Disregulasi Apoptosis pada Keganasan:*

Telaah Khusus pada Astrocytoma Siti Boedina Kresno Departemen Patologi Klinik FKUI/RSCM/RSKD PENDAHULUAN Apoptosis adalah suatu proses fisiologis yang dikendalikan dengan kontrol genetik yang ketat, berlangsung melalui proteolisis, kondensasi dan fragmentasi DNA disusul dengan pengerutan sel.1 Secara biokimiawi terjadi aktivasi berbagai endonuklease dan protease, DNA dipecah menjadi fragmen-fragmen dengan panjang berbeda. Proses ini berakhir dengan dimakannya sel-sel tersebut oleh sel-sel yang berada di sekitarnya misalnya makrofag, tanpa merangsang respons inflamasi.1 Apoptosis merupakan proses penting baik dalam perkembangan jaringan normal maupun homeostasis jaringan pada orang dewasa. Sejak lama juga diketahui bahwa apoptosis merupakan bagian integral dari fungsi sistem imun, khususnya untuk menyingkirkan sel-sel T autoreaktif untuk mencegah berlanjutnya penyakit autoimmune,3 atau untuk menyingkirkan sel-sel limfosit T yang terinfeksi HIV, baik di darah tepi maupun dalam kelenjar getah bening.4 Kematian sel terprogram juga merupakan proses penting dalam berbagai stadium perkembangan sel B, yaitu apabila terjadi kesalahan rearrangement gen imunoglobulin dan apabila terdapat klon sel B autoreaktif IgM+/IgD-. Di dalam pusat germinal juga terjadi proses apoptosis yang tinggi untuk menyingkirkan sel-sel yang tidak diperlukan dan memilih sel-sel yang mempunyai afinitas tinggi terhadap antigen.5,6,7,8 Dalam kaitannya dengan pengendalian tumorigenesis, apoptosis merupakan mekanisme penting untuk mencegah proliferasi sel yang mengalami kerusakan DNA, agar sel-sel dengan lesi DNA tersebut tidak dilipat gandakan, sehingga dalam hal ini apoptosis berfungsi sebagai salah satu kontrol checkpoint dalam siklus sel. Kegagalan sel-sel tumor untuk melaksanakan mekanisme apoptosis merupakan salah satu faktor yang mendasari pertumbuhan tumor yang makin lama makin besar, instabilitas genetik sel-sel bersangkutan dan resistensi terhadap khemoterapi.2,9 Defek mekanisme apoptosis dapat meningkatkan ketahanan hidup sel dan menambah kemungkinan ekspansi sel ganas. Akibat defek mekanisme apoptosis yang lain adalah memperbesar kemungkinan terjadinya keganasan selain akibat instabilitas genetik dan akumulasi kelainan genetik, juga akibat ketidak taatan terhadap aturan yang ditentukan pada checkpoint siklus sel untuk menginduksi apoptosis.10 JALUR APOPTOSIS DAN BERBAGAI MOLEKUL YANG TERLIBAT Proses apotosis dapat dibagi dalam tiga fase, yaitu: fase inisiasi atau induksi heterogen yang bergantung pada stimulus, fase efektor atau komitmen pada saat mana diambil keputusan untuk bunuh diri, dan fase degradasi atau eksekusi di mana sel-sel bersangkutan memperlihatkan gambaran biokimia dan morfologi apoptosis.10,11 Selama fase induksi atau inisiasi yang heterogen, sel menerima stimulus yang menginduksi kematian, kehilangan faktor-faktor yang menunjang ketahanan hidup, kekurangan suplai untuk metabolisme dan terjadi pengikatan reseptor yang meneruskan sinyal kematian, * Dimodifikasi dari publikasi dalam buku (e-book) Kresno SB: Ilmu Dasar Onkologi 2002

misalnya pengikatan Fas/FasL, TNF/TNFR dan lain-lain. Reaksi kimia yang berperan dalam fase induksi ini sangat heterogen bergantung pada seberapa lethal stimulus yang diterimanya. Pada fase berikutnya, yaitu fase efektor, proses inisiasi dilanjutkan dengan reaksi metabolik dengan pola yang lebih teratur, dan sel mengambil keputusan atau komitmen untuk bunuh diri. Pada fase selanjutnya, yaitu fase degradasi atau fase eksekusi , terjadi peningkatan berbagai aktivitas, termasuk peningkatan aktivasi enzimenzim katabolik dan produksi reactive oxygen species (ROS). Pada fase ini perubahan morfologi dan biokimiawi sel, di antaranya fragmentasi DNA, degradasi berbagai jenis protein dan lain-lain menjadi lebih jelas. Semua sel mengalami apoptosis menurut pola tertentu dan menunjukkan bahwa sel-sel tersebut mengekspresikan semua komponen protein yang diperlukan untuk meng-eksekusi kematian sel.10,11

Kerusakan subnekrotik

Sinyal melalui reseptor

Jalur privat

Fase induksi
ROS Transisi permeabilitas mitokhondria Aktivasi protease ROS
Bcl2
P e r u b a h a n m e m b r a n

Fase efektor

Jalur umum
AIF

Fase degradasi
ROS Perubahan sitoplasma Apoptosis nukleus

Gambar 1: Model pengaturan apoptosis.11 Gambar 1 memperlihatkan salah satu model pengaturan apoptosis. Apoptosis dapat diinduksi oleh kerusakan subnekrosis atau melalui sinyal yang diterima oleh reseptor pada permukaan sel. Proses induksi apoptosis yang terjadi selanjutnya dalam fase ini bergantung pada stimulus, sehingga jalur ini merupakan jalur privat dan heterogen. Integrasi berbagai jalur privat ke dalam jalur umum yang berlaku bagi semua jalur apoptosis dan tidak bergantung pada apa yang menginduksinya, berlangsung melalui transisi permeabilitas mitokhondria (permeability transition, PT). Onkoprotein Bcl2 mengatur induksi PT dan sebagai respons terhadap induksi PT, mitokhondria melepaskan apoptosis inducing factor (AIF) yang memberikan sinyal apoptosis pada nukleus. Di samping itu, PT mengakibatkan penglepasan reactive oxygen species (ROS) dan ekspresi phosphatidyl serine (PS) pada permukaan sel dalam waktu singkat.11 2

FAKTOR-FAKTOR YANG BERPERAN PADA FASE INISIASI

Berbagai stimulus dapat mengawali fase inisiasi melalui aktivasi berbagai reseptor transmembran. Contoh khas dari stimulasi ini adalah pengikatan Fas (CD95) dengan FasL dan TNF- dengan TNFR. Pada pengikatan Fas/FasL terjadi oligomerisasi dari reseptor yang mengakibatkan bagian intraseluler dari CD95 menggumpal dan dikenal dengan sebutan death domain. Protein lain yang kemudian di-rekrut dari sitoplasma dan berfungsi juga sebagai death domain adalah FADD (Fas associated death domain). FADD merupakan molekul adaptor yang berperan merekrut caspase. Untuk mempermudah proses ini molekul FADD mengandung molekul pengikat yang disebut DED (death effector domain) yang juga dimiliki oleh procaspase-8, sehingga keduanya dapat saling berikatan. (gambar 2) 12,13

CD95 ligand (Fas ligand)

CD95 (Fas)

Death domains Death effector domains (DEDs)

FADD Pro-caspase-8

Gambar 2: Salah satu jalur sinyal apoptosis melalui CD95 (Fas).12 Fas (CD95), suatu reseptor pada permukaan sel yang berikatan dengan FasL (CD95L) merupakan awal dari sinyal apoptosis. Pada gambar 2 tampak bahwa sekuen asam amino yang merupakan unsur-unsur death domains, death effector domains , FADD dan procaspase-8 saling berikatan untuk menginduksi fase efektor. Pengikatan CD95 pada FADD terjadi akibat interaksi antara death domain kedua protein. Faktorfaktor lain yang berperan pada inisiasi apoptosis adalah reseptor TNF (TNFR), CD27, CD30, CD40, DR3, DR4 dan DR5. Seperti halnya molekul CD95, molekul TNFR1, DR3, DR4 dan DR5 juga memiliki death domain, walaupun masing-masing meneruskan sinyal apoptosis melalui jalur yang berbeda.3,12 Beberapa penelitian terakhir mengungkapkan bahwa pada saat berlangsung sinyal apoptosis melalui Fas, yang pertama terbentuk adalah Fas-DISC (Fas-death inducing signal). Salah satu komponen Fas-DISC adalah SADS (small accelerator for death signaling) yang fungsinya meningkatkan interaksi antara FADD dengan procaspase-8. Hambatan terhadap SADS memperlambat apoptosis.14,15

Apoptosis juga dapat berlangsung melalui reseptor sel T (TCR). Hal ini terjadi apabila sel T mengenali antigen-diri (self antigen) dan merupakan suatu proses yang diperlukan untuk menyingkirkan sel T autoreaktif.3 Apoptosis ini disebut apoptosis yang diinduksi aktivasi (activation induced apoptosis). Jalur apoptosis melalui TCR diperlihatkan secara skematis pada gambar 3. Apoptosis yang diinduksi aktivasi ini juga terdiri atas fase induksi yang dirangsang dengan pengikatan TCR, disusul oleh fase efektor di mana terjadi berbagai reaksi biokimia untuk melangsungkan apoptosis.16

TCR/CD3 TNF TNFR FASL Fas

Ekstraseluler
ZAP-70
Lck

TRAF TRADD
c-IAP TRIP

FADD
FLICE Nedd2/Ich-1

Intraseluler

PriCE/CPP32/apopain ICE

RAR

ALG-3 NFAT

TDAG51

PARP, lamins DNA-PK topoisomerase fodrin

awal Fase induksi

lanjut Fase efektor

Gambar 3: Fase induksi dan fase efektor apoptosis melalui TCR.16

Sinyal yang diberikan oleh TNF/TNFR mengatur interface antara fase induksi awal dengan fase efektor yang melibatkan aktivasi caspases. ALG-3 dan NFAT merupakan regulator positif ekspresi FasL selama apoptosis dengan perantaraan TCR/CD3, sedangkan RAR (retinoic acid receptor) menghambat proses ini. TNFR tidak mengandung death domain tetapi menggunakan protein TRAF sebagai adaptor sinyal untuk merekrut molekul-molekul transduksi seperti TRADD, cIAP dan TRIP. Fas mengandung death domain pada bagian intrasitoplasmik dan berinteraksi dengan molekul adaptor sinyal yang juga mengandung death domain (FADD) dan dengan demikian merekrut molekul transduksi sinyal misalnya FLICE. ZAP-70 dan Lck merupakan enzim kinase yang merupakan pengatur jalur sinyal melalui TCR. Protein-protein yang berfungsi sebagai efektor tampak pada bagian kanan gambar 3.
FAKTOR YANG BERPERAN PADA FASE EFEKTOR

Ada berbagai bukti bahwa pengendalian apoptosis dihubungkan dengan gen yang mengatur siklus sel, termasuk di antaranya gen p53, Rb, myc dan lain-lain. Di lain fihak

berbagai jenis gen berfungsi sebagai penghambat apoptosis, di antaranya keluarga bcl2 dan beberapa jenis onkogen virus yang dikenal memiliki potensi untuk mengakibatkan transformasi sel menjadi ganas.. Gen p53 dan retinoblastoma (Rb) Fungsi produk gen p53 dan Rb terkait erat dengan peristiwa dalam siklus sel pada fase G1. Mekanisme kerja p53 sangat kompleks. Ia dapat berikatan dengan berbagai jenis protein dan terlibat dalam mengatur ekspresi berbagai gen. Dalam beberapa tahun terakhir terungkap bahwa p53 dapat mengatur proliferasi sel maupun apoptosis tergantung situasi dan latar belakang sel. Sel yang kehilangan p53 baik karena mutasi, infeksi virus atau sebab lain, mengakibatkan sel kehilangan kemampuan apoptosis yang diinduksi oleh khemoterapi, radiasi, kehilangan Rb, ekspresi c-myc dan anoksia. Di lain fihak, p53 yang wild type dapat mengkompensasi kehilangan Rb1 sehingga dengan demikian dapat mencegah terjadinya transformasi.17

Kontrol transkripsi & siklus sel E1A

Rb

E2F

Myc
Fungsi pertumbuhan

Iradiasi-

P53

Mdm2
P21,GADD45

FasL/TNF

Fas/TNFR1

Kel Bcl2 Mcl1, Bcl2 >< Bax,Bak,Nbk E1B, 19K Bcl-xl >< Bcl-xs Bad

Inhibisi CDK, PCNA

Growth arrest

?
Faktor survival
Crm A P35

?
Protease cystein menyerupai ICE ICE-Mch2 TX/ICErel-II/Ich-2 ICErel-III Ich-1/Nedd2 CPP32

IL-1

lamins dan substrat lain

PARP

Inflamasi

Apoptosis

Gambar 4: Peran p53 pada apoptosis.17 5

Gen retinoblastoma (Rb) mencegah berlangsungnya siklus sel pada fase G1/S dengan menghambat fungsi faktor transkripsi E2F dan dengan demikian menghambat fungsi berbagai gen yang bekerja pada fase S, termasuk di antaranya myc, myb, dan DNA polimerase . Sebagian besar partner Rb1 dalam mengatur siklus sel adalah regulator transkripsi seperti E2F, c-Abl dan Mdm2. Mdm2 merupakan salah satu faktor yang menghambat apoptosis. Pada saat apoptosis Mdm2 mengalami degradasi oleh caspases. Pada induksi apoptosis terjadi cleavage pada C-terminal molekul Rb oleh caspases sehingga terjadi akumulasi Rb1. Fragmen Rb1 ini secara biologis tetap aktif karena domain fungsional minimal Rb1 sebagai gen supresor terletak pada bagian ini, sehingga apoptosis lebih banyak diasosiasikan dengan kehilangan seluruh rantai Rb1 dan tidak bergantung pada akumulasi Rb1.

TNF- R

+
Upstream caspases

+ + Mdm2 + Rb1
F a s L / F a s

+ Rb1 + Mdm2 Mdm2 Degradasi Rb1 Degradasi Mdm2

Aktivasi E2F + +

Aktivasi p53

Death effector caspases

Apoptosis Gambar 5: Model peran Rb1 dalam pengaturan apoptosis.18 Walaupun tetap aktif secara biologis, Rb1 kehilangan kemampuan untuk mengikat Mdm2 yang mengakibatkan Mdm2 lebih peka terhadap degradasi oleh caspases. Karena itu cleavage Rb1 dan Mdm2 oleh caspases secara bersama menyebabkan aktivasi E2F-1 dan p53, yang diketahui merupakan pemicu apoptosis.18 Pada keadaan hilangnya fungsi Rb, siklus sel tetap berlanjut ke fase S, tetapi gen p53 yang aktif akan menginduksi sel tersebut untuk apoptosis.19,20 Gambar 4 memperlihatkan

model peran p53, sedangkan pada gambar 5 tampak model peran Rb1 pada apoptosis.18 Perombakan Rb1 di-katalisasi oleh upstream caspase(s) yang tidak memiliki kemampuan untuk membunuh sel kemudian dirombak oleh caspase(s) yang mampu membunuh sel (death effector caspases). Pada apoptosis yang diinduksi oleh Fas/FasL death effector caspases diaktivasi melalui jalur yang tidak bergantung pada Rb1. Preservasi Rb1 melalui ekspresi Rb1 tidak berdampak pada apoptosis melalui jalur Fas/FasL, tetapi pada induksi melalui TNF-R, upstream caspases diaktifkan untuk merombak Rb1, walaupun mekanisme ini tidak cukup efisien untuk menghasilkan kematian sel. Degradasi selanjutnya bersama-sama dengan perombakan Mdm2 mengakibatkan aktivasi E2F dan p53. Ekspresi Rb1 mutant yang resisten terhadap perombakan oleh caspases melindungi E2F dan mencegah degradasi Mdm2, sehingga aktivasi death effector caspases terhambat dan tidak terjadi apoptosis. Dalam konteks ini Rb1 merupakan substrat penting bagi caspases.18 Gen myc. Onkogen myc juga banyak dipelajari peranannya dalam proliferasi sel maupun apoptosis. Ekspresi myc diperlukan untuk mengakibatkan sel dalam fase G0 masuk ke dalam siklus sel, tetapi pada sel yang terus berproliferasi ekspresi myc juga dapat dijumpai pada fase G1. Walaupun c-myc berperan dalam proliferasi sel, ia sekaligus juga dapat berperan dalam apoptosis. 21,22,23 Model peran gen yang bertentangan ini dijelaskan dengan model sinyal ganda, di mana myc merangsang jalur proliferasi sekaligus jalur apoptosis. Dalam model ini, sementara mitogen mengaktifkan jalur proliferasi, jalur apoptosis secara aktif dihambat oleh faktor-faktor anti-apoptotik, misalnya oleh keluarga gen bcl2.21 Dalam fungsinya myc membentuk heterodimer dengan gen max.. Kompleks onkoprotein myc-max meningkatkan apoptosis bila sel kehilangan faktor pertumbuhan, atau bila ada intervensi farmakologis.24 Dimerisasi myc-max diperlukan baik untuk proliferasi maupun apoptosis. Walaupun demikian myc dan max masing-masing memodulasi jalur apoptotik yang berbeda. Hal ini dibuktikan dalam suatu penelitian yang menyatakan bahwa Bcl-xL menghambat apoptosis sel yang mengekspresikan max berlebihan tetapi tidak pada sel-sel yang mengekspresikan c-myc berlebihan. 24 Keluarga gen Bcl-2 Gen Bcl2 sejak lama dikenal sebagai inhibitor apoptosis.10,11 Gen bcl2 secara spesifik menghambat kemampuan c-myc untuk menginduksi apoptosis tanpa mempengaruhi sifat mitogenik gen bersangkutan. Walaupun gen bcl2 merupakan anti-apoptotik yang kuat, ia tidak dapat menghambat semua bentuk apoptosis, salah satu contoh di antaranya adalah apoptosis yang diinduksi oleh TNF yang tidak dapat dihambat oleh bcl2. Gen ini termasuk keluarga gen yang anggota keluarganya makin lama makin bertambah; beberapa anggota keluarga gen ini bersifat menghambat apoptosis (Bcl2, Bcl-x1, Mcl1 dan lain-lain), tetapi beberapa anggota keluarga yang lain ternyata bersifat memudahkan apoptosis (Bax, Bcl-xs, Bad, Bak, dan lain-lain) Gambar 6 memperlihatkan beberapa subtipe keluarga Bcl2.10

Grup I Pro-apoptotik
Bax Bax Bax Bcl2

Grup II Anti-apoptotik
Bcl2 Bcl2 Bcl2

Grup III Pro-apoptotik

Bad Bad

Bax Bax

Bcl-2 Bcl-xL Mcl-1 A1 (BFL-1) Bcl-W BRAG-1 (?)

Bcl-xs Bad Bik Bim Hrk Bid (?)

Gambar 6: Sub-tipe protein keluarga Bcl-2 (dimodifikasi dari Reed 10) Sebagian besar keluarga protein bcl2 mengandung rantai asam amino hidrofobik pada sisi carboxy-terminal yang setelah di-translasi mengakibatkan mereka dapat menancap pada membran biologis, khususnya membran mitokhondria, envelop nukleus dan bagian dari retikulum endoplasmik.10,25 Ekspresi relatif anggota keluarga Bcl-2 yang pro-apoptotik dan anti-apoptotik menunjukkan bahwa suatu sel dengan mudah mengalami apoptosis bila dihadapkan pada stimulus yang tepat. Beberapa protein anggota keluarga Bcl2 terdapat secara luas dalam jaringan di seluruh tubuh, tetapi diekspresikan dengan pola spesifik jaringan yang bervariasi sesuai fase proliferasi dan diferensiasi yang seringkali unik untuk sel tertentu.10,25 Bcl2 dan Bcl-xL diketahui dapat berinteraksi dengan berbagai protein, misalnya protein CED-4, Raf-1 (-kinase) dan fosfatase calcineurin (tabel 1) Tabel 1: Protein pengikat Bcl-2 (dimodifikasi dari Reed.10) Protein
CED-4 Raf-1 BAG-1 R-Ras H-Ras Nip-1 Nip-2 Nip-3 PrP P53-BP2 Calcineurin

Uraian
Protein baru Serine/threonine protein kinase Protein baru GTPase GTPase Homolog dengan fosfo-diesterase Homolog dengan protein pengikat Ca++ Homolog dengan calbindin D Protein prion seluler Protein pengikat p53 Protein serine/threonine kinase Fosfatase

Fungsi
Menjembatani Bcl-2 dengan caspase Meningkatkan sito-proteksi oleh Bcl-2 Menginduksi fosforilasi oleh Bad Meningkatkan sito-proteksi oleh Bcl-2 Mengaktifkan Raf-1 kinase Tidak diketahui Tidak diketahui Tidak diketahui Tidak diketahui Tidak diketahui Tidak diketahui Tidak diketahui Sekuester Bcl-2 dalam sitosol Menghambat aktivasi NF-AT

Interaksi ini menunjukkan bahwa salah satu peran Bcl2 adalah memberikan tempat bagi protein lain untuk berlabuh sehingga aktivitas seluler protein bersangkutan terhenti. Peristiwa ini menyebabkan terperangkapnya protein-protein seperti CED-4 atau calcineurin sehingga mereka tidak dapat berinteraksi dengan protein lain dalam sitosol Peristiwa berlabuhnya protein, misalnya Raf-1, pada bcl2 itu juga mengakibatkan protein tersebut melekat pada membran dan berinteraksi dengan protein membran yang lain. Raf1 yang merupakan suatu enzim kinase, yang dalam keadaan normal terdapat dalam sitosol, berpindah tempat (translokasi) ke membran, menjadi aktif kemudian menginduksi fosforilasi protein pro-apoptotik Bad sehingga Bad menjadi inaktif.10 Homolog gen bcl2 yang bersifat anti-apoptotik juga terdapat pada virus herpes yang menyebabkan kanker, termasuk di antaranya virus Epstein Barr (EBV) dan virus sarkoma Kaposi (KSV).25
FAKTOR YANG BERPERAN PADA FASE DEGRADASI ATAU EKSEKUSI

Fase terakhir dari apoptosis adalah eksekusi yang terjadi melalui aktivasi enzim caspases yang merupakan eksekutor utama dari apoptosis.10,13,25,26 Gambar 7 memperlihatkan bahwa caspase merupakan pusat mekanisme apoptosis yang mempunyai fungsi katalitik terhadap berbagai substrat.25 Caspases yang merupakan protease cysteine, selalu ada dalam sitosol sel normal dalam bentuk proenzim rantai tunggal (pro-caspases).

Rangsangan apoptosis
khemoreseptor antihormon oksidan GFR TNF-R1
Inisiator caspase ADEDs mitokhondria Bcl-2

sistem imun onkogen gen supresor sel lepas

IAPs

Effector caspases

.
D4-GP1 DCC PARP LaminA Gelsolvin ICAD DNA-PK mdm2 Rb PAK APC PKC- Death substrates

Gambar 7: Skema jalur apoptosis.(Reed.25) Proenzim diaktivasi menjadi enzim proteases yang berfungsi penuh melalui suatu proses cleavage pertama pada proses mana rantai tunggal proenzim itu menjadi beberapa sub-unit caspases berukuran besar dan kecil, dan cleavage kedua untuk menghilangkan domain N-terminal.12,13,18 Aktivasi caspase dapat terjadi melalui interaksi antar caspase

satu dengan yang lain melalui suatu kaskade aktivasi, tetapi juga dapat terjadi akibat diaktivasi oleh protease lain misalnya granzyme B yang diintroduksikan ke dalam sel oleh limfosit sitotoksik dan merangsang apoptosis melalui aktivasi caspase-3. Caspase dengan prodomain pendek yang tidak memiliki kandungan protein interaksi (caspase 3,6,-7) mungkin terutama diaktivasi melalui protease lain, dan caspase ini disebut caspase down stream, efektor atau eksekutor. Agregasi pro-caspase cukup untuk mengawali auto- atau transprocessing untuk menghasilkan caspase yang aktif. Agregasi pro-caspase terjadi melalui pengikatan molekul adaptor pada domain interaksi yang terdapat pada caspase, di antaranya yang merupakan death efector domain (DEDs) dan caspases recruitment domain (CARDs). 13 Faktor lain yang berperan pada apoptosis adalah cytochrome-c. Penglepasan cytochrome-c oleh mitokhondria tidak bergantung pada caspases, dan dampaknya tidak selalu diasosiasikan dengan terjadinya pori pada membran mitokhondria. Atas rangsangan apoptosis, bax yang merupakan faktor proapoptotik segera berpindah tempat dari sitoplasma ke mitokhondria dan secara langsung dapat menginduksi penglepasan cytochrome-c melalui pori yang dibuatnya pada membran mitokhondria. Apabila aktivasi caspase-8 melalui cara ini inefisien, ditempuh jalur lain yaitu melalui Bid, faktor proapoptotik anggota keluarga bcl2 yang lain. Bid segera mengalami cleavage dan fragmen C-terminalnya segera merangsang mitokhondria untuk melepaskan cytochrome-c (gambar 8).13

Aktivasi caspase-8 inefisien (lemah) caspase-8 Bid MITOKHONDRION

Pro-caspase-3

Bcl-2/bcl-xl
Cytochrome-c

Apaf-1 Caspase-9 Amplifikasi sinyal Caspase-3, -6, -7

Gambar 8: Interaksi antar-jalur apoptosis.(Green.13) Pada gambar 8 di atas tampak bahwa caspase-8 yang teraktivasi (misalnya karena pengikatan Fas/FasL) memecah Bid, menghasilkan fragmen C-terminal yang kemudian melekat pada mitokhondria dan menginduksi penglepasan cytochrome-c.

10

Cytochrome-c kemudian berfungsi mengatifkan Apaf-1 (apoptosis protease activating factor) dan pemrosesan caspases-9 yang selanjutnya mengaktifkan kaskade caspase yang lainnya. Bcl-2/bcl-xl berfungsi menghambat penglepasan cytochrome-c dan dengan demikian menghambat apoptosis.13 DISREGULASI APOPTOSIS PADA KANKER Seperti telah diuraikan di atas banyak sekali faktor yang berperan dalam proses apoptosis. Sudah diterima secara luas juga bahwa apoptosis merupakan salah satu cara untuk menyingkirkan sel yang mengandung lesi DNA, sehingga dapat dicegah terjadinya transformasi sel dan terjadinya kanker. Kelainan atau mutasi yang terjadi pada berbagai gen, khususnya gen yang berperan meningkatkan apoptosis, memungkinkan terjadinya resistensi terhadap proses apoptosis yang diperlukan untuk mencegah transformasi. Defek mekanisme apoptosis berperan dalam menimbulkan kanker dengan cara menghasilkan lingkungan yang memungkinkan terjadinya instabilitas genetik dan akumulasi kelainan gen yang menyebabkan checkpoint siklus sel tidak taat lagi pada pengendalian siklus sel yang dalam keadaan normal menginduksi terjadinya apoptosis, dan peningkatan ketahanan hidup sel.25 Peran bcl2 dalam tumorigenesis, seperti telah diuraikan di atas adalah melalui: 1) pencegahan dikeluarkannya cytochrome-c dari mitokhondria dan 2) gangguan aktivasi caspases oleh cytochrome-c dan Apaf-1. Diduga bahwa ekspresi berlebihan bcl2 dan bclxl dapat meningkatkan kedua proses di atas dan meningkatkan kemungkinan terjadinya transformasi.13 Mutasi gen bcl2 yang sering dijumpai adalah substitusi basa pada segmen penyandi (coding region) atau pada proline-rich loop yang mengatur fosforilasi. Hilangnya loop ini akibat mutasi mengakibatkan fosforilasi bcl2 terganggu dan sel resisten terhadap rangsangan apoptosis.10 Protein berbagai jenis virus memiliki sekuen yang homolog dengan bcl2 atau bcl-xl, misalnya p19-E1B dari adenovirus, p30 dari Baculovirus dan BHFR-1 dari Virus Epstein Barr (EBV). Karena virus-virus tersebut sering dihubungkan dengan kanker, diduga protein-protein tersebut mempunyai fungsi yang sama dengan bcl2, yaitu anti-apoptosis.27 Disregulasi proses apoptosis juga terjadi pada astrocytoma. Caspase-1 bersamasama caspase-3 dan 8 memediasi apoptosis yang diinduksi Fas pada astrocytoma. Resistensi astrocytoma terhadap apoptosis yang dimediasi oleh Fas mengakibatkan astrocytoma dapat menghindar dari sistem imun pejamu dan memungkinkan tumor menempuh jalur alternatif untuk inflamasi dan angiogenesis sehingga mendukung pertumbuhan tumor.28 Ekspresi caspase-9 dan caspase-9S juga memegang peran penting dalam menentukan kepekaan sel-sel astrocytoma pada apoptosis.29 Resistensi terhadap apoptosis akibat defek intrinsik pada caspase-9 juga dikemukakan oleh Ceruti dan kawan-kawan30 yang mengungkapkan bahwa defek caspase-9 pada astrocytoma mengakibatkan hambatan aktivasi enzim dan gangguan interaksi dengan protein yang dilepaskan oleh mitokhondria Seperti telah diuraikan di atas ada peran p53 dalam apoptosis. Kehilangan p53 akibat mutasi terjadi pada awal perkembangan astrocytoma. Kehilangan p53 pada awal perkembangan astrocytoma menyebabkan gangguan pada checkpoint G1 dari siklus sel sehingga terjadi ekspansi klonal, akumulasi kelainan genetik dan progresi astrocyt ke arah keganasan.31

11

PEMANFAATAN MEKANISME APOPTOSIS PADA TERAPI KANKER Tujuan terapi kanker adalah membunuh sel kanker dan melindungi sel normal dari akibat terapi. Salah satu upaya mengatasi masalah kanker adalah mengembalikan fungsi gen yang terganggu, yaitu mengembalikan fungsi apoptosis atau menginduksi apoptosis. Hingga saat ini khemoterapi maupun radiasi ditujukan untuk membunuh sel kanker melalui apoptosis, tetapi seperti telah diuraikan di atas fungsi apoptosis pada kanker seringkali terganggu, sehingga tidak jarang menyebabkan resistensi terhadap terapi. Karena itu pengetahuan rinci tentang jalur apoptosis dapat membantu kita untuk memberikan terapi yang lebih spesifik. Berbagai penelitian menyangkut peran mekanisme apoptosis pada kanker termasuk astrocytoma memberikan hasil yang menjanjikan untuk terapi di kemudian hari, misalnya pemberian obat yang merusak mitochondria.30 Pemberian cladribine (2-chloro2-deoxyadenosine) dan 2 chloroadenosine pada astrocytoma dapat mengaktifkan kaskade apoptosis melalui jalur caspase-2 dan caspase-3.32 Penelitian lain menggunakan berbagai molekul sasaran sebagai biomarker dalam stratifikasi pengobatan pasien33 dan yang lain lagi menggunakan integrin sebagai sasaran untuk menghambat angogenesis dan membunuh tumor.34 Rubel35 dalam penelitiannya menggunakan modulator apoptosis erucylphosphocholine (ErPC) dan erucyl-phosphomocholine (ErPC3) yang meningkatkan respons radiasi pada pasien dengan glioma malignan. Kehilangan fungsi gen p53 yang sering dijumpai pada berbagai jenis kanker, misalnya dapat menjadi salah satu pemikiran untuk memberikan substansi yang fungsinya mirip gen p53. Di masa mendatang ada kemungkinan bahwa terapi lebih diarahkan untuk mengganti gen yang rusak melalui suicide gene therapy. Salah satu model terapi semacam ini diperlihatkan pada gambar 9 (dimodifikasi dari Lal.36).

Prodrug

Activating enzyme

Prodrug
ribosom Metabolit toksik mRNA Hambatan sintesis DNA Suicide gene

Konstruksi vector mengandung suicide gene

Apoptosis

Gambar 9: Urutan terapi, mulai dari inkorporasi suicide gene ke dalam gen pejamu, aktivasi dengan prodrug yang sesuai dan apoptosis.36

12

Suicide gene yang dimaksud adalah gen yang menyandi enzim yang tidak mempunyai dampak bagi sel pejamu secara langsung, tetapi mampu mengubah prodrug yang tidak toksik menjadi substansi toksik. Pemberian prodrug menyebabkan sel yang telah diberi suicide gene memproduksi enzim tersebut dan selanjutnya sel akan mengalami apoptosis. Beberapa jenis suicide gene telah ditemukan, di antaranya cytosine deaminase (CDA) yang mengkatalisasi hidrolisis cytosine menjadi uracil. Kombinasi CDA-5FC juga telah digunakan pada studi preklinik dan laboratorium untuk terapi kanker kolon dan fibrosarkoma. 29 RINGKASAN Apoptosis merupakan bentuk kematian sel yang diperlukan, baik untuk perkembangan sel normal maupun homeostasis jaringan. Peristiwa ini dikendalikan secara ketat oleh berbagai gen, baik gen yang bersifat apoptotik maupun anti-apoptotik. Apoptosis terjadi melalui 3 fase berturut-turut, yaitu fase inisiasi, fase efektor dan fase eksekusi atau degradasi. Kanker diketahui sebagai akibat mutasi genetik, di antaranya mutasi gen yang terlibat dalam siklus sel dan mekanisme apoptosis. Pengetahuan mengenai mekanisme apoptosis pada keadaan normal maupun pada kanker penting untuk menentukan respons penderita terhadap terapi, bahkan di kemudian hari mungkin dapat digunakan sebagai landasan terapi gen yang dikenal dengan suicide gene therapy.

RUJUKAN 1. Gilewski T and Norton L. Cytokinetics of neoplasia. In: Mendelsohn J, Howley PM, Israel MA, Liotta LA (eds). The molecular basis of cancer. Philadelphia, WB Saunders Co, 1995; 143-159 2. Martin GS. Normal cells and cancer cells. In: Bishop JM, Weinberg RA (eds) Molecular oncology. New York, Scientific American 1996; 13-40 3. Winoto A. Cell death in the regulation of immune response. Current opinion in Immunol 1997; 9: 365-70 4. Hashimoto F, Oyaizu N, Kalyanaraman VS, Pahwa S. Modulation of Bcl2 protein by CD4 cross-linking: A possible mechanism for lymphocyte apoptosis in human immunodeficiency virus infection and for rescue of apoptosis by interleukin-2. Blood, 1997; 90(2): 745-53 5. Griffiths SD, Goodhead DT, Marsden SJ, et al. Interleukin-7 dependent B lymphocyte precursor cells are ultrasensitive to apoptosis. J Exp Med. 1994; 179: 1789-94 6. Cohen JJ. Programmed cell death in the imune system. Adv Immunol 1991; 50: 55-9 7. Hartley SB, Cooke MP, Fulcher DA, et al. Elimination of self-reactive B lymphocytes preceeds in two stages: Arrested development and cell death. Cell; 1993; 72: 325-9 8. Liu Y-J, Johnson GD, Gordon J, et al. Germinal centers in T-cell dependent antbody response. Immunol Today. 1992; 13: 17-21 9. Weinberg RA and Hanahan D. The molecular pathogenesis of cancer. In: Bishop JM and Weinberg RA (eds). Molecular oncology. New York, Scientific American 1996; 179-204

13

10. Reed JC. Bcl2 family proteins: Regulators of apoptosis and chemoresistance in hematologic malignancies. Semin in Hematol 1997; 34: 9-19 11. Kroemer G, Zamzami N, Susin SA. Mitochondrial control of apoptosis. Immunol Today, 1997; 18: 44-51 12. Tran PB and Miller RJ. Apoptosis: Death and transfiguration. Science and Med 1999; Mei/June: 27 13. Green DR. Apoptotic pathways: Road to ruin. Cell. 1998; 94: 695-98 14. Suzuki A, Obata S, Hayashiba M, et al. SADS: A new component of Fas-DISC is the accelerator for cell death signaling and is downregulated in patients with colon carcinoma. Nature Med. 2001; 7: 88-93 15. Takahashi H. A SADS defect in tumor cells provide optimism. Nature Med 2001; 7: 26-27 16. Wong B and Choi Y. Pathways leading to cell death in T cells. Current opinion in Immunol 1997; 9: 358-64 17. Perkins AS, Stern DF. Molecular biology of cancer: Oncogenes. In: DeVIta VT, Hellman S, Rosenberg SA (eds) Cancer: Principles of oncology, Philadelphia, Lippincott-Raven Publ, 1997; 79-102 18. Tan X and Wang JYJ. The caspase-RB connection in cell death. Trends in Cell,Biol, 1998; 8: 116-20 19. Pan HC and Griep AE, Altered cell cycle regulation in the lens of HPV-16 E6 or E7 transgenic mice-implications for tumor suppressor gene function in development. Genes and development 1994; 8: 1285-99 20. Morgenbesser SD, Williams BO, Jacks T and Depinho RA. P53 dependent apoptosis produced by rb deficiency in the developing mouse lens. Nature 1994; 371: 72-74 21. Evan GIAH, Gilbert CS, Littlewood TD, et al. Induction of apoptosis in fibroblasts by c-Myc protein. Cell. 1992; 69: 119-28 22. Amati A, Littlewood TD, Evan GI and Land H. The c-Myc protein induces cell cycle progression and apoptosis through dimerization with Max. EMBO J 1993; 12: 5083-87 23. Amati B and Land H. Myc-Max-Mad: A transcription factor network controlling cell cycle progression, differentiation and death. Current Biol 1994; 4: 102-108 24. Nesbit CE, Fan S, Zhang H and Prochownik EV. Distinct apoptotic responses imparted by c-myc and max. Blood 1998; 92(3): 1003-10 25. Reed JC. Mechanism of apoptosis avoidance in cancer. Current Opinion Oncol 1999; 11: 66-75 26. Los M, Stroh C, Janicke RU, et al. Caspases: more than just killers. Trends in Immunol. 2001; 22(1): 31-34 27. Oltvai ZN, Milliman CL, and Korsmeyer SJ. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with conserved homolog, bax, that accelerates programmed cell death. Cell,; 1993; 74: 609-19 28. Choi C, Jeong E and Benveniste EN. Caspase-1 mediates Fas-induced apoptosis and is upregulated by IFN- in human astrocytoma. J Neuro-Oncol 2004; 67: 16776

14

29. Waltereit R and Weller M. The role of caspase-9 and 9-short (S) in death ligand and drug induced apoptosis in human astrocytoma cells. Mol Brain Res 2002; 106: 42-9 30. Ceruti S, Mazolla A and Abbracchio MP. Resistance of human astrocytoma cells to apoptosis induced in mitochondria damaging agents. Possible implications for anticancer therapy. J Pharmacol & Therapy 2005; 324: 825-37 31. Nozaki M, Tada M, Kobayashi H, et al. Roles of the functional loss of p53 and other genes in astrocytoma tumorigenesis and progression. Neuro-oncol 1999; 1(2): 124-37 32. Ceruti S, Beltrami E, Matarresse P, et al. A keyrole for caspase-2 and caspase-3 in the apoptosis induced by 2-chloro-2-deoxyadenosine (cladibrine) and 2chloroadenosine in human astrocytoma cells. Mol Pharmacol 2003; 6: 1437-47 33. Freuhauff JP, Brem H, Brem S, et al. In vitro drug response and molecular markers associated drug resistance in malignant gliomas. Clin Cancer Res. 2006; 12: 4523-32 34. Bogler O and Mikkelson T. Angiogenesis and apoptosis in glioma: Two areas for promising new therapies. J Cell Biochem 2005; 96: 16-24 35. Rubel A, Handrick R, Lindner LH, et al. The membrane targeted apoptosis modulators erucylphosphocholine and erucylphosphomocholine increase the radiation response of human glioblastoma cells in vitro. Rad Oncol 2006; 1: 6-23 36. Lal S, Lauer UM, Niethammer D, et al. Suicide genes: past, present and future perspectives. Immunol Today 2000; 21: 4853

15