Analisis Clinico

Manual de Anlisis Clnico I
PRCTICA N 05
HEMATOLOGIA I: TOMA DE MUESTRA SANGUNEA, RECUENTO DE GLBULOS ROJOS, RECUENTO DE GLBULOS BLANCOS, HEMATOCRITO Y VELOCIDAD DE SEDIMENTACIN GLOBULAR
I. -
OBJETIVOS Conocer el fundamento y los conceptos generales sobre la toma de muestras sanguneas. Conocer el fundamento y las tcnicas de recuento de glbulos rojos y glbulos blancos. Conocer el fundamento y las tcnicas de determinacin de hematocrito y velocidad de sedimentacin globular.
II. INTRODUCCIN La sangre para poder ser estudiada debe extraerse del organismo y en ocasiones fraccionarse en sus componentes fundamentales como plasma o suero. La extraccin sangunea puede realizarse por diversos mtodos siendo los ms empleados la puncin venosa y la puncin capilar. Al igual que cualquier otra tcnica o prctica mdica, la extraccin sangunea precisa de un adecuado control de calidad y que de ello depende muchas veces que el resultado del anlisis de la muestra de sangre sea correcto. Se efectuar en ayunas o no dependiendo de la prueba a utilizar. Si se precisa obtener el plasma o estudiar algunas de las propiedades de la sangre o de alguno de los componentes celulares, en especial las plaquetas, es necesario aadir a la sangre recin extrada un anticoagulante. Para ello debe elegirse, el anticoagulante idneo, procurando que exista una proporcin adecuada entre ste y el volumen de sangre extrada. Los eritrocitos son clulas maduras que carecen de ncleo. El recuento se realiza para determinar el nmero de eritrocitos por mm3 de sangre, utilizando para ello sangre con anticoagulante o sangre obtenida por funcin cutnea. Se pueden emplear mtodos autonmicos o hemocitomtricos.
Valores referencia: Unidades SI (clx 1012/l) Varones 4.5 a 5.5 Mujeres 4.0 a 5.0 Nios 4.2 a 5.2 Lactantes 3.8 a 5.2 Recin nacidos 5.0 a 6.0
Unid. Tradicionales (millones de clulas/mm3) 4.5 a 5.5 4.0 a 5.0 4.2 a 5.2 3.8 a 5.2 5.0 a 6.0
Nota: Las unidades tradicionales se escriben con ceros completos
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Variaciones Policitemia. Es el aumento del nmero de eritrocitos; puede presentarse en diarreas graves, intoxicaciones agudas y en personas que viven en gran altura. Oligocitemia. Es la disminucin en el nmero de eritrocitos; se presenta en anemias, en la leucemia y despus de hemorragia. El recuento del nmero de leucocitos o glbulos blancos se expresa por mm 3 de sangre. La sangre se deposita en un lquido para diluir leucocitos, dejndolos intactos. En cambio los eritrocitos son destruidos por este lquido. Luego se cuentan los leucocitos en una cmara de recuento, por medio del microscopio, y se calcula el nmero que existe por mm 3 de sangre. Es importante conocer el nmero de leucocitos, pues este se altera en casos de enfermedades infecciosas. Existen tcnicas autonmicas y hemocitomtricas para el recuento de estos y son similares al recuento de G.R.
Valores referencia Grupos de edad Hombres y mujeres Nios de 1 ao Recin nacidos Nios de 3 a 9 meses
Leucocitos / mm3 5,000 - 10,000 8,000 - 15,000 10,000 - 12,000 4,000 - 15,000
Variaciones Leucocitosis > 10,000 / mm3 Fisiolgico: R.N., al final del embarazo, durante el trabajo de parto, luego de emociones internas Infecciosa: Cuando es originado generalmente por grmenes pigenos (apendicitis) y algunas infecciones virales como rabia, hepatitis, tambin en necrosis, enfermedades del metabolismo, etc. Leucomoide > 30 millones / mm3 Se halla mayormente en infecciones como meningitis, tosferina, mononucleosis infecciosa, tuberculosis y otros procesos graves Leucopenia < 5000 / mm3 Fisiolgico. Se presenta en anemia perniciosa, mala nutricin, anemia aplstica Infecciosas. Se presenta en ciertas enfermedades infecciosas en las que disminuye la formacin de glbulos blancos, como sucede en algunos casos: Muy frecuente en fiebre tifoidea, salmonelosis y fiebre de malta (brucelosis). Un nmero disminuido de leucocitos (leucopenia) pueden aparecer en ciertas enfermedades: Fallo de la mdula sea (por tumores, fibrosis, intoxicacin, etc...) Enfermedades autoinmunes (Lupus, etc...) Enfermedades del hgado o rin Exposicin a radiaciones Presencia de sustancias citotxicas
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Un nmero aumentado de leucocitos (leucocitosis) puede deberse a: Dao de tejidos en quemaduras Enfermedades infecciosas Enfermedades inflamatorias (por autoinmunidad-reumticas o por alergia) Estrs Leucemia
ALTERACIONES DE LA MEDICIN PORLA ACTUACIN DE MEDICAMENTOS Pueden aumentar el nmero de leucocitos: Alopurinol Epinefrina o adrenalina Cortisona Cloroformo Heparina Quinina Triamterene Pueden disminuir el nmero de leucocitos: Antibiticos Anticonvulsivantes Antihistamnicos Antitiroideos Arsenicales Barbitricos Diurticos Quimioterpicos Sulfonamidas
Determinacin de hematocrito Definida como el volumen ocupado por los eritrocitos en una determinada cantidad de sangre. Generalmente se expresa como volumen de eritrocitos por 100 ml. de sangre (%). Es til para el diagnstico de anemia. Representa la proporcin de glbulos rojos en la sangre circulante y se expresa en volmenes por ciento. Tcnicas de determinacin Tcnica del Microhematocrito Determinacin de la velocidad de sedimentacin globular (Ertitrosedimentacin) Viene a ser la velocidad de cada de los eritrocitos en sangre con anticoagulante. La VSG depende de la velocidad de concentracin del fibringeno, en menor grado de la globulina y de la diferencia existente entre la densidad del plasma y la masa globular. Este examen mide la tendencia de los eritrocitos a sedimentar, a colocar sangre anticoagulada en un tubo en posicin vertical. Se lee macroscpicamente a cabo de 1 hora la columna de plasma.
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Tcnicas de determinacin Tcnica de Microsedimentacin
MATERIALES Y MTODOS 1. Sangre venosa La sangre venosa es necesaria para la mayora de las pruebas que requieran anticoagulacin o cantidades mayores de sangre, plasma o suero de lo que podra proporcionar la sangre capilar. Materiales: - Aguja N 21 de 1 - Aguja de vacutainer - Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo - Alcohol 70 - Algodn - Jeringas de 5 mL. - Tubos de prueba con EDTA-sequestrene - Tubos al vaco con anticoagulante EDTA (K3), EDTA (Na2) u otro anticoagulante. - Agujas con dispositivo para extraccin de sangre al vaco: - N 21 para adultos. - N 22 para nios y neonatos. De preferencia, ambas de bisel corto para evitar la coagulacin - Gradilla - Guantes - Mascarillas - Marcador de vidrio - Lapiceros. Procedimiento OBTENCIN DE SANGRE CON JERINGA O EN TUBO DE PRUEBA a) La sangre venosa es normalmente obtenida de una de las venas de la fosa cubital. b) Aplicar el torniquete aproximadamente cuatro dedos por encima de la flexin del codo. Sujetar con un medio nudo, verificar que los elementos a utilizar estn listos y que el paciente este cmodo. c) Limpiar la zona con alcohol de 70 que puede ser iodado en un rea de 2 pulgadas. d) El paciente deber abrir y cerrar la mano durante unos segundos y despus la mantendr cerrada. Esto ayuda a mantener las venas superficiales. e) Se retira el estuche que protege la aguja de la jeringa y se coge de tal manera que el bisel se encuentre hacia arriba. f) Se coloca la aguja paralela a la vena, se perfora la piel haciendo avanzar la aguja 0.5 a 1 cm, en el tejido subcutneo, luego se perfora la vena. g) Se aspira la jeringa hasta el volumen requerido. En caso de usar tubo de prueba se deja gotear hasta obtener el volumen deseado. h) Retirar el torniquete e indicar al paciente que deje de hacer puo. Se coloca algodn con escaso alcohol o sin l encima de la puncin y se retira la aguja.
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i)
j)
Retirar la jeringa y vaciar a los tubos de prueba con anticoagulante y una gota a la lmina portaobjetos puede ser utilizado para realizar el frotis. En caso de usar slo aguja se retira la aguja. Agitar el tubo en crculos sobre la mesa para homogeneizar con el anticoagulante, en caso que se extraiga para exmenes hematolgicos. Para exmenes bioqumicos se extrae en tubos de prueba y luego se centrfuga.
OBTENCIN DE SANGRE CAPILAR Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequea o cuando por diferentes motivos no pueda practicarse una puncin venosa, debe recurrirse a la puncin capilar. Materiales - Lancetas descartables - Alcohol - Algodn - Marcador de vidrio - Lapiceros - Cuaderno de apuntes Procedimiento a) La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anular en los adultos y en el dedo gordo del pie o taln en los nios. b) Desinfectar la zona con alcohol de 70%, secar con algodn estril. c) Usar gasa estril para desechar la primera gota y recoger las siguientes. Evitar comprimir la extremidad para obtener sangre por que se altera la composicin sangunea. La gota que se forma, para el anlisis, debe ser redonda, caso contrario, significa que la piel est hmeda, secar con gasa estril. Recuento de eritrocitos: Mtodo hemocitomtrico Materiales: - Sangre capilar o venosa (con o sin anticoagulante) - Solucin de Hayem - Pipeta de Thoma para G.R. - Sorbete - Papel higinico o algodn - Cmara de Neubauer - Laminilla de Neubauer - Agitador mecnico - Microscopio - Contmetro Procedimiento Preparacin para el recuento 1. Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar.
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2. Llenar la pipeta de glbulos rojos con sangre hasta la marca de 0,5 para realizar una dilucin de 1/200, y si se carga hasta 1, la dilucin ser 1/100. Limpiar la punta con gasa o papel absorbente. 3. Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem) y llenar de lquido de dilucin hasta la marca de 101. 4. Se coloca en un rotador automtico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos. 5. Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo, luego colocar una gota pequea cerca de un extremo de la cmara para que por capilaridad se llene exactamente. 6. Hacer el recuento con objetivo de 40x 7. Se puede realizar con la pipeta automtica, se toma 20 L (0,02mL) de sangre total con anticoagulante, o sangre capilar y se deposita en un tubo de 12 x 75 que contenga 4 ml de solucin de Hayem (aqu se tiene una dilucin de 1:200). Se deja reposar aproximadamente 5 minutos y se procede a cargar la cmara con la misma pipeta usando un nuevo tip. El inconveniente aqu es el gasto de reactivo (4 ml) pero las medidas son ms exactas. Recuento - Cuntese los eritrocitos situados en 5 pequeos cuadraditos del gran retculo central (cada cuadradito pequeo a su vez est subdividido en 16 pequeos cuadraditos, adems se debe considerar los 4 pequeos cuadraditos ubicados en los extremos y 1 central). - Se incluyen al recuento las clulas que toquen los lmites izquierdo y superior de los cuadrados, pero no aquellos que toquen los lmites derecho e inferior. Antese la cantidad hallada en cada uno de los cuadrados. Las diferencias entre las cifras mayor y menor no deber exceder de 20. - Multiplquese el total de G.R. contados por 10,000 con el objeto de obtener el nmero de eritrocitos por mm3 de sangre.
Clculos Por qu multiplicar por 10,000?, por lo siguiente: Dilucin de la sangre: 1/200 Volumen total: 0.02 mm3, que resulta de multiplicar 0.00025 mm3 por 80 Factor 1/0.02 mm3 = 50 Glbulos rojos/mm3 = total de glbulos rojos contados por inversa de la dilucin x Factor = Total de glbulos rojos contados por 10,000 Otra forma de realizar los clculos sera el siguiente No de hemates x mm3 = hemates contados en 5 cuadrados pequeos Altura x dilucin x rea REEMPLAZANDO: hemates contados en 5 cuadrados pequeos 1/10 x 1/200 x 1/5 = hemates contados en 5 cuadrados pequeos
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1/10,000 = hemates contados x 10,000 Nota 1). Cmara de Neubauer mejorada (hemocitmetro). 2). Pipeta de glbulos rojos (de Thoma).- Presenta cerca del extremo superior, una marca de 101, inmediatamente contina una dilatacin (bulbo) que contiene una perlita roja mezcladora, luego sigue el tallo (extremo ms largo), la cual est dividida en diez partes con dos marcas: 1 (acabando el bulbo) y 0.5 a la mitad del tallo. Se utiliza al igual que para los leucocitos una boquilla para aspirar (sorbete). 3). Diluyente de glbulos Rojos: Cloruro de Sodio al 0.9%. Diluyente de Hayem.
Recuento Total de Leucocitos Materiales: Tcnica hemocitomtrica - Sangre capilar o venosa (con o sin anticoagulante) - Solucin de Turk - Pipeta de Thoma para G.B. - Sorbete - Papel higinico o algodn - Cmara de Neubauer - Laminilla de Neubauer - Agitador mecnico - Microscopio - Contmetro Procedimiento Preparacin para el recuento - Emplear sangre venosa con anticoagulante o sangre obtenida por puncin cutnea. - Utilizando la pipeta de Thoma, aspirar sangre hasta la marca 0.5 Limpiar la sangre excedente del extremo de la pipeta, con papel filtro o gasa, (cantidad) - Completar hasta la marca 11, con solucin de Turk y mantener en posicin horizontal Evitar la formacin de burbujas (volumen) - Agitar la pipeta durante de 03 minutos, utilizando un agitador mecnico o cubriendo los extremos con los dedos de la mano. Utilizar guantes por bioseguridad - Eliminar la cuarta parte del contenido de la pipeta (3 a 5 gotas) Para permitir formar muestra del mbolo de la pipeta. - Cargar inmediatamente un lado de la cmara de Neubauer, colocando para ello una gota entre la superficie de la cmara y el cubreobjetos. Se debe evitar la sobrecarga. - Dejar en reposo durante 03 minutos. Para que sedimenten los G. R. en la base de la cmara. -7-
- Colocar la cmara sobre la platina del microscopio y enfocar a menor aumento (10X), localizando el retculo de la cmara. Aplicar normas de manejo del microscopio Recuento - Cuntese los leucocitos situados en los 4 cuadrantes de los retculos externos de la cmara de Neubauer (cada cuadrado est subdividido en 16 cuadraditos). - Multiplquese el total de G.R. contados por 50 con el objeto de obtener el nmero de eritrocitos por mm3 de sangre. - Se incluyen al recuento las clulas que toquen los lmites izquierdo y superior de los cuadrados, pero no aquellos que toquen los lmites derecho e inferior. Antese la cantidad hallada en cada uno de los cuadrados. Las diferencias entre las cifras mayor y menor no deber exceder de 10. El recuento deber ser efectuado a menor aumento con objetos de 10X. Clculos Porqu multiplicar por 50?, por lo siguiente: Dilucin de la sangre: 1/20 Volumen total: 0.4 mm3 Factor 1/0.4 mm3 = 2.5 Glbulos blancos/mm3 = total de glbulos blancos contados por inversa de la dilucin x Factor = Total de glbulos rojos contados por 50. Determinacin del hematocrito:Tcnica del Microhematocrito Materiales Sangre con o sin anticoagulante Microcapilares heparinizados o no heparinizados Plastilina o mechero de Bunsen Gradilla Cronmetro Regla milimetrada Procedimiento Se emplea tubos capilares de 7 cm. de largo y 1 mm. de dimetro interior. Algunos capilares estn cubiertos con heparina al 1/100. Otros no tiene y se utiliza sangre con anticoagulante. Se puede utilizar sangre venosa o capilar. El tubo se llena hasta 1 cm del extremo y este se cierra a llama o se tapona con plastilina. Se centrfuga a altas velocidades en centrfuga especial a 16.,500 rpm/3 minutos o a 10,000 rpm/5 minutos o a 3,000 rpm/30 minutos. Despus se lee la proposicin del volumen ocupado por los hemates con una regla milimetrada con tabla de lectura para hematocrito o con el dispositivo que para tal fin acompaa a la centrfuga. Valores de referencia Varones Mujeres
40 50% 38 44%
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Nios (5 aos) 38 44% Lactantes (3 meses) 37 42% Recin nacidos 50 58% Variaciones En una anemia crnica pos hemorragia, segn Wintrobe, el volumen de eritrocitos sedimentados se reduce al 13%, en anemia perniciosa 8%, en la eritemia 60% y en la clorosis 25%. Su valor diagnstico incluye la intensidad del luecopenia, leucocitosis, alteraciones en el nmero de trombocitos y aspectos sanguneos. En general disminuye los valores de hematocrito en los casos de hemodilucin tales como: la hidremia fisiolgica del embarazo; al contrario de la hemoconcentracin a consecuencia de shock que dan a valores elevados, aparentemente patolgicas.
B).-
Determinacin de la velocidad de Sedimentacin Globular (Ertitrosedimentacin)
Materiales Tcnica de Microsedimentacin Sangre con o sin anticoagulante Microcapilres heparinizados o no heparinizados Plastilina o mechero de Bunsen Gradilla Cronmetro Regla milimetrada
Procedimiento Se emplea tubos capilares de 7 cm de largo 1 mm de dimetro interior. Algunos capilares estn cubiertos con heparina al 1/100. Otros no tiene y se utilizan sangre con anticoagulante. Se puede utilizar sangre venosa o capilar. El tubo se llena hasta 1 cm del extremo y este se cierra a llama o se tapona con plastilina. Se deja en reposo en posicin vertical / 01hs. Despus se lee la proporcin del volumen ocupado por el plasma con una regla milimetrada. Valores de referencia Varones hasta 14 mm / h Mujeres hasta 20 mm / h
Variaciones Se modifica siempre y cuando exista un desequilibrio humoral que afecta a las protenas plasmticas acelerndose cuando aumenta la proporcin fibringeno que ocurre los hemates y los adhiere entre s formando globulinas, otros factores son prcticamente despreciables.
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Se observa aumento en todas las enfermedades infecciosas agudas o crnicas en perodo de evolutivitas, en las afecciones purulentas, tumores malignos, fiebre reumtica, enfermedades generativas, enfermedades de la sangre y del sistema hematopoytico, embarazo, etc. La eritrosedimentacin tambin se encuentra aumentada por la ingestin de dextrano, penicilina y vitamina A. Se halla disminuida en la policitemia vera, en algunas afecciones hepticas, etc.
Anexo N 01 Informacin Sobre la Cmara de Recuento 1. Lo que es una cmara de conteo y dnde se utiliza La cmara de conteo es un aparato de vidrio ptico especial de precisin. Se utiliza para contar clulas u otras partculas en suspensiones bajo el microscopio. Las cmaras de conteo se utilizan principalmente para el anlisis de sangre (conteo de leucocitos, eritrocitos, trombocitos) y conteo de pulgadas en el licor. Pero las cmaras de conteo sirven tambin para el conteo de bacterias y esporas del moho.
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2. Principio de construccin Todas las cmaras de conteo muestran el mismo principio de construccin.
En una placa base rectangular y gruesa de vidrio ptico especial, del tamao de un porta-objetos, en el tercio medio se hallan cuatro ranuras longitudinales, que transcurren en paralelo con respecto a los laterales cortos. Las dos superficies laterales ms grandes estn sin trabajar y sirven para la rotulacin. El puente central y los dos puentes exteriores estn rectificados planos y pulidos. La superficie del puente central es ms profunda que los dos puentes exteriores. En el puente central (fondo de la cmara) estn grabadas las redes de conteo. Cuando se coloca un cubreobjeto sobre los puentes exteriores, entre la cara inferior del cubreobjeto y el puente central de la cmara de conteo se produce una ranura capilar.
3. Ejecucin e identificacin de las cmaras de conteo Ejecucin
Ejecucin simple - puente central sin dividir (una red de conteo)
Ejecucin doble - puente central dividido (dos redes de conteo) Adems, existen dos ejecuciones diferentes de divisin de redes: la normal y la de lneas claras: En la ejecucin normal, la red de conteo est directamente grabada en el vidrio. En la ejecucin de lneas claras, primero se recubre con rodio el fondo de la cmara y luego se raya la red de conteo en la capa de rodio. Mediante el desplazamiento del contraste, debajo del microscopio es posible la inversin de color, de manera que la red de conteo se puede ver opcionalmente en lneas claras u oscuras. -11-
Identificacin En las dos superficies laterales, sin trabajar, de la cmara de conteo estn impresas las siguientes indicaciones: El sistema de la red de conteo El nombre y la marca registrada del fabricante La profundidad de la cmara en milmetros La superficie del cuadrado ms pequeo en mm2 4. Fabricacin y explicaciones de calidad Las cmaras de conteo son aparatos de precisin. Se utilizan principalmente en laboratorios mdicos. En Alemania slo pueden utilizarse las cmaras de conteo y los cubreobjetos oficialmente contrastados, en el extranjero pueden ser usados tambin sin contrastar. Todas las cmaras de conteo distribuidas por la empresa Marienfeld se fabrican de acuerdo con la disposicin vlida sobre el contraste y la norma DIN. Por esta razn, hay que distinguir entre cmaras de conteo clasificadas y cmaras de conteo susceptibles de ser contrastadas. Fabricacin Por esta razn, slo se pretende describir a grandes rasgos la fabricacin de cmaras de conteo. El mecanizado comprende varias operaciones parciales, seguidas de los correspondientes controles rigurosos. El puente interior (fondo de la cmara) y los dos exteriores se rectifican y pulen. Gracias a este mecanizado se consiguen superficies especialmente planas y el puente interior (fondo de la cmara) enfrente de los puentes exteriores se rebaja exactamente en la profundidad de la cmara deseada. Despus de estas operaciones de trabajo, en la mquina divisora se graba con un diamante la red de conteo correspondiente (sistema). Finalmente se efecta la fase de impresin y secado al horno. Todas las cmaras de conteo se someten a un riguroso control final, que es regido por las exigencias de la norma DIN en vigor y las prescripciones de contraste. Exigencias en cuanto al control de calidad Las desviaciones de lmites segn la norma DIN 12847 son las siguientes: Para la profundidad de la cmara en la zona de una red de conteo + 2 % del valor nominal Para las distancias inferiores a 0,4 mm entre cualquieras lneas + 2 m Para las distancias superiores a 0,4 mm entre cualquieras lneas + 0,5 % del valor nominal Para los ngulos de la distribucin de red + 1 grado El ancho de las marcas no podr ser superior a 5 m. La tolerancia de planeidad, segn DIN 7184, parte 1, es la siguiente: Para el fondo de la cmara en la zona de una red de conteo 2 m Para las superficies de apoyo en la zona de una red de conteo 2 m Para las lminas cubreobjetos 3m (segn DIN 58884) 5. Llenado de una cmara de conteo Desplazamiento del cubreobjeto
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Los puentes exteriores se humedecen con agua destilada y luego se coloca el cubreobjeto a suave presin desde delante sobre la cmara de conteo.
Atencin: Peligro de rotura del cubreobjeto! La formacin de lneas de interferencia (anillos de Newton) entre los puentes exteriores y el cubreobjeto indica que el cubreobjeto ha sido correctamente colocado. Alimentacin Quitar del sacudidor la pipeta bien mezclada y rechazar las primeras gotas. Limpiar, secando, desde el exterior la pipeta y luego mantenerla inclinada hasta que se haya formado una pequea gota en la punta de la misma. Esta gota se sita en el punto entre el cubreobjeto y la cmara de conteo. Por capilaridad se llena la hendedura entre el cubreobjeto y el fondo de la cmara. Antes de que la solucin de sangre pueda hincharse en los bordes de la parte de la cmara, deber haberse retirado de nuevo ya hacia un lado la punta de la pipeta. Si son visibles las burbujas de aire o si el lquido se hincha sobre los bordes en las ranuras, deber limpiarse la cmara y alimentarse de nuevo.
Pipetas de mezclado de sangre utilizadas Pipeta de leucocitos (perla blanca) -13-
Pipeta de eritrocitos (perla roja)
6. Recuento de las partculas Tcnica de conteo El recuento presupone un conocimiento exacto de las lneas lmite de las cmaras de conteo utilizadas. stas se pueden ver en la ilustracin. Para que las clulas, que estn en o cerca de las lneas de limitacin, no se cuenten dos veces o se sobrepasen en el conteo, hay que atenerse a determinadas reglas (p.ej., vase la ilustracin derecha). Se cuentan todas las clulas dentro de una zona de medicin definida. Tambin se cuentan las clulas (marcadas en negro), que se apoyan o tocan en las 2 caras (I), p.ej. en la lnea de medida izquierda y superior. Esto tambin es vlido para el tipo de la operacin de conteo propiamente dicha, que debe efectuarse en forma de meandro.
El recuento se efecta en el ngulo superior izquierdo en direccin de la flecha.
Observaciones sobre el recuento
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a) En todos los conteos de cmaras, el diagrama del condensador en el microscopio deber estar cerrado en gran parte. b) La diferencia de las clulas contadas en los cuadrados grandes y en los cuadrados de grupos no podr ser superior a 10 clulas. c) En todos los conteos de clulas, han de realizarse dobles determinaciones. Despus del recuento de la red de conteo superior, se recuenta como control tambin la red de conteo inferior. Ha de tenerse en cuenta que la cmara no est resecada. Esto puede evitarse cuando la cmara inferior se llene justo poco antes del recuento y se recuente despus del tiempo de sedimentacin. d) La diferencia entre las sumas del recuento de ambas redes de conteo no podr ser superior a 10 clulas. El valor medio de los conteos se aplica luego en una frmula de clculo o se multiplica por el factor correspondiente. 7. Clculo Frmula:
EJEMPLO: Cmara: Neubauer improved a) Leucocitos 1. Clulas recontadas 161 leucocitos 2. Superficie recontada 4 cuadrados ( = 4 1 mm ) = 4 mm 3. Profundidad de la cmara 0,1 mm 4. Dilucin 1 : 20
b) Eritrocitos 1. Clulas recontadas 507 eritrocitos 2. Superficie recontada 5 cuadrados ( = 5 0,04 mm ) = 0,2 mm 3. Profundidad de la cmara 0,1 mm 4. Dilucin 1 : 200
8. Limpieza de las cmaras de conteo Inmediatamente despus del conteo realizado, se quita el cubreobjeto y la cmara de conteo se limpia con agua o - en caso de necesidad - con una solucin limpiadora suave.
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A continuacin, la cmara se seca con un pao blando o se lava con acetona. 9. Breve descripcin de la cmara de conteo Neubauer-improved Los diferentes sistemas de cmaras de conteo se diferencian por la ejecucin de la red de conteo y la profundidad de la cmara. La red de conteo est compuesta de una divisin de red cuadrada que slo queda visible con el microscopio (aprox. 100 aumentos). A continuacin se pretende describir la cmara de conteo Neubauer-improved ms utilizada: Cuadrado grande : 1 mm Cuadrado de grupos : 0,04 mm Cuadrado pequeo : 0,025 mm La profundidad de la cmara es de 0,100 mm. La divisin de red de esta cmara muestra 3 cuadrados grandes 3 veces de una superficie de 1 mm 2, respectivamente. Los 4 cuadrados rectangulares se utilizan para el conteo de los leucocitos. El gran cuadrado en el centro est adicionalmente dividido en 5 cuadrados en grupos de 5 con una longitud lateral de 0,2 mm, respectivamente, y un contenido de superficie de 0,04 mm 2. A su vez, los cuadrados de los grupos estn subdivididos en 16 cuadrados pequeos de 0,0025 mm 2 cada uno. Cinco de estos cuadrados de grupos son utilizados en el conteo de eritrocitos. Merece especial atencin el hecho de que la cmara muestre triples lneas lmite por todos los lados, de las cuales la lnea central (!) ha de considerarse la lnea de medida propiamente dicha. Esto es importante para valorar si las clulas que estn en la zona lmite, han de ser o no contadas tambin. 10. Por qu cmaras de recuento ocupan su puesto en el laboratorio a pesar de contadores elctricos En laboratorios menores no vale la pena la compra de aparatos electrnicos caros. Se usan las cmaras de recuento para p.ej. el recuento de clulas de licor de efusiones, recuento de huevos de verme, bacterias y esporas del moho. Para el recuento de pocos trombocitos los instrumentos electrnicos son menos exactos que las cmaras de recuento. En la prctica ocurren aplicaciones incorrectas como sigue: La cmara de recuento no estaba limpiada El cubre-objeto no est puesto correctamente (ningunos anillos de interferencia) Hay burbujas de aire en el relleno de la cmara La cmara est sobrellenada El tiempo de sedimentacin era demasiado corto contadores elctricos En laboratorios mayores se usan (gastos altos de inversin) Desventaja: Con frecuencia se distinguen los tipos de clulas por tamaos. Resultan errores en los contadores elctricos a causa de partculas de polvo hilachas. Ventaja: Tienen la ventaja de la evaluacin rpida y el error estadstico menor con el recuento de
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muchas
partculas.
Durante
el
recuento
resulta
el
error
estadstico
Frmula: error estadstico = 1 : n con n = 100 de clulas contadas 1:100 = 0,1 = 10 % con n = 10.000 clulas contadas 1:10.000 = 0, 01 = 1 %
CUESTIONARIO
1. Mencione las ventajas y desventajas de la extraccin sangunea venosa y capilar. 2. Esquematice las zonas de puncin adecuada para la extraccin sangunea venosa y capilar. 3. Investigue porque se forma hematomas despus de la extraccin sangunea. 4. Mencione otros mtodos para la determinacin de hemates y las variaciones en el recuento con respecto a los valores referenciales. 5. Qu sucede con la sangre cuando entran en contacto con la solucin de Hayen? Explique. 6. Explique cuando ocurre la polisemia. 7. Mencione en que tipos de enfermedades varan los valores de la VSG. 8. Refirase a las aplicaciones del mtodo automtico en hematologa.
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PRCTICA N 06
HEMATOLOGA II: HEMOGRAMA
I. -
OBJETIVOS Conocer las diferentes tcnicas que se aplican en la determinacin del hemograma. Desarrollar las actividades y destrezas del alumno, en el manejo de las tcnicas. Que el alumno tenga la suficiente capacidad de interpretacin de los resultados.
II. INTRODUCCIN El hemograma es un anlisis de sangre en el que se mide en global y en porcentajes los tres tipos bsicos de clulas que contiene la sangre, las denominadas tres series celulares sanguneas:Serie eritrocitaria o serie roja, serie leucocitaria o serie blanca y serie plaquetaria Cada una de estas series tiene unas funciones determinadas, y estas funciones se vern perturbadas si existe alguna alteracin en la cantidad o caractersticas de las clulas que las componen. La serie roja est compuesta por los hemates o glbulos rojos. Su funcin primordial es transportar el oxgeno desde los pulmones (a donde llega a travs de la respiracin) a todas las clulas y tejidos del organismo. En el hemograma se cuantifica el nmero de hemates, el hematocrito, la hemoglobina y los ndices eritrocitarios: El hematocrito mide el porcentaje de hemates en el volumen total de la sangre. La hemoglobina es una molcula que forma parte del hemate, y que es la que transporta el oxgeno y el dixido de carbono; se mide su concentracin en sangre. Los ndices eritrocitarios proporcionan informacin sobre el tamao (VCM), la cantidad (HCM) y la concentracin (CHCM) de hemoglobina de los hemates; el ms usado es el VCM o volumen corpuscular medio. Todos estos valores varan dentro de la normalidad segn la edad y el sexo. La serie blanca est formada por los leucocitos o glbulos blancos. Sus funciones principales son la defensa del organismo ante las infecciones y la reaccin frente a sustancias extraas. El recuento de leucocitos tiene dos componentes. Uno es la cifra total de leucocitos en 1 mm 3 de sangre venosa; el otro, la frmula leucocitaria, mide el porcentaje de cada tipo de leucocitos, que son: segmentados o neutrfilos, monocitos, linfocitos, eosinfilos y basfilos. El aumento del porcentaje de un tipo de leucocitos conlleva disminucin en el porcentaje de otros. Estos valores varan dentro de la normalidad segn la edad. La serie plaquetaria compuesta por plaquetas o trombocitos, se relaciona con los procesos de coagulacin sangunea. En el hemograma se cuantifica el nmero de plaquetas y el volumen plaquetario medio (VPM). El VPM proporciona informacin sobre el tamao de las plaquetas. El recuento de plaquetas tambin vara con la edad. -19-
Como realizar la prueba. Esta prueba no precisa ayuno previo. Previa desinfeccin se extraen en torno a 5 cc de sangre venosa, generalmente de una vena de la flexura del codo. Tras terminar la extraccin y retirar la aguja, se aplica presin en el punto de puncin durante unos minutos. Posteriormente se comprueba que no haya hemorragia en dicho punto. Utilidad El hemograma es una prueba que sirve para orientar hacia el diagnstico de diversas enfermedades que se han sospechado por la historia clnica y la exploracin fsica. A veces, los datos que nos da son suficientes para confirmar o descartar la enfermedad sospechada, pero con frecuencia se necesita utilizar otras pruebas diagnsticas que aporten ms informacin. Factores que interfieren en los resultados Serie roja: Alteracin en el tamao de los hemates. Un nmero muy alto de leucocitos. Hemodilucin: aumento de la cantidad proporcional de agua en la sangre. Deshidratacin: prdida de agua del organismo, que se refleja en la sangre. Embarazo: porque se produce hemodilucin. Residencia a gran altitud: por ejemplo, la gente que vive en el altiplano andino. Hemorragia inmediatamente previa a la prueba. Medicamentos. Serie blanca: La ingestin de algunos alimentos, la actividad fsica y el estrs pueden aumentar el nmero de leucocitos. Durante el ltimo mes de embarazo y en el parto, puede aumentar la cifra de leucocitos. Las personas a las que se les ha extirpado el bazo pueden tener una elevacin leve y persistente de la cifra de leucocitos. Medicamentos, que pueden aumentar o disminuir los niveles. Serie plaquetaria: La residencia a gran altitud puede aumentar los niveles de plaquetas. El ejercicio muy intenso puede aumentar el nmero de plaquetas. Medicamentos, que pueden aumentar o disminuir las cifras. III. MATERIALES Y METODOS Se basarn en las siguientes metodologas: 1. Recuento de Glbulos Rojos: Mtodo hemocitomtrico 2. Recuento de Glbulos Blancos: Mtodo hemocitomtrico 3. Recuento de Plaquetas: Recuento en Lmina Porta Objetos 4. Frmula Leucocitaria: Recuento hemocitomtrico 5. Determinacin del hematocrito: Tcnica del Microhematocrito 6. Determinacin de la hemoglobina: Tcnica de la cianometahemoglobina
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7. ndices hematolgicos: VCM, HCM y CHCM
RECUENTO DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS (FORMULA LEUCOCITARIA) OBJETIVOS Conocer, diferenciar y resaltar las funciones de los diversos leucocitos. INTRODUCCION La frmula leucocitaria tiene por objetivo determinar los porcentajes de las distintas clases de leucocitos normales y anormales en la sangre. A partir de los porcentajes puede incluso calcularse el nmero real de cada clase de leucocitos por mm3 de sangre (valor absoluto), conocindose el total de leucocitos.Por ejemplo:Si se tiene 60% de neutrfilos segmentados y el recuento total de leucocitos total es de 20 000, entonces la cifra absoluta de neutrfilos segmentados sera: 60/100 x 20 000 = 12 000 (valor absoluto) Valores de referencia absolutos de neutrfilos segmentados = 3000 - 5000 Conclusin: Los valores relativos slo nos sirven cuando los valores totales de leucocitos se encuentran dentro del valor normal. En caso contrario (leucocitosis o leucopenia) se debe emplear la frmula para obtener el valor real, y as determinar que elemento celular se encuentra fuera del rango normal, sea elevado o disminuido. PROCEDIMIENTO 1. Preparacin del frotis por el mtodo de los dos portaobjetos Consiste en la extensin de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75), empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensin.
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MATERIALES Lancetas descartables Alcohol 70 Algodn Portaobjetos limpios y desengrasados (25 x 75 mm). PROCEDIMIENTO Una vez extrada la sangre con cualquiera de las metodologas, se coloca una pequea gota de sangre (5mL) (aprox. 3 mm de dimetro) sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos. Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficie del primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre) formando un ngulo de 45. Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre el otro en sentido longitudinal, hasta que la gota de sangre quede bien extendida sobre la superficie del primer portaobjeto. El grosor del frotis sanguneo puede variar segn sea el ngulo que formen entre s ambos portaobjetos. As, si es superior a 45, la extensin obtenida ser gruesa y corta, si es inferior a 45 ser larga y fina. El secado del frotis es a temperatura ambiente y en posicin horizontal. Zona excesivamente gruesa: Se halla en la regin inmediata al punto de partida de la extensin (cabeza). En ella se aprecia siempre un aumento de linfocitos. Zona excesivamente fina: Corresponde al final de la extensin y termina en un rea donde las clulas adoptan una posicin acartonada (barbas). En esta regin existe un exceso de granulocitos y monocitos.
ella existe un reparto equilibrado de clulas. 2. COLORACIONES USADAS Una vez seco el frotis, se procede a la tincin hematolgica con el colorante de Romanowsky, constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno. Dentro de stas tenemos: Colorante de Giemsa. Colorante de May-Grunwald.
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Colorante de Wright. Colorante de Leishman No todos los leucocitos (G.B.) que circulan en la sangre son idnticos. Existen 5 tipos principales que se diferencian por el tamao, la forma del ncleo y el color de los grnulos del citoplasma.La proporcin o porcentaje de cada tipo de leucocitos es importante para el diagnstico. Esta proporcin o porcentaje se denomina: frmula leucocitaria. Para trabajar esta frmula se cuentan 100 leucocitos y se anota el nmero que se ha encontrado de cada tipo de ellos. Los colorantes ms usados son:
Para el estudio de las clulas sanguneas utilizar el 3 y 4, mientras que para estudio de hemoparsitos utilizar el 1. El 2 utilizar para casos especiales en que se desee observar con mayor claridad y especificidad los grnulos de los neutrfilos. Valores de Referencia Eosinfilos Basfilos Neutrfilos: Abastonados (cayado) Segmentados Linfocitos Monocitos Factores de error Frotis mal elaborado Tiempo inadecuado de exposicin al colorante. 3. Utilizacin de materiales sucios y/o hmedos. 3. TINCIN CON COLORANTE DE WRIGHT Fundamento 2 - 5% 45 - 65% 20 - 45% 4 - 8% 1 - 4% 0 - 1%
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El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar la sangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura, forma y tamao de los eritrocitos, su contenido de hemoglobina y sus propiedades de coloracin. La informacin obtenida de un frotis de sangre perifrica depende en gran parte de la calidad del extendido y la coloracin. MATERIALES Colorante de Wright Frasco gotero. Solucin amortiguada tamponada Agua tamponada PROCEDIMIENTO 1. Una vez obtenido el frotis sanguneo, se le dejar secar entre 15 y 20 minutos. 2. Luego se coloca la preparacin en un soporte y se cubre con el colorante de Wright, dejndolo por espacio de 5 minutos. 3. Posteriormente se aade solucin amortiguada tamponada en partes iguales hasta obtener un brillo metlico, dejando 6 minutos adicionales. 4. Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar. 5. Se coloca en el microscopio y, con pequeo aumento, se revisa la calidad de la coloracin, la cantidad aproximada de glbulos blancos y se escoge el sitio para iniciar el recuento. Se coloca una gota de aceite de inmersin y se enfoca a un aumento de 100x 6. La forma de los glbulos rojos se examinar detenidamente observando adems del color (cantidad de hemoglobina), presencia de plaquetas, su agrupacin y distribucin. CUESTIONARIO. 1. Mencione las variaciones en el recuento diferencial de leucocitos en relacin a los valores de referencia de los mismos. 2. Mencione las funciones que cumplen cada uno de los leucocitos.
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PRCTICA N 07
HEMOSTASIA: RECUENTO DE PLAQUETAS, TIEMPO DE SANGRA Y TIEMPO DE COAGULACIN
I. -
OBJETIVOS Conocer el fundamento y las tcnicas para determinar las diferentes fases de la hemostasia. Desarrollar actividades y destrezas del estudiante.
II.
INTRODUCCIN
Si por alguna razn se produce la ruptura de un vaso sanguneo, es decir una solucin de continuidad en el endotelio vascular, se producir la prdida de la sangre (hemorragia). El organismo pone en movimiento una serie de mecanismos encargados de detener el sangrado; esta respuesta se llama hemostasia. Fases Tcnicas a. Fase vascular Tiempo de sangra b. Fase plaquetaria Recuento de plaquetas Hemorragia HEMOSTASIA Intrnseca Tiempo de tromboplastina c. Fase de coagulacin Tiempo de coagulacin Extrnseca Tiempo de protrombina d. Fase de fibrinolisis Prueba de fibrinolisis 2. TOMA DE MUESTRAS Consideraciones generales 1. Uso de los anticoagulantes indicados; el tipo y la proporcin del anticoagulante deben ser evaluados previamente para cada muestra. 2. La sangre; y luego de su centrifugacin, el plasma; obtenido son activados por contacto con el vidrio. Esto puede alterar algunas pruebas por ello se sugiere usar recipientes de superficie no humedecibles, como vidrio o plstico siliconado. 3. El material de vidrio debe lavarse con detergente y luego ser puesto en mezcla sulfocrmica por lo menos durante seis horas. Luego debe ser enjuagada con agua destilada varias veces, que residuos de protenas deben contener sustancias tromboplsticas que activan el mecanismo de coagulacin. 4. Las pruebas deben realizarse lo antes posible y de haber demora, stas se podrn en refrigeracin a 4 C, para ser procesadas despus. 5. Las pruebas se realizan por duplicado, haciendo uso de controles normales. 6. Las muestras controles sern obtenidos usando la misma tcnica empleada para obtener la muestra problema. 7. Los promedios no deben diferir del 10% entre s. -25-
EXPLORACIN DE LA HEMOSTASIA INTRODUCCIN La exploracin global de la hemostasia sangunea puede realizarse mediantevarias pruebas que miden el tiempo que tarda en coagular la sangre o elplasma. No sirve para el diagnstico del dficit de un factor en particular, perosuministra una idea general sobre el estado de la va intrnseca y de la vacomn. Para ello existe un conjunto de principios elementales y comunes a todas las tcnicas que es preciso conocer para evitar errores en las determinaciones. Limpieza del material de vidrio Las pipetas y los tubos de hemlisis deben estar muy limpios. Los restos de detergente o de plasma influyen sensiblemente en el anlisis. Disolucin y conservacin de los reactivos Para disolver los reactivos deben emplearse agua bidestilada procurando no agitar (evitar la formacin de espuma y burbujas). Cuando se emplee plasma control, el tiempo indicado por las diferentes firmas comerciales debe ser respetado. Los reactivos que deben conservarse a unos 4 C se guardarn en la nevera. Si existe algn tiempo de caducidad, ste viene siempre indicado en el lote correspondiente. Asimismo, la estabilidad de los reactivos una vez disuelto se est indicada en cada una de las correspondientes metodologas de trabajo. Antes de su empleo, los reactivos deben estabilizarse a la temperatura indicada en la normativa correspondiente. OBTENCIN DEL PLASMA A una parte de citrato trisdico estril 0,1 mol/L se le aade nueve partes desangre (1/10). La puncin debe ser directa en la vena. No debe aspirar se violentamente para evitar la formacin de espuma y con ello la existencia de un cierto grado de hemlisis, lo que hara inservible el plasma para la realizacin de las diferentes pruebas. Una vez extrada la sangre, se centrifuga durante 15 minutos a 3500 rpm. El plasma sobrenadante se trasvasa cuidadosamente a otro tubo de hemlisis y puede conservarse hasta cuatro horas a 4 C antes de su utilizacin Tiempo de incubacin El tiempo de incubacin del plasma con los reactivos correspondientes debe ser muy exacto y la temperatura siempre a 37 C. Cuando no se empleen mtodos automatizados, el tiempo se medir mediante un cronmetro, el cual debe dispararse simultneamente con la adicin del reactivo y pararse en el instante en que se inicia la coagulacin. Causas de error En la obtencin del plasma Estasis venosa prolongada. Favorece la fibrinlisis local. Puncin venosa inadecuada. Dilucin errnea del plasma. Proporcin de sangre-anticoagulante inexacta. Esta proporcin (una parte de citrato trisdico + nueve partes de sangre)debe mantenerse con toda exactitud.
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Tiempo de centrifugacin inadecuado. Presencia de hemlisis en el plasma. Conservacin prolongada del plasma antes de realizar la prueba. Ello conduce a un descenso de la actividad de los factores lbiles (V y VIII) y, por tanto, el plasma debe ser analizado dentro de las dos o cuatro horas de practicada la extraccin. En la realizacin de la tcnica Errores de pipeteo. Empleo de los reactivos inadecuados o caducados. Empleo de los reactivos mal preparados. Empleo de una temperatura inadecuada. Tiempos de incubacin inexactos. Empleo de agua no destilada. III. MATERIALES Y METODOS 3.1. Tiempo de Sangra Principio. Es definido como el tiempo que transcurre entre la produccin del sangrado por la incisin estandarizada realizada en los pequeos vasos superficiales y la terminacin de dicho sangrado mediante la produccin del tapn plaquetario. Tcnicas: Mtodo de Duke Materiales: - Lanceta estril - Papel filtro - Alcohol yodado - Cronmetro Procedimiento - Limpiar el lbulo de la oreja con alcohol yodado sin presionar - Practicar la incisin no ms de 4 mm con una lanceta - Cada 30 segundos absorber la gota de sangre que se forma con un papel filtro, sin tocar la oreja, hasta que deje de salir sangre. Observaciones Si el tiempo de sangrado se prolonga examine una extensin de sangreteida segn el mtodo de Romanowski para observar si las plaquetasson escasas. Valores de referencia 1 a 4 minutos Interpretacin El tiempo de sangra por este mtodo es la mejor valoracin de la funcinplaquetaria. La prolongacin del tiempo en esta prueba se encuentra entrombocitopenias o las enfermedades de alteracin funcional de las plaquetas,como son la enfermedad de Von Willebrand, la tromboastenia de Glasmann,el Sndrome de Bernard-Soulier, la enfermedad de Storage Pool y
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otras. Midein vivo la adhesin, la agregacin y la liberacin plaquetaria como respuestadel organismo a la lesin vascular. Al realizar esta prueba, debe tenerse siempre en cuenta que la ingesta previade cido acetilsaliclico puede alterar los resultados. 3.2. Tiempo de coagulacin Principio. La sangre al ser extrada sin mayor contaminacin con tromboplastina tisular es capaz de coagular cuando se deposita en un tubo de vidrio. El tiempo que tarda este proceso est en relacin con el sistema de procaoagulantes e inhibidores fisiolgicos y adquiridos que influyen en la formacin del cogulo. Tcnicas: Mtodo de Burker Lmina portaobjetos
Materiales - Sangre capilar - Lancetas estriles - Lminas Portaobjetos - Alcohol yodado Procedimiento - Desinfectar el pulpejo del dedo y secarlo con algodn estril - Practicar la puncin con lanceta descartable, eliminar la primera gota - Colocar 03 gotas de sangre en el portaobjetos y tomar el tiempo - Cada 15 a 30 segundos examinar la formacin del cogulo con la punta de la lanceta. El punto final, es la formacin de un hilo de fibrina que se adhiere a la punta de la lanceta. Valores de Referencia Burker 2 a 4 minutos
Se considera alargado el tiempo de coagulacin, cuando difiere en ms de 2 minutos del lmite superior establecido en cada laboratorio. Interpretacin Se observa una reduccin del tiempo de coagulacin despus de hemorragias, esplenectoma, cardiopata descompensada y anestesia general. Se encuentra aumentado en la afibrinogenemia, hipofibrinogenemia, hemofilia, trombocitopenia, trombocitopata, dficit acentuado de los factores II, V y X, despus del tratamiento con heparina y por hipocalcemia consecutiva a transfusiones reiteradas. Tambin aumenta por la ingestin de anticoagulantes y tetraciclinas. 4. Recuento de Plaquetas Principio. El contaje de plaquetas se realiza directamente en el microscopio de contraste de fases, previa lisis de los hemates. Tambin se pueden contar en lminas coloreadas mediante la tcnica Wright.
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Tcnicas: Recuento en lminas portaobjetos Tcnica hemocitomtrica Toma de Muestra Se realiza por puncin venosa mediante el empleo de jeringa descartable obtenindose 2 mL. de sangre. A continuacin depositar una gota mediana de sangre sobre la lmina portaobjetos; proceder a realizar el frotis sanguneo. Retirar la aguja de la jeringa y en seguida depositar el contenido de sangre en un frasco con EDTA de secado, tapar y rotar nuevamente la base del frasco hasta la disolucin del anticoagulante. Materiales: - Sangre capilar o venosa - Cmara de Neubauer - Pipeta de Thoma para G. R. - Placas Petri - Diluyente: Solucin de procana Solucin de procana: Clorhidrato de Procana 3g. NaCl 200 mg. Agua destilada csp 100 mL. Conservar en frasco oscuro a 4 C. Disolver, filtrar y guardar por refrigeracin hasta por 2 semanas - Anticoagulante EDTA Procedimiento 1. Disponer 0.38 mL. de solucin de procana en tubos de plstico de 12 x 75 mm. 2. Agregar 0.02 mL. (20 L.) de sangre anticoagulada con EDTA. 3. Mezclar por agitacin. 4. Reposo a temperatura ambiente por 15 a 20 minutos. 5. Cargar en cmara de Neubauer en ambiente hmedo. 6. Reposo a temperatura ambiente de 15 a 20 minutos. 7. realizar el recuento de 5 cuadrados grandes en el retculo de Thoma y multiplicar x 1000. Recuento en lminas portaobjetos. Materiales: - Aceite de inmersin. - Agua taponada. - Colorante de Wright. Polvo colorante de wright. 2 g. Alcohol metilico. 1,000 mL. Preparacin: Colocar el colorante en un mortero al cual se va agregando pequeas cantidades de metanol hasta disolucin total. El colorante as preparado debe dejarse madurar por lo menos 5 das. Se filtra antes de usar. Procedimiento: - Colorear el frotis sanguneo con colorante de Wright por 1.
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Agregar agua taponada y controlar 9. Lavar con agua corriente. Secar. Echar aceite de cedro en ambos bordes de la lmina y contar el nmero total de 5 campos en cada borde, teniendo cuidado de que en ellos las plaquetas no estn aglomeradas. El recuento realizado debe multiplicarse por 1,000.
Nota: Ambos recuentos en cmara y en lmina deben guardar relacin; se saca un promedio y ste es el valor que se reporta. Valores de Referencia: V.N: 150,000 a 400,000/ mm3 Causas ms frecuentes de contaminacin en las muestras Hemlisis. Las muestras parcialmente hemolizadas contienen fragmentos del estroma de hemates, los que produciran un recuento falsamente aumentados. Fragmentos citoplasmticos celulares. Como los presentes en leucemias pueden interferir en el recuento. Valores de Referencia 150,000 a 400,000 plaquetas / mm3 Interpretacin Trombocitosis. Se denomina as al aumento de plaquetas por mm3 su importancia diagnstica es escasa, acompaa a estados infecciosos agudos, como escarlatina, fiebre reumtica, diversos tipos de septicemia, leucemia mieloide crnica, clorosis, etc. Trombopenia. Es la disminucin ms o menos acentuada del nmero de plaquetas; posee importancia diagnstica. Se observa en la anemia perniciosa, anemia aplstica, leucemia aguda o linftica crnica y algunas veces, al comienzo de enfermedades infecciosas agudas (tifoidea, paludismo, neumona). Puede ser provocado por antibiticos como el cloranfenicol, la estreptomicina, analgsicos como la antipirina y el salicilato de sodio y la sulfonamida, derivados sulfamdicos, etc. CUESTIONARIO
1. Qu es la hemoflica? Explique las causas que conllevan a esta patologa. 2. Esquematice la megacariopoyesis.
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PRCTICA N 09
BIOQUMICA CLNICA
DETERMINACION DE UREA MTODO CINTICO OBJETIVOS Aplicar el manejo adecuado de la tcnica para la determinacin de urea en una muestra biolgica Establecer los valores de referencia de la urea y comparar con el valor de nuestra muestra problema a analizar. Definir cules son las principales patologas que se presentan si tenemos valores altos o bajos de urea en una muestra biolgica.
a. DETERMINACIN CUANTITATIVA DE UREA EN SANGRE. FUNDAMENTO DEL MTODO: La ureasa descompone especialmente a la urea produciendo dixido de carbono y amoniaco; esta reacciona con fenol e hipoclorito en medio alcalino produciendo azul de indofenol que se determina colorimtricamente. PROCEDIMIENTO: TCNICA EN SUERO O PLASMA: En tres tubos de foto colormetro marcados B (blanco), S (Standard) y D (desconocido) colocar una o dos gotas de agua y agregar. B S D Standard 20 l Suero o Plasma 20 l Ureasa 1 gota 1 gota 1 gota Mezclar por agitacin suave e incubar 5 minutos a 37C luego agregar Reactivo 1 1 ml 1 ml 1 ml Reactivo 2 1 ml 1 ml 1 ml Mezclar por agitacin suave e incubar 5 minutos a 37C. Luego agregar. Agua destilada 10 ml 10 ml 10 ml Mezclar por inversin y retirar del bao. Despus de 10 minutos leer en foto colormetro con filtro verde (510 550 nm) o en espectrofotmetro a 540 nm, llevando a cero con el blanco. VALORES REFERENCIALES: 0.20 O.45 g/L.
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INTERPRETACION. Su aumento, se interpreta generalmente como una posible disfuncin renal, no se deja de lado al hecho que los valores sricos de urea estn relacionados con la dieta y el metabolismo proteico. c. DETERMINACIN DE GLUCOSA EN SANGRE FUNDAMENTO. La glucosa se oxida enzimticamente por la glucosa oxidasa a cido glucnico y agua oxigenada; agua oxigenada en presencia de peroxidasa produce la copulacin oxidativa del fenol con la 4- aminoferazona (4-AF) dando lugar a la formacin de un cromgeno rojo cereza con observancia mxima a 505 nm.
PROCEDIMIENTO Entre tubos de ensayo, marcados B(Blanco) S(Estndar) y D(Desconocido). colocar. B S D STANDAR 20 L MUESTRA 20 L REACTIVO DE TRABAJO 2 L 2 L 2 L Incubar por 10 minutos en Bao Mara a 37 C, luego leer en espectrofotmetro a 505 nm. calibrando el aparato a cero con el blanco. VALOR DE REFERENCIA En suero 0,70 1.10 g/L. INTERPRETACION DIABETES MELLITUS: Sndrome caracterizado por una secrecin anormal de insulina, que se refleja en una tendencia a la hiperglicemia, asociado con glucosuria. d. DETERMINACIN DE CREATITINA FUNDAMENTO DEL METODO La creatinina y otros compuestos de la muestra reaccionan con cido pcrico en medio alcalino dando un complejo coloreado, rojo que se cuantifica mediante lectura fotomtrica. La determinacin de creatinina puede llevarse a cabo por medio de una tcnica de punto final, o por una tcnica cintica eliminndose en ambas el color que se debe a los cromgenos no creatinina. En el primer caso, la adicin de cido o al medio, destruye el picrato de creatinina pero no el color formado por los de ms compuestos. Por lo tanto la diferencia entre la lectura fotomtrica antes y despus del agregado de cido, permite cuantificar la creatinina en forma especfica. En la tcnica cintica, los cromgenos no creatinina, reaccionan dentro de los primeros 302 de iniciada la reaccin, que se comporta como cintica de primer orden para la creatinina. De manera dentro de los 30 y los 5 segundos posteriores al inicio de la reaccin, el incremento de color se debe exclusivamente a la creatinina. LA CREATININA DIRECTA Elimina la interferencia dada por protenas, mediante el empleo de un bloqueador de sitios reactivos (La 5 Dimetil Animo Naftalen Sulfonamida o DANS) determinando creatinina en forma cintica o de punto final, con resultados comparables a los de los mtodos de referencia. -32-
PROCEDIMIENTO En tres tubos de ensayo marcados B(blanco), S (standard) y D (desconocido), colocar. B S D(suero) Desproteinizado ----3 ml Estndar --0.5 ml --Agua destilada 1 ml 0.5 ml --Reactivo 1 2 ml 2 ml --Reactivo 2 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml Se mezcl por inversin, se incub 20 minutos a temperatura ambiente. Luego leer en fotocolormetro con filtro verde (500 a 540 nm.), se llev a cero el aparato con agua destilada. Reactivos: Reactivo 1 : cido pcrico 41.4 mol/L Reactivo 2 : buffer glicina/NaOH 1mol/L, PH final 12.4 Reactivo 3 : solucin de creatinina 20mg/L Clculos: Creatinina en suero (mg/L) = D x F; F= 20mg/L Valores de Referencia: Creatinina: 0.8 1.4mg/100mL. CUESTIONARIO
1. Qu es el estndar y cul es su aplicacin? 2. Qu pruebas bioqumicas se realizan para diagnosticar enfermedades hepticas, cardiovasculares, metablicas y pancreticas?
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PRACTICA N 10
DIAGNSTICO SEROLGICO II: REACCIN DE AGLUTINACIN (PRUEBA DE WIDAL) Y REAGININA PLASMTICA RPIDA
I. OBJETIVOS - Conocer el fundamento, las tcnicas serolgicas y su aplicacin en el diagnstico de diferentes enfermedades. - Conocer el fundamento e importancia de la aplicacin de la prueba de Widal y Reagina plasmtica rpida.
II. INTRODUCCIN El diagnstico de una enfermedad puede realizarse utilizando mtodos directos: microbiolgicos, serolgicos y molecular e indirectos: serolgicos/inmunolgicos. La aplicacin de las diferentes tcnicas en el diagnstico depende de factores principalmente como sensibilidad, especificidad y valor predictivo; sin embargo otros factores influyen notablemente en su aplicacin tales como el tiempo de ejecucin y el costo que ocasiona dichos diagnsticos que finalmente son determinantes principalmente en pases en vas de desarrollo como es nuestro Per. Como toda tcnica inmunoqumica se basa en reacciones especficas antgeno-Anticuerpo, que en estos casos es de tipo primario (directo), consiste en buscar antgenos y el tipo secundario (indirecto) se basa en la bsqueda de anticuerpos. DIAGNSTICO DE UNA ENFERMEDAD
DIRECTO
INDIRECTO
Microbiolgico
Molecular
Serolgico
Serolgico
Hemocultivo Coprocultivo Mielocultivo Bilicultivo Cultivo celular
PCR Sondas A. N. Norther Blot Souther Blot
- Aglutinacin - Precipitacin - Inmunodifusin - Fijacin de complem. - Inmunoelectroforesis - Inmunofluorescencia - ELISA - RIA
Serolgico: - Aglutinacin - Precipitacin - Inmunodifusin - Fijacin de complem. - Inmunoelectroforesis - Inmunofluorescencia - ELISA - RIA - Western-Blot
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El desarrollo de la biologa molecular y la produccin de anticuerpos monoclonales, ha permitido disponer, en los ltimos aos, de reactivos de diagnstico de gran sensibilidad y especificidad, incluso en forma de KITS, de fcil y sencilla realizacin e interpretacin. De entre todos los mtodos actualmente disponibles, destacaremos en este captulo, por una parte, aquellos que presentan las mayores posibilidades para llevar a cabo estudios serolgicos a gran escala y pueden ser realizados sin necesidad de grandes medios tcnicos. Sensibilidad de las diferentes tcnicas para la deteccin de anticuerpos ( g/ml) MTODO SENSIBILIDAD ( g/ml) Precipitacin en gel 30 Precipitacin en anillo 18 Aglutinacin bacteriana 0,05 Fijacin de complemento 0,05 Hemaglutinacin pasiva 0,01 Inhibicin de la hemaglutinacin 0,005 Inmunofluorescencia 0,005 ELISA 0,0005 Neutralizacin bacteriana 0,00005 PRUEBAS SEROLOGICAS Basada en la capacidad que tiene el organismo humano de responder frente a una agresin microbiana formando anticuerpos especficos (IgG, IgM) contra los antgenos microbianos, situacin que puede ser detectada y servir de ayuda diagnstica. Por otro lado, es factible detectar la presencia de antgenos en los fluidos biolgicos para todos estos casos se han diseado una variedad de puebas. Entre las pruebas serolgicas ms comunes tenemos: Aglutinacin, precipitacin, inmunofluorescencia, turbidimetra, Inmunoensayo (RIA, EIA, EQL, WB). a). Aglutinacin. Tipos: Directa Indirecta (pasiva): Antgeno Aglutinacin Reversa: Anticuerpo Inhibicin de la Hemaglutinacin b). Precipitacin. Tipos: Precipitacin en fase lquida. Precipitacin en fase slida (inmunodifusin). Inmunofisin simple Inmunodifusin doble Microfloculacin c). Inmunofluorescencia. Tipos:
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Inmunofluorescencia Directa: Anticuerpo marcado + antgeno Inmunofluorescencia Indirecta: Anti-anticuerpo marcado + (anticuerpo + antgeno) d).- Enzimoinmunoanlisis (EIA). Tipos: ELISA Directa.- Para la Deteccin de antgenos ELISA Indirecta.- Para la deteccin de anticuerpos ELISA de competicin.- Para la deteccin de anticuerpos e).- Western Blotting. (inmunoelectrotransferencia o westerblot) III. Ejemplos de reacciones serolgicas. A.1.- Reacciones de aglutinacin para enfermedades febriles. Reaccin de Widal. Es una reaccin serolgica que se emplea para el diagnstico de las infecciones lticas y paralticas A y B. Como las salmonellas infectantes tienen ambos antgenos (O y H) es necesario determinar en el suero del paciente el nivel de los anticuerpos correspondientes a cada uno de ellos, para certificar la existencia de la enfermedad y evaluar su curso. Reaccin de Huddleson. Se emplea para el diagnstico de la brucelosis; se detectan los anticuerpos producidos por cualquiera de las tres especies de Brucella ( B. abortus, B. suis y B. melitensis). Reaccin de Weil-Felix. Se emplea para la deteccin de las enfermedades por richettsia (Tifus exantemtico). En este caso el antgeno no es la misma rickettsia infectante, sino la cepa de Proteus OX19, ya que ambas tienen algunas fraciones antignicas comunes. Existen 6 tipos de antgenos: 1.- Antgeno tpico H (Flagelar) 2.- Antgeno tpico O (Somtico) 3.- Antgeno paratpico A 4.- Antgeno paratpico B 5.- Antgeno Brucella 6.- Antgeno Proteus OX19 Procedimiento a. Prueba cualitativa - Se utiliza una lmina excavada o una lmina de vidrio cuadrado de 15cm de lado dividida en 36 cuadrados pequeos. - Se pone las siguientes marcas, en la parte superior: O, H, A, B, Br. OX que corresponden a cada uno de los antgenos enumerados anteriormente. - Se coloca una gota del suero del paciente en cada uno de los 6 cuadrados. - Se coloca una gota de antgeno sobre la del suero en el cuadrado respectivo y se mezclan. - Despus de un reposo de 1 a 3 minutos se observa el resultado: 1. POSITIVO Cuando hay aglutinacin visible a simple vista. 2. NEGATIVO cuando las mezclas permanecen homogneas. b.- Prueba cuantitativa Titulacin: se lleva a cabo slo en el antgeno que dio aglutinacin con la prueba cualitativa.
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En 5 cuadrados diferentes se colocan cantidades decrecientes de suero problema, utilizando una pipeta de 0.2 cc. Luego se agrega una gota de antgeno, se mezcla y se lee. En la grfica puede verse la cantidad de suero usada y el ttulo que le corresponde. Tubo N Suero Problema (ml) Antgeno Ttulo 1 0.08 1/20 01 Gota 2 0.04 1/40 01 Gota 3 0.02 1/80 01 Gota 4 0.01 1/160 01 Gota 5 0.005 1/320 01 Gota Cuando la aglutinacin persiste hasta el ttulo de 1/320 se hacen diluciones al dcimo del severo problema (0.1 cc de suero y 0.9 cc de solucin salina). Se procede igual como indica el cuadro y el resultado se multiplica por 10. VALORES NORMALES Reacciones Antgeno Anticuerpo Anti Tphico H Valor diagnstico Anti Tphico O Valor diagnstico Anti Tphico A Valor diagnstico Anti Tphico B Valor diagnstico Brucellas Valor diagnstico Proteus OX19 Valor diagnstico B.-
1:128 1:160 1:80 1:80 1:80 1:80
REACCIONES SEROLOGICAS EN LA CLINICA Prueba de VDRL: Venereal Disease Research Laboratory Se llama as a la reaccin de floculacion adaptada por la Venereal Disease Research Laboratory de Estados Unidos en la que se utiliza antgeno la cardiolipina, con la cual se efectan pruebas para un diagnstico presuntivo de sfilis. Reactivos Antgeno VDRL Diluyente de solucin salina tamponada Tcnica 1.- Prueba cualitativa a. Preparacin del suero - El suero se obtiene a partir de sangre coagulada y posteriormente centrifugada. - Llevar el suero claro al bao de agua a 56 C por 30 minutos con el objeto de inactivar el complemento. b. Preparacin del antgeno - Pipetear 0.4 mL. de la solucin salina tamponada en el fondo del frasquito pequeo. - Aadir 0.5 mL de antgeno girando el frasquito continuamente sobre una superficie plana. - Aadir 4.5 mL. de solucin salina tamponada, luego agitar de arriba abajo repetidas veces. c. Prueba - Colocar una gota de suero inactivo en una excavacin de lmina. -37-
Agregar una gota de suspensin de antgeno Llevar al agitador por el espacio de 5 minutos. d. Resultados - Grumos medios y grandes REACTOR ( R) - Grumos pequeos DEBIL REACTOR (DR) - Sin grumos o aspereza ligera NO REACTOR (NR)
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Prueba cuantitativa Todos los sueros que resulten Reactor y Dbil reactor en la reaccin cualitativa debe analizarse cuantitativamente. 1.- Prepara diluciones del suero problema a: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, de la siguiente manera. - A cada tubo nmero de 6 colocar 0.5 cc de suero fisiolgico. - Agregar 0.5 cc del suero del paciente al primer tubo y mezclar bien. - Transferir de primer tubo al segundo y previa mezcla transferir 0.5 cc el segundo al tercero y as sucesivamente hasta el sexto tubo. Al final se elimina los 0.5 cc sobrantes. 2.- Colocar 0.05 cc de cada dilucin de una excavacin de la lmina es decir de la dilucin , tomar 0.05 cc y colocarlo en una excavacin y as sucesivamente. 3.- Agregar con la ayuda de una hipodrmica con aguja N 10 un agota de antgeno en cada dilucin. 4.- Realizar movimientos de rotacin a ms o menos 120 RPM durante 4. 5.- Realizar la lectura con ayuda del microscopio y observar la presencia o ausencia de floculacin. 6.- Para el resultado se toma en cuenta la ltima dilucin que presenta aglutinacin. CUESTIONARIO
1. Explique el fundamento de la prueba de ELISA y sus aplicaciones. 2. Explique el fundamento de la prueba de RPR. 3. Mencione las diferencias entre una prueba serolgica e inmunolgica.
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PRCTICA N 11
DIAGNSTICO SEROLGICO II DETERMINACIN DE GRUPO SANGUNEO Y DIAGNSTICO DE EMBARAZO
I. OBJETIVOS Conocer el fundamento, las tcnicas serolgicas y su aplicacin en el diagnstico de diferentes enfermedades. Conocer el fundamento e importancia de la determinacin del grupo sanguneo Conocer el fundamento del diagnstico de embarazo II. INTRODUCCIN DETERMINACIN DE GRUPO SANGUNEO ABO Y FACTOR RHESUS Cuando se producen anticuerpos en respuesta a glbulos rojos producidos por individuos de su misma especie se habla de isoanticuerpos o isoantgenos. Tal es el caso de la presencia de isoantgenos en los glbulos rojos del hombre controlados genticamente y transmitidos a travs de los cromosomas; de acuerdo a esto se han establecido en el hombre la presencia de diferentes grupos sanguneos. Igualmente en el suero se contratarn anticuerpos contra los ausentes. Si colocamos glbulos rojos frente a antisueros conocidos podemos identificar los antgenos presentes por la presencia de una reaccin de aglutinacin. Sin embargo no basta slo una identificacin del grupo sanguneo tanto del donante como del receptor, es necesario enfrentar el suero del paciente con los glbulos rojos de donante para tener la seguridad que no hubo error y excluir algunas irregularidades de la reaccin que se produce a veces. En el ao de 1900 Karl Landststeiner establece el sistema AB() para la clasificacin de la sangre, aos despus se lleg a establecer el AB, A1 (Ag. fuerte). A2 (Ag dbil ). A3. ...., Am.. Posteriormente se estableci muchos grupos: ABO, MNSs, P, Rh, Lutheran, Kell, Lewis, Daffv, Kidd, Auberg, Xg, Doombrok Grupo Sanguneo ABO.- En los glbulos rojos. los determinantes antignicos, estn a nivel de la membrana celular; los cuales se tratan de aminoazcares: glucosamina y galactosamina, los que ligados a protenas (por que son haptenos) adquieren la capacidad antignica. Caractersticas de los cuatro tipos sanguneos: ABO Grupo Sanguneo G.R.: Antgenos Suero/Plasma: Anticuerpo "A" A Anti- A "B" B Anti- B "AB AyB -"O" --Anti- A y Anti-B Factor Rhesus.- En el Ao de 1940 Landsteiner - Wiener descubrieron el Factor Rh, cuando estudiaban la sangre de los monos Macaccus rhesus, el cual tambin presentaba el 85% de la poblacin humana. El estudio del factor Rh es muy importante para las transfusiones sanguneas,
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ya que es un poderoso antgeno, que cuando se realiza una transfusin sangunea incompatible, ocasionar grandes problemas post- transfusionales; as tambin en incompatibilidad de sangre Rh (-) de la madre y el feto Rh (+), proceso conocido como eritroblastosis feta III. DETERMINACIN DEL GRUPO SANGUNEO ABO Y FACTOR RHESUS GRUPO SANGUNEO ABO Materiales Suero Anti A monoclonal o policlonal. Suero anti - B monoclonal o policlonal. Suero anti AB monoclonal o policlonal. Lectin Centrifuga Gradilla de tubos Reactivos de eritrocitos A1. By O en suspensin al 5% en Sol Salina Fisiolgica Tubos de 10 x 15 mm. Pipetas Pasteur Lmparas Lente de magnificacin Procedimiento Fase celular Colocar una gota de anti A en un tubo de ensayo, rotulado y limpio. Colocar una gota de anti B en un tubo de ensayo, rotulado y limpio. Colocar una gota de anti AB en un tubo de ensayo, rotulado y limpio Agregar a cada tubo un agota de suspensin al 5% (en solucin salina) de los Eritrocitos o hemates en evaluar. Mezclar el contenido de los tubos y centrifugue por 15 segundos a 3400rpm. 1000 rpm por 1 minuto. Re suspenda nuevamente los botones celulares y examinar si existe aglutinacin, inclinar el tubo hasta la posicin horizontal y leerlo contra un fondo bien iluminado. Leer, interpretar y registrar los resultados segn patrn. Tubo en mano. Patrn de lectura: Una cruz: aglutinacin homognea. Dos Cruces: grumos irregulares, sobrenadante transparente. Nota: si es grupo A usar lecitina A1. Seguir el mismo procedimiento anterior. Interpretacin o Si hay aglutinacin indica presencia del antgeno correspondiente al suero utilizado o Si no hay aglutinacin indica la ausencia del antgeno correspondiente al suero utilizado. Fase Srica En tres tubos rotulados como A, B y O agregar dos gotas de suero a cada tubo. Agregar una gota de hemates conocidos de A al tubo marcado A. -40-
Agregar una gota de hemates conocidos de B al tubo marcado B. Agregar una gota de hemates conocidos de O al tubo marcado O. Mezclar suavemente el contenido de los tubos y centrifugar durante 15 segundos a 3400 rpm. 1000 rpm por 1 minuto. Resuspender suavemente los botones celulares y detectar la existencia de aglutinacin, inclinndolo hasta la posicin horizontal y leerlo contra un fondo bien iluminado. Leer, interpretar e informar tubo en mano, segn patrn. Interpretacin o Si hay aglutinacin indica presencia del anticuerpo correspondiente a la suspensin de hemates utilizado. o Si no hay aglutinacin indica la ausencia del anticuerpo correspondiente a la suspensin de hemates utilizado. FACTOR RH Materiales y equipos: Suero anti D. Albumina (control Rh) Tubos 10 x 75 mm. Hemates lavados al 5% en solucin salina fisiolgica. Pipetas Pasteur. Procedimiento: Colocar una gota de suero anti D en un tubo de ensayo, limpio y rotulado. Colocar una gota de albumina (control Rh) en otro tubo de ensayo, limpio y rotulado. Agregar a cada tubo una gota de la suspensin al 5% (en solucin salina fisiolgica) de los En trocitos a examinar. Mezclar suavemente y certificar por 15 segundos 3400 rpm. Desprender el botn de clulas del fondo del tubo agentndolo suavemente, inclinarlo hacia a posicin horizontal y leerlo contra un fondo bien iluminado para apreciar la aglutinacin. Anotar inmediatamente, tubo en mano, los resultados de la aglutinacin segn patrn. Informar en cruces de 0 a 4. Interpretacin: Si hay aglutinacin indica presencia del antgeno D correspondiente a un RH positivo. Si hay aglutinacin indica ausencia del antgeno D correspondiente a un RH negativo, debe ser confirmado por el test del variante Du.
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Nota:
El control RH en todos los casos no debe aglutinar por ser un control serolgico negativo.
DIAGNSTICO DE EMBARAZO Las pruebas de embarazo detectan la presencia en orina de hormona de Gonadotrofina Corionica humana (GCH)producida por el tejido trofoblstico placentario durante la gestacin o por tumores de origen trofoblstico en hombres y mujeres. En la prctica diaria las pruebas que se utilizan mayormente se basan en la inhibicin de la hemaglutinacin o del ltex. Comercialmente existen conjuntos de reactivos (Sed) del diversas marcas para realizar en tubos o en lminas, como la Gravindex. Pergnosticon. Planotest. Gamma. Fundamento. Se necesitan glbulos rojos partculas de ltex cubiertas con GCH (servirn de antgeno y un suero anti GCH) (Anticuerpos contra GCH). Cuando la orina no contiene GCH al mezclarse con el suero GCH no sucede nada, pero al aadir los glbulos rojos o las partculas de ltex cubiertos con GCH sucede una reaccin antgeno anticuerpo visualizndose una aglutinacin (Prueba negativa). La orina contiene GCH al reaccionar con el suero anti GCH lo neutraliza. Pero no se visualiza y finalmente al agregar los glbulos rojos o las partculas de ltex no sucede ninguna reaccin (prueba positiva). Procedimiento en placa: Prueba de Latex Seguir las indicaciones de cada fabricante para la obtencin de buenos resultados. El procedimiento usual en lmina es como sigue: 1. La muestra de orina debe ser tomada como para examen de orina completa y de preferencias procesar antes de las 12 horas, en caso contrario refrigerarse hasta por 24 horas. 2. Con un dispensador descartable colocar una gota de orina en una lmina de fondo oscuro. 3. Aadir una gota de suero anti GCH, mezclar y luego oscilar la lmina circularmente por 30 segundos. 4. Aadir una gota de partculas de ltex cubiertas con GCH, mezclar luego oscilar la lmina por 2 minutos y observar la presencia de aglutinacin. Resultados: Aglutinacin: Negativo (no existe gestacin) No Aglutinacin: Positivo (gestacin)
Test rpido de ELISA en Micropaca: Beta-Gonadotropina corinica humana (Test Cualitativo). Antes de proceder con el anlisis atemperar los reactivos, controles y muestras a 20- 27C. 1. Rotule la microplaca para cada suero de referencia, controles y muestras de cada paciente. Se recomienda utilizar tips nuevos para cada muestra, los cuales vienen dentro de la bolsa de alumnio almacenados a una temperatura de 2 a 8 C 2. Poner una gota con la micropipeta de 0.025 mL (25L) del frasco de suero de referencia, control y de la muestra en la microplaca.
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3. Luego aada dos gotas de la solucin HCG-enzima a todos los ensayos 4. Gire con movimientos de rotacin la microplaca por el espacio de 5 a 10 segundos y mezcle, e incube a temperatura de 20 a 27 C por 10 minutos. 5. Deseche el contenido de la microplaca por decantacin o aspiracin. Si utiliza la decantacin deseche el residuo de la microplaca con papel absorbente. 6. Finalmente a los tips utilizados en los ensayos, lave de dos a tres ceces con agua fra. 7. Luego aada 2 gotas de la solucin sustrato a todas las muestras. No mueva la placa despues de la adicin del sustrato. 8. Incube a una temperatura de 20 27 C por 5 minutos Interpretacin Si el color se evidencia de menos intensidad que el del calibrador B se considera negativo (< 25mIU/mL.) Si el color se evidencia de mas intensidad que el del calibrador B se consdera positivo (25mIU/mL.) CUESTIONARIO Porque es importante el estudio de los grupos sanguineos ABO? Explique Refirase sobre los efectos adversos de la transfusin sangunea.
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PRCTICA N 12
EXAMEN COMPLETO DE ORINA Y FUNCIONAMIENTO RENAL
I. OBJETIVOS Conocer el fundamento, conceptos generales y manejo de las diferentes tcnicas de anlisis de muestras de orina que se manejan en el examen completo de orina.. Interpretar los resultados obtenidos de las muestras analizadas.
III. INTRODUCCIN Es un conjunto de exmenes realizados en una muestra de orina que nos permita obtener una informacin cualitativa, cuantitativa o semicuantitativa de los componentes de la orina. OBTENCION DE MUESTRAS Para las pruebas cualitativas ordinarias se puede emplear en muestra tomada en cualquier. El momento en que se obtiene una muestra de orina deben ser el adecuado al tipo de examen que se va realizar. En lo posible se debe tener en cuenta ciertas recomendaciones para la obtencin de la muestra de orina que va permitir obtener datos ms precisos. La tcnica recomendada para este tipo de anlisis es la llamada chorro intermedio que consiste en desechar el chorro inicial a fin de eliminar la flora microbiana residente en la uretra y tomar el chorro intermedio en un frasco de vidrio de boca ancha, limpio, seco y estril. La calidad del anlisis depende en las condiciones que se toma, se almacena y se procesa la muestra, razn por la cual se debe tener en cuenta los siguientes aspectos: a).- Hora de recoleccin. De preferencia la primera orina de la maana, debido a que los diferentes elementos, que se encuentran en la orina estarn ms concentrados. b).- Evitar la contaminacin. Indicando al paciente el lavado externo de los genitales con agua y jabn comn, no es aconsejable el uso de antispticos. El paciente de origen rural, y personas que carecen de hbitos de higiene la contaminacin externa de la orina es muy frecuente, lo que ocasiona cambios en cuanto al aspecto fsico de la orina. c).- Inicio del examen. La descomposicin de la orina es especialmente rpida en ambientes clidos. Es preferible el examen inmediato. d).- Toma de datos del paciente. Datos que permitan identificar la muestra, adems de otros que puedan ayudar a determinar la patologa. Los conservadores, en general son poco satisfactorios. Se emplean lo siguiente: Toluol.- 2 mL de toluol por 100 mL. de orina Timol.- un pequeo fragmento flotante conserva la orina por varios das. Formalina.- se emplea una gota por cada 30 ml. de orina. La formalina en concentraciones demasiadas altas precipita las protenas. Es un agente fuerte y puede reducir el cobre o bismuto en las pruebas para glucosa.
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Acido brico.- una cucharadita de polvo (0.3 g.) retardar la descomposicin de 120 ml. de orina. Permite el crecimiento de hongos y precipita los cristales de cido rico. EXAMENES A PRACTICARSE 1. EXAMEN FISICO Volumen - Este parmetro es influenciado por mltiples condiciones como son tamao del paciente, tipo de alimentacin, actividad fsica, disponibilidad de agua, temperatura y humedad ambiental entre otros. En personas adultas normales se estima que se producen aproximadamente de 600 a 2500 mL. de orina cada 24 horas. - El volumen de orina se debe determinar en los casos en los que clnicamente se observe poliuria y polidipsia, proteinuria y para evaluar la perfusin renal en pacientes en estado de choque. - El volumen se toma iniciando con una vejiga vaca, para lo cual a las 0 horas se indica al paciente que miccione la orina y se desecha, las siguientes micciones se recolectan en un frasco los suficientemente grande, luego a las 24 horas se le indica que miccione, el cual se recolecta. Color - Determinar el color de la orina puede ser subjetivo en algunos casos, ya que puede existir enfermedad aunque el color sea normal y est influenciado por la presencia de pigmentos tanto endgenos como exgenos y aunque el conocer el color nos puede indicar una anormalidad, esta informacin puede ser muy inespecfica. El color de la orina es muy importante en los casos de determinaciones analticas colorimtricas. La intensidad del color est directamente relacionada con la gravedad especfica. Se debe considerar tambin la administracin de medicamentos, dieta y medio ambiente. - El color normal de la orina es de amarillo claro a ambarino, color que esta dado principalmente por 2 pigmentos que son el urocromo y la urobilina. - El color se determina colocando 10 mL de orina en un tubo de prueba, luego del cual se realiza la observacin. Olor Normal: Suigneris La deteccin de olores anormales es indicativa de un estudio ms profundo del paciente, aunque es muy inespecfico para la determinacin de algn padecimiento. La determinacin del olor es poco frecuente sin embargo su determinacin podra permitir facilitar el diagnstico presuntivo.
Aspecto - Se refiere a la claridad o turbidez que pueda presentar la orina, pudiendo ser: Lmpido, Ligeramente turbio, Turbio y Muy turbio. - En la mayora de las especies es translucida, aunque tiende a ser ligeramente turbia a medida que es ms concentrada. - Las alteraciones producidas in vitro principalmente por el aumento de la temperatura y pH, pueden causar la disminucin en la transparencia. La causa de la turbidez de la orina se debe explicar en base a los hallazgos del estudio del sedimento urinario, pero los problemas ms comnmente asociados a la turbidez de la orina
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pueden ser: cristales, eritrocitos, semen, bacterias y levaduras, contaminantes, lpido, moco, etc. - Su determinacin se realiza, colocando 10 mL de orina en un tubo de prueba, luego realizar la observacin Reaccin (pH) - Se puede usar papel tornasol, el papel de nitracina o cualquier otro indicador de pH. - Normal: 4.5 a 6.5. - Su determinacin se realiza a travs de tiras reactivas Densidad - La densidad puede ser medida mediante el refractmetro, cintas de inmersin y el Urinmetro o Urodensmetro. - Normal: 1,010 a 1,030. 2. EXAMEN QUMICO El anlisis de orina de rutina incluye pruebas qumicas para pH, protenas, glucosa, cetonas y sangre oculta. Algunos laboratorios tambin incluyen pruebas de bilirrubina, urobilingeno y nitrito, segn el tipo de tira reactiva que utilice. Desde la introduccin de tiras reactivas simples y mltiples, cintas de prueba y tabletas, el examen qumico de la orina se ha convertido en un procedimiento sensible y rpido. Actualmente es posible analizar hasta nueve pruebas diferentes en menos de 60 segundos. Existen dos marcas bsicas de tiras reactivas y cada una posee tiras reactivas con posibilidad de medir desde una hasta nueve reacciones diferentes. a) Protenas b) Glucosa c) Acetona d) Bilirrubina e) Urobilina 3. EXAMEN MICROSCPICO DE SEDIMENTO URINARIO El examen microscpico constituye una parte vital del anlisis de orina de rutina. Es una herramienta diagnstica valiosa para la deteccin y evaluacin de trastornos renales y del tracto urinario, as como de las enfermedades sistmicas. El valor del examen microscpico depende de dos factores fundamentales: el examen de una muestra adecuada y el conocimiento de la persona que realiza el estudio. La mejor muestra para el anlisis de orina de rutina es la primera miccin de la maana. Los cilindros y hemates tienden a disolverse o lisarse en muestras de bajo peso especfico o de pH alcalino, la primera orina de la maana por lo general proporciona el medio concentrado y cido necesario para mantener estas estructuras. El sedimento debe examinarse lo antes posible para su recoleccin, pero si no es posible hacer el examen en forma inmediata, puede refrigerarse la muestra durante unas horas. PREPARACIN DEL SEDIMENTO Y USO DEL MICROSCPIO El examen microscpico debe hacerse en una muestra centrifugada (si el volumen de la muestra es demasiado pequeo como para centrifugarlo, por Ej. slo unas pocas gotas, aqulla se examina directamente, pero se seala en el informe que los resultados se obtuvieron de una muestra sin centrifugar). Se mezcla la muestra y se colocan aproximadamente 10-15 mL. de orina en un tubo
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de centrifugacin, se centrfuga a 2000 r.p.m. durante 5 minutos. Se elimina el lquido sobrenadante (ste puede usarse para pruebas confirmatorias de protenas), y se suspende el sedimento en la orina que baja por las caras del tubo (algunos laboratorios dejan exactamente 1 mL de sedimento y de sobrenadante en el tubo). Se dan golpecitos en la parte inferior del tubo para mezclar el sedimento, se coloca una gota de ste en un portaobjeto limpio o en una cmara de conteo, se cubre con un cubreobjeto y se examina inmediatamente. La primera regla para el examen del sedimento urinario sin tincin con el microscopio de campo claro es que debe usarse luz amortiguada para dar un contraste adecuado. Esto se logra cerrando parcialmente al iris del diafragma y ajustando luego el condensador hacia abajo hasta lograr el contraste ptimo. Si hay demasiada luz algunas estructuras se pasarn por alto. La segunda regla es que el micrmetro debe ser continuamente ajustado haciendo movimientos hacia arriba y hacia abajo para poder ver la profundidad del objeto, as como otras estructuras que puedan encantarse en un plano focal diferente. Primero el examen debe hacerse con magnificacin de poco aumento (10X). Se registra el portaobjetos en busca de cilindros, cristales y elementos que se presentan un unos pocos campos. Cuando sea necesario delinear las estructuras se pasa a la lente de mayor aumento (40X). A. ELEMENTOS NO ORGANIZADOS CRISTALES Por lo general no se encuentran cristales en la orina recin emitida, pero aparecen dejndola reposar durante un tiempo. Cuando la orina esta sobresaturada con un compuesto cristalino particular, o cuando las propiedades de solubilidad de ste se encuentran alteradas, el resultado es la formacin de cristales. En algunos casos esta precipitacin se produce en el rin o en el tracto urinario, y puede dar lugar a la formacin de clculos urinarios (piedras). Muchos de los cristales que se encuentran en la orina poseen escasa significacin clnica, excepto en casos de trastornos metablicos, de formacin de clculos y en aquellos en que sea necesario regular la medicacin. Entre los cristales de mayor importancia se encuentran la cistina, la tirosina, la leucina, el colesterol y las sulfamidas. Los cristales pueden identificarse por su aspecto y, si fuera necesario, por sus caractersticas de solubilidad. Como la formacin de los cristales suele ser dependiente del pH, es til conocer el pH de la orina al efectuar el examen microscpico. CRISTALES EN ORINAS CIDAS Los cristales que se encuentran comnmente en las orinas cidas son el cido rico, oxalato de calcio y los uratos amorfos. Con menos frecuencia hay cristales de sulfato de calcio, uratos de sodio, cido hiprico, leucina, tirosina, colesterol y sulfamida. a). CRISTALES DE CIDO RICO Los cristales de cido rico pueden aparecer con muy diversas formas, las ms caractersticas son el diamante o el prisma rmbico y la roseta, constituida por muchos cristales arracimados. En ocasiones pueden tener seis caras, y en estos casos se identifican a veces en forma errnea como cristales de cistina (que son incoloros). Los cristales de cido rico con frecuencia estn teidos por los pigmentos urinarios y en consecuencia tienen color amarillo o rojo-castao. El color por lo general depende del grosor del cristal, por eso cristales muy delgados pueden ser incoloros.
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Cristales de cido rico. En la orina cida pueden adoptar mltiples formas: cuadros romboidales, rosetas, pesas, barriles, bastones.
Cristales de cido rico. En la orina cida pueden adoptar mltiples formas: cuadros romboidales, rosetas, pesas, barriles, bastones. b). CRISTALES DE OXALATO DE CALCIO stos son incoloros, de forma octadrica o de "sobre"; parecen cuadrados pequeos cruzados por lneas diagonales que se interceptan. Raras veces se presentan como esferas ovales o discos bicncavos, que tienen forma de pesas de gimnasia cuando se los ve en incidencia lateral. Estos cristales pueden variar de tamao, de modo que a veces son slo escasamente discernibles bajo magnificacin de alto poder. Al enfocar un tpico cristal de oxalato de calcio el observador ve la "X" del cristal sobresaliendo en el campo.
Cristales de oxalato de calcio. Son incoloros y muy birrefringentes. Es caracterstica su forma en sobre de carta
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Cristales de oxalato de calcio. Son incoloros y muy birrefringentes. Es caracterstica su forma en sobre de carta. Se observan varias clulas epiteliales planas. c). URATO AMORFO Con frecuencia hay en la orina sales de urato (sodio, potasio, magnesio y calcio) en una forma no cristalina, amorfa. Estos uratos amorfos tienen aspecto granular y color amarillo-rojo, son solubles en alcalosis y a 60 C de temperatura. Carecen de significacin clnica.
Uratos amorfos. Numerosas imgenes en forma de grumo que en parte se aglomeran y forman pseudocilindros d). CRISTALES DE CIDO HUPRICO Son prismas o placas elongadas amarillo-castao o incoloras. Pueden ser tan delgados que parecen agujas, y con frecuencia estn agrupados. Son ms solubles en agua y en ter que los cristales de cido rico. Se observan con escasa frecuencia en la orina y prcticamente carecen de significacin. e). URATOS DE SODIO Pueden existir como sustancias amorfas o como cristales. Los cristales de urato de sodio son agujas o prismas delgados, incoloros o amarillentos que se presentan en grupos o racimos. Son solubles a temperatura de 60 C y slo ligeramente solubles en cido actico. Los uratos carecen de significacin clnica. f). CRISTALES DE SULFATO DE CALCIO Son agujas o prismas largos, delgados e incoloros, de aspecto idntico al de los cristales de fosfato de calcio. El pH de la orina ayuda a diferenciar estos dos tipos de cristales; el sulfato de calcio se encuentra en orinas cidas mientras que el hallazgo de fosfato de calcio es habitual en orinas alcalinas. El sulfato es tambin extremadamente soluble en cido actico. Es raro ver cristales de sulfato de calcio en la orina, carecen de significacin clnica. -49-
g). CRISTALES DE CISTINA Son placas hexagonales, refringentes e incoloras cuyos lados pueden ser iguales o no. Pueden aparecer en forma aislada, unos sobre otros, o en acmulos. Con frecuencia poseen un aspecto estratificado o laminado. La presencia de cristales de cistina en la orina siempre tiene importancia aparecen en pacientes con cistinosis o cistinuria congnitas y pueden formar clculos.
Cristales de cistina. Se reconocen por su caracterstica forma hexagonal, incoloros y de variable tamao que en ocasiones se superponen.
Cristales de cistina. Se reconocen por su caracterstica forma hexagonal, incoloros y de variable tamao que en ocasiones se superponen
h). LEUCINA Los cristales de leucina son esferoides oleosos, altamente refractarios, de color amarillo o castao con estriaciones radiales y concntricas. Es probable que estn formados puramente por leucina, ya que la leucina pura cristaliza en forma de placas. La leucina es soluble en cido actico caliente, alcohol caliente y lcalis; es insoluble en cido clorhdrico. i). TIROSINA Los cristales de tirosina son agujas muy finas, altamente refringentes, que aparecen en grupos o acmulos. Los acmulos de agujas con frecuencia parecen de color, sobre todo en el centro, pero pueden tomar una coloracin amarilla en presencia de bilirrubina. Los cristales de tirosina son solubles en hidrxido de amonio y en cido clorhdrico, pero insoluble en cido actico j). COLESTEROL
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Los cristales de colesterol son placas de gran tamao, planas y transparentes, con ngulos mellados. Son solubles en cloroformo, ter y alcohol caliente. A veces se encentran formando una pelcula en la superficie de la orina en lugar de encontrarse en el sedimento. K). CRISTALES DE SULFAMIDAS Y OTROS FRMACOS Cuando se introdujo en teraputica el uso de las sulfamidas aparecieron muchos problemas por dao renal como consecuencia de la precipitacin del frmaco. Las nuevas sulfamidas son mucho ms solubles, an en medios cidos; por eso en la actualidad raramente se forman cristales en la orina. La mayora de las sulfamidas precipitan en forma de grupos de agujas, por lo general con una unin excntrica; su color puede ser claro o castao. CRISTALES EN ORINAS ALCALINAS Entre los cristales que pueden encontrarse en orinas alcalinas se incluyen los siguientes: fosfato triple (fosfato amnico-magnsico), fosfatos amorfos, carbonatos de calcio, fosfato de calcio y biuratos de amonio, tambin denominados uratos de amonio. a). FOSFATO TRIPLE Los cristales de fosfato (fosfato amnico-magnsico) pueden existir en orinas neutras y en orinas alcalinas. Son prismas incoloros de tres a seis caras que con frecuencia tienen extremos oblicuos. El fosfato amnico-magnsico a veces puede precipitar formando cristales plumosos o con aspecto de helecho. Los cristales de fosfato triple son solubles en cido actico.
Cristales de fosfato triple. Se aprecian como formas incoloras en "tapa de atad" en la orina alcalina Cristales de Fosfatos Han sido causa de debate sobre la significacin clnica de estos en la orina. En la prctica solo el fosfato de amonio y magnesio ha sido estimado como significativo. Esto hace suponer una infeccin con una bacteria productora de ureasa como el proteus. b). FOSFATO AMORFO Las sales de fosfato con frecuencia estn presentes en la orina en forma no cristalina, es decir, como sustancias amorfas. Estas partculas granulares carecen de una forma definida y por lo general a simple vista son indistinguibles de los uratos amorfos. El pH de la orina, as como sus propiedades de solubilidad ayudan a distinguir entre estos depsitos amorfos, los fosfatos amorfos son solubles en cido actico mientras que los uratos amorfos no lo son. Los fosfatos amorfos carecen de significacin clnica.
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Fosfatos de Amonio y Magnesio: Observe la tpica forma de "ataud" que presentan. c). FOSFATO DE CALCIO Los cristales de calcio son prismas largos, delgados e incoloros con un extremo puntiagudo, ordenados formando rosetas o estrellas (fosfatos estelares), o en forma de agujas. Pueden tambin formar granulares, de gran tamao, delgadas e irregulares, flotantes en la superficie de la orina. Los cristales de fosfato de calcio son solubles en cido actico diluido. d). CARBONATO DE CALCIO Los cristales de carbonato de calcio son pequeos e incoloros, aparecen con forma esfrica o de pesas de gimnasia, o en masas granulares de gran tamao. Tienen mayor tamao que las masas de las sustancias amorfas, y cuando aparecen en acmulos parecen tener color oscuro. En la masa de cristales de carbonato de calcio, contrariamente a lo que ocurre con los acmulos de fosfatos amorfos, existe conexin de los cristales a nivel de sus bordes.
Los Cristales de Carbonato de Calcio son hallados solos o unidos. e). BIURATO DE AMONIO Los cristales de biurato de amonio, o simplemente de urato de amonio, se encuentran en orinas alcalinas y neutras y ocasionalmente en orinas cidas. Los cristales de biurato de amonio, son cuerpos esfricos de color amarillo castao con espculas largas e irregulares. Su aspecto con frecuencia se describe con el trmino de "estramonio". Los cristales de biurato de amonio pueden existir como esferoides de color amarillo castao sin espculas, aunque esta forma no es muy comn. En la figura 4 se observan cristales hallados en orinas alcalinas. B. ELEMENTOS ORGANIZADOS CLULAS
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Entre las clulas que pueden estar presentes en la orina se encuentran eritrocitos (hemates o glbulos rojos), leucocitos (glbulos blancos) y clulas epiteliales provenientes de cualquier punto del tracto urinario, desde los tbulos hasta la uretra, o como contaminantes procedentes de vagina o vulva. a). ERITROCITOS Los hemates presentes en la orina pueden provenir de cualquier punto del tracto urinario, desde el glomrulo hasta el meato urinario, y en la mujer constituyen a veces contaminacin menstrual. Pueden aparecer en diversas formas, segn el medio de la orina. Cuando la muestra de orina es fresca, los hemates presentan aspecto normal de color plido o amarillento, son discos uniformes bicncavos de aproximadamente 7 um de dimetro y 2 um de grosor. Carecen de ncleo y cuando se observan en incidencia lateral tienen el aspecto de vidrio de reloj. En las orinas diluidas o hipotnicas, los hemates se hinchan y pueden lisarse, liberando de este modo su contenido de hemoglobina en la orina. Las clulas lisadas, que forman como corpsculos fantasmas o eritrocitos acrmicos, son crculos tenues incoloros (se trata en realidad de las membranas del eritrocito vaco), tambin se produce lisis en orinas alcalinas. En las orinas hipertnicas hay crenacin de los hemates, que se parecen a veces a grnulos. En ocasiones pueden verse en el sedimento urinario hemates microcticos.
Clulas Rojas o Eritrocitos. Note la forma bicncava de los mismos.
Eritrocitos eumorficos, caractersticos discos redondos con doble contorno.
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Hemates eumorficos y dismorficos presentes en el mismo campo. Las alteraciones morfolgicas en la membrana celular marcan la diferencia.
Eritrocitos dismorficos. Acantocitos, con su clsica forma de anillos y evaginaciones.
Eritrocito dismorfico. Acantocito. La microscopia electrnica de barrido permite evidenciar sus caractersticas evaginaciones.
Glbulos Rojos Crenados o Crenocitos: su forma es de "estrella" con la membrana arrugada.
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b). LEUCOCITOS Los glbulos blancos pueden entrar en cualquier punto del tracto urinario desde el glomrulo hasta la uretra. En promedio, la orina normal puede contener hasta 2 glbulos blancos/campo de gran aumento. Los leucocitos tienen un dimetro aproximado de 10-12m ; en consecuencia son de mayor tamao que los eritrocitos pero ms pequeos que las clulas del epitelio renal. Los eritrocitos tienen por lo general forma esfrica y color gris oscuro o amarillo verdoso. Puede aparecer en forma aislada o en acmulos. La mayora de los leucocitos de la orina son neutrfilos, y habitualmente se les identifica por sus grnulos caractersticos o por las lobulaciones del ncleo.
Clulas Blancas o Leucocitos. El centro es ms granuloso por la presencia del ncleo.
Leucocitos. Se reconocen por su tamao y su ncleo segmentado. Obsrvese la presencia de abundantes levaduras.
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Leucocitos. Se reconocen por su tamao mayor a los hemates y menor a las clulas epiteliales y su ncleo cargado de granulaciones c). CLULAS EPITELIALES Las clulas epiteliales presentes en la orina pueden provenir de cualquier sitio del tracto urinario, desde los tbulos contorneados proximales hasta la uretra, o la vagina. Normalmente pueden encontrarse algunas clulas epiteliales en la orina como consecuencia del desprendimiento normal de clulas viejas. Un incremento marcado indica inflamacin de la porcin del tracto urinario de donde proceden. Es muy difcil hacer la distincin del sitio de origen de las clulas epiteliales. Por esta razn muchos laboratorios informan su presencia sin intentar diferenciarlas. En los casos en que la distincin es posible pueden reconocerse tres tipos fundamentales de clulas epiteliales: tubulares, de transicin y pavimentosas. c.1). CLULAS EPITELIALES DEL TBULO RENAL Las clulas de los tbulos renales son ligeramente ms grandes que los leucocitos y poseen un ncleo grande y redondeado. Pueden ser planas, cbicas o cilndricas. La presencia de un nmero elevado de clulas epiteliales tubulares sugiere dao tubular, que puede producirse en enfermedades como pelonefritis, necrosis tubular aguda, intoxicacin por salicilatos, y en el rechazo del rin transplantado.
Clula de epitelio tubular. Se reconocen por su tamao y su ncleo grande y redondo. c.2). CLULAS EPITELIALES DE TRANSICIN Son de dos a cuatro veces ms grandes que los leucocitos. Pueden ser redondeadas. Piriformes o con proyecciones apendiculares. En ocasiones poseen dos ncleos. Las clulas de transicin revisten el tracto urinario desde la pelvis renal hasta la porcin proximal de la uretra.
Clulas de epitelio transicional, formando agrupaciones -56-
c.3). CLULAS EPITELIALES PAVIMENTOSAS O ESCAMOSAS Las clulas epiteliales pavimentosas se reconocen fcilmente por ser de gran tamao, planas y de forma irregular. Contienen ncleos centrales pequeos y abundante citoplasma. El borde presenta a menudo pliegues, y la clula puede estar enrollada en un cilindro. Las clulas epiteliales pavimentosas provienen principalmente de la uretra y de la vagina. Muchas de las que se encuentran en la orina de la mujer son el resultado de la contaminacin vaginal o vulvar y en esos casos poseen escaso significado diagnstico.
Clulas de epitelio plano. Cuerpo celular grande e irregular, en ocasiones plegado, con ncleo pequeo y redondo. Forman a menudo agrupaciones, como en este caso. CILINDROS Los cilindros urinarios se forman en la luz de los tbulos del rin, reciben ese nombre porque son moldeados en los tbulos. Pueden formarse por precipitacin o gelificacin de la mucoprotena de Tamm-Horsfall, por agrupamiento de clula o de otros materiales dentro de una matriz proteica, por adherencia de clulas o de material a la matriz, o por coaglutinacin de material en el interior de la luz tubular. Los tbulos renales secretan una mucoprotena denominada de Tamm-Horsfall que, segn se cree, forma la matriz de todos los cilindros. Algunos cilindros pueden contener tambin protenas plasmticas, pero por lo general stas estn confinadas en los grnulos del cilindro. En los cilindros creos las protenas plasmticas estn presentes en la distribucin homognea. os cilindros poseen caras casi paralelas y extremos redondeados o romos; varan en forma y tamao de acuerdo con lo tbulos donde se forman. Pueden ser contorneados, rectos o curvos; su longitud es variable. Los cilindros anchos, que pueden tener un dimetro de dos a seis veces superior al de los cilindros comunes, se forman en los tbulos dilatados o atrofiados por procesos patolgicos, o en tbulos colectores. Los cilindros anchos con frecuencia se denominan cilindros de la insuficiencia renal. a). CILINDROS HIALINOS Son los que se observan con mayor frecuencia en la orina. Estn formados por la protena de Tamm-Horsfall gelificada y pueden contener algunas inclusiones que se incorporan estando el cilindro en el rin. Como estn formados solamente por protena, tienen un ndice de refraccin muy bajo y deben ser buscados con luz de baja intensidad. Son incoloros, homogneos y transparentes y por lo general tienen extremos redondeados.
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Cilindro hialino, largo y arrollado, atraviesa todo el campo. Estos cilindros son homogneos, incoloros, transparentes y poco refringentes, por lo que son fciles de omitir.
Cilindro hialino, largo y arrollado, atraviesa todo el campo. Estos cilindros son homogneos, incoloros, transparentes y poco refringentes, por lo que son fciles de omitir.
Cilindros Hialinos de delicada apariencia y tamao pequeo. b). CILINDROS ERITROCITARIOS La presencia de cilindros eritrocitarios significa hematuria de origen renal; son siempre patolgicos. Son por lo general diagnstico de enfermedad glomerular; se encuentran en la glomrulonefritis aguda, en la nefritis lpica y otros padecimientos. Los cilindros eritrocitarios pueden tener color castao o ser casi incoloros. Pueden estar formados por pocos glbulos rojos en una matriz proteica, o bien por muchas clulas aglomeradas sin matriz visible. Si los hemates se encuentran intactos y su forma puede detectarse se denominan cilindros eritrocitarios. Si se produce degeneracin del cilindro y ste pasa a ser un cilindro granuloso de color castao rojizo, se trata de un cilindro hemaglobnico o hemtico.
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Cilindro eritrocitario. Se componen de eritrocitos adheridos a una matriz hialina. Se presenta en el contexto de una hematuria microscpica, confirmando su origen glomerular.
Cilindro eritrocitario, muy denso, lo que explica su color pardo tan oscuro. Se acompaa de eritrocitos, leucocitos y clulas de epitelio plano.
Cilindro eritrocitario. Muy denso y de color rojizo. Se presenta en el contexto de una hematuria microscpica, confirmando su origen glomerular.
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Cilindro eritrocitario. Muy denso y de color ligeramente rojizo. Se componen de eritrocitos adheridos a una matriz hialina. Se presenta rodeado de hemates.
c). CILINDROS LEUCOCITARIOS La mayora de los leucocitos que aparecen en los cilindros son neutrfilos polimorfonucleares. En el cilindro puede haber unos pocos leucocitos o bien puede estar formado por muchas clulas. Si las clulas se encuentran an intactas pueden observarse los ncleos con claridad, pero al comenzar la degeneracin de los elementos celulares las membranas desaparecen y el cilindro adquiere un aspecto granular.
Cilindro leucocitario. Se observa a su alrededor algunos leucocitos, eritrocitos, bacterias y filamentos de moco.
Cilindro leucocitario largo y un pequeo fragmento del mismo cilindro. Se observa a su alrededor algunos leucocitos y eritrocitos.
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Cilindro leucocitario. De pequeo tamao. Se componen de leucocitos adheridos a una matriz hialina, confirmando su origen glomerular. d). CILINDROS GRANULOSOS Los cilindros granulosos pueden formarse a partir de la degeneracin de cilindros celulares, o bien por la agregacin directa sricas en una matriz de mucoprotena de Tamm-Horsfall. Inicialmente los grnulos son de gran tamao y su aspecto es tosco, pero si la orina permanece en reposo durante un tiempo prolongado se destruyen y se forman grnulos de aspecto ms delicado.
Cilindro granuloso. Suelen ser ms grandes que los hialinos y presentar inclusiones granulares. Se observan hemates a su alrededor.
Cilindro granuloso. Suelen ser ms grandes que los hialinos y presentar inclusiones granulares.Se observan detritus a su alrededor.
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Cilindro granuloso. Ancho y denso. Suelen ser ms grandes que los hialinos y presentar inclusiones granulares e). CILINDROS DE CLULAS EPITELIALES Los cilindros epiteliales se forman como consecuencia de la estasis urinaria y de la descamacin de clulas del epitelio tubular. Las clulas epiteliales pueden estar ordenadas en el cilindro en hileras paralelas o carecer de ordenacin, varan en tamao, forma y estadio de degeneracin. Se piensa que las clulas que aparecen en hileras paralelas provienen del mismo segmento tubular, mientras que las que no tienen ordenacin provienen de diferentes porciones del tbulo.
Cilindro epitelial. Clulas de epitelio tubular adheridos a una matriz hialina.
Cilindro epitelial. Clulas de epitelio tubular adheridos a una matriz hialina. Llama la atencin el contorno marginal policiclico producido por las clulas de epitelio tubular. f). CILINDROS CREOS
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stos poseen un ndice de refraccin muy elevado, son amarillos, grises o incoloros y tienen un aspecto uniforme y homogneo. Con frecuencia aparecen como cilindros anchos y cortos de extremos romos o cortados, y a menudo sus bordes son serrados o de aspecto resquebrajado. Se ha postulado que pueden formarse a partir de la degeneracin de cilindros granulosos.
Cilindro creo. Ms anchos que los hialinos, con mayor refringencia. Presenta muescas o hendiduras finas en sus bordes, que se dirigen perpendicularmente al eje longitudinal del cilindro.
Cilindro creo. Ms anchos que los hialinos, con mayor refringencia. Presenta muescas o hendiduras finas en sus bordes, que se dirigen perpendicularmente al eje longitudinal del cilindro.
g). CILINDROS GRASOS Son aquellos que incorporaron gotitas de grasa libre o bien cuerpos ovales grasos. Pueden contener slo unas pocas gotitas de grasa de diferente tamao. Si la grasa es colesterol, las gotitas sern anisotrpicas, formadas por triglicridos, no polarizan la luz. h). PSEUDOCILINDROS O CILINDROIDES.- Provienen de las partes bajas de las va urinarias y estn constituidas por moco, abundan en las inflamaciones superficiales; no tienen mucha importancia clnica, observndoseles despus de la anestesia con ter o despus de ejercicios violentos, en las enfermedades febriles y en diversos procesos irritativos del rin.
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Pseudocilindro o cuerpo cilindroide. Con forma de banda longitudinal, acaban en punta por los extremos o se disponen en filamentos. C. ELEMENTOS EXTRAOS Otras estructuras que pueden aparecer en la orina son: bacterias , hongos, cilindroides, espermatozoides, moco y grasa. a). BACTERIAS Normalmente en la orina a nivel renal y vesical no existen bacterias, pero puede contaminarse por bacterias presentes en la uretra, en la vagina o procedentes de fuentes externas. Cuando una muestra de orina fresca correctamente recolectada contiene gran nmero de bacterias, y en especial cuando esto se acompaa de muchos leucocitos, por lo general es ndice de infeccin del tracto urinario. La presencia de bacterias se informa de acuerdo a su nmero (pocas, moderada cantidad, etc.) pero en el examen de rutina no se realizan estudios para identificar el organismo exacto. Sin embargo cabe sealar que las bacterias mas frecuentes son las enterobacterias como Escherichia coli, as tambin no debemos olvidar de Gardnerella vaginalis, Neisseria gonorhoeae, entre otros. b). HONGOS Las clulas micticas son uniformes, incoloras, por lo general de forma ovoide con pared de doble refringencia. Pueden tener diferente tamao y con frecuencia muestran gemacin. A veces se las puede confundir con glbulos rojos pero, a diferencia de stos, no son solubles en cido ni lcalis y no se tien con eosina. c). ESPERMATOZOIDES Pueden existir espermatozoides en la orina masculina despus de convulsiones epilpticas, poluciones nocturnas, enfermedades de los rganos genitales y en la espermatorrea. Pueden tambin observarse en orinas de ambos sexos despus del coito. Los espermatozoides tienen cuerpo oval y cola larga, delgada y delicada. d). FILAMENTOS DE MOCO Son estructuras de forma acintada, largas, delgadas y ondulantes que pueden mostrar tenues estriaciones longitudinales. Algunos de los filamentos ms anchos pueden confundirse con cilindroides o cilindros hialinos. Los filamentos espesos tienden a incorporar leucocitos. e). CUERPOS OVALES GRASOS Y GOTITAS DE GRASA LIBRE En la orina puede existir grasa en forma de gotitas o glbulos libres, en el interior de clulas en proceso de degeneracin o necrticas (cuerpos ovales grasos) o incorporada en cilindros. Por lo comn los cuerpos ovales grasos se definen como clulas del tbulo renal que contienen gotitas de grasa altamente refringentes. Su presencia se debe a la incorporacin de grasa filtrada a travs del glomrulo en el interior de la clula o la degeneracin grasa de clulas tubulares. -64-
Los lpidos pueden aparecer en la orina tambin como gotitas de grasa libre, que con frecuencia varan de tamao por coalescencia de los glbulos. Las gotitas de grasa son altamente refringentes, de forma globular y con frecuencia de color amarillo-castao, aunque con poco aumento o con luz atenuada pueden ser negros debido a su elevado ndice de refraccin.
Inclusiones lipidicas que al ser observadas con luz polarizada muestran la caracterstica Cruz de Malta f). ARTIFICIOS Una variedad de objetos extraos pueden encontrarse en la muestra de orina durante la recoleccin, al transportarla, mientras se realiza el estudio o estando sobre el portaobjetos. g). CRITALES DE ALMIDN Aparecen con frecuencia en la orina. Tienen forma redondeada u oval, son altamente refringentes y de tamao variable. El tipo de almidn ms comn que se observa en la orina es el de maz, posiblemente porque algunas marcas de talco lo contienen. Los cristales de almidn de maz (maicena) son casi hexagonales y presentan en el centro una indentacin irregular. h). FIBRAS Las fibras de tela son sin duda, el tipo de cuerpo extrao que se observa con mayor frecuencia en la orina. Provienen de ropas, paales, papel higinico, o pueden ser hilachas del aire. Las fibras largas y planas se reconocen con facilidad, pero las cortas y aproximadamente del mismo tamao que los cilindros pueden ser confundidas con stos, incluso por algunos "expertos en el anlisis de orina". i). GOTITAS DE ACEITE Las gotitas de aceite en la orina son consecuencia de la contaminacin por lubricantes. Tienen forma esfrica y tamao variable. j). ESTRUCTURAS DIVERSAS Entre los dems tipos de material extrao que puede encontrarse en el sedimento pueden mencionarse: cabellos, fragmentos de vidrio, as como marcas o rayas en el portaobjetos, burbujas de aire, grnulos de polen y partculas de talco, por lo general formadas por silicatos; tienen, por lo tanto, formas anguladas. La orina puede estar contaminada por materia fecal, en consecuencia puede contener fibras de vegetales, fibras de msculo y hebras de tejido. Deben reconocerse estas estructuras como contaminacin fecal. k). PARSITOS
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Ocasionalmente pueden encontrarse parsitos en la orina, sea porque ocupan el tracto urinario, sea como resultado de contaminacin; el parsito que mas a menudo se observa en la orina es la Trichomonas vaginalis, Trichomonas hominis que tienen aproximadamente el mismo tamao de un leucocito grande. En el extendido mojado y sin tincin su presencia no debe informarse a menos que tenga movilidad. Pueden encontrarse huevos, larvas y en ocasiones tambin el adulto hembra del Enterobius vermicularis ("oxiuro"), quiz incluso con ms frecuencia que los que se crea. Los huevos tienen forma muy caracterstica; una de sus caras es plana y otra redondeada, a travs de su cscara transparente se puede observar, por lo general, la larva en desarrollo. El Schistosoma haematobium es un gusano trematodo que habita en las venas de la pared de la vejiga. El adulto deposita sus huevos en los capilares de la mucosa. Alrededor de los huevos se forman abscesos. En la orina pueden encontrarse huevos acompaados de hemates y leucocitos. Tambin es frecuente encontrar las levaduras Candida albicans. Todos estos parsitos son patgenos y no es normal encontrarlos en la orina.
Tricomonas. Se trata de estructuras redondas u ovaladas que disponen de cuatro flagelos en uno de los polos, generalmente mviles. Su tamao es aproximadamente 2 a 3 veces mayor que el de los leucocitos IV. Nota Presentar los resultados, discusiones, conclusiones, recomendaciones y anexos en tablas, cuadros y/o grficos, flujogramas, fotos, organizadores grficos, segn crea conveniente. Presentar las referencias bibliogrficas. En este proceso el estudiante pondr en prctica sus capacidades de comprensin, pensamiento crtico y pensamiento resolutivo. As mismo sus valores y destrezas.
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REFERENCIA BIBLIOGRAFICA 1. ANGEL, 1978. Interpretacin Diagnstico del Laboratorio Clnico. 1era Edicin. Editorial. Interamericana. Mxico D.F. 2. AIQUEL, F. 1977. Manual de Anlisis Clnico. 4ta. Edicin. Editorial. Mdica Panamericana, Argentina. 3. BALCELLS, A. 1984. La Clnica y el Laboratorio. 13ava Edicin. Editorial. Marn S.A. Barcelona. Espaa. 4. BERBARD, J. Y col. 1985. Manual de Hematologa. 3era Edicin. Editorial. Toray Messon. Espaa. 5. CARTER W. 1980. Interpretacin de Pruebas de Laboratorio. 1era Edicin. Brisbana. 6. CHESSBROUGH, M, y col. 1979. Manual de Laboratorio para Hospitales Rurales en Zonas Tropicales. 1ra Edicin. Editorial Continental S.A Mxico. 7. GUYTON, A. 1969. Fisiologa Humana. 3era Edicin. Editorial. Interamericana. S:A Mxico. 8. GUERCI, A 1985: Laboratorio: Mtodos de Anlisis Clnico y su Interpretacin. 3era Edicin. Editorial El Ateneo. Argentina. 9. INS. 2005. Manual de procedimientos de laboratorio en tcnicas bsicas de hematologa. 11. LYNCH, M. Y col 1972. Mtodos de Laboratorio. 2da Edicin. Editorial Interamericana. Mxico 12. MEDRANO, M y cols. 1975. Tcnicas de Hematologa y Laboratorio Clnico. Universidad Nacional de San Cristbal de Huamanga. Ayacucho. Per. 13. OPPENHEIM, I. 1972. Manual para Tcnicas de Laboratorio. Edit Mdica Panamericana. Argentina. 14. http://www.galenica.cl/hematologia/reticulocitos.html 15. http://www.a14.san.gva.es/lab/contajeparticulas.htm 16. http://www.farestaie.com.ar/docs/analisis/f_z/RETICULOCITOS_RECUENTO.html
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