and removal of intronic RNA segments and splicing of exonic RNA segments

O mecanismo de encadeamento segue nesta ordem: (1) clivagem na juno de cadeia 5`; (2) ataque nucleoltico G terminal do stio doador de encadeamento, a fim de formar uma estrutura em forma de lao; (3) clivagem na juno 3`, com liberao do intron sob a forma de lao e o encadeamento dos exons. Essas reaes tambm podem ser mediadas por complexos de RNA e de protenas, o ENCADEOSSOMO, que consiste de cinco tipos de snRNA (U1,U2, U4, U5, U6) e de mais de 50 tipos de protenas. Neste processo, cada molcula de snRNA liga-se a uma protena especfica, formando partculas de snRNP (ribonucleoproteinas de pequeno tamanho), e cuja especificidade da reao de encadeamento estabelecida por complementaridade de bases entre o transcrito e as molculas de snRNA. O terminal 5do snRNA U1 tem uma seqncia que pareia com a seqncia consenso do stio doador de encadeamento. Depois que snRNP U1 se ligou, o snRNA U2 reconhece o stio de ramificao por complementaridade de bases e, logo aps a interao entre os snRNP U1 e U2 aproxima as duas extremidades que sero unidas. Em seguida, uma partcula com mltiplos snRNP, contendo snRNAs U4, U5 e U6, associam-se com o complexo U1-U2.

Mechanism of RNA splicing (GU-AG introns). (A) Mechanism. The nucleophilic attack involves the 2-hydroxyl group attached to the conserved A at the branch site and the G of the conserved GU at the start of the intron, and results in a new covalent bond linking these two nucleotides to give a branched structure (lariat). (B) Role of snRNPs. Small nuclear ribonucleoprotein particles (snRNPs) are part of the spliceosome. U1 snRNA has a terminal sequence complementary to the splice donor consensus and binds to it by R A-R A base pairing. After the U1 snRNP has bound, U2 snRNA recognizes the branch site by a similar base-pairing reaction. Interaction between the splice donor and splice acceptor junctions is stabilized by subsequent binding of a preformed multi-snRNP particle, containing U4, U5 and U6 snRNAs, with the U5 snRNP able to bind simultaneously to both splice donor and splice acceptor.
Quadro 2.1: Grupos e fases de introns Grupos de Introns Introns de encadeossomos - So introns tradicionais; - Possuem seqncias conservadas que servem para a indicar as suas extremidades (stios de encadeamento 5e 3`) e o stio de ramificao. Introns de Grupos I e II - Possuem estruturas secundrias que permite catalisar a sua remoo; - Esto presentes nos transcritos de rRNA e tRNA; - Podem atuar como elementos mveis. Fases dos Introns ( posio em que o intron interrompe os exons)

Intron de Fase 0 : Interrompem a seqncia codificadora entre codons adjacentes. Intron de Fase 1: Interrompem um cdon entre a primeira e a segunda base. Intron de Fase 2: Interrompem um cdon entre a segunda e a terceira base.

2.3.2. Capeamento do mR A: Este evento que ocorre durante a transcrio, no qual adiciona-se um nucleosdeo metilado (7 metilguanosina) ao primeiro nucleotdeo 5 transcrito. A enzima guaniltransferase a responsvel pela unio entre esses dois nucleotdeos atravs de uma ligao fosfodister especial 5`-5`. Assim como os mRNAs, os snRNAs tambm so capeados, mas suas capas podem sofrer outras modificaes. Supe-se que as funes da capa sejam: (1) facilitar o encadeamento; (2) facilitar o transporte no ncleo para o citoplasma; (3) proteger o transcrito do ataque de exonucleases 5` 3`; (4) auxiliar no encaixe da subunidade 40S ribossmica ao mRNA. 2.3.3. Poliadenilao do mR A: Os genes transcritos pela RNA-polimerase II no apresentam stios de termino de transcrio, sendo assim, a polimerase transcreve at perder afinidade pelo DNA. Posteriormente, uma endonuclease reconhece o stio AAUAAA e corta a jusante deste ponto. Por fim, a enzima poli(A)polimerase adiciona cerca de 200 resduos de adenilato (AMP), para formar uma cauda poli(A). Supe-se que essa cauda tenha vrias funes, tais como: (1) facilitar o transporte do mRNA para o citoplasma; (2) maior durabilidade a molcula; (3) facilitar a traduo, ao permitir uma intensificao do reconhecimento do mRNA pela maquinaria ribossmica. As excees a esta regra so os mRNAs de histonas e snRNAs, que no sofrem adio de cauda poli(A).

2.4. Traduo do mR A: Para a traduo, somente o segmento central do mRNA determina a seqncia de aminocidos do polipeptdio a ser transcrito. As seqncias adjacentes, isto , a regio no-traduzida 5`-P e no-traduzida 3-OH auxiliam a ligar e estabilizar o mRNA nos ribossomos, onde ocorre a traduo do segmento central. 2.4.1. Ribossomos: Os ribossomos so grandes complexos de RNA e protenas compostos por duas subunidades. Nos eucariotos, os ribossomos citoplasmticos contm duas unidades: a subunidade maior de 60S (formada por cerca de 50 protenas ribossmicas e rRNAs 28S, 5,8S e 5S), e a subunidade menor de 40S (formada por 30 protenas ribossmicas e rRNA 18S). O gene do rRNA 45S policistrnico, pois um nico transcrito possui a informao gentica para trs tipos de rRNA. Aps a transcrio o pr-rRNA sofre metilao nas regies referentes aos rRNAs 18S, 5,8S e 28S. Estas marcaes auxiliam na determinao das seqncias iniciais e terminais de cada rRNA. Aps a adio desta marcao, os introns (Classe I ou II) catalisam a sua prpria remoo.

Processamento do pr-transcrito de rRNA. 2.4.2. Traduo: O incio da traduo marcado pelo reconhecimento pela subunidade ribossmica 40S ao cap 5`, por intermdio de suas protenas que se ligam especificamente a ela. Ento a subunidade 40S percorre o mRNA at encontrar o cdon de iniciao, que quase sempre o AUG (os codons alternativos para a iniciao so: ACG, GUG e CUG). Geralmente, mas nem sempre o primeiro AUG encontrado ser o codon de iniciao. Porm, o AUG s ser eficientemente reconhecido como tal se estiver inserido na seqncia GCCPurinaCCAUGG. Os determinantes mais importantes nesta seqncia so o G, logo aps o cdon AUG, e a purina (preferencialmente a adenina) no terceiro nucleotdeo anterior a ele. A seguir, sucessivos aminocidos so incorporados cadeia polipeptdica crescente por reaes de condensao: o grupo amino do aminocido, situado no stio A, reage com o grupamento carboxlico do aminocido presente no stio P. A catlise dessa reao feita enzima peptidil-transferase, situada na subunidade maior. A traduo ocorre no sentido 5` 3` e continua at o complexo ribossmico encontrar um dos trs codons de parada (UAA, UAG, UGA). Por isso, o arcabouo do produto primrio da traduo ter uma metionina com um grupamento amino livre em uma extremidade (a terminao N) e um aminocido com um grupamento carboxila livre na outra extremidade (a C-termial).

2.5. Controle da Expresso Gnica: O principal nvel de controle da expresso gnica o inicio da transcrio. Entretanto, vrios mecanismos reguladores so necessrios para manter os diferentes tipos de expresso gnicas nos nveis temporal (estgios de desenvolvimento, estgios de diferenciao, estgios do ciclo celular, expresso induzvel) e espacial (padro rgo/tecido). Embora simplista, conveniente considerar-se trs amplos nveis nos quais a regulao gnica pode operar: (1) Regulao da expresso gnica simultnea a transcrio a regulao pode ocorrer por meio da regio promotora central de um gene, em nvel de recrutamento e processabilidade da RNA-polimerase relacionada; (2) Regulao da expresso gnica posterior a transcrio esta categoria inclui mecanismos que operam em nvel do processamento do RNA (encadeamento e adio das extremidades 5e 3), transporte do mRNA, traduo, estabilidade do mRNA, processamento e sinalizao da ptn, estabilidade da ptn, etc; (3) Mecanismos epigenticos de controle a longo alcance da expresso gnica. 2.5.1. Controle da Expresso Gnica em vel de Transcrio: Fatores de Transcrio trans-atuantes: Os fatores de transcrio so protenas que reconhecem seqncias especficas na regio de controle do gene (promotor), permitindo assim a chegada da RNA-polimerase. As protenas que participam do processo de transcrio de todos os genes estruturais, e so chamadas de FATORES GERAIS DE TRANSCRIO (RNA-pol I TFI; RNA-pol II TFII; e RNA-pol III TFIII). Outras chamadas de FATORES ESPECFICOS DE TRANSCRIO tm funes mais especficas, ativando apenas alguns genes em determinados estgios do desenvolvimento. Os fatores de transcrio reconhecem e liga-se a seqncias curtas de nucleotdeos, normalmente como resultado de uma complementaridade extensa entre a superfcie da protena e as caractersticas das hlices do DNA. Os fatores de transcrio apresentam duas caractersticas que so essenciais para o seu funcionamento adequado: (1) DOMNIO DE ATIVAO estimula a transcrio atravs da interao com outros fatores de transcrio, bem como na formao do complexo transcricional; (2) DOMNIO DE LIGAO AO DNA permite a ligao especfica do fator de transcrio aos seus genes-alvo. Os principais so: dedo de zinco, hlice-volta-hlice, hlice-giro-hlice e zper de leucina. Seqncias reguladoras cis-atuantes (silenciadores e reforadores): O complexo formado pela polimerase e pelos fatores gerais de transcrio conhecido como o aparato de transcrio basal; ele contm tudo o que necessrio para iniciar a transcrio. Os genes que so constitutivamente expressos em uma taxa mnima, determinada pela regio promotora central a menos que a taxa de transcrio seja elevada ou desligada por elementos reguladores positivos (reforadores) ou negativos (silenciadores) adicionais. Em geral, estes elementos esto situados a alguma distncia da regio promotora. Alguns genes que codificam polipeptdeos so genes de manuteno, mas ao contrrio dos produtos dos genes transcritos pelas RNAs polimerases I e III, a grande porcentagem dos genes transcritos pela RNA pol II demonstra possuir modelos de expresso tecido-restrito ou tecido-

especfico. Uma vez que o DNA de diferentes clulas nucleadas de um indivduo essencialmente idntico, a identidade de uma clula definida pelas protenas produzidas por ela. Alm dos fatores gerais de transcrio, portanto, os fatores de transcrio tecido-especficos ou tecido-restritos regulam a expresso de muitos genes que codificam polipeptdeos, pelo reconhecimento e pela ligao especfica de elementos de seqncia cisatuantes. A especificidade de tecido e a especificidade do estgio de desenvolvimento so, freqentemente, conferidas pelas seqncias reforadoras e silenciadoras as quais so reconhecidas por fatores de transcrio tecido-especficos. Alm de promover ativamente a transcrio tecidoespecfica (reforadores), alguns elementos cis-atuantes, denominados de silenciadores, conferem especificidade de tecido ou estgio de desenvolvimento pelo bloqueio da expresso em todos os tecidos, exceto no tecido desejado. Regulao da transcrio em resposta a estmulos externos: Sinais ambientais, tais como as concentraes extracelulares de certos ons e pequenas molculas nutrientes, temperatura, choque, etc., podem resultar na alterao dramtica do padro da expresso gnica nas clulas expostas a mudanas nesses parmetros. Nestes casos, o controle da transcrio ocorre da seguinte forma: um fator de transcrio, previamente inativo, ativado especificamente pela rota de sinalizao e, depois, liga-se subseqentemente, a seqncias reguladoras especficas, localizadas nos promotores dos genes-alvo, ativando, por meio disso, a transcrio desses genes. No caso da transcrio regulada por molculas sinalizadoras ou seus intermedirios, tais seqncias reguladoras so freqentemente referidas como ELEMENTOS DE RESPOSTA. Transcrio alternativa: Vrios genes humanos possuem dois ou mais promotores alternativos, que podem resultar em diferentes isoformas, com diferentes propriedades. As isoformas podem proporcionar: (1) especificidade de tecido; (2) especificidade do estgio de desenvolvimento; e (3) localizao subcelular diferente.

2.5.2. Controle da Expresso Gnica em vel de Ps-Transcrio: Controle da traduo em resposta a estmulos externos: Seqncias cis-atuantes presentes na regio 5`UTR de alguns mRNAs contm um elemento de resposta (stio) que reconhecida por uma protena de ligao a seqncia cis-atuante, potencializando assim a traduo. Controle da traduo durante o desenvolvimento inicial: Aps a fertilizao de um ocito humano, nenhum mRNA inicialmente produzido, at o estgio de 4 a 8 clulas, quando a transcrio zigtica ativada. Antes desse perodo, as funes celulares so especificadas pelo mRNA materno, que foi previamente sintetizado durante a oognese. Uma variedade de mRNAs armazenada nos ocitos em uma forma inativa, caracterizada por apresentar caudas de poli(A). Tais mRNAs foram previamente submetidos a desadenilao, e ascaudas do poli(A) resultantes significam que eles no podem ser traduzidos. Subseqentemente, na fertilizao ou, mais tarde, no desenvolvimento, as espcies de mRNAs inativas armazenadas podem ser ativadas pela poliadenilao citoplasmtica, que restaura o tamanho normal das caudas poli(A). A poliadenilao citoplasmtica parece utilizar o mesmo tipo de atividade da poli(A)-polimerase. No entanto, alm do sinal AAUAAA, o mRNA necessita possuir um elemento de poliadenilao citoplasmtico a montante, rico em uracilas. Encadeamento Alternativo: Uma frao representativa dos genes humanos sofre encadeamento alternativo, pelo quais deferentes combinaes de exons so includas em transcritos a partir do mesmo gene, durante o processamento do RNA. O encadeamento alternativo resulta em uma diversidade considervel nas regies no traduzidas, bem como isoformas (que so tecido-especficas). As diferentes isoformas podem fornecer uma variedade de possibilidades de propriedades funcionais alteradas, mas o conhecimento detalhado da significncia funcional das diferentes isoformas ainda escasso. Poliadenilao Alternativa: Em muitos genes, dois ou mais sinais de poliadenilao foram encontrados na regio 3`-UTR, e os transcritos alternativamente poliadenilados podem apresentar especificidade de tecido; em outros casos, sinais de poliadenilao alternativos podem ser produzidos aps o encadeamento alternativo. Edio do mR A: Este um mecanismo de processamento posterior a transcrio, que pode envolver a insero ou a deleo ou substituio de nucleotdeos a mediada por enzimas. Os efeitos das edies so variados, podendo gerar: stop cdon prematuro tecido-especfico, mutaes de sentido trocado entre outras.

2.5.3. Mecanismos Epigenticos de Controle da Expresso Gnica: Metilao e Compactao do D A: No DNA de vertebrados, a seqncia CpG um sinal para metilao por uma DNA metil-transferase citosina-especfica, que adiciona um grupo metil no carbono 5da citosina. A 5-metilcitosina resultante quimicamente instvel e est sujeita desaminao, resultando em timina. Durante longos perodos de tempo evolucionrio, o nmero de dinucleotdeos CpG no DNA de vertebrados tem diminudo gradativamente, devido a lenta, porem constante converso de CpG em TpG (e CpA na fita complementar). Genes associados a ilhas CpG incluem todos os genes de manuteno e genes que so amplamente expressos de uma maneira tecido-especfica. As ilhas CpG associadas com stios de iniciao da transcrio de genes cuja expresso restrita a certos tecidos no so metiladas, nesses tecidos, mas so metiladas nos tecidos onde os genes so expressos. No entanto, as ilhas CpG localizadas a jusante do stio de iniciao da transcrio podem ser metiladas em tecidos onde o gene expresso. Outro mecanismo, alm da metilao, atua na represso da expresso gnica. Este mecanismo o grau de compactao da cromatina. As acetiltransferases especficas de histonas adicionam grupamento acetil aos resduos de lisina prximos regio N-teminal de histonas. Os terminais N-acetilados formam, ento, caudas que se projetam a partir do centro do nucleossomo. Imagina-se que, como as histonas acetiladas possuem uma afinidade reduzida pelo DNA, e possivelmente uma pela outra, a cromatina pode ser capaz de adotar uma estrutura mais aberta, que est mais apropriada para a expresso gnica. A desacetilao das histonas, no entanto, promove a represso da expresso gnica, presumidamente devido ao fato da cromatina tornar-se mais condensada. Mudanas na estrutura da cromatina tm um papel importante no controle da expresso gnica. A cromatina existe sob duas formas, EUCROMATINA (pouco compactada) e HETEROCROMATINA (fortemente condensada). A eucromatina transcricionalmente ativa, e replica-se cedo na fase S do ciclo celular. A heterocromatina transcricionalmente inativa e replica-se tardiamente na fase S do ciclo celular. Pr-programao genmica (Imprinting): A pr-programao baseia-se na inativao aleatria (independente da origem parental) ou no (dependente da origem parental) do alelo materno ou paterno de certos genes biallicos. O mecanismo de pr-programao ainda no est totalmente elucidado, entretanto especula-se que alguns mecanismos moleculares sejam capazes de distinguir entre alelos patri- e matrilinearmente herdados. Este mecanismo deve ocorrer da seguinte maneira: a medida que os cromossomos passam atravs das linhagens germinativas do macho e da fmea, eles devem adquirir alguma pr-programao para sinalizar uma diferena entre alelos paternos e maternos, no organismo em desenvolvimento. Um componentechave, ao menos na manuteno do status de pr-programao, a metilao do DNA, alelo-especfica.

A pr-programao uma propriedade de um nmero limitado de genes ou de uma pequena regio cromossmica. Atualmente, so conhecidos no genoma humano mais de 30 genes pr-programados, sendo os dois principais: regio de 1Mb em 11p15 que contm ao menos 7 genes; um grupamento de 2,5Mb na regio 15q11-q13 tambm contm ao menos sete genes. A grande maioria dos genes pr-programados conhecidos autossmica. No entanto, o gene XIST, que possui papel importante na inativao do cromossomo X, pode ser considerado um exemplo de um gene pr-programado ligado ao X, uma vez que a expresso do alelo matrilinearmente herdado preferencialmente reprimida no trofoblasto. Nas demais clulas, esse mecanismo aleatrio.

2.5.4. Regulao da Atividade das Protenas: A regulao da atividade da protena compreende principalmente 3 tipos de processos: (1) translocaes de protenas em diferentes compartimentos celulares; (2) as interaes protena-protena; e (3) as modificaes enzimticas reversveis ou irreversveis. Estas funes aparentemente diferentes so intimamente relacionadas umas com as outras. A translocao subcelular de polipeptdeos recm-sintetizados ocorre por dois caminhos principais. Na via citoslica, toda a protena traduzida no citoplasma (traduo livre de membrana). Subseqentemente, o produto enviado para uma organela ou fica no citoplasma. A captao por organelas mais provavelmente ocorre por receptores especficos de organelas que reconhecem seqncias peptdicas curtas (peptdeo sinal). As protenas que ficam residindo no citoplasma ficam l porque no contm o peptdeo sinal. A segunda via atravs do retculo endoplasmtico. A deciso por este caminho tomada durante a traduo. Uma protena destinada a esta via geralmente contm uma seqncia de sinal hidrofobia com o seu N-terminal. Esta seqncia de sinal reconhecida pela partcula de reconhecimento do peptdeo sinal (SRP), um complexo protena-RNA, que por sua vez ancora o polissomo aos receptores SRP da membrana do retculo. Durante a continuidade da traduo (agora ligada a membrana), o polipeptdeo recm-sintetizado translocado para a luz do retculo. As protenas so ou completamente secretadas na luz do retculo ou se forem protenas transmembranares, ficam ligadas membrana do retculo.

Modificaes Ps-Traducionais e a Regulao da Estabilidade da Protena: A meia-vida de uma protena parece uma conseqncia de algumas seqncias estabilizadoras e caractersticas gerais da estrutura secundria. Os aminocidos Met, Ser, Ter, Ala, Gli, Val e, mais provavelmente tambm Cis e Pro tm efeito estabilizador sobre a protena quando localizados na extremidade N. Todos os outros aminocidos tornam a protena vulnervel a uma protease que rapidamente a degrada. A maquinaria proteoltica responsvel pela degradao seletiva de protenas dependente de ubiquitina. A ubiquitina uma pequena protena de 76 aminocidos que se liga a outras protenas. Quando a maquinaria proteoltica dependente de ubiquitina reconhece um aminocido desestabilizante no N-terminal de uma protena, uma molcula de ubiquitina ligada covalentemente ao terminal N ou a uma lisina prxima. Subseqentemente, uma srie de ubiquitinas adicionais acrescentada, produzindo uma protena ramificada multiubiquinada. Uma protease especfica reconhece tais ubiquitinas e as degrada enquanto recicla os polipeptdeos de ubiquitina. Como j mencionado, a degradao de protenas dependente de ubiquitina especificada pelo primeiro aminocido no terminal N de cada protena. Embora em todos os genes de protenas eucariticas o primeiro cdon (AUG) codifique uma metionina, muitas poucas espcies de protenas prontas tm metionina em seu N-terminal. Geralmente, o N-terminal cotraducionalmente modificado por atividades de aparo e adio de terminal no muito bem compreendido. Curiosamente, as protenas que so endereadas ao retculo em geral tm o N-terminal no modificado, tornando-as altamente instveis no citosol mas no no retculo. Isto pode ser importante em permitir que a clula seja capaz de degradar especificamente protenas que entram na via citoslica por acidente.

2.6. Ferramentas para Manipulao de R A e Protenas: A estrutura, a expresso e a funo dos genes humanos podem ser estudadas por uma variedade de mtodos. A prioridade inicial na definio da estrutura do gene obter uma seqncia completa de cDNA e identificar os stios de iniciao e terminao de traduo e os stios de poliadenilao. A estrutura exon/intron pode ento ser determinada pela comparao da seqncia de cDNA com as seqncias de clones de DNA genmico relacionados. Subseqentemente, podem ser feitas tentativas para uma caracterizao gentica completa, em nvel genmico, por meio do sequenciamento das regies promotoras, das seqncias flanqueadoras 5 e 3 e das seqncias de introns.

2.6.1. Mtodos para obteno de clones de genes para estudar a sua estrutura, expresso e funo: Clonagem de cD A enriquecido o DNA genmico de todas as clulas humanas nucleadas consiste basicamente da mesma coleo de seqncias, porm, a representatividade das vrias populaes de mRNA variam entre as clulas. Por exemplo, mRNA de -globina e -globina so abundantes entre as molculas de mRNA de eritrcitos e, conseqentemente, seqncias de cDNA de globina so abundantes em bibliotecas de cDNA de eritrcitos. Mtodos baseados em PCR tambm foram desenvolvidos para amplificar seletivamente cDNAs correspondendo aos subconjuntos de genes transcricionalmente ativos. Clonagem direcionada protena a seqncia de aminocidos da um polipeptdeo pode ser determinada para permitir a sntese de oligonucleotdeos especficos para um gene os quais podem ser usados como sondas de hibridizao para isolar um cDNA correspondente ou um clone de DNA genmico.

2.6.2. Mtodos para estudar a estrutura do gene: 2.6.2.1. Mapeamento de stios de transcrio Ensaio de proteo nuclease S1 neste ensaio, um fragmento de restrio da extremidade 5 de um gene clonado suspeito de conter o stio de iniciao de transcrio. Ele marcado nas extremidades 5, desnaturado e misturado com o RNA total de clulas nas quais acredita-se estar sendo expresso o gene relevante. O mRNA cognato pode hibridizar com a fita de DNA anti-senso, formando um heterodplex RNA-DNA. Tratamento subseqente com nuclease S1 (enzima que degrada acido nuclico de fita simples) resulta na clivagem progressiva da extremidade livre 3 da seqncia de DNA at o ponto em que o DNA est hibridizado extremidade 5 do mRNA. Fracionamento por tamanho, em uma eletroforese em gel desnaturante, pode identificar a diferena de tamanho entre o DNA original e o DNA hibridizado aps o tratamento com nuclease S1. Ensaio de extenso de primer neste caso, o fragmento de restrio suspeito de conter o stio de iniciao de transcrio escolhido deliberadamente para ser pequeno. A hibridizao com um mRNA cognato ir deixar um mRNA com uma extremidade 5 livre. O DNA pode servir como um primer para a transcriptase reversa (RT) estender a sua extremidade 3 at que a extremidade 5do mRNA seja alcanada. O aumento de tamanho aps o tratamento com a transcriptase reversa (+RT) comparado com antes do tratamento (-RT) mapeia o stio de incio da transcrio. Um mapeamento mais preciso possvel, em ambos os mtodos, pelo seqenciamento do DNA aps o tratamento com S1 ou RT.

Figura: (A) ensaio de proteo a nuclease S1. (B) ensaio de extenso de primer

2.6.2.2. Mapeamento dos limites exon/intron A presena de introns pode ser usualmente inferida por meio de mapeamento comparativo de clones genmicos e de cDNAs relacionados. Uma vez que toda a seqncia de cDNA estabelecida, primers para o seqenciamento podem ser definidos a partir dos vrios segmentos de cDNA e usados para o seqenciamento de DNA por PCR com clones de cosmdeos desnaturados como moldes de DNA. As sequencias obtidas devem cruzar a regio limtrofe exon/intron.

2.6.3. Mtodos aplicados ao estudo da expresso gnica: Uma vez eu um clone genmico ou de cDNA torna-se disponvel, pode ser marcado e usado como sonda para detectar a expresso daquele gene ao nvel de RNA. H diferentes mtodos a disposio para se estudar a expresso de RNA, tais como: Hibridizao pela tcnica de orthern blot - esse um mtodo de baixa resoluo, mas que permite detectar padres de expresso por meio da hibridizao de uma sonda gnica ou de cDNA, com extratos de RNA total ou RNA poli(A)+ preparados a partir de diferentes tecidos ou de linhagens de clulas. O fato de o RNA ser fracionado por tamanho em um gel possibilita estimar o tamanho de transcritos. A presena de mltiplas bandas de hibridizao em uma canaleta pode indicar a presena de isoformas de diferentes tamanhos. Hibridizao in situ em tecidos neste procedimento, os tecidos so congelados ou embebidos em parafina e cortados usando-se um micrtomo, para obter cortes muitos finos, os quais so montados em uma lmina de microscpio. A hibridizao de uma sonda especfica para um gene, no tecido presente em lmina, pode oferecer imagens detalhadas de expresses representativas da distribuio de RNA no tecido de origem. Hibridizao de D A em microarranjo para investigar a expresso de genes de interesse, dispostos nos microarranjos, o RNA extrado das clulas-alvo selecionadas, convertido em cDNA (pela enzima transcriptase reversa), marcado com substncia fluorescente e hibridizado ao microarranjo. O cDNA marcado , naturalmente, uma populao bastante heterognea, correspondente ao RNA transcrito de todos os genes expressos nas clulas-alvo. Um gene que intensamente expresso nas clulas-alvo ser, portanto, bem representado na sonda de cDNA total; por sua vez, um gene que pouco expresso ser escassamente representado no cDNA marcado. Quando o cDNA marcado hibridizado ao microarranjo, a intensidade do sinal que permanece ligado aos clones individuais de cDNA, ou aos oligonucleotdeos individuais, indica o quanto a respectiva seqncia bem representada no cDNA marcado, sendo portanto, uma medida de expresso gnica. O estudo da expresso gnica tambm pode ser conduzido em nvel de expresso de protenas. As principais abordagens so: Imunobloting (ou Western blotting) esse mtodo foi projetado para analisar a expresso bruta de protenas usando extratos celulares fracionados, de acordo como o tamanho das molculas. Geralmente isso obtido por meio de um SDS-PAGE unidimensional, uma forma de eletroforese em gel de poliacrilamida na qual a mistura de protenas extradas dissolvida em uma soluo de SDS (um detergente aninico que interrompe quase todas as interaes no covalentes em protenas nativas). Mercaptoetanol tambm adicionado para reduzir as pontes de enxofre. Aps a eletroforese, as protenas fracionadas podem ser visualizadas por meio de colorao com um corante apropriado. Gis bidimensionais tambm podem ser utilizados: a primeira dimenso envolve o ponto isoeltrico, que a separao, de acordo com a carga, em um gradiente de pH. A segunda dimenso envolve o fracionamento por tamanho por meio do SDS-PAGE. Nesse caso, as protenas fracionadas so transferidas (blotted) para uma membrana de nitrocelulose e expostas a um anticorpo especfico. Imunocitoqumica - essa tcnica visa estudar os padres gerais de expresso em nvel de protenas, dentro de um tecido ou outra estrutura multicelular. Essa tcnica considerada como o equivalente protico dos mtodos de hibridizao in situ, em tecidos para rastrear a expresso de RNA. Assim como este caso, os tecidos so geralmente congelados ou embebidos em parafina, e ento cortados em seces muito finas antes de serem montados em lamnula. O anticorpo apropriado utilizado para ligar-se protena no corte do tecido, podendo produzir dados de expresso disponveis para comparao com a colorao histolgica de cortes de tecidos vizinhos. Microscopia de imunofluorescncia esse mtodo usado na investigao da localizao subcelular de uma protena de interesse. Para tanto, um corante fluorescente apropriado, acoplado ao anticorpo desejado, permitindo que a protena relevante seja localizada dentro da clula por meio de microscopia de imunofluorescncia.

2.6.4. Mtodos aplicados na investigao da funo de genes: Aps um gene codificador de um polipeptdeo ter sido caracterizado ao nvel de nucleotdeos e uma seqncia polipeptdica esperada ter sido descoberta, investigaes adicionais se concentram na expresso, na regulao da expresso e na funo biolgica do gene. Os mtodos mais eficientes para a investigao da funo de um gene humano baseiam-se na extrapolao de resultados obtidos em camundongos. O gene equivalente (ortlogo) identificado em um camundongo e o direcionamento a um gene-alvo usado para eliminar a sua expresso e ver se o seu silenciamento produz algum tipo de fentipo mutante. Outro mtodo muito eficiente expressar uma seqncia de interesse, para produzir uma protena e usar essa protena de modo a identificar outras protenas ou cidos nuclicos aos quais ela possa se ligar.

10

MDULO 3 GE TICA DE DOE AS HUMA AS As doenas hereditrias humanas so normalmente classificadas sob os ttulos de: Monognicas quando um carter hereditrio determinado pela modificao em um nico gene. Cromossmicas quando o distrbio gentico resulta da perda ou ganho de uma quantidade significativa de material cromossmico. Polignicas (multifatoriais) quando a doena gentica decorrente dos efeitos combinados de vrios genes, cada um fazendo uma pequena contribuio, associado com fatores ambientais de risco. Esta classe de doena gentica mais comumente observada. A maioria das malformaes congnitas e de doenas comuns como cncer e diabetes so exemplos de doenas genticas multifatoriais.

3.1. Padres de Herana Monognica: 3.1.1. omenclatura Bsica: Gene autossmico o que est situado em um cromossomo autossomo, ou seja, um dos cromossomos numerados de 1 a 22. Gene Ligado ao X ou Ligado ao Y refere-se ao gene situado no cromossomo X ou Y, respectivamente. Locus (plural loci) a posio ou local em um cromossomo onde o gene est situado. Alelos so formas alternativas do mesmo gene. Heterozigoto refere-se a presena de dois alelos diferentes em um mesmo lcus. Homozigoto refere-se a presena de dois alelos idnticos em um mesmo lcus. Gentipo a combinao dos alelos presentes em um ou mais loci. Fentipo expresso observada de um gentipo. Heterogeneidade refere-se a diversidade. Heterogeneidade de lcus significa que uma condio pode ser causada por mutaes e loci diferentes. Heterogeneidade allica indica que um carter gentico pode ser causado por mutaes diferentes no mesmo lcus. Dominante significa que uma nica cpia de um gene anormal o suficiente para o desenvolvimento do distrbio gentico. Recessivo - indica que ambas as cpias do gene tm que estar alteradas para a expresso da doena. Heredograma construo esquemtica de uma rvore familial com o propsito de facilitar o reconhecimento do padro de transmisso do distrbio gentico.

3.1.2. Herana Autossmica Dominante: Mas da metade dos distrbios mendelianos herdado como autossmico dominante. A incidncia de alguns distrbios autossmicos dominantes alta, pelo menos em reas geogrficas especficas, como por exemplo: 1 em 500 para hipercolesterolemia familiar em populaes descendentes de europeus e japoneses; 1 em 550 para a distrofia miotnica no noroeste de Quebec/Canad; e de cerca de 1 em 2.500 a 3.000 para diversas condies, como a doena de Huntington, neurofibromatose e doena dos rins policsticos em populaes de norte-americanas. Um fentipo que expresso tanto em homozigotos quanto em heterozigotos para um alelo mutante reconhecido como dominante. Os distrbios dominantes ocorrem se houver ou no um produto gentico normal produzido pelo alelo normal remanescente. Em uma doena dominante pura, homozigotos e heterozigotos para o alelo mutante so, ambos, igualmente afetados. Entretanto, os distrbios dominantes so mais graves em homozigotos do que em heterozigotos, situao na qual a doena denominada incompletamente dominante (ou semi-dominante). O risco e a gravidade da doena dominantemente herdada na prole dependem de se um ou ambos os genitores est afetado e de se a caracterstica estritamente dominante ou incompletamente dominante. Estipulando-se D como o alelo mutante e d como o alelo normal, as unies que produzem crianas com doena autossmica dominante podem ser entre dois heterozigotos (D/d) para a mutao ou, mais freqentemente, entre um heterozigoto para a mutao (D/d) e um homozigoto para o alelo normal (d/d):
Unio parental Afetado com no afetado D/d x d/d Afetado com afetado D/d x D/d Prole D/d d/d D/D D/d d/d Risco para a prole afetado no afetado Se estritamente dominante: afetados no afetado

Se incompletamente dominante: afetado semelhante aos genitores mais gravemente afetado que os genitores no afetado

Cada filho de uma unio D/d com d/d possui uma probabilidade de 50% de receber o alelo D anormal do genitor e uma chance de 50% de receber o alelo normald.Na populao como um todo, a descendncia de genitores D/d com d/d de, aproximadamente, 50% D/d e 50% d/d. Obviamente, cada gestao um evento independente, no governado pelo resultado de gestaes anteriores. Portanto, dentro de uma famlia, a distribuio de filhos afetados e no afetados pode ser bem diferente da proporo terica esperada de1:1, especialmente se a prole for pequena. Na prtica mdica, os homozigotos para os fentipos dominantes no so freqentemente vistos porque as unies que poderiam produzir uma descendncia homozigota so raras. Novamente, estipulando o alelo mutante como D e o alelo normal d, as unies que podem produzir um homozigoto D/D podem, teoricamente, ser D/d com D/d, DD com D/d ou D/D com D/D, ou o paciente, em situaes excessivamente raras, ter recebido a mutao de um genitor geneticamente no afetado. Em termos prticos, somente a unio entre dois heterozigotos precisa ser considerada porque os homozigotos D/D so raros e, geralmente, gravemente afetados para se reproduzirem. Na hiptese de unio entre dois heterozigotos, dos afetados poderiam apresentar a mesma condio se esta for dominante pura, ou 1/3 dos afetados poderia ser homozigoto e mais gravemente afetado do que os heterozigotos D/d. De fato, no foi claramente provado que nenhum distrbio dominante humano fosse dominante puro. Mesmo a doena de Huntington, que um distrbio mais freqentemente invocado como dominante puro, porque a doena geralmente semelhante em natureza e gravidade dos sintomas tanto em homozigotos quanto em heterozigotos, parece apresentar um curso de durao acelerado desde o incio da doena at o bito em indivduos homozigotos, se comparados aos heterozigotos.

11

Herana incompleta dominante a acondroplasia um distrbio esqueltico incompletamente dominante, que se manifesta como um nanismo de membros curtos e cabea grande. Os casamentos entre dois indivduos acondroplsicos no so incomuns. Freqentemente, o exame clnico j suficiente para identificar um filho homozigoto D/D do heterozigoto D/d; os indivduos homozigotos para a acondroplasia so mais gravemente afetados do que os heterozigotos e comumente no sobrevivem ao perodo ps-natal. Mutao nova na herana autossmica dominante a maioria das condies dominantes de importncia clnica ocorre no somente por meio da transmisso de alelos mutantes, mas tambm por meio da herana de uma nova mutao, espontnea, em um gameta herdado de um genitor no afetado. Isso acontece porque os distrbios dominantes podem ocorrer quando s um dos membros do par de alelos em um lcus defeituoso, tenha ele sido herdado de um genitor heterozigoto ou surgido por meio de uma mutao espontnea no gameta transmitido por um genitor no-afetado. Caractersticas da herana autossmica dominante O fentipo geralmente aparece em todas as geraes, com cada uma das pessoas afetadas possuindo um genitor afetado. As excees a essa regra so: casos originados por mutao nova ocorrida no gameta do genitor no afetado, e casos dos quais no expresso (no penetrante) ou s expresso de modo sutil em uma pessoa que herdou o alelo mutante; Qualquer filho de um genitor afetado tem 50% e risco de herdar a o alelo mutante; Membros fenotipicamente normais das famlias no transmitem o fentipo afetado para seus filhos; Homens e mulheres tm iguais probabilidades de transmitir o fentipo para a prole. Distrbios que apresentam herana autossmica dominante acondroplasia, distrofia miotnica, doena adulta do rim policstico, doena de Huntington, hipercolesterolemia familiar, neurofibromatose (tipos 1 e 2), osteognese imperfeita, retinoblastoma, Sndrome de Marfan.

3.1.3. Herana Autossmica Recessiva: Um distrbio que apresenta herana autossmica recessiva s se manifesta no estado homozigoto, sendo os indivduos afetados portadores dos dois alelos mutantes. Com raras excees, um destes alelos mutantes ter sido herdado de cada um dos genitores heterozigotos no afetados (portadores). Trs tipos de combinaes podem levar a uma prole homozigota afetada por uma doena autossmica recessiva. O alelo recessivo mutante simbolizado como r e o seu alelo dominante como R. Embora qualquer combinao na qual cada genitor possua ao menos um alelo recessivo possa produzir descendncia homozigota afetada, a combinao mais comum aquela entre dois heterozigotos no afetados.
Unio parental Portador com portador (R/r x R/r) Prole R/R R/r r/r R/r r/r S r/r Risco para a prole no afetados afetado afetado no afetado Todos afetados

Portador com afetado (R/r x r/r) Afetado com afetado (r/r x r/r)

Quando dois genitores que so ambos portadores tm filhos, em mdia, deles sero portadores, ser homozigoto afetado e o restante ser homozigoto normal. Caractersticas da herana autossmica recessiva Homens e mulheres so igualmente afetados; Em geral, apenas os membros de uma famlia so afetados; A probabilidade de que um irmo ou irm de um afetado tambm seja afetado de 1 em 4 (25%). Distrbios que apresentam herana autossmica recessiva Albinismo ocolocutneo, alcaptonria, anemia falciforme, doena de Tay-Sachs, fenilcetonria, fibrose cstica, hemocromatose, galactosemia, e quase todos os erros hereditrios do metabolismo.

3.1.4. Herana Ligada ao X: Os cromossomos X e Y, que so responsveis pela determinao do sexo, esto distribudos desigualmente entre homens e mulheres. Por este motivo, os fentipos determinados pelos genes localizados no cromossomo X apresentam uma distribuio sexual caracterstica e um padro de herana que geralmente no fcil de identificar. Acredita-se que aproximadamente 1.100 genes estejam localizados no cromossomo X, dos quais sabe-se que 40% so associados a fentipos patolgicos. Uma vez que os homens possuem somente um cromossomo X, enquanto as mulheres possuem dois, s existem dois gentipos possveis em homens e trs em mulheres com respeito a um alelo em um lcus ligado ao X. Um homem com um alelo mutante em um lcus ligado ao X hemizigoto para aquele alelo, enquanto as mulheres podem ser homozigotas tanto para o alelo do tipo selvagem quanto para o mutante, ou podem ser heterozigotas. Por exemplo, se XH for o alelo de tipo selvagem para o gene do fator VIII de coagulao e um alelo mutante, Xh, provocar a hemofilia A, os gentipos esperados em homens e mulheres poderiam ser os seguintes:
Gentipos Hemizigotos XH Hemizigotos Xh Homozigotos XH /XH Heterozigotos XH /Xh Homozigotos Xh /Xh Fentipos No afetados Afetados No afetados No afetados (normalmente) Afetados

Homens Mulheres

Inativao do cromossomo X, Compensao de doses e a Expresso de Genes ligados ao X A inativao do X um processo fisiolgico normal no qual um cromossomo X , em grande parte, inativado nas clulas somticas nas mulheres normais (mas no nos homens normais), igualando, assim, a expresso da maioria dos genes ligados ao X em ambos os sexos (Teoria de Compensao de Dose). A relevncia da inativao do X profunda. Ela faz com que as mulheres possuam duas populaes celulares, uma na qual um dos cromossomos X est ativo e uma outra na qual o outro cromossomo X est ativo. Ambas as populaes celulares nas mulheres so prontamente identificadas para alguns distrbios. Por exemplo, na distrofia muscular de Duchenne, os portadores femininos exibem a tpica expresso mosaica, permitindo que sejam identificados pela imunocolorao para a distrofina. Dependendo do padro de inativao aleatria do X dos dois cromossomos X, duas mulheres heterozigotas para uma doena ligada ao X podem apresentar quadros clnicos muito diferentes, uma vez que diferem na proporo de clulas que possuem o alelo mutante no X ativo em um tecido relevante.

12

3.1.4.1. Herana Recessiva Ligada ao X: A herana recessiva ligada ao X segue um padro bem definido e facilmente identificvel.Uma mutao recessiva ligada ao X tipicamente expressa no fentipo de todos os homens que a receberam, mas somente nas mulheres que so homozigotas para a mutao. Conseqentemente, os distrbios recessivos ligados ao X geralmente esto restritos aos homens e raramente so observados em mulheres. Caractersticas da herana recessiva ligada ao X a incidncia da caracterstica maior em homens do que em mulheres; as mulheres heterozigotas geralmente no so afetadas, mas algumas podem expressar a condio com gravidade varivel, conforme determinada pelo padro de inativao do X; O gene responsvel pela condio transmitido de um homem afetado para todas as suas filhas. Qualquer um dos filhos das suas filhas tem 50% de chance de herda-lo; O alelo mutante geralmente nunca transmitido por um homem afetado para todas as suas filhas; O alelo mutante pode ser mantido atravs de uma srie de portadores femininos; se assim o for, os homens afetados em uma famlia so aparentados atravs das mulheres. Distrbios que apresentam herana recessiva ligada ao X daltonismo verde-vermelho, distrofia muscular de Duchenne e Becker, Hemofilia (A e B), Sndrome de Hunter, deficincia de glicose-6-fosfato desidrogenase. 3.1.4.2. Herana Dominante Ligada ao X: Um fentipo ligado ao X descrito como dominante se for regularmente expresso em heterozigotos. A herana dominante ligada ao X pode ser imediatamente distinguida da herana autossmica dominante pela ausncia de transmisso homem a homem, o que obviamente impossvel para a herana ligada ao X, uma vez que os homens transmitem o cromossomo Y, no o X, para os seus filhos. Desse modo, a caracterstica distintiva de um heredograma dominante ligado ao X completamente penetrante que todas as filhas e nenhum dos filhos dos homens afetados so acometidos; se qualquer das filhas no for afetada ou qualquer filho estiver afetado, a herana dever ser autossmica, e no ligada ao X. O padro de herana por via feminina no diferente do padro autossmico dominante; uma vez que a mulheres possuem um par de cromossomos X, assim como possuem pares de autossomos, cada filho de uma mulher afetada tem 50% de chance de herdar a caracterstica, independente do sexo. Nas mltiplas famlias com uma doena dominante ligada ao X, a expresso geralmente mais branda nas mulheres, que quase sempre so homozigotas, porque o alelo mutante est localizado no cromossomo X inativo em uma proporo das suas clulas. Portanto, a maioria dos distrbios dominantes ligados ao X so incompletamente dominantes, como o caso da maioria dos distrbios autossmicos dominantes. Caractersticas da herana dominante ligada ao X Os homens afetados com parceiras normais no tm nenhum filho afetado e nenhuma filha normal; Tanto os descendentes masculinos quanto os femininos das mulheres portadoras apresentam o risco de 50% de herdarem o fentipo. O padro do heredograma semelhante ao observado na herana autossmica dominante; As mulheres afetadas so cerca de duas vezes mais comuns do que os homens, mas nenhuma mulher afetada possui uma expresso mais leve (embora varivel) do fentipo. Distrbios que apresentam herana dominante ligada ao X sndrome do X frgil, raquitismo resistente a vitamina D, sndrome de Rett

3.1.5. Herana Ligada ao Y: Apenas um pequeno nmero de genes foi identificado no cromossomo Y, a maioria dos quais envolvidos na determinao da masculinidade e manuteno da espematognese. Eles incluem o SRY (do ingls, Sex determining Region of the Y chromosome) e DAZ (do ingles, Deleted in Azoospermia). Um distrbio que ligado ao Y dito apresentando herana holndrica, e transmitido por um homem para todos os filhos homens e nenhuma das filhas mulheres.

3.1.6. Herana Pseudo-Autossmica: A herana pseudo-autossmica descreve o padro de herana observado em genes na regio pseudo-autossmicados cromossomos X e Y que podem ser permutados regularmente entre os dois cromossomos sexuais. Alelos para genes na regio pseudo-autossmica podem exibir transmisso homem a homem e, portanto, mimetizar a herana autossmica, porque podem fazer crossing-over do X para o Y durante a gametognese masculina e ser passados a diante a partir de um pai para a sua descendncia masculina. A discondroenteose (baixa estatura e deforminade do antebrao) um exemplo de condio pseudo-dominante. Maior prevalncia da doena foi observada no sexo feminino, se comparado ao masculino, sugerindo um distrbio dominante ligado ao X, mas a presena da transmisso homem a homem claramente eliminou uma herana estritamente ligada ao X. O gene SHOX, responsvel por esta condio, est localizado na regio pseudo-autossmica em Xp e Yp, escapando da inativao do X.

3.1.7. Herana Materna D A mitocondrial: Sabe-se que alguns heredogramas de doenas hereditrias que poderiam no ser explicados pela herana mendeliana tpica de genes nucleares so conhecidos por causarem mutaes do genoma mitocondrial e por manifestarem uma herana materna. Distrbios provocados por mutaes do DNA mitocondrial demonstram uma srie de caractersticas incomuns que resultam das peculiaridades da biologia e da funo mitocondrial. Mais de 100 rearranjos diferentes e 100 diferentes pontos de mutao que podem provocar doena humana foram identificados no mtDNA, freqentemente envolvendo os sistemas nervoso central e musculoesqueltico. As doenas que resultam dessas mutaes exibem um padro distintivo de herana devido a trs caractersticas incomuns da mitocndria: segregao replicativa, homoplasmia e heteroplasmia, e herana materna. Segregao replicativa A primeira caracterstica singular do cromossomo mitocondrial a ausncia da segregao firmemente controlada, observada durante a mitose e meiose dos 46 cromossomos nucleares. Na diviso celular, as mltiplas cpias do mtDNA em cada uma das mitocndrias de uma clula se replicam e distribuem aleatoriamente entre as mitocndrias recm-sintetizadas. As mitocndrias, por sua vez, so distribudas aleatoriamente entre as duas clulas-filhas. Este processo conhecido como segregao replicativa. Homoplasmia e heteroplasmia a segunda caracterstica singular da gentica do mtDNA provm do fato de que a maioria das clulas contm muitas cpias de molculas de mtDNA. Quando surge uma mutao no mtDNA, inicialmente ela s est presente em uma das molculas de mtDNA

13

em uma mitocondria. Com a segregao replicativa, porm, uma mitocndria contendo um mtDNA mutante ir adquirir mltiplas cpias da molcula mutante. Com a diviso celular, uma clula contendo uma mistura de mtDNA normal e mutante pode distribuir propores muito diferentes do DNA mitocondrial mutante e do tipo selvagem s suas clulas-filhas.Uma clula-filha pode, por acaso, receber mitocndrias que s contm uma populao pura de mtDNA normal, ou uma populao pura de mtDNA mutante (uma situao conhecida como homoplasmia). Alternativamente, a clula-filha pode receber uma mistura de mitocndrias, algumas com algumasa sem mutao (heteroplasmia). Uma vez que a expresso fenotpica de uma mutao no mtDNA depende das propores relativas a de mtDNA normal e mutante nas clulas constituintes dos diferentes tecidos, a penetrncia reduzida, e a expresso varivel e a pleiotropia so todas caractersticas tpicas dos distrbios mitocondriais. Herana materna do mtD A A caracterstica determinante da gentica do mtDNA a herana materna. As mitocndrias dos espermatozides geralmente so eliminadas do embrio, de modo que o mtDNA herdado da me. Portanto, todos os filhos de uma mulher que seja homoplasmtica para uma mutao no mtDNA herdaro esta mutao, enquanto que nenhum dos descendentes de um homem portador da mesma mutao herdar o DNA defeituoso.A herana materna de uma mutao homoplasmtica do mtDNA causadora da neuropatia ptica hereditria de Leber est exemplificada na figura abaixo.

Heredograma da neuropatia pitica de Leber, uma forma de cegueira espontnea provocada por um defeito no mtDNA. A herana se d atravs da linhagem materna. Nenhum homem afetado transmite a doena.

A herana materna na presena de heteroplasmia na me est associada a caractersticas adicionais da gentica do mtDNA que so de significncia mdica. Em primeiro lugar, o nmero de molculas de mtDNA no interior de ovcitos em desenvolvimento reduzido antes de ser subseqentemente amplificado at o imenso total observado nos ovcitos maduros. Esta restrio e subseqente amplificao do mtDNA durante a ovocitognese so denominados gargalo gentico mitocondrial. Conseqentemente, a variabilidade na percentagem de molculas mutantes de mtDNA observadas na descendncia de uma me com heteroplasmia para uma mutao no mtDNA provm, ao menos em parte, da amostragem de apenas um subconjunto de mtDNA durante a ovocitognese. Como poderia ser esperado, as mes com uma elevada proporo de molculas mutantes de mtDNA esto mais propensas a produzir vulos com uma proporo mais elevada de mtDNA mutante e, conseqentemente, apresentam maior probabilidade de ter uma prole clinicamente afetada do que as mes com uma proporo mais baixa. Uma exceo herana materna ocorre quando a me heteroplasmtica para uma mutao por deleo no seu mtDNA; por razes desconhecidas, as molculas removidas de mtDNA geralmente no so transmitidas das mes clinicamente afetadas para os seus filhos. Embora as mitocndrias sejam, quase sempre, exclusivamente herdadas por meio da me, pelo menos um exemplo de herana paterna de mtDNA ocorreu em um paciente com uma miopatia mitocondrial. Conseqentemente, em pacientes com mutaes aparentemente espordicas no mtDNA, a rara ocorrncia da herana paterna de mtDNA deve ser considerada. Caractersticas da herana mitocondrial Todos os filhos de mulheres homoplasmticas para uma mutao herdaro esta mutao; os filhos dos homens portadores de uma mutao semelhante nunca o faro. As mulheres heteroplasmticas para mutaes de ponto e duplicaes as passaro para todos os seus filhos. Todavia, a frao de mitocndrias mutantes na prole, e conseqentemente, o risco e a gravidade da doena, podem variar consideravelmente dependendo da frao de mitocndrias mutantes nas suas mes, assim como da probabilidade aleatria operando sobre um pequeno nmero de mitocndrias por clula no gargalo dos ovcitos. As delees heteroplasmticas geralmente no so herdadas. A frao de mitocndrias mutantes nos diferentes tecidos de um indivduo heteroplasmtico para uma mutao pode variar tremendamente, provocando, assim, um espectro de doenas entre os membros de uma famlia na qual haja heteroplasmia para uma mutao mitocondrial. A pleiotropia e a expressividade varivel nos diferentes membros afetados da famlia so freqentes.

3.1.8. Fatores que Afetam os Padres de Herana: Mutaes novas: Se uma criana nasceu com uma doena gentica e no h histrico da doena na famlia, possvel que a criana seja produto de uma mutao nova (isto especialmente provvel se a doena em questo for autossmica dominante). Isto , o gene transmitido por um dos genitores sofreu alterao no DNA, resultando em uma mutao de um alelo normal para um causador de doena. Os genes neste lcus nas outras clulas germinativas do genitor seriam normais. Neste caso, o risco de recorrncia para a prole subseqente do genitor no elevado acima do da populao em geral. Entretanto, a prole da criana afetada pode ter um risco de ocorrncia substancialmente elevado. Uma grande proporo dos casos observados de muitas doenas autossmicas dominantes resulta de mutaes novas. Por exemplo, estima-se que 7/8 de todos os casos de acondroplasia so devidos a mutaes novas, enquanto que apenas 1/8 so transmitidas por pacientes acondroplsicos. Isto ocorre principalmente porque a doena tende a limitar o potencial de reproduo. Mosaicismo germinativo: Ocasionalmente, duas ou mais pessoas da prole apresentaro uma doena autossmica dominante quando no h histrico familiar da doena. Como a mutao um evento raro, improvvel que isso seja devido a vrias mutaes na mesma famlia. O mecanismo mais provvel como responsvel chamado mosaicismo germinativo. Durante o desenvolvimento embrionrio de um dos genitores, ocorreu uma mutao que afetou toa ou parte da linhagem germinativa, mas poucas ou nenhuma das clulas somticas do embrio. Assim, o genitor tem a mutao em sua linhagem germinativa, mas de fato no expressa a doena. Como resultado, ele (ou ela) pode transmitir a mutao para vrios descendentes. Este fenmeno, embora relativamente raro, pode ter efeitos significativos nos riscos de recorrncia, quando ele ocorre. Exemplos de doenas com mosaicismo germinativo so: acondroplasia, neurofibromatose tipo 1, DMD e hemofilia A. Idade atrasada de manifestao: Enquanto algumas doenas genticas se expressam ao nascimento, ou logo aps, muitas outras no so aparentes seno j na vida adulta. Isto conhecido como idade atrasada de manifestao. O atraso na idade de incio reduz assim a seleo natural contra um gene de doena, aumentando a sua freqncia na populao. Penetrncia reduzida: a probabilidade de que um gene venha, de fato, a possuir uma expresso fenotpica. Quando a freqncia de expresso de um fentipo de menos de 100% - ou seja, quando alguns falham completamente em express-los -, diz-se que o gene exibe uma penetrncia reduzida. A penetrncia um conceito de tudo-ou-nada. a percentagem de pessoas com um gentipo predisponente que so afetadas, pelo menos em alguma medida. Estudos familiares mostraram que cerca de 10% dos portadores obrigatrios do gene de suscetibilidade ao retinoblastoma no possuem a doena. Neste caso, a penetrncia do gene dita ser de 90%.

14

Expressividade varivel: A expressividade varivel refere-se a intensidade da expresso do fentipo da doena. As causas da expressividade varivel em geral no so conhecidas. Efeitos ambientais podem s vezes ser responsveis: na ausncia de um determinado fator ambiental, o gene se expressa com gravidade diminuda ou nenhuma. Uma outra causa possvel a interao de outros genes, chamados de genes modificadores, com o gene da doena. Finalmente, a medida que a base molecular da mutao torna-se melhor compreendida, fica claro que alguns casos de expressividade varivel so devidos a tipos diferentes de mutaes (alelos diferentes) no mesmo lcus de doena. Isto se chama heterogeneidade allica. Pleiotropia e Heterogeneidade: Os genes que exercem efeitos em mltiplos aspectos da fisiologia ou anatomia so pleiotrpicos. A pleiotropia uma caracterstica comum de genes humanos. A sndrome de Marfan (acometimento de olhos, esqueleto e sistema cardiovascular), a Fibrose Cstica (acometimento das glndulas sudorparas, pulmes, pncreas) osteognese imperfeita (ossos, dentes e esclera so afetados) e o albinismo (distrbios na pigmentao e no desenvolvimento da fibra ptica) so exemplos clssicos de doenas hereditrias com efeitos pleiotrpicos. Do mesmo modo que um gene pode ter mltiplos efeitos, um nico fentipo de doena pode ser causado por mutaes em diferentes loci em diferentes famlias. A causa do mesmo fentipo de doena por mutaes em loci distintos chamada de heterogeneidade de lcus. Imprinting genmico: Alguns genes de doenas podem-se expressar diferentemente quando herdados de um sexo versus o outro. Isto o imprinting genmico. Ele est associado, e possivelmente causado, pela metilao do DNA. Antecipao e Expanso de repetio: A antecipao refere-se a uma expresso mais cedo e mais grave de uma doena. A expanso de repeties de DNA tem sido demonstrada causando antecipao em algumas doenas humanas (ex.: doenas neuromusculares e neurodegenerativas). Estas doenas podem ser classificadas em grupos, dependendo do tamanho da expanso, local da repetio, conseqncias fenotpicas da expanso, efeito da mutao e genitor no qual ocorreu tipicamente a grande expanso.

3.2. Anomalias Cromossmicas: As anomalias cromossmicas so responsveis por uma proporo significativa das doenas genticas, ocorrendo em aproximadamente um em cada 150 nativivos. Elas so as causas conhecidas que levam tanto ao retardo mental quanto perda gestacional. As anomalias cromossmicas so vistas em 50% dos abortos espontneos do primeiro trimestre e 20% do segundo trimestre. Assim, elas so uma importante causa de morbidade e de mortalidade. As anomalias cromossmicas so classificadas em dois grupos: Numrica (quando a quantidade de cromossomo est aumentada ou diminuda), e Estrutural (quando o cromossomo apresenta alguma anormalidade na sua estrutura). Clinicamente, o resultado de uma anomalia cromossmica depende de ocorrer alguma perda ou ganho de material cromossmico e, com base nisso, as anomalias cromossmicas podem ser classificadas como balanceadas ou no balanceadas. As anomalias cromossmicas so no-balanceadas quase sempre tm um efeito adverso no crescimento e desenvolvimento. Em contrapartida, os rearranjos balanceados geralmente no tm efeito na pessoa na qual esto presentes, a menos que o funcionamento de um gene importante tenha sido perturbado por dano em um dos pontos de quebra do cromossomo. Entretanto, a importncia de se reconhecerem os rearranjos balanceados est em sua capacidade de causar problemas em futuras geraes, se um filho herdar um complemento cromossmico no balanceado de um genitor balanceado.

3.2.1. Anomalias Cromossmicas umricas: 3.2.1.1. Anomalias cromossmicas numricas do tipo poliploidia A poliploidia, definida como a presena de um ou mais conjuntos haplides de cromossomos, raramente vista em humanos. As condies poliplides que foram observadas em humanos so a triploidia (69 cromossomos em cada ncleo celular ou 3n) e a tetraploidia (92 cromossomos em cada ncleo celular ou 4n). Os cromossomos adicionais codificam uma grande quantidade de produto gnico excedente, causando mltiplas anomalias, tais como defeitos cardacos e do SNC. A poliploidia vista em apenas 1 em 10.000 nativivos, mas essa anormalidade numrica responde por uma taxa estimada de 15% das anomalias cromossmicas que ocorrem na concepo. Assim, a grande maioria das concepes poliplides espontaneamente abortada, e aquelas que sobrevivem at o nascimento tipicamente morrem logo aps o parto. A causa mais comum da poliploidia a fertilizao de um ovcito por dois espermatozides (dispermia). O zigoto resultante recebe 23 cromossomos do ovcito e 23 cromossomos de cada um dos dois espermatozides. A triploidia tambm pode ser causada pela fuso de um ovcito com um glbulo polar, cada um com 23 cromossomos, e pela subseqente fertilizao por um espermatozide. A falha meitica, na qual um ovcito ou espermatozide diplide produzido tambm pode causar um zigoto triplide. A tetraploidia muito mais rara do que a triploidia, tanto na concepo quanto entre os nascidos vivos. Os raros casos de tetraploidia conhecidos so provenientes de abortos espontneos. A tetraploidia pode ser causada por uma falha mittica no incio do desenvolvimento embrionrio, na qual todos os cromossomos duplicados migram para uma das clulas-filhas. A tetraploidia tambm pode resultar da fuso de dois zigotos diplides. 3.2.1.2. Anomalias cromossmicas numricas do tipo aneuploidia A aneuploidia refere-se a perda ou ganho de um ou mais cromossomos, e assim podem ser classificadas como monossomias (2n-1) ou trissomia (2n +1). A causa mais comum de aneuploidia a no-disjuno, a falha de um par de cromossomos em se separar normalmente durante a meiose. A no-disjuno pode ocorrer durante a meiose I ou a meiose II e as suas conseqncias so: Efeitos da no-disjuno na Meiose I metade dos gametas produzidos apresentar duas cpias do cromossomo (n+1), enquanto que a outra metade no possuir nenhum (n-1). Efeitos da no-disjuno na Meiose II metades dos gametas produzidos possuir a quantidade normal de cromossomos (n), possuir duas cpias do cromossomo (n+1), e no possuir nenhum (n-1).

3.2.1.2.1. Aneuploidia de Cromossomos Autossomos Monossomia de cromossomos autossmicos - a monossomia de qualquer cromossomo autossomo incompatvel com a vida. Trissomia do cromossomo 21 (sndrome de Down) a trissomia do 21 (caritipo 47, XX +21 ou 47, XY+21), que causa a sndrome de Down, vista em aproximadamente 1/800 a 1.000 nativivos, fazendo dela a condio aneuploide mais comum compatvel com a sobrevivncia a termo. Os problemas clnicos mais significativos incluem retardo mental, obstruo do trato gastrointestinal, defeitos cardacos congnitos, infeco respiratria e leucemia. Os homens com sndrome de Down so quase sempre estreis; foram relatados apenas dois casos nos quais homens com Down se reproduziram. Muitas mulheres com esta condio podem ter filhos, embora aproximadamente 40% no ovulem. Como a reproduo muito incomum, quase todos os casos de trissomia do 21 podem ser considerados mutaes novas (por no-disjuno ou por translocao). O cromossomo 21 extra de origem materna em aproximadamente 90% dos casos. Mosaicismo visto em 2% a 4% dos casos de sndrome de Down, e freqentemente acompanhado de um fentipo mais brando.

15

Trissomia dos cromossomos 13 e 18 A trissomia do cromossomo 13 ou Sndrome de Patau (47, XX +13 ou 47, XY+13), vista em cerca de 1/10.000 nascidos, e a trissomia do 18 ou Sndrome de Edwards (47, XX +18 ou 47, XY+18), com prevalncia de 1/6.000 nativivos, so algumas vezes compatveis com a vida a termo, embora 95% ou mais dos fetos afetados sejam abortados espontaneamente. Essas trissomias so muito menos comuns ao nascimento do que a trissomia do 21, e elas possuem um fentipo mais seriamente afetado, com 95% de mortalidade durante o primeiro ano de vida. Assim, como na trissomia do 21, existe um efeito da idade materna importante, e a mo contribui com o cromossomo extre em aproximadamente 90% dos casos.

3.2.1.2.2. Aneuploidia de Cromossomos Sexuais Entre os bebs nativivos, cerca de 1/400 meninos e 1/650 meninas possuem alguma forma de aneuploidia dos cromossomos sexuais. Principalmente devido inativao do cromossomo X, as conseqncias dessas classes de aneuploidia so menos severas do que aquelas das aneuploidia autossmicas. Monossomia do cromossomo X (Sndrome de Turner) esta sndrome, que afeta preferencialmente as mulheres, comumente causada por um caritipo 45, X. As principais caractersticas clnicas descritas para esta sndrome so: baixa estatura, infantilismos sexual, pescoo largo e alado, trax largo e em forma de escudo e comprometimento cardaco. Mulheres com o diagnstico de Turner apresentam uma considervel variabilidade quanto ao grau de comprometimento clnico. Este fato foi associado presena de variaes citogenticas, tais como: o caritipo 45,X, normalmente relacionado a um maior nmero de alteraes clnicas; e o caritipo mosaico (45, X/46, XX), observado preferencialmente em pacientes com sintomas mais brandos. Ainda, grande parte das concepes 45, X perdida na fase pr-natal, e entre aquelas que sobrevivem a termo so na maioria mosaicos cromossmicos. Com base nestas observaes, provvel que a presena de algumas clulas normais no feto mosaico contribua para o aumento de sua sobrevida. Sndrome de Klinefelter esta sndrome est associada ao caritipo 47, XXY e vista em aproximadamente 1/500 a 1/1.000 nascimentos masculinos. Embora a sndrome de Klinefelter seja uma causa comum de hipogonadismo primrio no homem, o fentipo menos marcante do que aquele das sndromes descritas at agora. Homens com a sndrome de Klinefelter tendem a ser mais altos do que a mdia, com braos e pernas desproporcionalmente longos. O exame clnico de pacientes ps-pberes revela testculos pequenos (menos de 10ml) e a maioria dos homens com sndrome de Klinefelter estril como resultado da atrofia dos tbulos seminferos. Os nveis de testosterona em adolescentes e adultos so baixos. A ginecomastia vista em aproximadamente 1/3 dos homens afetados, e leva a um risco aumentado de cncer de mama. O risco pode ser reduzido por mastectomia. Os plos no corpo so tipicamente esparsos nos homens ps-pberes, e a massa muscular tende a ser reduzida. Alm disso, existe uma predisposio para incapacidade de aprendizado e reduo do QI. Trissomia do Cromossomo X o caritipo 47, XXX ocorre em aproximadamente 1/1.000 mulheres e normalmente tem conseqncias benignas. Anomalias fsicas claras so vistas raramente, mas essas mulheres algumas vezes sofrem de esterilidade, irregularidade menstrual ou retardo mental leve. Aproximadamente 90% dos casos so resultado de no-disjuno na me e, assim como as outras trissomias, a incidncia aumenta entre a prole de mulheres mais velhas. Tambm foram detectadas mulheres com 4, 5 ou at mais cromossomos X. Cada cromossomo X adicional acompanhado por retardo mental aumentado e anomalias fsicas. Sndrome 47, XYY a ocorrncia deste caritipo de 1/1.000 homens. Os portadores desta sndrome tendem a ser mais altos do que a mdia e possuem uma reduo de 10 a 15 pontos no QI e poucos problemas fsicos.

3.2.2. Anomalias Cromossmicas Estruturais: As anomalias estruturais dos cromossomos podem ser no-balanceadas (quando o rearranjo causa um ganho ou perda de material cromossmico) ou balanceadas (quando o rearranjo no produz uma perda ou um ganho de material cromossmico). Ao contrrio da aneuploidia e da poliploidia, anomalias estruturais balanceadas freqentemente no produzem conseqncias srias para a sade. Entretanto, as anomalias estruturais nobalanceadas podem comprometer o desenvolvimento do indivduo portador e de sua prole. 3.2.2.1. Anomalia cromossmica estrutural do tipo translocao Uma translocao o intercambio de material gentico entre cromossomos no homlogos. Translocaes balanceadas representam uma das aberraes cromossmicas mais comuns nos seres humanos, ocorrendo em 1/500 a 1.000. Existem dois tipos bsicos de translocaes, denominadas translocaes recprocas e translocaes balanceadas. Translocaes recprocas as translocaes recprocas acontecem quando ocorrem quebras em dois cromossomos diferentes e os segmentos cromossmicos so mutuamente intercambiado. Os cromossomos resultantes so denominados cromossomos derivados. O portador de uma translocao recproca normalmente no afetado porque possui um complemento normal do material gentico. Entretanto, a prole do portador pode ser normal, pode portar a translocao ou ter duplicaes ou delees de material gentico. Translocaes robertsonianas nesta classe de translocao, os braos curtos de dois cromossomos acrocntricos (13, 14, 15, 21 e 22) so perdidos e os braos longos se fundem no centrmero para formar um nico cromossomo. Esse tipo de translocao confinado aos cromossomos acrocntricos porque o brao curto desses cromossomos muito pequeno e no contem material gentico essencial. Quando uma translocao robertsoniana ocorre, os braos curtos so normalmente perdidos durante as divises celulares subseqentes. Como os portadores da translocao robertsoniana no perdem materiais genticos essencial, eles so fenotipicamente normais, mas possuem apenas 45 cromossomos em cada clula. Suas proles, entretanto, podem herdar um brao longo ausente ou extra de um cromossomo acrocntricos. Delees uma deleo causada por uma quebra cromossmica e subseqente perda de material genmico. Uma nica quebra levando a perda que inclui a ponta do cromossomo denominada deleo terminal. Quando ocorrem duas quebras e o material genmico entre elas perdido, ocorre uma deleo intersticial. As delees visveis microscopicamente geralmente envolvem a perda de muitos genes, e as conseqncias de se perder essa quantidade de material gentico, mesmo sendo de apenas um membro do par de cromossomos, podem ser severas. Um exemplo bem conhecido de sndrome de deleo cromossmica a sndrome de cri-du-chat (do francs, miado de gato) que se refere ao choro caracterstico das crianas com esta sndrome. Esse choro normalmente se torna menos bvio medida que a criana cresce, tornado o diagnstico clnico mais difcil aps os dois anos de idade. A sndrome de cri-du-chat causada por uma deleo do brao curto distal do cromossomo 5: o caritipo 46, XX, Del (5p). Vista em aproximadamente 1/50.000 nativivos, ela tambm caracterizada por retardo mental (QI em torno de 35), microcefalia, e uma aparncia facial caracterstica. A sobrevivncia at a vida adulta j foi observada, mas no comum. Duplicaes uma trissomia parcial, ou duplicao, de material gentico pode ser vista na prole de indivduos que portam uma translocao recproca. Duplicaes podem tambm ser causadas por crossing desigual durante a meiose, como descrito para os loci da viso em cores ligados ao X e para a doena de Charcot-Marie-Tooth. As duplicaes tendem a produzir conseqncias menos srias do que as delees, novamente ilustrando o princpio de que a perda de material genmico mais sria do que o seu excesso.

16

Cromossomo em anel as delees algumas vezes ocorrem em ambas as extremidades de um cromossomo. Nestes casos, ass terminaes remanescentes do cromossomo podem ento se fundir, formando um cromossomo em anel. Se o cromossomo em anel inclui o centrmero, ele pode freqentemente continuar atravs da diviso celular, mas sua estrutura pode criar dificuldades. Os cromossomos em anel so freqentemente perdidos, resultando em monossomia para o cromossomo pelo menos em algumas clulas (i.e., pode ser visto mosaicismo para o cromossomo em anel). Cromossomos em anel foram descritos em pelo menos um caso para cada um dos cromossomos humanos. Inverses uma inverso o resultado de duas quebras, em um cromossomo, e posterior reinsero do fragmento perdido em seu stio original, mas na ordem invertida. Se a inverso inclui o centrmero, ela denominada inverso pericntrica. Inverses que no envolvem o centrmero so denominadas inverses paracntricas. Assim como as translocaes recprocas, as inverses so um arranjo estrutural balanceado. Conseqentemente, elas raramente produzem doenas no portador da inverso. As inverses podem interferir com a meiose, entretanto, produzindo anomalias cromossmicas na prole dos portadores da inverso. Como os cromossomos devem se alinhar em perfeita ordem durante a prfase I, um cromossomo com uma inverso deve formar uma laa para se alinhar com seu homlogo normal. O crossing dentro dessa ala pode resultar em duplicaes ou delees nos cromossomos das clulas-filhas. Assim, a prole de indivduos portadores de inverses freqentemente possu5 we delees cromossmicas ou duplicaes. Estima-se que 1/1.000 pessoas porte uma inverso e esteja, dessa forma, em risco de produzir gametas com duplicaes ou delees. Isocromossomo algumas vezes um cromossomo se divide ao longo do eixo perpendicular ao seu eixo normal de diviso. O resultado um isocromossomo, um cromossomo que tem duas cpias de um brao e nenhuma cpia do outro. A maioria dos isocromossomos observados em nativivos envolve o cromossomo X, e indivduos com isocromossomos Xq (46, X,i[Xq]) normalmente possuem caractersticas da sndrome de Turner. O isocromossomo 18q, que produz uma cpia extra do brao longo do cromossomo 18, foi observado em bebs com a sndrome de Edwards. Embora a maioria dos isocromossomos parea ser formada por falhas na diviso, eles tambm podem ser criados por translocaes robertsonianas de cromossomos acrocntricos homlogos (ex.: translocao robetsoniana dos dois braos longos do cromossomo 21).

3.3. Herana Polignica: O termo multifatorial atribudo ao modo de transmisso apresentado por um grande nmero de distrbios que possuem agregao famlia, mas que no esto de acordo com o padro reconhecido de herana monognica. Estes distrbios incluem vrias malformaes congnitas comuns (fenda labial e palatina, defeitos de fechamento do tubo neural) e distrbios desenvolvidos na vida adulta (diabetes, doena arterial coronariana, hipertenso). O mecanismo gentico envolve a interao de inmeros genes, cada um com efeito discreto (polignico), com fatores ambiental.

3.3.1 Identificao de um distrbio multifatorial Por definio, os distrbios multifatoriais tm um componente familial que no pode ser explicado por herana mendeliana simples, e conseqentemente no h mtodos estatsticos capazes de detectar com segurana o risco de recorrncia do carter numa famlia. Diante disso, tornase importante o rastreamento de caractersticas que permitam predizer se um distrbio possui ou no um componente gentico importante. Para tanto, utiliza-se abordagem, tais como e estudo de agregao familiar e de concordncia entre gmeos. 3.3.1.1. Agregao famlia Doenas de herana complexa normalmente demonstram agregao familiar porque mais provvel que os parentes de um indivduo afetado tenham os mesmos alelos que predispem s doenas em comum com a pessoa afetada do que com indivduos no relacionados. A agregao familiar de uma doena pode ser medida por meio da comparao da freqncia da doena nos parentes do probando afetado com a freqncia (prevalncia) na populao geral. A razo do risco relativo r definida como:

r =

prevalenciadadoenanosparentesdeumapessoaafetada prevalenciadadoenanapopulaogeral

O valor de r a medida da agregao familiar que depende do risco de recorrncia da doena na famlia e da prevalncia na populao; quanto maior o r, maior a agregao familiar. A prevalncia da populao faz parte do calculo porque, pois quanto mais comum for a doena, maior a probabilidade da agregao ser apenas uma coincidncia e menor a probabilidade de ser resultante do compartilhamento de alelos que predispem a doena. 3.3.1.2. Estudo de Gmeos A anlise da taxa de concordncia em gmeos pode dar uma valiosa informao sobre a contribuio relativa de genes e ambiente em causar um determinado distrbio. Os gmeos so denominados de concordantes se ambos forem afetados ou no afetados; eles so discordantes se apenas um for afetado. Aproximadamente um tero dos gmeos so monozigticos (MZ); os restantes dois teros so dizigticos (DZ). Os gmeos MZ surgem de um nico zigoto fertilizado, que se dividiu em dois, e, portanto so geneticamente idnticos. Os gmeos DZ surgem quando dois ovcitos so fertilizados por dois espermatozides diferentes; e portanto, compartilham em mdia 50% de seus genes. Se uma condio exclusivamente gentica, as taxas de concordncia geralmente so de100% em gmeos MZ,mas muito menos em gmeos DZ. Se uma condio for multifatorial, ento a taxa de concordncia maior nos gmeos MZ que nos gmeos DZ, mas raramente to alta quanto 100%. Finalmente, se um distrbio exclusivamente de origem ambiental, ento a taxa de concordncia em MZ e DZ ser aproximadamente igual.

3.3.2. Abordagens para encontrar genes de suscetibilidade A identificao de genes que contribuem para distrbios multifatoriais uma rea de intensa atividade, que visa identificar genes que tenham um papel importante para o aumento da suscetibilidade de distrbios comuns da vida adulta de modo a desenvolver testes para a sua deteco prclnica e novos enfoques com base gentica para a sua preveno e tratamento. Infelizmente, os progressos tm sido desanimadores, aponto de, aps mais de uma dcada de grandes investimentos e pesquisa, s terem sido identificados alguns genes de suscetibilidade de doenas multifatoriais. Para tanto, foram aplicadas trs estratgias principais: anlise de ligao, estudos de associao e desequilbrio de ligao. 3.3.2.1. Anlise de ligao O mtodo mais comumente usado envolve a anlise de pares de irmos afetados mais freqentemente do que seria esperado pelo acaso (figura 2). Em mdia, os pares de irmos seriam esperados compartilhando, 2, 1 ou 0 alelos em um determinado lcus em uma proporo de 1:2:1. Se identificado um lcus no qual um grande nmero de pares de irmos com um determinado distrbio apresenta desvio estatstico significativo desta proporo, ento isto indica que os alelos neste lcus, ou em um lcus adjacente ligado, esto de algum modo implicados em causar a doena.

17

Figura 2: A lgica do uso de pares de irmos afetados na anlise de ligao

Em um estudo tpico, uma amostra com pelo menos 200 pares de irmos afetados seria analisada juntamente com seus pais e cerca de 300 loci igualmente espaados usando-se um painel de microssatlites polimrficos (SNPs).Isto gera uma probabilidade significativa de se detectar ligao. Anlise matemtica feita usando-se os programas de computao, tais como MAPMARKER/SIBS ou GENEHUNTER. Este tipo de anlise de ligao, nomeada de escaneamento total do genoma (GWAs), uma poderosa ferramenta na deteco de loci candidatos suscetibilidade. Entretanto, os dados obtidos precisam ser validados em diferentes populaes com o intuito de eliminar possveis resultados do tipo falso-positivo. Sendo assim, o passo seguinte utilizar estratgias de estudos de associao e de desequilbrio de ligao. 3.3.2.2. Estudos de associao Os estudos de ligao envolvem a anlise de um grande painel de marcadores, tais como os SNPs, em geral usando-se a tecnologia de microarranjos numa amostra numerosa. Esta abordagem visa detectar associaes, estatisticamente significativas, entre um ou mais marcadores e a doena multifatorial sob investigao. A desvantagem deste mtodo que uma associao aparente pode de fato no ser causualmente relevante devido aos seguintes fatores: A associao espria devido a um erro estatstico. Se um nmero suficientemente grande de marcadores analisado, possvel que, apenas por acaso, um ou mais apresentem uma aparente associao estatstica com a doena; A associao pode ser espria devido a estratificao a populao. Isto significa que tanto o distrbio quanto o alelo aparentemente associado so comuns na populao que est sendo estudada; 3.3.2.3. Desequilbrio de ligao Uma vez que tenha sido feita a localizao aproximada com base na anlise de ligao ou estudos de associao, a etapa seguinte geralmente envolve uma tentativa de situar a regio candidata usando-se a abordagem de desequilbrio de ligao. A lgica desse enfoque baseada na hiptese de que a maioria dos membros afetados da populao em estudo compartilhariam um mesmo segmento genmico curto, equivalente a um hapltipo em comum, circundado por alelos de suscetibilidade. Assim, uma vez identificada a(s) regio(es) de interesse, esta(s) (so) analisada(s) usando-se marcadores polimrficos (geralmente SNPs) a fim de estreitar a regio de interesse, para ento tentar identificar de genes candidatos. Infelizmente, este processo no fcil, uma vez que: 1) grupos tnicos ou populaes diferentes podem desenvolver a mesma doena por motivos totalmente diferentes e, portanto, ter fatores genticos de risco distintos; e 2) em populaes heterogenias provvel que muitos alelos de suscetibilidade estejam presentes, o que dificulta a deteco de eventos de desequilbrio de ligao.

3.3.3. Exemplos de distrbios multifatoriais: Doena de Alzheimer esta doena a causa mais comum de demncia senil e pr-senil, com uma prevalncia de cerca de 20% em pessoas com mais de 80 anos de idade. Na maioria das famlias acometidas, observa-se que um padro de herana multifatorial. Estudos por anlise de ligao, realizados em famlias com casos da doena, permitiram a deteco de um lcus polimrficos no cromossomo 19 associado doena. A presena de alelos de risco no gene da apolipoprotena E (ApoE) est freqentemente aumentada em pacientes com o diagnstico de Alzheimer a ponto de que as chances dos portadores dos alelos de risco vir a desenvolver a doena de cerca de 35% para os homens e 50% para as mulheres. Estudos de ligao sugerem que ainda existam quatro outros genes que conferem suscetibilidade a doena. Diabetes mellitus tipo 1 esta forma relativamente rara, com prevalncia de 1/200, geralmente se apresenta na infncia ou no incio da idade adulta. Esta doena causada pela destruio das clulas pancreticas que produzem insulina. Tanto os estudos familiais quanto de gmeos so consistentes com a herana multifatorial. O risco de recorrncia para irmos e prole da pessoa afetada de 5-6%. As taxas de concordncia em gmeos MZ e DZ so de aproximadamente 30-49% e de 5-10%, respectivamente. A pesquisa de genes de suscetibilidade identificou dois loci definidos. O primeiro o lcus IDDM1, onde se situa o gene HLA, que contribui com 30-40% da suscetibilidade total. Cerca de 95% das pessoas afetadas e portadoras tm o antgeno HLA-DR3 e/ou HLA-DR4, enquanto que eles so encontrados em apenas 50% da populao geral. O segundo lcus, IDDM2, inclui o gene de insulina no cromossomo 11, juntamente com a regio que contem vrias cpias de seqncias microssatlites repetida de 14pb. Um curto nmero de repetio confere suscetibilidade diabetes tipo 1, provavelmente reduzindo a expresso do gene da insulina. Diabetes mellitus tipo 2 a diabetes tipo 2 afeta aproximadamente 5% dos adultos aps os 45 anos. Os riscos para parentes em primeiro grau so de 10-15%, ou seja, duas a trs vezes o risco da populao geral, e a taxa de concordncia para gmeos MZ de 90%; logo, a evidencia em favor de uma etiologia gentica forte. O progresso em encontrar genes que contribuem para a forma comum de manifestao tardia do diabetes tem sido lento. Os estudos de ligao e associao identificaram mais de 20 loci diferentes, mas freqentemente os achados originais no foram replicados com estudos subseqentes dando resultados conflitantes.

18

MDULO 4: GE TICA DO C CER O cncer um importante problema de sade pblica mundial devido a sua elevada taxa de mortalidade. Dados da Organizao Pan-Americana da Sade (OPAS, 2002) indicaram que o cncer responsvel por mais de 15% de todas as causas de morte no mundo tanto em pases desenvolvidos, quanto em desenvolvimento. No Brasil, um levantamento feito realizado em 2003 pelo Ministrio da Sade mostrou que o cncer ataca mais de um tero da populao brasileira. O cncer, se no tratado, invariavelmente fatal. O diagnstico precoce e o tratamento imediato so vitais, assim como a identificao de pessoas com risco aumentado de cncer, antes do seu desenvolvimento, constitui-se um importante objetivo da pesquisa do cncer. O cncer uma coleo de doenas que compartilham a caracterstica comum de crescimento celular incontrolado. Vrios eventos-chave precisam ocorrer para as clulas escaparem das restries que evitam a proliferao incontrolada, tais como: 1) sinais adicionais de crescimento dever ser produzidos e processados e as clulas devem tornar-se resistentes aos sinais que normalmente inibem o crescimento; 2) como estas caractersticas anormais tipicamente levariam ao processo de morte celular programada (apoptose), as clulas devem de alguma forma invalidar este processo; 3) a massa de clulas crescentes (tumor) requer nutrio, ento um novo abastecimento sanguneo deve ser obtido pela angiognese (formao de novos vasos sanguneos); 4) sinais inibitrios adicionais devem ser superados para que o tumor atinja um estado maligno, tornando-o capaz de invadir os tecidos prximos e se espalhar (metstase) para locais mais distantes no corpo. A capacidade de invadir e de formar metstase distingue as neoplasias malignas das benignas.

4.1.Mecanismos bsicos de controle da proliferao celular: Um componente da regulao celular mediado por sinais externos que chegam as clulas pelos fatores de crescimento (fatores de crescimentos derivados de plaquetas, fatores de crescimento epidermais, hormnios esterides) produzidos por outras clulas. Cada fator de crescimento interage com um receptor de crescimento especfico situado na superfcie da clula. A ligao de um fator de crescimento ativa o receptor, disparando molculas que enviam mensagens para o ncleo da clula em um processo chamado de transduo de sinal. As molculas transportadoras deste sinal incluem cinases proticas, tais como tirosina cinase src, a cinase protica ativada por mitgeno (mapK) e a cinase jun (junK), que podem alterar a atividade de protenas alvo atravs de sua fosforilao. O estgio final da via de transduo de sinal a regulao da transcrio de DNA no ncleo. Os componentes da cascata de transduo de sinal interagem com fatores de transcrio nuclear que regulam a atividade de genes especficos cujos produtos proticos influenciam o crescimento celular e a proliferao. Os genes que codificam estes fatores de transcrio incluem MYC, FOS e JUN. Depois de vrios ciclos de diviso celular, as clulas normalmente recebem sinais que as dizem para pararem o crescimento e se diferenciarem em clulas especializadas. Os sinais podem vir de polipeptdeos, de hormnios esterides, do contato direto com clulas adjacentes, ou de programas internos que definem o nmero de divises celulares permitidas. Os sinais so transduzidos at o ncleo da clula receptora. Nesse caso, por meio da alterao dos padres de transcrio dos genes que governam os padres do ciclo celular, eles reprimem genes que promovem a diviso celular e induzem genes que inibem a entrada no ciclo de diviso celular. Uma clula tumoral pode emergir a partir de uma populao de clulas em crescimento por meio do acmulo de mutaes nestes genes regulatrios. Ainda que estas mutaes ocorram apenas raramente, estas clulas podem deixar de responder aos sinais de diferenciao e continuarem a se dividir ao invs de entrarem no programa de diferenciao normal. Mais ainda, o cncer parece ser quase sempre resultado de uma srie de eventos progressivos que aumentam a extenso da desregulao dentro da linhagem celular. Finalmente, emerge uma clula cujos descendentes se multiplicam sem os controles apropriados Mudanas adicionais do a estas clulas capacidade de invadirem tecidos adjacentes e formarem metstase. Cada uma destas mudanas envolve mutaes, e a necessidade de mltiplas alteraes molecular foi caracterizada como multi-evento (multi-hit) da carcinognese.

4.2. Classes de genes envolvidos no desenvolvimento do cncer: O desenvolvimento do cncer (carcinognese) resulta de mutaes em genes que regulam a proliferao celular e a morte celular programada. Os genes nos quais as mutaes causam cncer so classificados em duas categorias: os oncogenes e os genes supressores tumorais (genes de manuteno e genes de controle). O catlogo de genes envolvidos no cncer inclui tambm genes que so transcritos em RNAs no-traduzidos a partir dos quais microRNAs (miRNAs) reguladores so gerados. Existem pelo menos 250 miRNAs no genoma humano que realizam a inibio mediada por RNA da expresso de seus genesalvo codificadores de protenas, ou por induzirem a degradao dos seus mRNAs-alvo ou por bloquearem sua traduo. Aproximadamente, 10% dos miRNAs so encontrados hiperexpressos ou inibidos em vrios tumores, que so referidos como oncomirs. A hiperexpresso de alguns miRNAs pode suprimir a expresso de genes-alvo supressores de tumores, enquanto que a perda de funo de outros miRNAs pode permitir a hiperexpresso de oncogenes que eles regulam. Como cada miRNA pode regular at 200 genes-alvo diferentes, a hiperexpresso ou a perda de funo dos miRNAs pode ter amplos efeitos oncognicos porque muitos genes estaro desregulados. 4.2.1.Oncogenes: Um oncogene um proto-oncogene mutante cuja funo ou expresso alterada resulta na estimulao anormal da diviso e proliferao celular. As mutaes responsveis pela ativao de um oncogene podem promover o ganho de funo na seqncia que codifica os elementos reguladores ou ainda um aumento do nmero de cpias genmicas, levando a uma funo heterecrnica ou ectpica desregulada do produto do oncogene. Os oncogenes tm um efeito dominante em nvel celular; isto , quando ele ativado ou hiperexpresso, um nico alelo mutante suficiente para iniciar a mudana no fentipo de uma clula, de normal para maligno. Os oncogenes ativados codificam protenas que agem muitas etapas na via que controla o crescimento celular, tais como: 1) fatores de crescimento que estimulam a diviso celular (ex. SIS); 2) receptores (ex: ERBB, FMS) e protenas citoplasmticas que traduzem esses sinais (ex. famlia RAS e ABL); 3) protenas nucleares ligantes a DNA e fatores de transcrio que respondem aos sinais traduzidos (MYC e JUN); e 4) protenas que impedem a morte celular programada (temolerase e protenas antiapoptticas). 4.2.1.1.Ativao de Oncogenes: A ativao de oncogenes compreende um ganho de funo que pode ser quantitativo (aumento de produo de um produto inalterado) ou qualitativo (sntese de um produto sutilmente modificado em conseqncia de uma mutao ou sntese de um produto novo por um gene quimrico criado por rearranjo cromossmico). Essas mudanas so dominantes e normalmente afetam um s alelo do gene. Ativao do Oncogene por amplificao gnica: A amplificao gnica um fenmeno caracterizado pela presena de mltiplas cpias normais de um gene ou de um segmento genmico na clula, resultando no aumento do nvel da expresso gnica. A amplificao gnica comum em muitos cnceres, incluindo neuroblastoma, gliobastomas e cncer colorretal. Os segmentos amplificados do DNA so prontamente detectados por tcnicas de citogentica molecular (hibridizao genmica comparativa) ou convencional (bandeamento cromossmico). Neste ltimo caso, a amplificao gnica pode se apresentar como cromossomos acessrios muito pequenos (diminutos duplos) ou como regies de colorao homognea (regies genmica que normalmente no so bandeadas e contm mltiplas cpias amplificadas de um segmento particular de DNA). Como e por que os diminutos duplos ou as regies de colorao homognea ocorrem ainda pouco compreendido, mas sabe-se que as regies amplificadas incluem cpias extras e normais de proto-oncogenes, tais como os genes que codificam myc, ras e o receptor de crescimento epitelial, que estimulam o crescimento celular ou bloqueiam a apoptose, ou ambos. Ativao do Oncogene por mutaes pontuais: O gene H-RAS pertence a uma famlia de genes que codificam protenas envolvidas na transduo de sinais dos receptores acoplados protenas G. Um sinal do receptor desencadeia a ligao da GTP protena RAS e o complexo GTP-RAS retransmite o sinal na clula. A protena RAS tem atividade de GTPase, logo o complexo GTP-RAS convertido rapidamente em GDP-RAS inativo. Mutaes pontuais especficas nos genes RAS so encontradas freqentemente nas clulas de vrios tumores, como os de cncer de colo, de pulmo, de mama e de bexiga. Elas levam substituio de aminocidos, que fazem diminuir a atividade de GTPase da protena RAS. Em conseqncia, o sinal de GTP-RAS inativado mais lentamente e a resposta celular ao sinal do receptor se torna excessiva. O RAS mutante estimula o crescimento da linhagem celular, transformando-a, portanto em um tumor.

19

Ativao do Oncogene por translocaes cromossmicas: Nem sempre os oncogenes so resultados de uma mutao do DNA. Em alguns casos, um oncogene ativado por uma mutao cromossmica, geralmente atravs de translocao. Mais de 40 translocaes cromossmicas oncognicas foram descritas, principalmente em leucemias espordicas e linfomas.Em alguns casos, os pontos de quebra das translocaes so dentro de introns de dois genes, fusionando dois genes em um gene anormal que codifica uma protena quimrica com novas propriedades oncognicas. O exemplo mais bem conhecido a translocao entre os cromossomos 9 e 22 que observada na leucemia meilide crnica. Neste caso, a translocao move o proto-oncogene ABL (gene da tirosina quinase) da sua posio normal no cromossomo 9q para a regio de grupo de ponto de quebra do gene BCR (do ingls breakpoint cluster region) no cromossomo 22q. A justaposio permite a sntese de uma protena quimrica que maior do que a protena abl normal e que tem a atividade da tirosina quinase aumentada. O aumento da atividade da tirosina quinase da nova protena codificada pelo gene quimrico constitui-se no evento primrio que causa a leucemia mielide crnica. Uma nova e altamente eficiente terapia para a leucemia mielide crnica foi desenvolvida com a droga imatinibe e baseada na inibio dessa atividade da tirosina quinase quimrica. Em outros, a translocao ativa um oncogene colocando-o em seguida a um forte promotor constitutivo, que pertence a outro gene. Dois exemplos bem conhecidos so a translocao entre os cromossomos 8 e 14 no linfoma de Burkitt e a translocao envolvendo o cromossomo18 no linfoma de clulas B. Na maioria dos tumores do linfoma de Burkitt, o proto-oncogene MYC translocado de sua posio cromossmica normal em 8q24 para uma posio distal no lcus da cadeia pesada da imunoglobulina em 14q32. Citogeneticamente, essa mutao vista como uma translocao 8;14 aparentemente balanceada. Entretanto, a translocao coloca o acentuador ou outras seqncias de ativao transcricional, normalmente associadas a genes da imunoglobulina, perto do gene MYC. O efeito dessa translocao a expresso desregulada do gene MYC, que resulta em crescimento celular descontrolado. A protena myc um fator de transcrio com efeitos potentes na expresso de vrios genes envolvidos na proliferao celular como tambm na expresso da telomerase. O primeiro gene apopttico implicado no cncer foi identificado no linfoma espordico de clula B. Em quase todos os linfomas de clula B do tipo folicular, um gene, o BCL2, localizado em 18q21, foi encontrado ativado por uma translocao cromossmica t(14;18) que colocou o gene sob um forte promotor e acentuador do gene da cadeia pesada de imunoglobulina, localizado em14q32. A protena codificada pelo BCL2 uma protena de membrana interna mitocondrial com potentes efeitos antiapoptticos nas clulas B. A expresso prolongada e inapropriada desse gene, ativada pelo promotor da imunoglobulina, resulta em expanso macia de clulas B, no por causa da proliferao aumentada, mas porque a apoptose normal dessas clulas est inibida.

4.2.2. Genes Supressores Tumorais (GST): Enquanto as protenas codificadas pelos oncogenes promovem o cncer, as mutaes nos genes supressores de tumor contribuem para a malignidade por um mecanismo diferente, isto , atravs da perda de funo de ambos os alelos de um gene. Os GSTs so altamente heterogneos. Alguns suprimem realmente os tumores por regulares o ciclo celular ou por causarem a inibio do crescimento pelo contato clula-clula; os GSTs desse tipo so denominados de genes de controle porque eles regulam diretamente o crescimento celular. Os GSTs de controle codificam: 1) os reguladores de vrios pontos de checagem do ciclo celular (RB1, TP53); e 2) mediadores da morte celular programada (DCC, VHL). Outros GSTs, os de manuteno, esto envolvidos no reparo de danos ao DNA e na manuteno da integridade genmica. A perda de ambos os alelos de genes que esto envolvidos no reparo de danos ao DNA ou quebras cromossmicas leva diretamente ao cncer, pois permite que mutaes secundrias adicionais se acumulem ou em proto-oncogenes ou em outros GSTs. Os GSTs de manuteno codificam: 1) protenas responsveis pela deteco e pelo reparo das mutaes (BRCA1 e BRCA2); 2) protenas envolvidas na disjuno e normal dos cromossomos durante a mitose; e 3) componentes da maquinaria da morte celular programada. 4.2.2.1.Genes de Regulao do ciclo celular (gatekeepers): Gene Supressor Tumoral RB1- O produto do gene RB1 uma fotoprotena que hipofosforilada e depois hiperfosforilada em diferentes estgios do ciclo celular. No seu estado hiperfosforilado, bloqueia a progresso do ciclo celular no limite entre as fases G1 e S, inibindo assim, a entrada na fase S pela liberao de fatores que promovem a sntese de DNA. medida que a Rb1 se torna progressivamente mais fosforilada, libera seus parceiros de ligao protena, permitindo a entrada da clula na fase S; durante o curso do ciclo celular, a Rb1 , ento, progressivamente defosforilada, o que permite que ela funcione novamente como bloqueio de entrada para a fase S do prximo ciclo celular. A perda do gene Rb1 priva as clulas de um importante ponto mittico de checagem e permite a proliferao descontrolada. O gene Rb1 , portanto, um tpico GST de regulao. digno de nota que o Rb1 mutado em grande nmero de linhagens celulares derivadas de certos outros tumores durante sua progresso. Gene Supressor Tumoral TP53 - A protena p53 uma protena de ligao ao DNA que parece ser um componente importante da resposta celular aos danos no DNA. Alm de ser um fator de transcrio que ativa a transcrio de genes que cessa a diviso celular e permite o reparo de danos ao genoma, a TP53 parece, tambm, estar envolvida na induo de apoptose de clulas que tenham sofrido danos irreparveis ao DNA. Portanto, a perda de funo da TP53 permite que clulas com o DNA danificado sobrevivam e se dividam, propagando, assim, as mutaes potencialmente oncognicas. O gene TP53 pode, portanto, ser considerado tambm um GST de regulao. Gene Supressor Tumoral F1: A inspeo de seqncias do gene da neurofibromina (NF1) e seus produtos proticos demonstraram uma homologia significativa com as protenas que ativam a atividade da GTPase do produto do oncogene RAS. Esse achado sugere fortemente, que p produto do NF1 normal interage com um membro desconhecido da famlia do gene RAS para regulara atividade proliferativa em clulas normais.O gene mutante NF1 falha na regulao do crescimento em clulas normais, a partir das quais se originam os neurofibromas observados em pacientes com neurofibromatose tipo 1, levando a um crescimento inapropriado e a formao de tumores. Mutaes somticas de perda de funo foram encontradas em NF1 em vrios tumores, incluindo cncer colorretal, melanoma, e neuroblastoma. As mutaes na linhagem germinativa em NF1 causam a neurofibromatose tipo1. 4.2.2.2.GTS de Manuteno (caretakers): genes que atuam em mecanismos de reparo do D A Existem vrios sistemas complexos para reparar danos no DNA, decorrentes de agentes mutagnicos extrnsecos (radiao ionizante, luz ultravioleta, agentes qumicos mutagnicos) ou por erros intrnsecos na replicao do DNA. Estes sistemas usam vrias famlias de enzimas para desenrolar a dupla hlice (helicases), remover o DNA anormal (endonucleases e exonucleases), sintetizar um novo seguimento de DNA (polimerase) e unir os novos filamentos (DNA ligases). Erros em qualquer um destes sistemas podem levar ao acmulo de mutaes em oncogenes e genes supressores tumorais, levando por sua vez formao de tumores. Processos relevantes conhecidos como associados a sndromes especficas de predisposio ao cncer incluem a exciso de nucleotdeos, reparo de quebras bifilamentares, e o reparo de pares de bases mal pareadas. Impedimento de exciso de nucleotdeos: O reparo por exciso de nucleotdeos envolve uma via que comea com a deselicoidizao da cromatina, seguido da exciso de nucleotdeos no filamento danificado, e completado pela sntese e integrao do novo DNA pela DNA polimerase e DNA ligase. A capacidade reduzida ou ausente do reparo global do genoma ou do reparo ps-replicao representa a perda das funes necessrias para a manuteno da integridade do genoma, e resulta em acmulo de mutaes oncognicas. As neoplasias cutneas de pacientes com o xeroderma pigmentoso possuem um nvel elevado de mutaes de oncogenes e de GSTs, do que os tumores da populao normal, e tais mutaes parecem ser altamente especficas do UV. Reparo prejudicado de quebra bifilamentar:O reparo de quebras bifilamentares, como pode ocorrer por radiao ionizante, envolve um processo complicado e no totalmente compreendido, onde o ciclo celular parado para permitir que um complexo multiproteico inicie e complete de reparo. O complexo multiproteico inclui as protenas ATM, BRCA1 e BRCA2, reconhecidamente envolvidas com sndromes de predisposio ao cncer. ATM atua na parada do ciclo celular e na ativao do complexo protico de reparo bifilamentar. A ocorrncia de mutaes no gene da ATM causa a ataxia telangiectasia. BRCA1 e BRCA2 atuam no reparo de quebras bifilamentares pelos processos de recombinao homloga e

20

ligao das pontas dos filamentos de DNA quebrados. As mutaes heterozigotas nos genes que codificam BRCA1 e BRCA2 causam cncer hereditrio de mama e ovrio, enquanto que mutaes homozigotas no BRCA2 causam a anemia de Fanconi.

4.2.3.Inativao dos GSTs: A existncia de mutaes no GSTs, levando ao cncer, foi proposta originalmente em 1960 para explicar por que certos tumores podem ocorrer em ambas as formas, hereditria e espordica. Por exemplo, foi sugerido que a forma hereditria do cncer infantil de retina (retinoblastoma), podia ser iniciada quando uma clula, em uma pessoa heterozigota para a mutao na linhagem germinativa em um gene supressor de tumor retinoblastoma, o qual necessrio para impedir o desenvolvimento do cncer, sofre uma segunda mutao, um evento somtico, que inativa o outro alelo. Como conseqncia desse segundo evento somtico, a clula perde a funo de ambos os alelos, originando um tumor. A perda do alelo normal em um tumor chamada de perda de heterozigose (LOH, do ingls loss of heterozigosity). O segundo evento em geral uma mutao somtica, embora a perda de funo sem mutao, tal como ocorre com o silenciamento transcricional, tenha sido tambm observada em algumas clulas cancerosas. Na forma espordica do retinoblastoma, ambos os alelos esto tambm inativados, mas nesse caso, a inativao resulta de dois eventos somticos que ocorreram na mesma clula. O modelo dos dois eventos amplamente aceito como uma explicao para muitos cnceres familiares alm do retinoblastoma, incluindo a polipose de clon familiar, o cncer de mama familiar, a neurofibromatose tipo 1 (NF1), e a sndrome de Li-Fraumeni. Os mecanismos genticos responsveis pela inativao dos genes supressores tumorais so: 1) deleo, refletida na perda de heterozigose; 2) mutaes pontuais; 3) converso gnica; e 4) metilao do DNA. Converso gnica: um evento raro no qual um membro do par de alelos heterozigotos torna-se idntico ao seu homlogo, possivelmente devido a formao de um heteroduplex entre os dois alelos com o subseqente reparo das bases mal pareadas. Metilao do D A: A inativao de GSTs pode tambm ser causada por uma mudana no estrutural decorrente da hipermetilao de regies de controle da expresso gnica (promotor). A hipermetilao dos dinucleotdeos CpG presentes em regies regulatrias de genes supressores tumorais um achado comum em muitos tumores, e existem evidencias que este mecanismo epigentico seja o responsvel pela inativao dos genes CDKN2A, VHL, RB1 e MLH1.

21

MDULO 5 GE TICA DE DOE AS I FECCIOSAS A variabilidade gentica humana na resistncia/suscetibilidade a infeces um processo complexo e influenciado por mltiplos genes. Em principio, podemos distinguir dois tipos diferentes de variao na resistncia a patgenos infecciosos: uma resistncia natural primria, dependente de fatores genticos que influenciam a adeso de agentes infecciosos s clulas do hospedeiro e sua subseqente penetrao intracelular, e uma resistncia secundria, dependente na maior parte da ao do sistema imunolgico.

5.1. Pesquisa de genes de suscetibilidade a doenas infecciosas. Uma primeira questo a ser abordada na pesquisa de mecanismos genticos associados suscetibilidade seria a procura de indivduos geneticamente resistentes que no se infectam e/ou no desenvolvem a doena mesmo compartilhando o mesmo ambiente com indivduos infectados e que teoricamente constituem um foco de infeco. Um segundo indicador da existncia de fatores genticos na suscetibilidade a doenas a maior concordncia em gmeos monozigticos do que em gmeos dizigticos. Um exemplo disso proporcionado por estudos sobre a tuberculose em grupos de gmeos mono- e dizigticos. Enquanto 87,2% de monozigticos eram concordantes em relao tuberculose, entre dizigticos a concordncia era de s 25,6%. Outro aspecto de importncia na procura de determinantes genticos da suscetibilidade o estudo das correlaes intrafamiliares. Cabello et al (1995) trabalhando sobre residentes em zonas endmicas da leishmaniose visceral (LV) verificaram a no existncia de correlao para a LV entre os pais (pai x me), porem correlaes significativas foram observadas nas comparaes pais x filhos e entre pares de irmos; sabendo que o compartilhamento de genes entre os pais relativamente baixo (dependendo das freqncias populacionais), mas que a correlao gentica entre pais e filhos e entre irmos de aproximadamente e , respectivamente, os resultados da agregao familiar antes observados so evidencias claras da existncia de mecanismos genticos na infeco pela LV.

5.2. Estratgias utilizadas na deteco de componentes genticos envolvidos na manifestao da doena: As estratgias adotadas na disseco do componente gentico de doenas complexas esto as anlises de agregao familial de casos, os estudos comparativos de taxas de concordncia da ocorrncia da doena entre gmeos mono e dizigticos, e as anlises de segregao complexa, que visam descrever o modo de herana gentica que melhor explica as observaes em um conjunto de pedigrees. 5.2.1. Estudos de ligao - Estudos de ligao so estudos de mapeamento gentico, cujo objetivo localizar genes responsveis por determinado efeito no intervalo cromossmico mais estreito possvel. Esses estudos, embora poderosos no mapeamento de genes exercendo efeito gentico moderado a intenso, no tm poder de resoluo para implicar um nico gene tipicamente, estudos de ligao terminam localizando o gene em questo em um intervalo genmico contendo dezenas de genes. O resultado desse tipo de estudo normalmente expresso em LOD escores; um LOD escore igual ou superior a 3,0 indica significncia estatstica, e a regio genmica encontrada passa a ser tratada como regio candidata a abrigar o gene que est se procurando identificar. 5.2.2. Estudos de associao - Os estudos de associao, em seu formato mais simples, baseiam-se na comparao das freqncias allicas de um marcador gentico entre os indivduos afetados e no afetados. Determinado alelo considerado associado com o fentipo estudado quando ocorre com freqncia diferente entre indivduos afetados em comparao com um grupo controle de no afetados. Estudos de associao tm alto poder de deteco de efeitos genticos moderados a fracos e geralmente so utilizados ou na anlise de genes candidatos, ou como seqncia complementar de estudos de ligao, com o objetivo de se identificar com preciso, em regio genmica candidata, o gene responsvel pelo efeito detectado.

5.3. Genes candidatos para a suscetibilidade a doenas infecciosas: Fator de necrose tumoral alfa (T F-) o TNF- um potente imunomediador e uma citocina pr-inlamatria que tem sido associada patognese de numerosas doenas humanas. O gene responsvel por esta citocina encontra-se dentro do principal complexo de histocompatibilidade (cromossomo 6p21.3); devido sua atividade biolgica, tem se tornado alvo de procura de polimorfismos dentro deste gene que podem contribuir para a associao desta regio do genoma com um nmero considervel de doenas infecciosas e auto-imunes. Polimorfismos no promotor do gene o TNF- tem sido associados com a suscetibilidade a doenas meningoccica, hansenase, Hepatite B, Hepatite C, HIV-1, leishimaniose tegumentar, malria, tuberculose e choque sptico. A quantidade de TNF no soro apareceu elevada em todos estes estudos o que, juntamente com a associao gentica, sugere que os nveis elevados de TNF tm um papel patognico. Estas consideraes estiveram na base de intervenes teraputicas que, utilizando uma grande variedade de compostos anti-TNF, tiveram por objetivo controlar a severidade das doenas citadas. Lecitina ligada a manose (MBL) - uma protena srica que tem um papel importante na imunidade inata. O MBL liga-se a acares, sobretudo Nacetilglucosamina e manose, existentes superfcie dos microrganismos e facilita a sua opsonizao pelos macrfagos. Ativa tambm o sistema complemento por intermdio de duas proteases de serina que lhe esto associadas. Mutaes que inativam o gene da MBL so freqentes em muitas populaes. Alteraes de um nico aminocido so encontradas nos cdons 52, 54 ou 57, cada uma das quais leva a uma reduo substancial na concentrao de MBL nos heterozigticos. Os homozigticos ou heterozigticos combinados para estes variantes tm uma quantidade muito baixa de MBL no soro, ou no tm MBL. Mutaes no promotor do gene tm tambm efeito, embora menos marcado, na quantidade de MBL srica. As associaes entre as mutaes no gene da MBL e as doenas bacterianas tm sido pouco claras. No entanto, estudos recentes indicam que os indivduos homozigticos para alteraes nos cdons da MBL podem ser mais susceptveis a doena invasiva provocada por bactrias encapsuladas, sobretudo pelo Streptococcus pneumoneae Slc11a1 (previamente denominado RAMP1) - Algumas alteraes de seqncia no gene Slc11a1 tm sido associadas com susceptibilidade para tuberculose pulmonar severa na frica Ocidental. A funo do produto deste gene desconhecida, mas est presente apenas nos macrfagos na membrana dos fagolisossomas em que o M. tuberculosis se multiplica. O gene Slc11a1 homlogo ao recentemente descrito gene NRAMP2, que codifica para um transportador de ons bivalentes que pode influenciar as concentraes intracelulares de ferro e, assim, a multiplicao micobacteriana. Receptor de Vitamina D (VDR) - A forma ativa da vitamina D, vitamina D3, tem simultaneamente funes imuno-regulatrias e um papel importante no metabolismo do clcio. O receptor da vitamina D3 expresso nos macrfagos e linfcitos ativados, e a presena da vitamina D3 leva a um aumento da ativao dos macrfagos e a uma alterao no perfil de secreo de citocinas por parte dos linfcitos. A variao gentica no receptor da vitamina D tem sido associada com resistncia tuberculose e infeco persistente pelo vrus da hepatite B. Antgeno Leucocitrio Humano (HLA) - O papel fundamental do HLA na iniciao e regulao das respostas imunitrias, juntamente com as suas caractersticas polimrficas, motivou numerosos estudos da sua influncia na susceptibilidade s doenas infecciosas. O HLA-DR2, um HLA da classe II, nas populaes Asiticas, predispe em geral para o desenvolvimento da hansenase per se. No entanto, estudos efetuados em populaes indianas demonstraram que o HLA-DR2 est simultaneamente associado com, e geneticamente ligado hansenase tuberculoide. Em algumas populaes asiticas, mas no noutros continentes, o mesmo tipo de HLA tem sido associado com susceptibilidade tuberculose. Desconhece-se o mecanismo envolvido nestas associaes de susceptibilidade, mas especula-se que o HLA-DR2 pode influenciar o tipo de resposta imunitria desenvolvida, levando a uma resposta humoral mais forte porem, a respostas celulares protetoras mais fracas contra os antgenos micobacterianos.

5.4. Bases genticas de doenas infecciosas 5.3.1. Aspectos genticos do vrus da imunodeficincia adquirida (HIV) algumas linhagens deste vrus entram nas clulas T helper por via de um receptor de clula T que normalmente se liga a uma citocina. Uma vez dentro da clula, o HIV insere seu material gentico no ncleo e se utiliza da maquinaria celular para se replicar. A destruio das clulas T helper leva a uma grave imunodeficincia secundria. Recentemente, foi demonstrado que indivduos homozigticos para uma deleo de 32pb no gene que codifica o receptor de citocina (CMKBR5) so resistentes

22

infeco de HIV. Este deleo especialmente comum nas populaes do leste europeu, onde a freqncia do gene atinge 0,16. A anlise de desequilbrio de ligao na regio cromossmica que contem CMKBR5 indica que a deleo surgiu nestas populaes h poucos anos. Como o HIV s se originou h algumas dcadas, alta freqncia gnica no Leste europeu deve ser devida a alguma outra fora evolutiva ou talvez deriva gnica. Evidentemente, haveria uma forte seleo a favor desta mutao nas populaes hoje muito expostas ao HIV, e a deleo eventualmente aumentaria de freqncia nestas populaes. Aspectos genticos da Malria o primeiro exemplo concreto sobre a relao entre fatores genticos e o desenvolvimento de uma doena foi dada pela interao de polimorfismos da cadeia da hemoglobina, a anemia sicmica e a malria provocada pelo Plasmodium falciparum. Pauline t al (1949) mostraram que uma anemia hereditria, comum em americanos de ascendncia africana, podia ser caracterizada atravs da corrida eletrofortica da hemoglobina. Os indivduos infectados apresentavam uma hemoglobina anormal de mobilidade eletrofortica mais lenta do que a hemoglobina normal. Esta hemoglobina denominada S (do ingls slow) um produto da substituio de um cido glutmico por uma valina na posio 6 da cadeia da hemoglobina. Os indivduos que carregavam essa hemoglobina podem apresentar duas formas da doena: a) uma anemia leve, porem com a caracterstica de que seus glbulos vermelhos adotam uma forma de foice quando submetidos a uma baixa tenso de oxignio; estes indivduos so heterozigotos para o gene S e so capazes de sintetizar ambas, uma hemoglobina normal (A) junto com uma hemoglobina anormal (S); b) a forma severa da anemia, pela condio homozigota SS, que devido a seus efeitos pleiotrpicos apresenta uma serie de manifestaes mrbidas que pode leva-los a morte. O polimorfismo da cadeia das hemoglobinas tem uma interao extremamente significativa com a malria: os eritrcitos dos indivduos normais para a hemoglobina (homozigotos AA) constituem um meio apropriado para o desenvolvimento do P. falciparum, portanto esses indivduos tornam-se suscetveis malria; j os eritrcitos dos heterozigotos AS diminuem o desenvolvimento do parasita e conseqentemente apresentam uma anemia leve associada a uma malria tambm leve. Por outro lado, no caso dos homozigotos SS, os parasitas no se estabelece, porem estes indivduos apresentam a forma severa da anemia. Em outras palavras, a hemoglobina S em estado heterozigtico proporciona alguma proteo contra a malria causada pelo P. falciparum. Temos, ento, um exemplo clssico de um polimorfismo gentico sendo mantido por seleo a favor dos heterozigotos, fenmeno este denominado de heterose, onde ambos os alelos so favorecidos pela seleo. Ainda em relao a malria, deve-se mencionar que tanto as talassemias como a deficincia glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PD) tambm tem sido sugerida como protetores contra a malria. Esquitossomose vrios estudos epidemiolgicos realizados em indivduos que vivem em reas onde o Schistosoma mansoni endmico sugerem o envolvimento de fatores genticos na suscetibilidade infeco por este parasita.Observaes anteriores de que a alta intensidade de infeces e reinfeces est agregada dentro de famlias, e no distribudas ao acaso, suportam a hiptese da existncia de um gene que influencia a intensidade da infeco. Atravs de anlises de ligao utilizando 11 famlias brasileiras e 246 microssatlites como marcadores, o principal loco envolvido na suscetibilidade foi mapeado em 5q31-33. Esta regio contem vrios genes envolvidos na regulao da resposta imune, e que so crticos na proteo contra o S. mansoni, como as interleucinas IL3, IL4. IL5 e IL13. Hansenase - Hansenase pode ser brevemente definida como doena infecciosa crnica causada pelo Mycobacterium leprae que afeta primariamente apele e o sistema nervoso perifrico. A hansenase doena de manifestao clnica espectral. Segundo Ridley e Jopling, os plos desse espectro so ocupados de um lado pela forma mais localizada denominada tuberculide, associada a resposta imunolgica do tipo Th1 (celular), e do outro pela forma virchowiana (assim denominada no Brasil em substituio ao termo lepromatosada classificao original), sistmica, e associada a resposta imunolgica do tipo Th2 (humoral), com trs formas clnicas intermedirias ou borderline. Hoje, amplamente aceita a noo de que conjuntos diferentes de genes modificam a susceptibilidade doena em pelo menos dois momentos distintos,a saber: (i) no controle da infeco per se, isto , a doena independentemente de sua forma de manifestao clnica; e (ii), uma vez o indivduo infectado, na definio da diferentes formas clnicas da doena (figura).

Representao esquemtica do espectro clnico da hansenase, sugerindo a participao de conjuntos diferentes de genes no controle das duas etapas da patognese da doena infeco per se e manifestao clnica

Gene MBL: A lectina ligante de manose (MBL) liga-se a resduos de manose e N-acetilglicosamina presentes na superfcie de bactrias e fungos, o que resulta em ativao do Sistema Complemento, opsonizao e fagocitose. Entretanto, alelos relacionados com baixa produo desta molcula possuem elevada freqncia em diversas populaes sugerindo uma vantagem evolutiva destes. No caso da hansenase, cujo agente etiolgico um parasita intracelular obrigatrio que depende da fagocitose para penetrar nas clulas do hospedeiro a reduo nos nveis de MBL poderia conferir proteo contra a doena. De fato, Dornelles et al. relataram que baixos nveis de MBL conferem proteo contra a hansenase virchowiana, mas no tuberculide. Fitness et al. compararam a freqncia do polimorfismo 239G/A (G57E) no exon 1 do gene MBL2 entre pacientes com hansenase e controles e no encontraram associao alguma. Cabe ressaltar que este SNP no leva a diminuio na expresso da protena. Messias-Reason et al., por sua vez, verificaram diferenas na freqncia de polimorfismos no exon 1 do gene MBL2 entre pacientes e controles, alm disso, uma menor freqncia de gentipos/hapltipos relacionados com baixa produo de MBL foi encontrada nos pacientes virchowianos em comparao com tuberculides. Esses dados sugerem que SNPs capazes de influenciar os nveis de expresso de MBL tem papel relevante na ocorrncia e forma clnica da doena. Genes Fator de ecrose Tumoral (T F) e Linfotoxina-a (LTA) - proximidade com a regio gnica do HLA, classicamente envolvida com a hansenase, e a relevncia do TNF em doenas infecciosas tem levado a um grande interesse sobre o papel de alteraes do gene do TNF na etiopatogenia das infeces. Na hansenase, o TNF atua na ativao de macrfagos estimulando a atividade micobactericida destes e a apresentao de antgenos via MHC de classe II, mas tambm contribui para a ocorrncia de danos neurais. A regulao da produo desta citocina parece ter forte influncia gentica, o que pode determinar a susceptibilidade a doenas. Nesse contexto, Sarno et al. sugerem que polimorfismos no gene TNF devem estar associados com dano neural causado pela resposta inflamatria na hansenase. Assim, polimorfismos de base nica na regio promotora do gene do TNF, com potencial para alterao desta protena, tm sido de interesse na investigao dos determinantes da susceptibilidade gentica para hansenase. Um polimorfismo na posio -308 da regio promotora do gene TNF apresentou significativa associao com a hansenase per se. Tambm foi encontrada associao entre o alelo TNF2 deste SNP (-308A) e hansenase multibacilar em estudos indiano e tailands. Contrariamente, em estudos brasileiros este alelo foi associado com resistncia a esta forma clnica de hansenase. J Leve et al. no encontraram associao de SNPs no gene TNF com a hansenase estudando famlias multiplex na Polinsia Francesa. A implicao funcional deste polimorfismo ainda controversa; alguns estudos indicam que a presena do alelo A resulta em maior produo desta citocina, enquanto outros no indicam relevncia funcional do mesmo. Ainda nesta regio, localiza-se o gene LTA, que codifica uma quimiocina com mltiplos efeitos na regulao do sistema imune. Shaw et al. estudando famlias brasileiras no verificaram correlao do SNP LTA+252A/G isolado com hansenase. Entretanto, em anlise estendida, encontraram associao com hansenase deste SNP em hapltipos formados com TNF-308, o que foi replicado em estudo com a populao brasileira Gene HLA: A regio 6p21 do cromossomo 6 humano, que abrange os genes do Complexo Principal de Histocompatibilidade de classe I e II (HLA) e o do fator de necrose tumoral (TNF) e linfotoxina- (LTA), tem sido associada com a ocorrncia de hansenase em diversos estudos, uma vez que a segregao dos hapltipos de HLA parentais no se d de modo aleatrio entre filhos saudveis e queles acometidos pelas formas tuberculide e virchowiana. Estudos familiares tm apontado para a associao das regies gnicas do HLA com a hansenase per se. O refinamento destes estudos levou a associao dos loci HLA-DQB1, HLA-DQA1 e HLA-DRB1 com a doena, assim como forte ligao da

23

regio 6p21.32/HLA-DQ3 foi identificada. Todd et al. e Hegazy et al. associaram HLA-DR2 e HLA-DQw1 com a ocorrncia de hansenase per se. Semelhante associao de HLA-DR2 foi previamente observada no Japo. Na populao chinesa por outro lado, no houve associao de HLA-DR2 com a doena. Com relao s formas clnicas HLA-DR2, HLA-DR3 e HLA-DQw1, j foram relacionados com a hansenase tuberculide. Enquanto DR2, DRw8, DQw1 foram associados com a forma virchowiana. Os genes altamente variveis relacionados cadeia MHC de classe I A (MICA) e B (MICB) tambm tm sido associados hansenase. Essas protenas so expressas durante a apresentao de antgenos e funcionam como co-estimulatrias para a ativao de linfcitos T , linfcitos T CD8+ e clulas NK. Entre os chineses HLAB e MICA-A estiveram relacionados com proteo contra a forma multibacilar da hansenase; enquanto na ndia, Tosh et al. relataram associao de HLA-DRB1 e MICA*5A5.1 com a doena per se. O gene TAP2, tambm localizado na regio 6p21, codifica a cadeia 2 da protena transportadora associada ao processamento antignico (TAP) que atua na translocao de peptdeos do citosol para o retculo endoplasmtico e na ligao de peptdeos ao MHC de classe I. So relatados vrios polimorfismos deste gene que em combinao originam diferentes alelos (AH) os quais podem diferir quanto capacidade de apresentar antgenos via MHC de classe I. Rajalingam et al estudaram a implicao destes SNPs na hansenase e observaram que a freqncia do alelo TAP2-B estava significativamente aumentada na hansenase tuberculide e especialmente entre os pacientes com HLADR1. Contudo, devido estreita proximidade do gene TAP2 com a regio do HLA, esses resultados devem ser observados com cautela, uma vez que podem decorrer de desequilbrio de ligao com alelos HLA. Esses dados em conjunto indicam que a regio do genoma humano codificadora das molculas do HLA est fortemente associada ocorrncia da hansenase, entretanto, o alelo associado varia de acordo com cada populao em funo da distino do background gentico. Assim como outras doenas infecciosas, a hansenase possui carter complexo e polignico, ou seja, a associao de alteraes em diversas regies genmicas deve compor um perfil de susceptibilidade. Nesse contexto, os dados ora disponveis acerca das variaes genticas que devem contribuir para a susceptibilidade doena revelam que, isoladamente, estas associaes so discretas. Adicionalmente, nem todas estas associaes so replicadas em diferentes populaes o que sugere que cada uma destas deve possuir um perfil gentico de susceptibilidade distinto e, ainda, aponta para possveis equvocos associados aos desenhos dos estudos, como, por exemplo, na seleo de controles.

24

MODULO 6 MUTAO, REPARO E RECOMBI AO DO D A 6.1. MUTAO: 6.1.1. Categorias de Mutao Humana: A mutao definida como uma mudana na seqncia de nucleotdeos ou no arranjo do DNA, e assim so classificadas em trs categorias: Mutaes genmicas: so alteraes no nmero de cromossomos intactos (aneuploidias) que surgem de erros na segregao cromossmica, durante a meiose ou mitose. Mutaes cromossmicas: so mudanas envolvendo apenas uma parte de um cromossomo, tais como duplicaes, delees, inverses e translocaes, as quais podem ocorrer espontaneamente ou resultar de segregao anormal de cromossomos translocados durante a meiose; Mutaes gnicas: so mudanas da seqncia do DNA dos genomas nucleares ou mitocondriais, variando desde uma pequena mudana, como um nico nucleotdeo, at alteraes que podem afetar milhes de pares de bases. As mutaes gnicas so decorrentes de falhas nos processos de replicao ou de reparo do DNA. Uma mutao genmica que deleta ou duplica um cromossomo inteiro pode alterar os nveis de expresso de centenas ou milhares de genes. De modo semelhante, uma mutao cromossmica que deleta ou duplica grandes pores de um ou mais cromossomos tambm pode afetar a expresso de centenas de genes. Mesmo uma pequena mutao gnica pode ter grandes efeitos fenotpicos, dependendo de qual gene tenha sido afetado e de qual efeito a alterao tenha sobre a expresso do mesmo. Uma mutao gnica consistindo em uma mudana de um nico nucleotdeo na seqncia codificadora pode levar a perda completa da expresso gnica ou formao de uma variante protica com propriedades alterada. Algumas alteraes no DNA, entretanto, no tm efeito fenotpico. Uma translocao ou inverso cromossmica pode no afetar a poro crtica do genoma e pode no ter quaisquer efeitos fenotpicos. Uma mutao dentro de um gene pode no ter efeito, ou porque a mudana no altera a seqncia primria do aminocido de um polipeptdio (mutao silenciosa) ou porque a mudana no alterara as propriedades funcionais da protena (mutao neutra). Nem todas as mutaes, portanto, tem conseqncias clnicas. Todos os trs tipos de mutao ocorrem com freqncia aprecivel em muitas diferentes clulas. Se uma mutao ocorre no DNA das clulas que iro fornecer a populao da linhagem germinativa, a mutao pode ser passada para as geraes futuras. Em contraste, mutaes somticas ocorrem por acaso em apenas um subgrupo de clulas em certos tecidos e resultam em mosaicismo somtico, como visto, por exemplo, em muitas situaes de cncer. As mutaes somticas no podem ser transmitidas prxima gerao.

6.1.2. Tipos de Mutaes Humanas 6.1.2.1. Mutao por substituio de nucleotdeos: Mutao de Sentido Trocado este tipo de mutao reconhecido quando a substituio de um nico nucleotdeo (ou mutao de ponto) em uma seqncia de DNA capaz de alterar o cdigo em uma trinca de bases, e assim causar a substituio de um aminocido por outro no produto gnico. Em muitos distrbios, tais como as hemoglobinopatias, so derivados de mutaes de sentido trocado. Mutao Sem Sentido ou Mutao de Trmino de Cadeia este classe identificada quando uma mutao pontual no DNA causa, na seqncia do mRNA, a substituio do cdon normal por um dos trs cdons terminais. Como conseqncias da formao de um cdon de parada prematuro, o mRNA carregando a mutao freqentemente instvel, e no possvel a sua traduo; e mesmo que o mRNA esteja estvel o bastante para ser traduzido, a protena gerada ser truncada e normalmente to instvel que ser rapidamente degradada. Uma mutao de ponto no apenas pode criar um cdon de termino prematuro, como tambm pode destruir um cdon de trmino e permitir que a traduo continue at que o prximo cdon de trmino seja atingido. Igualmente, uma mutao criar uma protena com aminocidos adicionais em seus terminais carboxila que poder comprometer qualquer funo fornecida pela regio 3-UTR posterior ao cdon de terminao normal. Mutaes no Processamento do R A o mecanismo normal pelo qual os mRNAs transcritos inicialmente so convertidos em mRNAs maduros requer uma srie de modificaes, incluindo o cap 5, a poliadenilao e recomposio. Todas essas etapas na maturao do mRNA dependem de seqncias especficas dentro do mRNA. No caso da recomposio, a remoo dos introns e conseqente unio dos exons requer seqncias especficas dentro e prximas das junes exon-intron (local doador 5) ou intron-xon (local receptor de 3). As mutaes que afetam estas bases requeridas em cada ponto doador ou receptora interferem na recomposio normal de RNA naquele local. Uma segunda classe de mutaes no processamento do RNA envolve substituies de base no intron que criam locais doadores ou aceptores alternativos que competem com os locais normais durante o processamento do RNA. Assim, pelo menos uma proporo do mRNA maduro, em tais casos, pode conter seqncias de intron impropriamente recompostas.

Mutaes no encadeamento podem parecer por alterao das sequncias conservadas dos stios doador e receptor de encadeamento ou por ativao de stios de encadeamento ocultos.

6.1.2.2. Mutao por deleo/insero: As mutaes tambm podem ser causadas pela insero, inverso, fuso ou deleo de seqncias de DNA. Algumas delees e inseres envolvem apenas alguns poucos nucleotdeos e em geral so mais facilmente detectadas pelo seqenciamento de nucleotdeos. Em outros casos, um seguimento substancial de um gene ou um gene inteiro deletado, invertido, duplicado ou translocado. Nestes casos, as mutaes so normalmente detectadas pelas tcnicas de biologia molecular (ex.: transferncia de Souther blotting, reao em cadeia da polimerase) ou citogentica (ex.:bandeamento cromossmico, hibridizao in situ por fluorescncia, cariotipagem espectral).

25

 Mutaes na matriz de leitura Quando o nmero de bases envolvidas no mltiplo de trs, a mutao altera a leitura da traduo a partir do ponto de mutao, resultando numa uma protena com sequncia de aminocidos diferentes do esperado. Quando o nmero de bases envolvidas multiplo de trs, a mutao resulta numa protena com a adio ou falta de aminocidos.

Mutao por seqncias de transposio a insero de seqncia LINE, como descrito em alguns poucos pacientes no relacionados portadores da hemofilia A, com diversos quilibases de tamanho foi encontrada inserida em um exon no gene do fator VIII, interrompendo a seqncia de codificao e inativando o gene. Este achado sugere que pelo menos algumas das 850.000 cpias da famlia LINE no genoma humano so capazes de causar doenas por mutagnese insercional.

6.1.2.3. Mutao Dinmica: As mutaes em distrbios como a doena de Huntington e a Sndrome do X-frgil envolvem a amplificao de seqncias compostas por 3 nucleotdeos. Nessas doenas, a repetio de um nico trinucleotdeo, localizado na regio de codificao (no caso da doena de Huntington) ou na regio transcrita, mas no traduzida de um gene (no caso da sndrome do X-frgil), pode se expandir durante a gametognese, na qual referida como uma mutao dinmica, e interfere com a expresso gnica normal. Uma repetio na regio de codificao ir gerar um produto protico anormal, enquanto a expanso repetida em partes transcritas, mas no traduzidas de um gene, pode interferir com a transcrio, processamento do mRNA ou traduo. As mutaes dinmicas ainda no so completamente compreendidas, porm acredita-se, que durante a replicao a DNA polimerase deslize pelos filamentos que esto sendo sintetizado, aumentando assim um aumento da seqncia bsica de repetio. Este fenmeno descrito como slippage.

6.1.3. Conseqncias moleculares das mutaes: bom pensar nas mutaes em termos de seus efeitos sobre o produto protico. De maneira geral, as mutaes podem resultar em GANHO DE FUNO ou em PERDA DE FUNO do produto protico. Mutaes de ganho de funo - ocasionalmente resultam em um produto protico completamente novo, mas comumente, resultam em hiperexpresso do produto ou em expresso inapropriada (no tecido errado ou no estgio errado do desenvolvimento). As mutaes de ganho de funo produzem um distrbio DOMINANTE. Mutaes de perda de funo - so em geral vistas nas doenas recessivas. Aqui, uma mutao que resulta na perda de 50% do produto protico, mas os 50% restantes so suficientes para o funcionamento normal. Portanto o heterozigoto no afetado. Em alguns casos, entretanto, 50% do produto protico no so suficientes para o funcionamento normal (HAPLOINSUFICINCIA), podendo resultar um distrbio dominante. Como muitos distrbios envolvendo a haploinsuficincia, os homozigotos so gravemente afetados quando comparados com os heterozigotos. As mutaes de perda de funo so em geral vistas nas doenas recessivas.

6.1.4. omenclatura para as mutaes: A posio da mutao designada como estando no DNA genmico, numa seqncia de cDNA ou no DNA mitocondrial, pelo prefixo g., c. ou m., respectivamente. Uma mudana no nucleotdeo notada primeiro pelo nmero daquela base, o nucleotdeo original, o smbolo > e o novo nucleotdeo naquela posio. No DNA, os smbolos dos nucleotdeos so maisculos; no mRNA eles so em minsculos. Exemplo: g.1166A>C (mutao no DNA) Os nucleotdeos em um intron (referidos pela sigla IVS) so contados como +1, +2, e assim por diante, onde +1 a constante G do GT no stio doador da ligao 5, ou como 1, -2, e assim por diante, contagem regressiva da altamente invarivel G do stio aceptor de unio AG 3. Exemplos: g.IVS33+2T>A, g.IVS33-2T>A Pequenas delees so indicadas pelos nmeros dos nucleotdeos deletados, separados por sublinhado (__), seguido pelo termo del, e depois os nucleotdeos reais deletados. Exemplo: c.1524_1427delCGTA Pequenas inseres so designadas por ins aps dois nucleotdeos entre os quais ocorreu a insero, seguida pelo novo nucleotdeo inserido. Exemplo: c.1277_1278insTTAC Uma mutao espontnea ou sem sentido pode ser descrita ao nvel da protena pela doao do aminocido correto, a posio daquele resduo, e o aminocido que substituiu o normal. Ex: Glu6Val

6.1.5. Mutagnese: As mutaes na seqncia do DNA podem ocorrer de forma espontnea (mutao espontnea) ou induzida (mutao induzida). No primeiro caso, as mutaes so decorrentes de erros cometidos ela DNA polimerase, durante o processo de replicao do DNA. O surgimento de mutaes espontneas ocorre quando DNA polimerase insere uma base incorreta que no pode formar pontes de hidrognio com a base no filamento parentalmolde. As mutaes espontneas tambm podem surgir como conseqncia de mudanas tautomricas nas bases dos nucleotdeos. Cada uma das quatro bases nitrogenadas capaz de existir em uma forma rara, isomrica alternativa (tautmero), tendo propriedades diferentes de pontes de hidrognio. As raras formas imino (A*) e citosina (C*) fazem pares de bases com citosinas e adenina, respectivamente, enquanto que as raras formas enol de timina (T*) e guanina (G*) fazem pontes de hidrognio com guanina e timina, respectivamente. Uma base pode ser incorporada em sua forma normal e ento sofrer uma mudana tautomrica aps a incorporao. Durante a rodada subseqente de replicao do DNA, a presena de um destes tautmeros raros no molde pode resultar na incorporao de uma base incorreta na molcula-filha de DNA (um processo similar ocorre quando agentes mutagnicos chamados de anlogos de bases sofrem tautomerizao). Depurinao refere-se a quebra de ligaes N-glicoslica entre a base (neste caso uma purina) e a desoxirribose do nucleotdeo, com a perda subseqente da base nitrogenada. A menos que tal dano seja reparado antes da replicao do DNA, h uma grande probabilidade de que surja uma mutao, pois o stio apurnico no tem a informao necessria para especificar a insero da base complementar correta n o novo filamento de DNA. Se a DNA polimerase atingir o stio apurnico antes que o reparo tenha ocorrido, a replicao pode parar e/ou uma base incorreta pode ser inserida no novo filamento de DNA em oposio ao sitio apurnico. Novamente, existem mecanismos especficos de reparo envolvendo enzimas chamadas de ENDONUCLEASES AP (AP = apurnico) para lidar com tal dano. A desaminao um outro processo que origina mutaes. Esta mutao caracterizada pela perda do grupo amino presente na citosina. Esta, por sua vez, transforma-se em uracila. Aps uma rodada de replicao, esta mutao leva a substituio do par original G-C por um A-U, que se tornar ento um par A-T aps outra rodada de replicao. J as mutaes induzidas so causadas por agentes conhecidos coletivamente como mutgenos. Os mutgenos de principal destaque so:

26

Radiao ionizante (raios-X): ons eletricamente carregados quando situados dentro ou prximos de molculas de DNA podem promover reaes qumicas que mudam as bases do DNA. A radiao ionizante tambm pode quebrar a DNA unifilamenar ou bifilamentar. Esta forma de radiao pode atingir todas as clulas do corpo, inclusive as da linhagem germinativa; Radiao no-ionizante (raios U.V.): esta classe de radiao forma ligaes covalentes entre bases pirimidnicas adjacentes (citosina ou timina). Estes dmeros de pirimidina so incapazes de se parear apropriadamente com purinas durante a replicao do DNA. Isto resulta em uma substituio de pares de bases. Como a radiao UV absorvida pela epiderme, no atinge a linhagem germinativa, mas pode causar cncer de pele. Anlogos de bases: podem substituir uma base verdadeira do DNA durante a replicao. O anlogo no exatamente igual base que substitui, de modo que pode causar erros de pareamento durante as replicaes subseqentes.

6.2. RECOMBI AO Uma importante propriedade do DNA das clulas a sua capacidade de sofrer rearranjos, que podem ocasionar desde novas combinaes entre os genes presentes em qualquer genoma individual at alteraes qualitativas e quantitativas na expresso desses genes. Trata-se de uma fonte de variao gentica fundamental para permitir que os organismos evoluam em resposta a mudanas ambientais. Esses rearranjos do DNA so realizados pela recombinao gentica. Duas amplas classes de recombinao so comumente reconhecidas: a recombinao geral e a stio-especfica. Na recombinao geral (ou recombinao homloga), a troca gentica envolve seqncias homlogas (complementares) de DNA. Um dos exemplos mais importantes desse tipo de troca entre cromossomos homlogos (denominado crossingover) acontece na meiose. O crossing-over ocorre entre cromossomos altamente relacionados nos estgios iniciais de desenvolvimento de vulos e espermatozides. Na recombinao stio especfica no necessria homologia extensa do DNA. Nesse caso, as trocas ocorridas so curtas. Seqncias especficas de nucleotdeos so reconhecidas por uma enzima de recombinao stio-especfica que altera a posio relativa das seqncias de nucleotdeos nos genomas. 6.2.1. Recombinao geral Esse tipo de recombinao pode ocorrer em qualquer local ao longo de 2 molculas complementares de DNA. O principal resultado desse processo sempre o mesmo: duas molculas de DNA homlogas sobrepem-se e trocam partes (crossing-over), isto , suas hlices duplas quebram-se e as duas extremidades quebradas unem-se com suas parceiras opostas para formar, novamente, duas hlices intactas, cada uma composta por partes das 2 molculas de DNA iniciais.O stio de troca pode ocorrer em qualquer lugar da seqncia homloga de nucleotdeos das 2 molculas de DNA envolvidas. Uma fita de uma das molculas faz pareamento de bases com uma das fitas da outra molcula, criando a juno alternativa (staggered joint), usualmente chamada de juno heterodplex, entre as duas diferentes hlices duplas. No h alterao nas seqncias de nucleotdeos no stio de troca; a quebra e os eventos de re-ligao ocorrem de uma forma to precisa que no h perda, ganho ou alterao de um nico nucleotdeo. A freqncia de recombinao no constante ao longo de todo o genoma e influenciado por efeitos tanto globais quanto locais ( X , e dentro do mesmo genoma). A recombinao necessita de um mecanismo que permita que um dplex interaja com outro dplex homlogo (fitas simples envolvidas). O mecanismo utilizado provm do modo pelo qual os cidos nuclicos reconhecem um ao outro (complementaridade). Um pareamento extensivo de bases entre dois dplices homlogos s poder ocorrer se um corte primeiramente feito em um deles, deixando a fita livre para os eventos de desenrolamento e enrolamento necessrios formao de um heterodplex com a outra molcula de DNA. Portanto, qualquer evento de troca requer pelo menos duas clivagens, uma em cada uma das fitas das hlices duplas que iro interagir. Finalmente, cada uma das quatro fitas deve ser clivada para permitir que cada uma seja ligada a uma parceira diferente. Na recombinao geral, esses eventos s ocorrem quando duas hlices de DNA dividem uma extensa regio de homologia. Acredita-se que qualquer evento que resulte em quebras na cadeia de DNA estimule o incio de um processo de crossing-over. Por isso, por exemplo, radiao UV aumenta a freqncia de crossing-over na clula, ao criar quebras na fita dupla ou regies de fita simples do DNA. 6.2.1.1. Enzimas e mecanismos moleculares da recombinao gentica A ao de conectar 2 molculas de DNA de fita dupla o ponto principal do processo de recombinao. A troca recproca entre as extremidades livres cria uma conexo entre os dois dplices, que formam uma molcula unida. O ponto no qual uma fita de DNA cruza de um ponto para outro chamado de juno recombinante. Uma caracterstica importante de uma juno recombinante a sua capacidade de mover-se ao longo do dplex. Tal mobilidade chamada de migrao da ramificao. O ponto de ramificao pode migrar em ambas as direes, medida que uma fita deslocada pela outra. Quando a molcula unida rota um dplex em relao ao outro, isso pode ser visualizado em um plano como uma estrutura de Holliday. A molcula unida, formada pela troca de fitas, deve ser resolvida em dois dplices separados. A resoluo necessita de um par de clivagens adicional. Se os cortes forem feitos no par de fitas que no foram originalmente clivadas (o par de fitas que no iniciou a troca), todas as 4 fitas originais so clivadas. Isso resulta em molculas de DNA recombinantes combinadas. Se as mesmas duas fitas envolvidas nas clivagens originais forem clivadas novamente, as outras duas fitas permanecero intactas. As clivagens liberam os dplices parentais, os quais permanecem intactos, salvo que cada um possuir um vestgio do evento de recombinao, na forma de uma regio de heterodplex. Esses recombinantes so chamados de recombinantes remendados. Protena RecA - RecA possui um papel central na recombinao, atuando tanto como uma protena estrutural como em reaes catalticas. Essa enzima capaz de parear duas molculas de DNA homlogas e catalisar as reaes de trocas de fitas, levando formao do heterodplex de DNA.RecA reconhece especificamente DNA de fita simples e anela esse segmento a uma seqncia complementar de um dplex homlogo, substituindo, simultaneamente, a fita original complementar pela nova fita. Se ATP est presente, a protena RecA do filamento pode, ento, ir desenrolando sucessivamente diferentes partes do dplex, na tentativa de anelar o filamento de fita simples a uma regio desenrolada. Uma vez que uma pequena poro corretamente pareada, usando como molde a cadeia intacta, a energia do ATP direciona a reao de pareamento at o final. A protena RecA deslocada quando a nova molcula de DNA hbrida formada. A protena RecA possui um papel central na regulao da recombinao gentica, na reparao do DNA e na mutagnese induzida por UV.Estudos demonstraram que a protena RecA ATPase DNA-dependente. No entanto, a reao de troca de fitas isoenergtica (para cada par de bases quebrado, outro par formado) e ocorre mesmo na ausncia de ATP.A protena RecA pode atuar guiando a formao de uma hlice com quatro fitas, composta pelas duas molculas de DNA, acelerando o processo de troca de fitas e permitindo que a juno se mova ao longo de toda a regio do dplex. Enzimas Acessrias Protenas RecBCD - Complexo protico com potentes atividades nuclesica, de helicase e de ATPase. Uma carcterstica importante dessas protenas que iniciam o processo de desenrolamento e degradao do DNA somente em uma molcula que contenha uma extremidade livre. Tambm foi demonstrado que o complexo RecBCD promove a recombinao com maior freqncia em cadeias de DNA que contm o chamado stio chi, com seqncia 5-GCTGGTGG-3. Quando essa seqncia reconhecida, uma atividade endonuclesica especfica de RecBCD cliva uma das fitas de DNA em uma regio prxima ao stio chi. O reconhecimento desse stio faz com que a subunidade RecD dissocie-se do complexo ou torne-se inativa, ficando o complexo apenas com sua atividade de helicase. Outras enzimas RuvA e RuvB: reconhece junes Holliday, e atua como helicase RecG: helicase RuvC: endonuclease, reconhece junes Holliday (tetranucleotdeo ATTG): direciona a resoluo SSB: protegem o segmento de fita simples da degradao por nucleases at que o processo de pareamento homlogo inicie; DNA polimerase: preenche as lacunas deixadas quando 2 molculas de DNA recombinantes so clivadas separadamente. DNA ligase: une os fragmentos deixados pela DNA-polimerase.

27

6.2.2. Recombinao stio-especfica Pela sua natureza, o crossing-over geralmente preserva a ordem das seqncias de DNA em cromossomos homlogos. Em casos excepcionais, no entanto, as clulas tambm utilizam um elaborado processo recombinacional de regulao, que tem como conseqncia o rearranjo de seqncias atravs da recombinao direta entre stios especiais. Segmentos de DNA podem ser movidos pela recombinao stio-especfica, resultando, freqentemente, na expresso de diferentes genes ou grupos de genes. A recombinao stio-especfica no envolve extensa homologia entre as seqncias de DNA, como ocorre no crossing-over. Ela necessita apenas que as seqncias de ligao sejam localizadas por enzimas especializadas, que catalisam a quebra e a reunio das molculas. Esse tipo de recombinao iniciado por processos reguladores que tornam as enzimas corretas disponveis. Na recombinao stio-especfica conservativa, uma molcula de DNA clivada em ambas as fitas em dois locais especficos e as extremidades so religadas s suas novas parceiras. O primeiro passo na recombinao stio-especfica a ligao de protenas (recombinases) a alguns ou a todos os elementos de reconhecimento de um ou ambos os stios que iro recombinar. Depois disso, esses stios fazem uma sinapse (ou troca de fitas). No necessria homologia entre as partes recombinantes nessa etapa. A complexidade dos sistemas de recombinao stio-especfica varia muito, e cada sistema tem uma recombinase especfica que reconhece as seqncias de DNA. Freqentemente, a regio codificadora dessa recombinase est relacionada com seus stios de reconhecimento e, algumas vezes, com um elemento reforador (enhancer) recombinacional.

6.2.3 Consequncias moleculares da recombinao (figura2): Converso gnica interlcus a transferncia no recproca de informao de sequncia entre um par de DNA no-allicas; Converso gnica interallica a transferncia no recproca de informao de sequncias allicas. Ambos os mecanismos ocorrem quando uma sequncia do par de sequncia atuantes como doadora, permanece inalterada. A outra sequncia de DNA, a receptora, modificada, tendo alguma ou toda a sua sequncia substituda pela sequncia copiada da doadora. A troca de seqncias , portanto, direcionada; a seqncia receptora modificada pela seqncia doadora, mas no ocorre a maneira inversa.

Figura2: Converso gnica envolve uma troca de sequncias no recproca entre genes allicos e no-allicos.

6.3. REPARO: O DNA nas clulas sofre uma ampla srie de danos: Bases pricas so perdidas pela fisso espontnea das ligaes base-acar; Citosinas e ocasionalmente adeninas, so desaminadas espontaneamente para produzir uracila e hipoxantina, respectivamente; Espcies de oxignio reativas nas clulas atacam os anis das purinas e pirimidinas; A luz ultravioleta faz com que timinas adjacentes formem um dmero quimicamente estvel; Erros na replicao do DNA resultam na incorporao de uma base mal pareada; A radiao ionizante causa quebras nas fitas simples e duplas; Erros na replicao ou na recombinao deixam quebras nas fitas do DNA. Todas essas leses devem ser reparadas para a clula sobreviver. A importncia de sistemas de reparao eficientes destacada por doenas graves que afetam pessoas com deficincias nos sistemas de reparao. A reparao do DNA freqentemente envolve a simples eliminao da mudana que causou a leso. Quase sempre uma fita de DNA contendo o(s) nucleotdeos(s) danificado(s) removida e a lacuna preenchida atravs de re-sntese. Existem ao menos cinco tipos principais de reparao do DNA nas clulas humanas: 6.3.1. Reparo por reverso direta: O mecanismo mais simples de reparo de bases alteradas restaura-las ao normal sem uma grande cirurgia na molcula de DNA. No caso dos dmeros de pirimidina formados no DNA por luz UV, esta reverso mediada pela enzima fotoliase (ativada por luz visvel). A fotoliase corta os dmeros de pirimidina gerando pirimidinas intactas. Outro exemplo de reverso direta a metiltransferase, uma enzima que reconhece O6 metil guanina no DNA e remove o grupo metil agressor. Nessa reao, a guanina normal do DNA restaurada e a enzima inativada. 6.3.2. Reparo por Exciso de Base: Este procedimento utiliza enzimas glicosidases para remover bases anormais. Uma endonuclease, APendonuclease, corta o arcabouo de acar-fosfato na posio da base perdida. Uns poucos nucleotdeos da dita de DNA so retirados por exonucleases, a lacuna preenchida por re-sntese, e o corte remanescente fechado pela DNA ligase-III. O mesmo processo utilizado para reparar depurinaes espontneas. interessante ressaltar que no se conhece nenhuma doena humana causada por falha neste mecanismo de reparo do DNA. Talvez qualquer defeito desse tipo seja letal, uma vez que este mecanismo responsvel pela correo de um grande nmero de leses no DNA. 6.3.3. Reparo por Exciso de ucleotdeo: Remove dmeros de timina e grandes aductos qumicos. O mecanismo de ao deste processo envolve a protena XPA, que reconhece o DNA danificado e liga-se a ele ou por ligao a RPA (protena que se liga a fita simples). O complexo DNA-XPARPA recruta o fator de transcrio TFIIH (um complexo multiproteico que inclui as protenas XPB e XPD). As protenas XPB e XPD so helicases e atuam na abertura das fitas de DNA, um seguimento com cerca de 30 nucleotdeos de extenso. Em seguida, dois cortes so feitos na cadeia de acar-fosfato da fita danificada. XPF+ERCC1 cortam as extremidades 5, e XPG corta a extremidade 3.Em seguida, a DNA polimerase , juntamente com o fator de replicao C e a subunidade DPE2 sintetizam DNA para preencher a lacuna. Por fim, a DNA ligase une as lacunas. Defeitos neste mecanismo de reparo causam a doena autossmica recessiva Xeroderma pigmentar (XP) Pacientes XP so extremamente sensveis luz UV, peles expostas ao sol desenvolvem milhares de sardas, muitas das quais progridem para o cncer de pele. 6.3.4. Reparao Posterior a Replicao: Este procedimento necessrio para corrigir quebras nas fitas duplas. O mecanismo usual processo semelhante converso gnica (reparao por recombinao), em que uma fita simples de um cromossomo homlogo invade a hlice do DNA danificado. Os genes humanos envolvidos nesta rota incluem BLM (mutado na sndrome de Bloom), e os genes de suscetibilidade ao cncer de mama (BRCA2 talvez o BRCA1). 6.3.5. Reparo por mau pareamento: Este mecanismo corrige pares de bases mal pareadas, causados por erros ocorridos durante a replicao do DNA. Estes erros, normalmente, so reconhecidos e corrigidos pela funo de edio das polimerases. No caso de uma base ocasionalmente incorporada erradamente no ser percebida durante a edio, um segundo sistema de correo, chamado de reparo de mau pareamento, existe para lidar com tais bases pareadas erradamente. No reparo de mau pareamento, um par de bases no ligadas por pontes de hidrognio reconhecido como incorreto, e um seguimento polinucleotdico removido, removendo assim um membro do par incorreto.

28

MDULO 7 CITOGE TICA CLSSICA E MOLECULAR

7.1. Cromossomo Humano: O complemento cromossomo humano normal, ou caritipo, consiste em 46 cromossomos, sendo 44 autossomos e 2 cromossomos sexuais, XX nas mulheres e XY nos homens. Os cromossomos so divididos morfologicamente em metacntrico, submetacntrico e acroscntrico, dependendo da posio do centrmero. Os cromossomos acrocntricos possuem o brao curto pequeno, que consistem em satlite com um pednculo. Eles contm vrias centenas de cpias de genes codificadores de RNA ribossmico. Ao contrrio, de quase todo o resto do material cromossmico, a perda destes satlites, como ocorre na translocao robertsoniana, no tem significado clnico. Note que estes satlites no tem nada a ver com microssatlites ou minissatlites. Com base no tamanho individual e posio dos centrmeros, os cromossomos foram originalmente divididos em sete grupos: A (1-3), B (4-5), C (6-12 e X), D (13-15), E (16-18), F (19-20), G (21, 22 e Y). Eles so numerados em ordem decrescente de tamanho, e representados aos pares. Geralmente os cromossomos so mostrados como eles aparecem na metfase da mitose, quando eles consistem em duas cromtides-irms unidas pelo centrmero. Estas cromtides surgiram como resultado da sntese de DNA antes de clulas entrarem na fase mittica. Normalmente metade dos cromossomos de uma pessoa so herdados de cada um dos genitores, e metade de seu conjunto gentico ser transmitido para cada filho. Um conjunto nico de 23 cromossomos constitui um complemento haplide: o total normal de 46 cromossomos vistos em todas as clulas somticas representa o complemento diplide. Os pares de cromossomos so chamados de homlogos. 7.1.1. Composio do Cromossomo Humano: Cada cromossomo constitudo por uma molcula longa de DNA, associada a diversas protenas. As protenas associadas ao DNA classificam-se em duas grandes categorias: protenas histonas que interagem diretamente com a fibra de DNA, e protenas no-histonas. O complexo formado por DNA, histonas e protenas no-histonas chama-se cromatina. Logo, a cromatina o material que compem os cromossomos. As histonas so fundamentais no enrolamento da cromatina. Trata-se de protenas com uma alta proporo de lisina e arginina, quer dizer, de aminocidos carregados positivamente. Isto contribui para a unio das histonas s molculas de DNA, nas quais predominam as cargas negativas. Existem cinco classes de histonas, chamadas de H1, H2A, H2B, H3 e H4. A H1, da qual existem 6 subtipos, contem cerca de 220 aminocidos, enquanto que os subtipos restantes possuem entre 103 e 135 aminocidos cada um. Estes ltimos recebem a denominao de histonas nucleossmica, porque a molcula de DNA se enrola em tono delas, para formas os nucleossomos, que constituem as unidades bsicas do enrolamento cromatnico. Em cada nucleossomo, as histonas nucleossmicas se associam para formar uma estrutura octamrica, composta por dois H2A, dois H2B, dois H3 e dois H4. Ao redor deste octmero de histonas, o DNA d aproximadamente duas voltas e meia. Visto que cada volta equivale a 83 pares de nucleotdeos, o segmento de DNA associado ao nucleossomo contm, no total, 146 pares de bases. Os nucleossomos se encontram separados entre si por uma poro de DNA espaadores, de comprimento varivel (20-60 pares de bases). A alternncia de nucleossomo e segmento espaador d a cromatina a aparncia de colar de contas. A cromatina normalmente classificada como eucromatina (regio do DNA que apresenta genes ativos, ou seja, genes que esto continuamente sendo traduzidos) e heterocromatina (regio do DNA que no possui genes ativos, e que parecer funes estruturais durante o ciclo celular). Podem ainda distinguir-se dois tipos de heterocromatina: 1) Heterocromatina constitutiva, que nunca se expressa como protenas e que se encontra localizada volta do centrmero (contem geralmente sequncias repetitivas); 2) Heterocromatina facultativa, que, por vezes, transcrita em outros tipos celulares, consequentemente a sua quantidade varia dependendo da atividade transcricional da clula.

7.1.2. Estrutura do Cromossomo Humano: Em cada cromossomo existem estruturas que so imprescindveis para a replicao, isto , para a duplicao do DNA. So as seguintes: Centrmero, ou constrio primria, o ponto no qual as cromtides-irmes se juntam e onde os microtbulos se ligam para separar as cromtides na meiose. Em humanos, os centrmeros consistem em seqncias de repeties em tandem com 171 pb, classificadas como satlite, estrutura que participa da diviso das duas cpias cromossmicas geradas como conseqncia da replicao do DNA. Telmero so as seqncias terminais dos cromossomos

7.1.3. veis de Compactao do Cromossomo Humano: Durante o ciclo celular, os cromossomos passam por um estgio ordenado de condensao e descondensao. No entanto, quando os cromossomos esto no seu estado mais descondensado, em um estgio do ciclo celular denominado interfase, o DNA acondicionado na cromatina est substancialmente mais condensado se estivesse como uma dupla hlice normal. Isto ocorre porque para caber no pequeno espao que o ncleo lhe oferece, o genoma precisa estar num estgio primrio de compactao. Os estgios de compactao que, a partir de uma molcula de DNA, ocorre a formao de um cromossomo esto destacados a seguir: Primeiramente, o DNA se enrola ao redor de um octmero de protenas (histonas) para formar o nucleossomo. Cerca de 140 a 150 bases de DNA se enrolam ao redor de cada cerne de histonas, e de 20 a 60 bases formam um elemento espaador antes do complexo nucleossmico seguinte. Em seguida, os nucleossomos se enrolam sobre si e geram uma estrutura helicoidal chamada de solenide, de 30nm de dimetro. Cada volta do solenide contem cerca de 6 nucleossomos. Tanto estes como os futuros enrolamentos dependem das histonas H1, que, alm disso, estabilizariam as fibras de 30nm. A contnua compactao do DNA gera a formao de estruturas em forma de lao ou alas de diferentes comprimentos, ancorados em um eixo constitudos por protenas no-histonas. O conjunto de eixos protico compe vrias armaes ou arcabouos, de modo que, em cada base de cada lao, as pores do cada DNA associadas a cada um destes eixos levam o nome SAR (do ingls, scaffold associated regions). Os extremos dos laos se acham firmemente unidos aos eixos proticos, porem no se sabe ainda como as SAR se sujeitam a eles. O resultado final desta helicoidizao e da organizao em alas que o DNA, quando no seu estado mximo de compactao assume a forma denominada de cromossomo.

7.2. omenclatura de cromossomos Um sistema padro para denominar os cromossomos foi estabelecido em 1971. Cada cromossomo tem braos curtos (p) e longo (q) separados pelo centrmero. Cada brao dividido em regies numeradas a partir do centrmero para a extremidade (ex.: p1, p2, etc), e cada regio subdividida em bandas (ex.: p1.11, p1.12, etc), novamente numerando do centrmero para a extremidade. Os termos proximal e distal so usados com relao ao local em um ponto do cromossomo. Proximal indica que um lcus est na metade do cromossomo adjacente ao centrmero, enquanto que o distal indica que est situado numa regio adjacente ao telmero.

7.3. Indicao clnica para anlise citogentica: A anlise cromossmica indicada como um procedimento diagnstico de rotina para uma srie de fentipos especfico encontrados na prtica mdica. Alm disso, tambm existem situaes clnicas no especficas que indicam a necessidade de anlise cromossmica. Problemas precoces de crescimento e desenvolvimento a falta ou o retardo do desenvolvimento, malformaes mltiplas, baixa estatura, genitlia ambgua e retardo mental so achados freqentes em crianas como anomalias cromossmicas. A menos que haja um diagnstico no-cromossmico definitivo, a anlise cromossmica deve ser realizada nos pacientes que se apresentam com uma combinao de tais fatores. atimorto e morte pr-natal a incidncia de anomalias cromossmicas mais elevada entre os natimortos (aproximadamente 10%) do que entre os nativivos (aproximadamente 0.7%). Ela tambm elevada entre as crianas que falecem no perodo neonatal (cerca de 10%). A anlise cromossmica deveria ser realizada em todos os natimortos e bitos neonatais que possam apresentar uma base citogentica a fim de identificar uma possvel causa

29

ou alternativa, ou descartar uma anomalia cromossmica como motivo para a perda. Em tais casos, a cariotipagem essencial para a consulta gentica, podendo fornecer importantes informaes para o diagnstico pr-natal em futuras gestaes. Problemas de fertilidade os estudos cromossmicos esto indicados para mulheres que apresentam amenorria e para casais com histria de infertilidade ou abortos recorrentes. A anomalia cromossmica observada em um dos genitores em cerca de 3-6% dos casos nos quais existe infertilidade ou dois ou mais abortos. Gestao em uma mulher em idade avanada existe o risco aumentado de anomalias cromossmicas nos fetos concebidos por mulheres com mais de 35 anos. A anlise cromossmica fetal deveria ser oferecida como parte da rotina dos cuidados pr-natais nessas gestaes.

7.4. Mtodos de Anlise Cromossmica Os 24 cromossomos encontrados no genoma humano podem ser prontamente identificados citologicamente por uma srie de procedimentos especficos de colorao. Estes procedimentos tambm so teis no diagnstico de diversos transtornos cromossmicos, tais como: translocaes, delees, inverses e duplicaes cromossmicas. As tcnicas de bndeamento cromossmico rotineiramente utilizadas so: 7.4.1. Tcnicas de citogentica clssica Os cromossomos so estudados coletando-se um tecido vivo (geralmente sangue), cultivando-se o tecido pelo tempo apropriado (em geral de 48 a 72 horas para linfcitos), adicionando-se colchicina para produzir o bloqueio metafsico, isolando-se as clulas e colocando-as em uma lmina, rompendo a membrana nuclear com uma soluo salina hipotnica, corando com um corante especfico de cromossomos e fotografando as metfases de cromossomos na lmina.As fotografias so ento recortadas e os 22 pres de cromossomos autossomos so dispostos de acordo como seu tamanho, ficando os cromossomos sexuais a direita. Esta arrumao dos cromossomos denominada caritipo. Bandeamento G - Os cromossomos so tratados inicialmente com tripsina (para desnaturar as protenas) e depois submetidos colorao pelo Giemsa. As bandas G, que aparecem escuras, contm DNA rico em regies AT. Este o mtodo de colorao comumente utilizado em laboratrios de anlise citogentcia. Bandeamento Q - Quando os cromossomos so tratados com quinacrina, desenvolve um padro especfico de bandas escuras intercaladas com outras brilhantes (Q), que so de fcil identificao em um microscpio de fluorescncia. As bandas Q coincidem quase que exatamente com as bandas G, de modo que tambm so ricas em seqncias AT. Bandeamento R - Neste caso, os cromossomos so submetidos ao calor antes da colorao pelo Giemsa, o que resulta num padro de bandas escuras (bandas R) e claras, ao contrrio do obtido com os bandeamentos G e Q. A anlise molecular das bandas R mostra uma maior proporo de seqncias C-G. Bandeamento C - Este mtodo cora de maneira especfica quelas pores da cromatina que permanecem, tambm, condensadas na interfase, como por exemplo, a heterocromatina constitutiva dos centrmeros. Padro de banda de alta resoluo - Este tipo de padro de bandas obtido atravs de tcnicas de padro de bandas G ou R para corar os cromossomos que foram obtidos em um estgio inicial da mitose (prfase ou prmetafase), quando eles ainda se encontram em um estado relativamente no condensado. O padro de bandas de alta resoluo especialmente til quando se suspeita de anomalia estrutural sutil de um cromossomo.

7.4.2. Tcnicas de citogentica molecular Hibridizao in situ com fluorescncia (FISH) - Esta tcnica permite examinar a presena ou ausncia de uma seqncia especfica de DNA ou para avaliar o nmero ou a organizao de um cromossomo ou de uma regio cromossmica. O princpio bsico consiste em adicionar um corante fluorescente a uma sonda de DNA, de modo que, quando a sonda marcada hibridiza-se a seu cromossomo complementar em uma disperso metafsica, ele fluoresce se visto sob luz ultravioleta. As sondas normalmente utilizadas so de seqncias genmicas nicas, que iro hibridizar-se a uma regio complementar no cromossomo. Estas sondas de seqncias nicas so extremamente teis para detectar anomalias sub-microscpicas tais como as microdelees. Cariotipagem espectral (SKY) - A tcnica de FISH foi ampliada usando-se sondas mltiplas, cada uma marcada com uma cor diferente, de modo que vrias anomalias numricas ou estruturais podem ser testadas simultaneamente na mesma clula. Alm disso, novas tcnicas como a cariotipagem espectral, usando combinaes variadas de cinco sondas fluorescentes diferentes em conjunto com cmeras especiais e programas de processamento de imagens, de modo que cada cromossomo corado de um modo nico (pintado) para pronta identificao. Tais imagens so especialmente teis na identificao de rearranjos cromossmicos. Hibridizao genmica comparativa (CGH) - Esta extenso da tecnologia FISH pode ser usada para demonstrar a presena de grandes delees cromossmicas ou duplicaes em tecidos como tumores slidos que no podem ser submetidos anlise cromossmica convencional. Essencialmente a CGH envolve a hibridizao competitiva de uma mistura de DNA-teste da amostra diagnstica e o DNA normal de uma amostra controle com cromossomos metafsicos humanos normais. O DNA-teste marcado com um corante verde e o DNA controle com um corante vermelho. Se a amostra de teste contiver mais ou menos DNA de uma determinada regio cromossmica que o DNA-controle, isto revelado por um aumento ou diminuio da proporo verde para vermelho, conforme revelado pela imagem processada pelo computador. A complexidade tecnolgica deste mtodo, acoplada a seu custo, significa qeu seu uso tende a ser limitado aos estudos das anomalias cromossmicas de tumores.

30