IDENTIFICACIN DE CARBOHIDRATOS UNIVERSIDAD DE NARIO DEPARTAMENTO DE QUIMICA Resumen: Para la determinacin de distintos carbohidratos presentes en miel, leche, jugo

de uvilla y una solucin problema , los cuales se compararon con patrones de carbohidratos, se realizaron diferentes pruebas que se basan en la reactividad de los grupos funcionales carbonilo e hidroxilo que hacen parte de estos y les confieren la base para la mayora de las reacciones usadas para su identificacin; algunas de ellas fueron: prueba de Molisch, cido mcico, Fehling, Benedict, Barfoed, Seliwanoff, Bial y Lugol. A travs de estas pruebas se encontr que el jugo de uvilla contiene glucosa y fructosa, la leche contiene lactosa y sta est formada por galactosa y glucosa, la miel contiene sacarosa (glucosa y fructosa), maltosa y galactosa y la solucin problema contiene fructosa. Palabras clave: carbohidratos, monosacridos, disacridos, polisacridos, azcares reductores. Introduccin Los carbohidratos son los compuestos orgnicos ms abundantes de la biosfera y a su vez los ms diversos. Normalmente se los encuentra en las partes estructurales de los vegetales y tambin en los tejidos animales, como glucosa o glucgeno. Estos sirven como fuente de energa para todas las actividades celulares vitales. En cuanto a la bioqumica elemental de los hidratos de carbono, podemos decir que son polihidroxicetonas o polihidroxialdehdos y sus derivados. Para los fines de estudio en nutricin solamente se tienen en cuenta aquellos con cuatro o ms tomos de carbono. Estos compuestos son extremadamente polares y se unen entre si dando polmeros. Las funciones que cumplen en el organismo son, enrgeticas, de ahorro de protenas, regulan el metabolismo de las grasas y estructural. En tanto a los tipos y fuentes de hidratos de carbono, existen tres tipos de carbohidratos: los monosacridos, los oligosacridos y los polisacridos [1]. Los monosacridos se clasifican de acuerdo con el nmero de tomos de carbono presentes (triosa, tetrosa, pentosa, etc.), y depende tambin de que el grupo carbonilo se presente como un aldehdo (aldosa) o como una cetona (cetosa). Ejemplos: glucosa, fructosa, galactosa, arabinosa y xilosa [2]. La glucosa tiene frmula emprica C6H12O6, la misma que la fructosa pero con diferente posicin relativa de los grupos -OH y CO. Es una hexosa, es decir, que contiene 6 tomos de carbono, y es una aldosa, esto es, el grupo carbonilo est en el extremo de la molcula. Es una forma de azcar que se encuentra libre en las frutas y en la miel. Es el azcar que normalmente est presente en la sangre. La fructosa es una forma de azcar encontrada en las frutas y en la miel. Tiene la misma frmula emprica que la glucosa (C6H12O6), forma un derivado pentaaecetilado y tiene las propiedades de un compuesto carbonlico. Es una cetosa y no una aldosa. La galactosa, desde el punto de vista qumico es una aldosa, es decir su grupo qumico funcional es un aldehdo (CHO) ubicado en el carbono 1. Por otra parte, al igual que la glucosa, la galactosa es una piranosa ya que tericamente puede derivarse del anillo de seis lados formado por cinco tomos de carbono y uno de oxgeno, llamado pirano. La arabinosa posee cinco carbonos con un grupo aldehdo por lo

que pertenece al grupo de las aldosas y dentro de ste al de las aldopentosas. De las dos formas D y L, el enantimero ampliamente extendido en la naturaleza es la L-arabinosa, siendo uno de los constituyentes de la pectina y la hemicelulosa. La xilosa tambin llamada azcar de madera es una aldopentosa, que tiene un ismero funcional que es la xilulosa. Tiene forma de pirano (hexgono) y se encuentra ampliamente distribuida en distintas materias vegetales: madera (cerezo), paja, etc. Tambin se puede encontrar en los tejidos conectores como en el pncreas o el hgado. Los disacridos estn formados por dos monosacridos unidos entre s por enlaces glucosdicos. Ejemplos: (+)maltosa (azcar de malta), (+)-celubiosa (+)-lactosa (azcar de leche) y sacarosa (azcar de caa o remolacha). La maltosa se obtiene por hidrlisis parcial del almidn. La maltosa est formada por dos unidades de glucosa. Tiene frmula molecular C12H22O11. Es un azcar reductor. La (+)-lactosa tiene frmula molecular C12H22O11. Es tambin un azcar reductor forma osazonas y existe en formas alfa y beta. La lactosa es el azcar principal en la leche humana y en la de vaca (de 4 a 8% de lactosa). La hidrlisis de la lactosa produce cantidades equimolares de D-galactosa y D-glucosa. La sacarosa es el compuesto orgnico de mayor produccin en forma pura, tiene la frmula molecular C12H22O11. Es un azcar no reductor. Los oligosacridos tienen entre tres y diez monosacridos unidos tambin por enlaces glucosdicos. Las dextrinas son un grupo de oligosacridos de poco peso molecular producidas por la hidrlisis del almidn. Tienen la misma frmula general que los polisacridos pero son de una longitud de cadena ms corta. Los polisacridos son polmeros naturales con varios miles de unidades de azcar sencillo ligadas entre s. Ejemplos: El almidn, glucgeno y celulosa. El almidn es la reserva

alimenticia de los vegetales, se hidroliza con mayor facilidad que la celulosa. El almidn se utiliza como alimento: papas, maz, trigo, arroz, etc. Est formado por cuatro unidades de glucosa unidas principalmente por enlaces 1,4 alfa glicosdicos, aunque sus cadenas pueden presentar un nmero de ramificaciones unidas mediante enlaces 1,6 alfa glicosdicos. La hidrlisis parcial del almidn produce maltosa, y la hidrlisis completa produce solamente D-glucosa. El glucgeno se encuentra en tejidos animales, mayormente en el hgado y el tejido muscular y es la forma de almacenamiento de carbohidratos. El glucgeno posee unidades de 1,4glucosa repetidas, interrumpidas por puntos de ramificacin 1,6, sin embargo el glucgeno tiene cadenas lineales ms cortas que la de la amilopectina, con 12 a 18 residuos de glucosa y ramificacin ms frecuente. Entre los azcares que son esenciales para la nutricin humana, se encuentran: la xilosa, la galactosa, la glucosa, la manosa, la N-acetilglucosaminco, Nacetilgalactosamnico, la fructosa y el cido slico.
Azcar Importancia Constituye el carbohidrato del organismo. Es el azcar que transporta la sangre y el que se encuentra en mayor proporcin en los tejidos. El hgado y el intestino, pueden transformarla en glucosa. El hgado puede transformarla en glucosa. Forma la lactosa de la leche materna. Es un constituyente del polisacrido prosttico de las albuminas. Fuente de Obtencin Nctar de frutas. Hidrlisis del almidn. Azcar de Caa. Nctar de frutas. Hidrlisis del azcar de caa y de la insulina. Miel. Hidrlisis de la lactosa. Hidrlisis de las manosas vegetales. Gomas.

D-Glucosa

D-Fructosa

D-Galactosa

D-Manosa

Tomado de: Rodrguez, G. Len, P. L. (1984). Bioqumica. Buenos Aires: Lizar. Adems de reconocer si un compuesto pertenece a la familia de los carbohidratos, es necesario diferenciar si

se trata de un monosacrido tipo aldosa o cetosa, si es fcilmente oxidable o no, es decir si es un azcar reductor o no lo es, si es de cinco o seis tomos de carbono, si es disacrido o polisacrido [3] . Existen varias pruebas qumicas con las cuales se identifican los carbohidratos entre ellas se encuentran: Ensayo de Molisch: Esta prueba es un ensayo para reconocimiento general de carbohidratos en el que los polisacridos y disacridos se hidrolizan con cido sulfrico concentrado hasta monosacridos y se convierten en derivados del furfural o 5-hidroximetil furfural los cuales reaccionan con naftol formando un anillo de color prpura violeta Ensayo de Benedict: El ensayo de Benedict permite el reconocimiento de carbohidratos reductores, al igual que el reactivo de Felhing, el de Benedict contiene ion cprico en medio alcalino que se reduce hasta xido cuproso en presencia de azcares con el hidroxilo hemiacetlico libre. Ensayo de Barfoed: Esta prueba permite diferenciar entre monosacridos y disacridos reductores, tambin contiene ion cprico que se reduce hasta xido cuproso ms rpidamente con los monosacridos que con los disacridos. Ensayo con Lugol: El reactivo de Lugol que contiene una mezcla de yodo y yoduro, permite reconocer polisacridos, particularmente el almidn por la formacin de una coloracin azul-violeta intensa y el glicgeno y las dextrinas por formacin de coloracin roja. Ensayo de Seliwanoff: Este ensayo es especfico para cetosas y se basa en la conversin de la cetosa en 5-hidro-metilfurfural y su posterior condensacin con resorcinol formando as complejos coloreados. Ensayo de Bial: El reactivo de Bial contiene orcinol en cido clorhdrico, el cual forma complejos de coloracin slo con las pentosas.

Resultados y discusin Tabla 1. Resultados de la identificacin de carbohidratos

Sln. problema

M
Leche Uvilla Miel

Glucgeno

Galactosa

Arabinosa

Sacarosa

Fructosa

Dextrina

Glucosa

Almidn

Lactosa

P
Molish A.mcic o Fheling Benedict Barfoed Seliwano ff Bial Lugol

+ + + + + + + + + + -

+ + + + -

+ + + + -

+ + + + -

+ + +

+ + + +

+ + + + + -

PRUEBA DE MOLISCH RECONOCIMIENTO CARBOHIDRATOS

PARA DE

Figura 1. Prueba de Molish Se considera que la reactividad de los hidratos de carbono es debida fundamentalmente, a los grupos funcionales carbonilo e hidroxilo, que les confieren a su vez la base para la mayora de las reacciones usadas para su identificacin y cuantificacin, algunas de las cuales se llevaron a cabo en la prctica. La primera prueba que se realiz para determinar la presencia de carbohidratos en las diferentes muestras biolgicas, fue la prueba de Molisch, dicha prueba se constituye en un punto de partida, ya que permite la identificacin de azcares en

Maltosa

Xilosa

general (es una reaccin general para carbohidratos que contienen ms de 5 tomos de carbono). Entendindose como azcar, un compuesto qumico del grupo de los hidratos de carbono que se disuelve en agua con facilidad; entre cuyas propiedades estn el ser incoloros, inodoros y normalmente cristalizables. A todos se les confiere un sabor ms o menos dulce. En general, a todos los monosacridos, disacridos y trisacridos se les denomina azcares para distinguirlos de los polisacridos como el almidn, la celulosa y el glucgeno. Es por ello que la glucosa, fructosa y sacarosa, monosacridos los dos primeros y disacrido el ltimo, dieron positiva esta prueba, al presentarse la aparicin de un anillo violeta-.rojizo en el sitio de contacto de los dos lquidos (Tabla 1), ya que los cidos concentrados originan una deshidratacin de los azcares para rendir furfurales, que son derivados aldehcos del furano, posteriormente los furfurales se condensan con los fenoles para dar productos coloreados caractersticos. La ecuacin de la reaccin de Molisch, se representa en la figura 1. PRUEBA DEL CIDO MCICO PARA RECONOCIMIENTO DE GALACTOSA

quercita y la mayora de las variedades de goma natural que incorporan cido ntrico. Es por ello que tanto la galactosa como la lactosa dieron respuesta positiva a la prueba de cido mcico (Tabla 1), lo cual se evidenci debido a que en los tubos que las contenan, la solucin resultante era transparente, confirmando la presencia de cido mcico. Esta prueba permite diferenciar la galactosa o los azcares que la contienen, de las dems aldohexosas por formacin de un cido sacrico que es el cido mcico. El cido sacrico cristalino es insoluble en cido ntrico diluido. El cido ntrico concentrado oxida los dos carbonos terminales de las aldohexosas formando los correspondientes cidos sacricos. En general, los cidos sacricos son solubles en cido ntrico diluido, pero el cido mcico es insoluble en estas condiciones, por lo que precipita como cristales transparentes si la solucin se enfra rpidamente. Dichos cristales fueron observados en un microscopio ptico, presentando una apariencia alargada. AZCARES REDUCTORES PRUEBA DE FHELING

Figura 3. Prueba de Fheling La prueba de Fehling o la prueba de Benedict, permiten determinar si un carbohidrato es o no reductor, sin embargo estas reacciones son menos tiles de lo que parecen, ya que entre otras cosas, no sirven para diferenciar aldosas de cetosas.

Figura 2. Prueba de cido mcico El cido mcico, C6H10O8, se obtiene por la oxidacin del azcar de la leche (lactosa), la dulcita, la galactosa, la

El reactivo de Fehling es un agente oxidante moderado, el cual permite la oxidacin de los grupos aldehdos al mismo tiempo que ste se reduce. Consiste de dos partes: una parte est constituida por una solucin de sulfato cprico, y la otra por hidrxido de sodio y tartrato de sodio potasio (sal de Rochelle). Al mezclar cantidades iguales de estas dos soluciones, se forma un complejo soluble de tartrato cprico, de color oscuro, el cual proporciona una pequea concentracin de iones cprico. La presencia de carbohidratos reductores queda evidenciada, ya que el grupo aldehdo reduce la solucin de Fehling y forman un precipitado rojo ladrillo de xido cuproso. El hidrxido de sodio y el tartrato que contiene el reactivo de Fehling, son empleados, ya que actan como agentes quelantes, para que el ion cuproso no se precipite como hidrxido cprico e interfiera con la reaccin. El tartrato no puede formar complejos con el in cuproso, de manera que la reduccin del ion cuproso a cprico, al reaccionar con los carbohidratos, provoca la formacin de un precipitado rojo ladrillo, proveniente del xido cuproso, cuando la reaccin es positiva. Pero, las cetosas tambin dan positiva a la reaccin de Fehling, ya que en condiciones bsicas se tautomerizan a aldosas, debido a un equilibrio cetoenlico, catalizado por el medio bsico y la adicin de energa, en este caso representados por el hidrxido de sodio y el calentamiento. En el caso de la fructosa, sta se isomeriza a Glucosa y Manosa. Todos los monosacridos, sean aldosas o cetosas, son azcares reductores, como lo son tambin la mayora de los disacridos, siendo una excepcin importante la sacarosa (azcar comn de mesa), que no es reductora, ya que es un disacrido formado por la unin de dos monosacridos mediante un enlace glucosdico que se efecta entre dos carbonos anomricos, por lo cual no

presenta el potencial aldehdo o cetona libre, es por ello que la glucosa y la fructosa dieron una respuesta positiva a esta prueba, mientras que la sacarosa dio respuesta negativa (Tabla 1). Finalmente cabe mencionar que la ecuacin de la reaccin de Fehling, se representa en la figura 3. PRUEBA DE BENEDICT

Figura 4. Reaccin de Benedict Una de las reacciones ms comunes en la identificacin de carbohidratos es la reaccin de Benedict. Esta reaccin es especfica para azcares con grupo reductores libres (C=O). Todos los monosacridos poseen un grupo reductor libre. Los disacridos maltosa y lactosa tienen grupos reductores libres, pero la sacarosa no los posee, ya que se pierden los grupos reductores de sus componentes cuando sta es formada. Este reactivo contiene sales cpricas que le dan un color azul al reactivo. En medio alcalino el ion cprico Cu+2 se transforma en hidrxido cprico y ste en presencia de un azcar reductor se transforma en hidrxido cuproso que a su vez, por accin del calor se transforma en xido cuproso, el cual es insoluble en agua y produce un precipitado de color rojo y amarillento a bajas concentraciones. La glucosa al ser un azcar simple y al reaccionar con el reactivo de Benedict form un precipitado de color rojo, puesto que las formas cclica de esta azcar est en equilibrio con la correspondiente forma lineal aldehdica, un reactivo reacciona con el azcar eliminando del equilibrio la forma abierta, la glucosa se

oxid dando lugar a la reduccin del sulfato de cobre (II), de color azul, a xido de cobre (I) de color rojoanaranjado. La sacarosa dio la reaccin de Benedict negativa debido a que esta es un disacrido que no posee carbonos anomricos libres por lo que carece de poder reductor. Sin embargo, en presencia de HCl y en caliente, la sacarosa se hidroliza, es decir incorpora una molcula de agua y se descompone en los monosacridos que la forman, glucosa y fructosa que si son reductores. La prueba puede o podra haberse verificado con la hidrlisis que se realiza con el reactivo de Fheling y si el resultado es positivo aparecera un precipitado rojo. Si el resultado es negativo, la hidrlisis no se ha realizado correctamente y si en el resultado final aparece una coloracin verde se debe a una hidrlisis parcial de la sacarosa {4}. PRUEBA DE BARFOED PARA DISTINGUIR ENTRE MONOSACRIDOS Y DISACRIDOS RCOH + 2Cu+2 + 2H2O Cu2O + 4H+ RCOOH +

calentamiento se prolonga unos minutos ms, los disacridos podran dar una prueba positiva. (Ver tabla 1). Los disacridos tienen menor poder reductor al tener comprometido uno de sus carbonos anomricos en el establecimiento del enlace glucosdico, no reaccionan y por lo tanto dan un resultado negativo.

Figura 5. Prueba positiva para la fructosa PRUEBA PARA EL RECONOCIMIENTO DE CETOSAS (SELIWANOFF)

Ec.1 Prueba De Barfoed Esta prueba sirve para distinguir monosacridos reductores de disacridos reductores, basndose en la velocidad de reaccin, en los monosacridos la formacin del xido cuproso es ms rpido que en los disacridos. La reaccin consiste en utilizar acetato cprico y cido actico con lo que slo los monosacridos son capaces de reducir al cobre. La formacin de un precipitado rojo entre 5 y 7 minutos, es prueba positiva para monosacridos reductores, lo que indica que los carbohidratos: glucosa y fructosa estn incluidos en este grupo. La maltosa y lactosa, son disacridos y por ende dan una prueba negativa, pero si el

Figura 6. Prueba de Seliwanoff Esta prueba es especfica para cetosas que contengan 5 o ms tomos de carbono. En presencia de un cido fuerte producen rpidamente derivados furfricos que reaccionan con resorcinol, este condensa con los fufurales derivados de cetosas originando un color rojo-anaranjado intenso. Este fenmeno se desencadena porque las cetosas se deshidratan a mayor velocidad que las aldosas. En las condiciones en las que se efecta el ensayo, todas las cetosas que puedan estar unidas por enlaces glucosdicos, quedaran en libertad y darn una reaccin positiva como ocurre con el residuo de fructosa derivado de la sacarosa. Segn la tabla 1. Los carbohidratos: fructosa y sacarosa reaccionan con el reactivo de Seliwanoff y forman el producto coloreado; mientras que la

glucosa no reacciona, esto quiere decir que, la ltima no pertenece al grupo de las cetosas si no al de las aldosas. En la figura 6 se muestra la reaccin de la fructosa con el reactivo de Seliwanoff formando un complejo coloreado rojoanaranjado. PRUEBA BIAL PENTOSAS PARA RECONOCER

Figura 7. Prueba de Bial Cuando se calientan pentosas con HCl concentrado se forma el furfural, este se condensa con orcinol en presencia de iones frricos para dar un color verde azulado. Esta prueba es positiva para la xilosa y arabinosa, porque son pentosas. Mientras que la glucosa pertenece al grupo de las hexosas y por tanto no hay reaccin. La reaccin no es absolutamente especfica para las pentosas, ya que el calentamiento prolongado de algunas hexosas produce hidroximetil furfural que tambin reacciona con orcinol para dar productos coloreados. RECONOCIMIENTO DE POLISACRIDOS CON EL REACTIVO DE LUGOL

El yodo forma complejos coloreados de absorcin con los polisacridos. El almidn al combinarse con solucin de yodo en yoduro de potasio toma una coloracin azul. Mientras, que si la reaccin se efecta con glucgeno y almidn parcialmente hidrolizado da un color pardo rojizo. El almidn es un polisacrido vegetal formado por dos componentes: la amilosa (figura 8.1) y la amilopectina (figura 8.3). La primera se colorea de azul en presencia de yodo debido no a una reaccin qumica sino a la adsorcin

o fijacin de yodo en la superficie de la molcula. Se forma un complejo de coordinacin entre las micelas de almidn y yodo. Estas micelas estn formadas por cadenas polisacridas enrolladas en hlices (figura 8.2). El color observado desaparece cuando se somete a calentamiento la solucin, lo cual destruye el complejo formado por el yodo y almidn. Por lo anterior esta prueba se lleva a cabo en frio. La reaccin con las muestras biolgicas dio negativa porque estos alimentos no estn formados por polisacridos, sino por azucares simples. Conclusiones A travs de estas pruebas y realizando la comparacin con las muestras biolgicas se concluye que; el jugo de uvilla contiene glucosa y fructosa, ya que dio reaccin positiva en las pruebas de Molisch, Fehling y Barfoed, porque se consideran monosacridos reductores, y reaccin positiva en la prueba de Seliwanoff para la fructosa, que es una cetosa. La leche contiene lactosa, que se hidroliza en galactosa y glucosa, por tanto dio positiva a las pruebas de Molisch, cido mcico, Fehling. La miel de abeja contiene principalmente glucosa y fructosa, ya que dio positiva a las pruebas de Molisch, Benedict, Fehling y Barfoed, tambin contiene galactosa al dar positiva la prueba de cido mcico. Con los datos de la tabla 1 se concluye que la solucin problema contena carbohidratos dando positiva a la prueba de Molisch, una vez comprobada su presencia se procedi a realizar la prueba de Benedict mediante la cual se encontr que dicha muestra contena un carbohidrato reductor, mediante la prueba de Barfoed se determin la presencia de un monosacrido debido a la formacin de

un precipitado rojo amarillento, con la prueba de Seliwanoff se estableci que la muestra es una cetosa, esto fue evidente por la reaccin inmediata ya que esta se caracteriza por tener en su cadena un grupo carbonilo en el carbono 2. Con la prueba de Bial se concluye que la cetosa no es una pentosa porque dio prueba negativa y finalmente con la prueba de lugol se reafirm que se trataba de un monosacrido ya que esta prueba result negativa, ya que esta se utiliza para identificacin de polisacridos. Con esto se puede deducir que la cetosa puede corresponder a la fructosa debido a que esta es una hexosa y es un monosacrido reductor. Bibliografa [1] Morrison y Boyd, Qumica orgnica, quinta edicin, Adison Wesley Iberoamericana S.A, 1990. [2] Hart Harold, Qumica orgnica, novena edicin, McGraw-Hill, 1995. [3] Universidad de Bogot Jorge Tadeo Lozano, GUIA 7: reconocimiento e identificacin de carbohidratos. [4] KAIRUZ de Civeta, Luz A. Introduccin al estudio de la composicin de alimentos. Universidad Nacional de Colombia. Bogot. 1984 Pag. 31,68,108,109