FISIOLOGIA E ECOLOGIA DA FERMENTAO ALCOLICA

Luiz Carlos Basso ESALQ/USP

 O Processo Industrial A Fisiologia da Fermentao

Balano Energtico Balano de Massa

Fatores Limitantes da Produtividade

Agentes Txicos e Estressantes Bactrias Contaminantes Leveduras Contaminantes

Obteno de Linhagens Apropriadas ao Processo Industrial

O PROCESSO FERMENTATIVO COM RECICLO DE CLULAS

CIDO MOSTO
pH=1.8-2.5 2-5 horas 32-40oC 6-10 horas 7-14% cels
CENTRFUGA CUBA

DORNA

CREME
pH=3.7-4.5

VINHO

7-11%EtOH

O AGENTE DA FERMENTAO :
A LEVEDURA - Saccharomyces cerevisiae 5 10

A CLULA DE LEVEDURA E SEUS COMPARTIMENTOS

A SINGULARIDADE DA FERMENTAO ALCOLICA

AUCAR
ATP CARBONO CLULA FILHA

ETANOL CO2

A FERMENTAO ALCOLICA
+
FRUTOSE GLICOSE

HEXOSE P NH4+ Mg++ K+

BIOMASSA
TREALOSE E GLICOGNIO

PROTEINAS

SACAROSE

GLICEROL PIRUVATO

ATP

K+

AMINOCIDOS

Zn++ CO2 ETANOL ETANOL

NH4+
AC.ORGNICOS AC.ORGNICOS : SUCCNICO, MLICO, PIRVICO

PORQUE A LEVEDURA TRANSFORMA O ACAR EM LCOOL ?

A FERMENTAO ALCOLICA A MANIFESTAO DA VIDA EM CONDIES DE ANAEROBIOSE (Pasteur)

C6H1206
BIOMASSA (ATP) GLICEROL

2C2H60

2CO2

AC. ORGNICOS, ETC.

BALANO ENERGTICO DA RESPIRAO AERBICA

(47g BIOMASSA/100g ART)

O2

100 g ART

380 Kcal (100 %)

CALOR
212 Kcal (56 %)

ATP
168 Kcal (44 %)

108 g GUA

+
9
264 g CO2

0 Kcal (0 %)

ALTA EFICIENCIA DE FORMAO DE BIOMASSA EM AEROBIOSE

AUCAR (100g)
10 ATP CARBONO BIOMASSA (50g)

CO2 H20 (50%)

10

BALANO ENERGTICO DA FERMENTAO

(1- 5g DE BIOMASSA/100g ART) 100 g ART 380 Kcal (100 %)

CALOR 17,5 Kcal (4,6 %)

ATP 9 Kcal (2,4 %)

51,1 g LCOOL

354 Kcal (93 %)

+
11
48,9 g CO2

BAIXA EFICIENCIA DE PRODUO DE BIOMASSA NA FERMENTAO

AUCAR (100g)
1 ATP CARBONO BIOMASSA (5g)

ETANOL CO2 (90%)

GLICEROL (5g)

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BALANO ENERGTICO
(FERMENTAO X RESPIRAO) ANAEROBIOSE: C6H1206 FERMENTAO
CO2 + ETANOL + 2 ATP/MOL 1 - 5 g BIOMASSA SECA/100gART

AEROBIOSE: RESPIRAO C6H1206 + O2

CO2 + GUA + 38 ATP/MOL 47 g BIOMASSA SECA/100g ART

PARA COMPENSAR A BAIXA EFICINCIA ENERGTICA DA FERMENTAO A LEVEDURA INTENSIFICA A VELOCIDADE DE DEGRADAO DO ACAR QUANDO EM ANAEROBIOSE

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BALANO DE MASSA
(EM ANAEROBIOSE)

PRODUTOS DA FERMENTAO

% DO ART CONSUMIDO (86 A 92% DE REND*.)

ETANOL GS CARBNICO BIOMASSA GLICEROL AC. SUCCNICO AC. ACTICO LEO FUSEL
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46 - 47 41 - 45 1-5 2-9 0,3 - 1,2 0,1 - 0,7 0,2 - 0,6

* Para consumo total de acar pela levedura

BALANO DE MASSA
(NA FERMENTAO)

TODOS OS PRODUTOS DA FERMENTAO COMPETEM ENTRE SI PELA MESMA FONTE DE CARBONO - O ACAR EXISTE UMA RELAO ENTRE ELES - A FORMAO DE ALGUNS AFETA OS TEORES DOS DEMAIS
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A FORMAO DO GLICEROL
(O PRODUTO SECUNDRIO GERADO EM MAIOR PROPORO)
O
BIOMASSA C. SUCCNICO C. ACTICO

A ID OX

GLICOSE (ACAR)

NAD+

NADH+ H+

NAD+

RE

DU

GLICEROL

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O NADH+ H+ GERADO DEVE SER CONSUMIDO PARA MANTER O EQUILBRIO DE XIDO-REDUO EM ANAEROBIOSE

A FORMAO DO GLICEROL
ACOPLADO AO CRESCIMENTO E CIDOS
1 Kg DE BIOMASSA SECA GERA 1 Kg DE GLICEROL 1 Kg DE CIDO SUCCNICO GERA 4 Kg DE GLICEROL

ACOPLADO AOS ESTRESSES

OSMTICO - CAUSADO POR ELEVADAS CONCENTRAES DE ACAR OU SAIS NO MOSTO CONTAMINAO BACTERIANA PRESENA DE SULFITO NO MOSTO

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BALANO DE MASSA
(EM ANAEROBIOSE)

A FORMAO DOS SUBPRODUTOS DA FERMENTAO CONSOMEM ACAR EM DETRIMENTO DA FORMAO DE ETANOL PODE-SE AUMENTAR A FORMAO DE ETANOL DIMINUINDO A FORMAO DE BIOMASSA, GLICEROL, CIDOS ORGNICOS, ETC. AT ONDE SE PODE FAZER ESSA REDUO?

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BALANO DE MASSA
(EM ANAEROBIOSE)

BIOMASSA - NECESSRIO FAZER A REPOSIO

DA PARCELA PERDIDA A CADA RECICLO

GLICEROL - ACOPLADO BIOMASSA E C. ORG.

- ACOPLADO AOS ESTRESSES
OSMTICO, TEMPERATURA, SULFITO, BACTRIAS, EXCESSO DE K+

CIDO SUCCNICO - ATIVIDADE ANTIBACTERIANA

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CIDO SUCCNICO
O CIDO ORGNICO MAIS ABUNDANTE NA FERMENTAO COOH C6H12O6
10 H++10 e-

CH2 CH2
1

COOH
+
2

20

GLICEROL

CO2

Efeitos da reduo da formao do cido succnico durante a fermentao

Reduziu a formao do cido succnico e glicerol Aumentou o rendimento em etanol A partir do 3o ciclo aumentou a contaminao bacteriana que comprometeu o rendimento O que se ganhou em etanol no cobriu o custo do controle bacteriano

AO ANTIBACTERIANA DO CIDO SUCCNICO

TRATAMENTOS
(CONDIES DE CRESCIMENTO)

APS 24 HORAS BACTRIAS pH FINAL 6 cels/mLx10

CONTROLE BACTRIA (%)

Controle (pH=5,0) FERMENTAO (pH=5,0)

3,11 3,67

185 3

0 98

22

AC.SUCC+ETANOL (pH=3,5)

3,56

96

OUTROS INSUCESSOS DO DESCONHECIMENTO DA FISIOLOGIA

O Bloqueio metablico na produo de glicerol resultou na incapacidade de crescimento O Incremento na formao de glicerol para resultar em vinho com melhor corpo, resultou em produto com maior teor de cido actico (j avinagrado)

FATORES LIMITANTES DA PRODUTIVIDADE

NUTRIENTES MINERAIS: N, P, K, Mg, Zn, Mn AGENTES TXICOS E ESTRESSANTES: TEMPERATURA ELEVADA ETANOL ACIDEZ (pH) PRESSO OSMTICA (ACAR E SAIS) SULFITO, Ca++ CONTAMINAO BACTERIANA ALUMNIO, EXCESSO K+

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FATORES ESTRESSANTES
TEMPERATURA ETANOL
DESN.PROTEINAS PRESSO OSMTICA

K+, Ca++ ACAR

GUA

H2SO3
SULFITO = S02 ATP

HSO3H+

GLICEROL

H+
AC. ORGNICOS
ADP ADP ADP

+ 2H

ATP-Al

CH3COOH
COOH CHOH CH3 COOCHOH + H+ CH3

H+ CH3COOATP-Mg

SO4-2

H2SO4 Al+3

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CONT. BACTERIANA = ACIDOS .ACTICO E LTICO

CONTAMINAO BACTERIANA

CONTAMINAO BACTERIANA
Consumo de acar e nutrientes cidos ltico e actico Biomassa bacteriana Manitol Floculao da levedura Tempo fermentao Gasto de cido sulfrico Maior formao de espuma Ao estressante levedura (glicerol) Produo de toxinas (?)

GRANDE IMPACTO NO RENDIMENTO DA FERMENTAO

93

REND. FERMENTAO %

92 91 90 89 88 87 86 85 -1206

794

2794

4794

6794

VINHO BAST. x 10^5

Y = 91,66357 - 0,00080 X (** r = -0,70692)

BIODIVERSIDADE BACTERIANA
Grande biodiversidade Predominncia de Lactobacillus e Bacillus L. fermentum, L. plantarum, L. buchneri, L. fructivorans, L. fructosus, L.vaccinostercus, L. paracasei, B. subtilis, B. coagulans, etc..... Tcnicas moleculares mostram espcies no cultivveis em meios convencionais

BIODIVERSIDADE BACTERIANA
Metabolismo pouco conhecido Poucos estudos sobre as relaes trficas com as leveduras Apresentam diferenas no antagonismo frente s leveduras Apresentam diferenas quanto floculao das leveduras

CONTROLE DA CONTAMINAO BACTERIANA

Qualidade da matria prima Sanitizantes e antibiticos (resistncias) Antibiograma em algumas destilarias Restrio ao uso de antibiticos (levedura para consumo humano e animal) Tratamento cido do fermento Alternativas mais naturais (lpulo, bacteriocinas, fagos, leveduras com atividade antibacteriana, etc.)

A IMPORTNCIA DA VIABILIDADE DA LEVEDURA

PARAMETROS VIABILIDADE (%) RENDIMENTO (%) GLICEROL (%) TREALOSE (%) BACT.x10 (cels/mL)
7

VIABILIDADE ALTA 100 - 45 92 3,5 11,2 6,7 BAIXA 70 - 30 87 4,2 7,0 23,0

PE-2 X Lactobacillus fermentum

IMPACTO DAS LEVEDURAS CONTAMINANTES

Grande biodiversidade Diferentes caractersticas fermentativas Rendimento em etanol Formao de glicerol Formao de espuma Floculao (com e sem bactria)

POPULAO CONSTITUDA POR MUITAS LINHAGENS

DESTILARIA A

LINHAGEM DOMINANTE
(MAIS RARO)
DESTILARIA B

MAIS RARO AINDA: PERSISTNCIA

Caractersticas fermentativas das leveduras contaminantes

desejvel

espuma

floculao

326 isolados das ultimas 4 safras

9%

91%
63% - espumam 32% - floculam 53% - sobra acar 3-5% - no Saccharomyces*

COM PROBLEMAS

SEM PROBLEMAS

*Schizossacharomyces, Candida, Brettanomyces (Dekkera)

SELEO DE LEVEDURAS
(utilizao da presso seletiva exercida pelo prprio processo industrial)
CAPACIDADE DE SOBREVIVNCIA NO PROCESSO INDUSTRIAL
DOMINNCIA PERSITNCIA MANUTENO DE ALTA VIABILIDADE (TREALOSE)

BOAS CARACTERSTICAS FERMENTATIVAS

RENDIMENTO EM ETANOL BAIXA FORMAO DE GLICEROL AUSNCIA DE FLOCULAO (C/ E S/ BACTRIA) NO FORMAO DE ESPUMA ANTAGONISMO FRENTE BACTRIAS, ETC.

LEVEDURAS COM ALTO DESEMPENHO FERMENTATIVO

SUPORTAR OS ESTRESSES DA FERMENTAO INDUSTRIAL COM RECICLO DE CLULAS
-ALTAS TEMPERATURAS -ELEVADOS TEORES ALCOLICOS -TRATAMENTO CIDO -PARADAS (FALTA DE ACAR) -SULFITO, ALUMNIO, EXCESSO K+, Ca++ -PRESSO OSMTICA -CONTAMINAO BACTERIANA -ESTRESSES DESCONHECIDOS (?)

SUSTENTAR ALTA VIABILIDADE CELULAR DURANTE RECICLOS E APRESENTAR BOA EFICINCIA EM ETANOL

LEVEDURAS COM ALTO DESEMPENHO FERMENTATIVO

PARMETROS PARMETROS AVALIADOS AVALIADOS
1 1 REND. ETANOL (%)(%) REND. ETANOL 1 1 GLICEROL (%) GLICEROL (%)

17% ART A 7-8%EtOH A 30 30 0 C FL FL 88,8 88,8 4,6 4,6

2

21% 9% EtOH ART A A 33 33 0 C FL FL 89,5 89,5 5,7 5,7 35 35 48 48 9 9 4 4 PE -2 PE2 93,2 93,2 3,7 3,7 49 49 97 97 16 16 9 9

IZ-1904 IZ-1904 90,0 90,0 5,1 5,1 -10 10 28 28 7 7 0 0

2 TAXA CRESCIMENTO (%) TAXA CRESCIM. (%)

3 3 VIABILIDADE (%) VIABILIDADE (%) 3 3 GLICOGNIO (%) GLICOGNIO (%) 3 3 TREALOSE (%) TREALOSE (%)

41 41 80 80 16 16 7 7

1 Frao do acar metabolizado transformado em etanol ou glicerol 2 Taxa de crescimento da levedura no transcorrer de 6 ciclos

40

3 Valores referentes levedura do 60 ciclo fermentativo

BENEFCIOS DO USO DAS LINHAGENS SELECIONADAS

RENDIMENTO INSUMOS

(DIFCIL VERIFICAR)

(FCIL COMPUTAR OS GASTOS)

CONSUMO DE ANTIESPUMANTE E DISPERSANTE

1,2 g / L LCOOL

0,8

A B C

0,4

0 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004

A A LEVEDURA SELECIONADA PERMANECEU AT O FINAL DA SAFRA B A LEVEDURA SELECIONADA FOI SUBSTITUDA AO LONGO DA SAFRA C NO SE UTILIZOU DE LEVEDURAS SELECIONADAS

N D IC E D E IM P L A N T A O
D A S L E V E D U R A S S E L E C IO N A D A S
(1 9 9 4 - 2 0 0 5 )
L e v e d u ra s S e le c io n a d a s Taxa de P e rm a n n c ia (% ) Taxa de D o m in n c ia (% ) n d ic e d e Im p la n ta o

PE2 BG1 CAT1 SA1 VR1 CR1

PANIFICAO, TA, Y-904, TURBO, OUTRAS

58 42 51 32 25 17

54 65 45 44 15 6

3132 2730 2295 1408 375 102

CONCLUSES
ESTUDO DAS CONDIES FISIOLGICAS DA LEVEDURA NA FERMENTAO COM RECICLO IDENTIFICAO E ADMINISTRAO DOS FATORES ESTRESSANTES DO PROCESSO ESTUDO DA ESTEQUIOMETRIA DA FERMENTAO E COMO ALTER-LA NAS CONDIES DO PROCESSO MELHOR CONHECER A BIODIVERSIDADE DAS LEVEDURAS E BACTRIAS, BEM COMO SUAS RELAES TRFICAS FORMAS ALTERNATIVAS DE CONTROLE BACTERIANO OBTENO DE LINHAGENS DE LEVEDURAS APROPRIADAS FERMENTAO INDUSTRIAL

44