HISTOQUMICA DE PIGMENTOS.

Los pigmentos son sustancias coloreadas de orgen muy diverso que suelen hallarse en clulas y tejidos. Estas sustancias pueden plantear interrogantes de relevancia para el diagnstico, sobretodo por la similitud de color ( pardo) que muchos de ellos comparten. Es frente a esta situacin donde cobra gran valor la diferenciacin Histoqumica.

Los pigmentos , en general los podemos clasificar como:

I) II) Pigmentos derivados del metabolismos de la Tirosina y del Triptofano: MELANINA Y CROMAFINES. Pigmentos derivados del grupo pirrlico: PORFIRINAS; HEMOGLOBINA; HEMOSIDERINA; BILIRRUBINA; HEMATOIDINA; PIGMENTO MALRICO; PIGMENTO FORMOLADO. Pigmentos lipdicos: LIPOFUCSINA ; CEROIDE. Carotenoides.

III) IV)

Otra clasificacin dice relacin con pigmentos EXGENOS y ENDGENOS. Dentro de los pigmentos EXGENOS podemos considerar a aquellos considerados como artefactos de tcnica: a base de depsitos de cristales demercurio (fijadores sublimados); pigmento formolado (formalina cida); Antracosis (carbn); tinturas de tatuaje; Pigmento malrico. Como pigmentos ENDOGENOS entenderemos a todas aquellas sustancias coloreadas presentes en los tejidos y elaboradas por el propio organismo a aprtir de materiales provenientes del catabolismo, degradacin o sntesis de diferentes elementos. Estos pueden subdividirse en 2 grandes grupos: los llamados PIGMENTOS HEMOGLOBINMICOS Y LOS NO HEMOGLOBINMICOS. En cuanto a su localizacin, los podemos clasificar como: INTRACELULARES y EXTRACELULARES.

I.-Pigmentos derivados del metabolismos de la Tirosina y del Triptofano

MELANINA:
-Son resistentes a todo tipo de solventes orgnicos (incluso piridina caliente). -No es modificada por la accin de cidos. -Si se modifica por la accin de lcalis (1 N): disuelve la matrz de los grnulos. -Es el nico pigmento que se decolora con sustancias oxidantes (pierde el color pero se mantienen los grnulos). - Reducen la Plata amoniacal a pH = 4 (tambin la lipofucsina y el pigmento de DubinJohnson). - Dan Test de SCHMORL positivo: Reducen el ferricianuro de potasio en presencia de cloruro frrico a Ferrocianuro Frrico (Azul de Prusia). Lo mismo sucede con la lipofucsina, pero es sensible para la melanina). -Forma complejos con el in Ferroso: Azul de Turnbull. -Se tie con colorantes bsicos (Azul de Toluidina). -Es PAS negativo. -No se colorea con lisocromos. Para el estudio histoqumico de la melanina tenemos 4 mtodos: 1.- MTODOS DE REDUCCIN: Schmorl Y Fontana-Masson. Recordemos que la melanina presenta capacidad reductora per se, segn su estructura. 2.-MASSON-FONTANA (1914): La Melanina es ARGENTAFN . Los cortes de tejido se incuban en una solucin de plata amoniacal a temperatura ambiente durante toda la noche en oscuridad. Luego se elimina la plata no reducida con Tiosulfato. 3.- REACCIN DE SCHMORL: La melanina es capaz de reducir el: Ferricianuro Frrico Ferrocianuro Frrico.

La melanina tambin, es capaz de formar QUELATOS con los iones Ferroso (Fe +2). 4.- REACCIN DE CAPTURA DEL IN FERROSO (Lillie, 1957). Uno de los mtodos ms sensibles para melanina. Las melaninas forman quelatos con el in ferroso presente

en el Sulfato Ferroso. Los Fe+2 quedan quelados en el pigmento = melanina ferrosa. Posteriormente se incuban los cortes con Ferricianuro de potasio , formndose el Ferricianuro Ferroso (+2), semejante al Azul de Turnbull. Como anexo, diremos que tambin resulta til la caracterizacin de clulas nvicas por medio de la reaccin de la DOPA oxidasa Cortes por congelacin y sin fijar, se incuban a 37C por 45 min a 2 hrs con DOPA (dihidroxifenilalanina) en buffer fosfato a pH 7,4. Las reas de actuividad enzimticas se observan de color pardo oscuro. Una clula melnica por mucho que no presentara pigmentacin visible, presentaba la maquinaria enzimtica para generar melanina. DECOLORACIN DE LA MELANINA: Al oxidarse este pigmento pierde su coloracin caracterstica (por ruptura del anillo fenlico con dobles enlaces). Agentes oxidantes utilizados : Perxido de Hidrgeno. Los cortes se tratan por varias horas. Tambin se utiliza el cido ascrbico, son de los ms especficos. Con el Permanganato de Potasio se utilizan cortes parafinados (los anteriores tambin) a 60C bin con energa de microondas. El inconveniente: tambin decolora otros pigmentos (no sirve para hacer diagnstico de melanina por decoloracin). Sin embargo consideremos la utilidad desde el punto de vista que la decoloracin nos permitira visualizar lo que oculta la melanina, la clula, por ejemplo (melanomas melnicos y enmascaramiento de cromgenos como el DAB utilizado en IHQ de melanomas). Otros potenciales agentes oxidantes son, elFeCl3 y el HCl
C

Figura N 1

Acmulos de histiocitos cargados de pigmento melnico (melanfagos) en dermis de piel canina (Imgen A). Del mismo modo, queratinocitos con pigmento melnico localizados en el permetro de la epidermis basal de la piel pigmentada en el perro (imagen B). En ambas muestras se aplic el mtodo de Fontana-Masson. En el recuadro (imagen C, puede verse la melanina en elestrato basal de la epidermis del perro con su color natural (marrn).

PIGMENTO CROMAFN (Reaccin cromafn).

La adrenalina, la noradrenalina y la serotonina son hormonas que se caracterizan por tener ciertos redicales qumicos similares,siendo la estructura bsica de las dos primeras un difenol que recibe la denominacin de pirocatequina y la tercera,un indol oxidado en posicin 5. La adrenalina y noradrenalina se producen en la mdulasuprarrenal e intervienen en la regulacin de la circulacin sangunea y en los mecanismos de stress. La Serotonina (5-hidroxitriptamina) esun importante mediador qumico relacionado con mecanismos alrgicos, vasodilatacin,exudacin y activacin de la reaccin inflamatoria. Estas tres hormonas pueden detectarse histoqumicamente a travs de una reaccin, la reaccin cromafn.

Serotonina

La adrenalina y la noradrenalina son sustancias reductoras que en contacto con un agente oxidante como el Dicromato de Potasio se oxidan, originando como producto de reaccin xido de Cromo e Hidrxido Potsico. El xido de Crmo es un pigmento pardo, insoluble en agua, que precipita sobre el tejido. Debido a esto ltimo, lo s tejidos que presentan estas hormonas reducen directamente el dicromato de potasio presente en fijadores como el Zenker y el Helly (fijacin y coloracin de manera simultnea). Esta reaccin se manifiestaan con posterioridad si eltejido ha sido previamente fijado con formalina (El Feocromocitoma por ejemplo se caracteriza macroscpicamente por presentar una coloracin marrn-rojiza caracterstica cuando se pone en contacto consoluciones fijadoras que contienen Dicromato de potasio.

PIGMENTOS HEMOGLOBINMICOS:

II.- Pigmentos derivados del grupo pirrlico.

HEMOGLOBINA:
-Los estudios histoqumicas, pasan por la accin Seudoperoxidsica de esta y tincin con colorantes cidos. - Es conveniente no fijar. De ser necesario conservar la morfologa, hacerlo con FormolAcetato de Plomo o bin con Formol Ferricianuro. La tcnica ms habitual es la de las peroxidasas (Bencidina). Las seudoperoxidasas son resistentes a la temperatura de proceso. IDENTIFICACIN DE FIERRO (ver hemosiderina). Por oxidacin (con Permanganato perxido de H) del in ferroso (Fe +2) presente en la hemoglobina y posterior reconocimiento con ferrocianuro de potasio que pasa a ferrocianuro Frrico (azul de Prusia).

DERIVADOS DE LA HEMOGLOBINA (HEMOGLOBINMICOS).

1.- BILIRRUBINA:
Insoluble en agua. Soluble en cloroformo; tetracloruro de carbono; lcalis. No reacciona con Fierro. No es decolorado por agentes oxidantes. Da reaccin argentafin. No se colorea con lisocromos.

Histoqumica del pigmento biliar (bilirrubina): REACCIONES DE OXIDACIN: La bilirrubina se presente de color pardoamarillento. Al oxidarla se logra su conversin a biliverdina (verdosa)

Reaccin de KUTLIK (1957): Utiliza Cloruro Frrico que en presencia de cido actico Alumbre Frrico en agua. La bilis es oxidada a biliverdina (verde) y colecianina (azul verdoso).

Reaccin de STEIN (1935): Se utiliza una solucin de Yodo. La bilirrubina se oxida a biliverdina. La reaccin de FOUCHET (1917): Utiliza Cloruro Frrico en solucin con ATC. La reaccin de Glenner (1957):Utiliza Bicromato de potasio en cortes por congelacin. Importante en chequeo previo de la coloracin caracterstica de la bilirrubina. Reaccin de GMELIN (1826): Aqu la bilirrubina presente es tratada con cido Ntrico Sulfrico concentrados. Aqu se constata una serie de espectros cromticos sufridos por la bilirrubina y sus derivados (amarillo; verde; rojo; azul; prpura). No siempre da los resultados esperados. No es permanente; Suele presentarse muy rpidamente. Culmina habitualmente con la destruccin del tejido. REACCIONES CON SALES DE DIAZONIO (tejidos cortados por congelacin y sin fijar). Segn RAIA (1965): se utilza el Di-cloro 2,4 Anilina diazotada + bilirrubina conjugada--------- azul. DEAMENT (1968): Utiliz el etil antramilato + bili conjugada ----rojo. Es ms sensible y el tejido puede fijarse. -

2.- HEMATOIDINA.
Pigmento de color caf en hemorragia e infartos antiguos. Tendra una estructura similar a la bilirrubina. Al oxidarse se colorea.

Figura N 2

Presencia de pigmento de color pardo oscuro atribuble a pigmento biliar con la H/E (imagenA) en muestra de hgado con colestasia intraheptica. La imagen B,muestra el pigmento biliar caracterizado con el mtodo de Kutlik.

3.- PIGMENTO FORMOLADO:

Pigmento de localizacin extracelular. Se debe a la accin de la formalina acidificada (pH 3-4) por tiempo prolongado en tejidos ricos en glbulos rojos. -Se elimina con el tratamiento de soluciones alcohlicas de cido pcrico soluciones alcalinas (amonaco). .No presenta in ferroso ni frrico. -No da autofluorescencia. -No presenta lpidos. - Es molecularmente similar al pigmento producido por el hematozoario de la Malaria.

4.- PIGMENTO MALRICO:

Pigmento caf de localizacin intracelular. Intracelular. No presenta reacciones de Fierro (no presenta fierro). Argentafin negativo. No es fluorescente. Insoluble en agua. Insoluble en solventes orgnicos y cidos diludos. No se tie con lisocromos.

5.- HEMOSIDERINA.
Pigmento caf de localizacin intracelular. Complejo de in Frrico unido a protena. -Micelas de Hidrxido de fierro; Ferritina y derivados de la ferritina (Fierro = 57 % del peso seco; protenas el 17% y monosacridos y lpidos). Localizacin : extra intracelular (macrfagos). No utilizar fijadores cidos (cidos diludos la disuelven). Insoluble en agua y lcalis. Soluble en cidos diludos. No presenta reaccin argentafin. No se colorean con lisocromos.

Es PAS negativo. No se decoloran frente a agentes oxidantes

En la reaccin de PERLS no se identifica la Hemosiderina como tal, sino los iones Frricos. La hemosiderina y la ferritina, liberan iones frrico (Fe +3) en presencia de un cido mineral diludo. El Fe +3, el cual, en presencia de in Ferrocianuro, forma un precipitado de color azul, el Azul de Prusia (Ferrocianuro Frrico). La ecuacin que representa la reaccin es la siguiente: HCl

3K4[Fe+2(CN)6]+ 4Fe+3 Cl3

Ferrocianuro de Potasio + in Frrico

Fe4+3 [Fe+2(CN)6]3 + 12 KCl

Ferrocianuro Frrico ( Azul de Prusia)

Formacin del Azul de Turnbull para la identificacin de Fe +2: Esta reaccin utiliza el Ferricianuro de potasio. Hay reduccin del Fierro +3 a Fierro +2 que luego se identifica con ferricianuro de Potasio, con lo que genera el Ferricianuro ferroso (+2), de color azul , similar al de Prusia, llamado azul de Turnbull. La reduccin del Fierro +3 se logra con el tratamiento del tejido con Sulfuro de Amonio, formndose el Sulfuro de Ferroso que es soluble y que se disocia en iones Ferroso y Sulfuro (gas). El Sulfuro Ferroso reacciona con el Ferricianuro de K formndose el Ferricianuro Ferroso que es una molcula compleja, insoluble.

2K3[Fe+3(CN)6] + 3Fe+2 Cl2

Ferricianuro de Potasio + in Frroso

HCl

Fe+2[Fe+3(CN)6]2 + 6KCl
Feericianuro Ferroso (Azul de Turnbull)

La reaccin ms especfica y sensible es la de Perls (Azul de Prusia): Ferrocianuro de potasio en medio cido y in Frrico (presente en la hemosiderina) ferrocianuro frrico (azul de prusia). El tratamiento de la mdula sea con descalcificadotes cidos (especialmente el cido Ntrico), elimina el Fierro por solubilizacin .

1.- PIGMENTO CEROIDE.

Grnulos de color caf, intracelulares. Se logra hallar a partir de cirrosis diettica en ratas; Anemia experimental en perros; Fstula biliar crnica; desnutricin severa en el hombre; macrfagos del ovario; musculatura digestiva en sndromes de mala absorcin (sprue); Pancreatitis crnica; Ndulos regenerativos en cirrosis.

Al parecer, el pigmento se formara por polimerizacin de cidos grasos insaturados y

se tratara de una lipofucsina en fase inicial de formacin, aunque con caractersticas propias. -Son altamente estables a los solventes orgnicos (alcohol; acetona; ter; cloroformo). -No es solubilizado por lcalis ni cidos diludos. -Presentan autofluorescencia amarillo-verde. -Se colorea con lisocromos. -No reducen al Ferricianuro (Schmorl negativo). -Reaccin cromafin negativa. -Muy cido-resistente (teidos con colorantes bsicos tipo fucsina, resisten

Figura N 3

Tejido heptico presentando hemosiderosis (Imagen A) . La hemosiderina presente en los heptocitos es puesta de manifiesto con el mtodo de Perls, en el cual el in Frrico el Ferrocianuro Frrico (Azul de Prusia) el cual se aprecia como un depsito granular difuso de color azulado (imagen B).

PIGMENTOS NO HEMOGLOBINMICOS.
PIGMENTOS LIPDICOS (LIPOPIGMENTOS)
Localizacin: Intracelular.

decoloracin con mezcla de alcohol-cido). -Reaccin Fierro negativa.

2.-LIPOFUCSINA.

El trmino de lipofucsina proviene de hecho de que en el miocardio de ancianos se aprecia pardo y flccido= atrofia fusca (caf). Su coloracin es pardo-amarillenta. Se trata de una sustancia relacionada al ceroide, pero mucho ms polimerizada que ste, mayoritariamente lipdica y no degradable (mezcla compleja de lpidos y protenas) generada a partir de lisosomas alterados (Cuerpos residuales ,siempre rodeados por una membrana). - Resistente a solventes orgnicos. - Presenta resistencia al tratamiento con lcalis concentrados. - Presenta fluorescencia caf-rojiza. - Reacciones Fierro negativas. - Test de Schmorl positiva (reducen al Ferricianuro). - Se tien con lisocromos ( Negro Sudn y Azul de Nilo). - Acido resistencia variable. - PAS positiva en fases intermedias de oxidacin (restos de hidratos de carbono).

Tanto el pigmento ceroide como de lipofucsina se les denominan pigmentos de desgaste, generndose a todas las edades y donde se acumula a lo largo del tiempo. Se pueden encontrar en hepatocitos; miocardio; neuronas; zona reticular de corteza suprarrenal; clulas intersticiales del testculo; etc.

ACTIVIDADES DIRIGIDA A LOS ALUMNOS: 1.- Investigue y obtenga imgenes que caractericen en el contexto de la histologa normal histopatologa cada uno de los pigmentos mencionados. 2.- Revise las ecuaciones que caracterizan a la reaccin del Azul de Prusia y la del Azul de Turnbull. Caracterice lo expuesto por medio de imgenes, siguiendo el protocolo histoqumico y fundamente . 3.- En relacin a la melanina: exponga la bioqumica de la sntesis de melanina y caracterice cada uno de los pasos a nivel ultraestructural. Apoye su investigacin por medio de imgenes. 4.- Realice un listado de lesiones melnicas y caractercelas conceptual y grficamente. Por qu ya no se utiliza la reaccin de la DOPA oxidasa en el diagnstico de melanomas amelnicos?. 5.- Haga resumen del metabolismo de la hemoglobina con nfasis en la sntesis. Orinte su exposicin hacia los principales grupos qumicos. 6.- Caracterice los principales eventos asociados al catabolismo de la hemoglobina, reconociendo aquellos

Figura N 4

A.- Miocardio normal teido con H/E . B.- Mtodo de Scmorl que pone de manifiesto los grnulos de lipofucsina con tonalidades oscuras ( ). C.- Pigmento de lipofucsina visualizado en miocardio con el mtodo del Sulfato Azul de Nilo (imagen C).

sitios de degradacin y caracterizando aquellos derivados de inters histoqumico. 7.- Establezca una defensa con respecto a la utilidad de caracterizar pigmento biliar en el contexto de la Histopatologa. 8.- Repase lo relacionado con el concepto de sustancia cromafn y argentafin respectivamente. Realice un listado de sustancias cromafines y argentafines. 9.- Investigue en relacin al pigmento que se presenta en la Ocronosis y en el sndrome de Dubin-Johnson.

ANEXO 1. PIGMENTOS

CARACTERSTICAS HISTOQUMICAS DE LOS PRINCIPALES PIGMENTOS

PIGMENTO FORMOLADO

COLOR Y FORMA Caf oscuro Pardo

LOCALIZACIN Extracelular Intracelular (macrfagos)

CAUSA Formol cido + hemates Plasmodium malariae.

EXTRACCIN Bouin; Soluc. Ac. Pcrico-OH Alcohol-cido (por hrs.)

MALRICO

HEMOSIDERINA MELANINA

Pardo

Intracelular (macrfagos)

Hemorragia Agentes oxidantes (permanganato; Perxido; etc)

Caf (claro-oscuro)

Intracelular(melanocitos; clula epitelial, melanforos) Intracelular

Pigmentacin normal.

LIPOFUCSINA

Pardo amarillo

BILIAR

Amarillento con H/E

Extracelular (canalculos biliares)

Oxidacin de lpidos y lipoprotenas Lisis de hemates y degradacin de la hemoglobina. Patologas que afectan drenaje normal de la bilis.

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ANEXO 2. MTODOS HISTOQUMICOS PARA PIGMENTOS

Mtodo
Color Sudan /Oil Red Reaccin de Perls Reduccin de ferrocianuro Argentafin Acido-resistencia PAS Oxidante (perxido) Stein Gmelin Fluorescencia Lipofucsina
Caf amarillento

Ceroide
Caf .amarillento

Pig. Biliar
Cafamarilento

DubinJohnson
Caf oscuro

Hemosiderina
Caf amarillento

Hemoglobi na
Caf amarillento

Ocronosis
Amarillo oscuro

Cromafin
Caf

Melanina
Amarillo oscuro- caf

Formalin a
Caf oscuro

Malrico
Caf oscuro

+ + a+
Variable

+ - a+ + + +

+ + -

+ + +

+ -

+ + -

+ + Ocasional Ocasional

+ -

+ -

+ +

+ + -

15

HISTOQUMICA DE SUSTANCIAS INORGNICAS.

Las sustancias inorgnicas en los tejidos las podemos hallar como: Sustancias propias de la clula y tejidos. Sustancias propias de algunas patologas. Depsitos por tratamiento o medicacin.

Un requisito que deben cumplir las sustancias inorgnicas para ser evidenciables es el de ser capaz de encontrarse en un estado ionizado: Ca +2; Fe +2; Fe +3; etc. Para esto ltimo deben hallarse solubles. Si no son ionizables , la nica manera de ser identificables es a travs de la microincineracin. En este apartado consideraremos tres tipos de iones relevantes, estos son: el in Calcio (Ca+2) ; El Fierro (Fe+2 y Fe+3) y el Cobre (Cu+2).

A.-CALCIO = Depsitos calcificados.

Se puede presentar como: Sales solubles (plasma sanguneo) ; Sales ligeramente solubles e Insolubles (tejidos osificados y tejido seo). La calcificacin distrfica se caracteriza por una acumulacin patolgica de sales de Calcio en tejidos necrosados degenerados. Tambin podemos encontrar depsitos localizados de sales de calcio en lesiones beniganas como es el caso de los Carcinomas papilares que presentan cuerpos de psamoma ; las microcalcificaciones mamarias ; lesiones inflamatorias de la vescula biliar y calcificacin de la media de algunas arterias (de Monckeberg). Debemos recordar que existen tumores malignos productoras de osteoide, susceptible de presentar calcificaciones (osteosarcoma). Desde el punto de vista de la Histoqumica del Calcio tenemos las siguientes reacciones: Rojo de Alizarina S ; hematoxilina; Azul de Galamina. De estas las ms conocida es la del Rojo de Alizarina S, en donde el color de la laca vara de acuerdo al pH de la reaccin y van del Anaranjado al Rojizo .

1.- Aquellas en que hay formacin de una laca:

16

-ROJO DE ALIZARINA :La Alizarina es un colorante del tipo antraquinona

sinttica. Los quelatos de Calcio se constituyen a partir de 2 molculas de Alizarina Roja S. El mecanismo de quelacin no est completamente claro. Con la alizarina (colorante aninico) podemos tener fondo. Para que el Calcio reaccione con la Alizarina debemos , primero que nada, solubilizarlo, es decir liberarlo de los depsitos insolubles por medio de un cido. Un inconveniente inherente a la solubilizacin por medio de soluciones cidas es que puede haber difusin del in y prdida del mismo. La idea es que exista la menor difusin posible y esto lo logramos manejando el pH: pH muy bajo = ms calcio liberado del depsito = reaccin ms intensa = > sensibilidad, el riesgo es tambin > difusin del in. A pH mas alto = < sensibilidad ; < color y por ende < difusin. El rango ms adecuado es de pH 4 8. Con respecto a la fijacin del tejido, algo que seguramente ya se inmaginan: no utilizar fijadores cidos. Si bin la formalina neutra se utiliza con mayor frecuencia, no es la que mejor conserva al in. Sacrificando la morfologa, sera recomendable el uso del etanol al 80% como un buen fijador. El criterio medira que: Si la cantidad de calcio es escasa, el fijador es crtico y ah me inclino, en desmedro de la morfologa por el etanol.

Con respecto a la Hematena (formada por la oxidacin de la hematoxilina), diremos que es capaz de formar lacas intensamente coloreadas con muchos metales (Al; Be; Bi; Cr; Cu; Fe; Mo; etc).

17

2.- Reacciones de Quelacin: Hay atrapamiento del Calcio a travs de una sustancia (colorante* o no) que acta como quelante.
* An, comprendiendo que en la gnesis de una laca existe quelacin del metal por parte de la molcula colorante, consideraremos al Glioxal como el principal agente quelante dentro de losmtodos de quelacin, reservndonos la oprtunidad de referirnos ms profundamente al rol de la Alizarina S en la caracterizacin de depsitos de de Calcio como laca por aspectos netamente formativos.

-Uso del Glioxal (GBHA) : es uno de los mtodo ms sensibles. Recomendable para
la identificacin de pequeas cantidades de depsitos de Calcio. No se trata de un colorante. Forma quelatos con diversos metales aparte del calcio (Estroncio; Bario; Nquel; Cadmio). El quelato obtenido a partir del Glioxal con el Calcio es de color rojo-anaranjado (semejante al de la Alizarina). Tcnica sensible pero compleja. Se debe trabajar con soluciones que no presentes trazas de calcio. El tratamiento de la muestra es, ya sea por: Congelacinsustitucin (con alcoholes) Congelacin-desecacin inclusin en parafina; cortes de 7 micras y montaje sin adhesivo. Secado a 40C. La reaccin con GBHA puede darse en depsitos compactos y otras en donde el calcio se hallaba soluble. Las soluciones se depositan sobre el tejido parafinado y se dejan ah hasta la desecacin, luego se desparafinan los cortes y se puede contrastar el fondo. Los resultados son magnficos. Para grandes cantidades me inclinara por mtodos como Von Kossa o Rojo de Alizarina.

18

3.- Reacciones de Sustitucin:

Se utilizan sales de plata (Nitrato de Plata) ,

en donde la plata sustituye al in calcio (o cualquier in metlico) en las sales y posteriormente se reduce a plata metlica (Ag o) en presencia de luz solar. El mtodo aplicado es el de

Von Kossa (VK). Es una reaccin Argirfila basada en la

reduccin de sales de plata, formndose un Carbonato de plata. El mtodo de VK lo que est demostrando en s, son los fosfatos y carbonatos no el Ca+2. Es una tcnica sencilla.

Con Carbonatos: Ca CO3 + 2Ag+ Con Fosfatos: Ca (PO4)2 + 6 Ag

Ag2 CO3 +

Ca +2

2 Ag3 PO4 + 3 Ca+2

B.- COBRE.
Este in es escaso en nuestro organismo, pero es posible hallarlo como depsito txico en el hgado y Sistema Nervioso (por acumulacin) en personas que sufren la enfermedad

Figura N 5

Nucleos de calcificacin tisular vistos con el mtodo de Von Kossa (imagen A) y con el de la Alizarina Roja (Imagen B).

19

de Wilson. Es una enfermedad poco frecuente. En arcnidos y moluscos existen

molculas transportadoras de oxgeno que presentan cobre. La cantidad de cobre que requerimos es escasa y el cobre es transportado por la ceruloplasmina, molcula srica encargada de su transporte (el 95% de ste) Los pacientes portadores del mal de Wilson presentan un defecto en el gen codificante de la ceruloplasmina, en el brazo largo del cromosoma 13 (autonmica recesiva). En estos pacientes se manifiesta una hepatitis crnica con fibrosis y destruccin del parnquima (necrosis). Un mtodo utilizado es el del Acido Rubenico (Ditiooxamina), cuya especificidad es relativa ( sensibilidad < 15%). En esta reaccin existe quelacin del Cobre por medio del cido Rubenico formndose un polmero que adquiere un color tpicamente verdoso. El tratamiento de la enfermedad en estos pacientes es slo paliativo , con la administracin de agentes quelantes como el Zinc que atrapa cobre.

Hgado con depsitos patolgicos de Cobre en paciente con enfermedad de Wilson, puestos de manifiesto con el mtodo de la Rodanina. La coloracin se manifiestas como pequeas granulaciones pardo-anaranjadas en el citoplasma de los hepatocitos.

Figura N 6

5-(4-dimetilaminobecilideno)- Rodanina

20 El cobre en la enfermedad de Wilson se acumula en el hgado en forma difusa a nivel del citosol, formando complejos lisosmicos insolubles unidos a una protena especfica, la metalotionena. La sensibilidad y selectividad de las pruebas histoqumicas es variable. El cobre lisosmico puede detectarse por medio del mtodo de la Orcena de Shikata que colorea la protena en exceso , que se encuentra asociada al metal y generalmente es positiva en lesiones de larga data. El mtodo de la Rodanina suele ser reconocido como el mtodo que presenta lamayor sensibilidad. Se considera que la Ronanina colorea directamente el cobre que se encuentra unido a la Tionena en estados tempranos de la enfermedad.

ACTIVIDADES A DESARROLLAR POR EL ALUMNO. 1.- Realice un listado de lesiones (tanto benignas como malignas) que con mayor frecuencia presentan fenmenos de calcificacin. 2.- Revise el concepto de osteoide y averigue que lesiones pueden formarlo. 3.- Caracterice por medio de imgenes microscpicas los fenmenos anteriormente mencionados. Agregue imgenes de los principales mtodos mencionados. 4.- Realice un cuadro con los signos caractersticos de la Enfermedad de Wilson y respalde lo anterior con 2 signos clsicos de la enfermedad (imgenes).

21
MTODOS DE ESTUDIO IN SITU

REQUISITO FUNDAMENTAL: INES SOLUBLES.

-Propias de clulas y tejidos. -propias de algunas patologas. -Depsitos por tratamiento o medicacin.

Formacin de LACAS : Rojo de Alizarina S; Hematoxilinas.

IN CALCIO

(Ca

+2:

Reacciones de QUELACIN: Con atrapamiento de Ca +2 por una sustancia, ya Sea este, un Colorante u otra sustancia. Uso del GLIOXAL (GBHA) , quelato de color rojo-anaranjado

Reaccin de SUSTITUCIN (Argirfila) utilizando Sales de Plata, en donde la plata sustituye al Ca +2 en sales insolubles (carbonatos; fosfatos) y posterior reduccin a Plata metlica (Ag0) en presencia de luz solar. Mtodo de Von Kossa.
(FERROCIANURO FRRICO) ; (FERRICIANURO FERROSO)

IN Frrico (Fe+3); IN Ferroso (Fe+2) :

IN Cobre (Cu+2):

Azul de Prusia ; Azul de Turnbull.

Mtodo de Quelacin con Ditiooxamina (Acido Rubenico). Baja sensibilidad (15 %) con la formacin de un polmero de color verdoso.Otro mtodo es el de la Rodanina (dimetilaminobencilideno) y el de la Orcena de Shikata.

22
MTODOS DE ESTUDIO IN SITU

Reacciones de Oxidacin:
-Kutlik : FeCl3 + Ac. Actico -Stein: Yodo biliverdina. biliverdina.

- BILIRRUBINA(Pigmento biliar):

-Gmelin : HNO3/H2SO4

Arcoiris no permanente.

Reacciones con Sales de Diazonio:

Por congelacin y sin fijar.

(Derivados de la Hb)

- HEMATOIDINA: Con estructura similar a la bilirrubina. Al oxidarla

HEMOGLOBINMICOS

es posible colorearla. Presente en hemorragias e infartos. PIGMENTO FORMOLADO: Extraccin con una solucin OH de Ac. Pcrico.

Es decir, derivados del metabolismo de la hemoglobina (Pirrol y Porfirnicos).

- PIGMENTO

MALRICO:

No presenta Fierro en su molcula.Negativo para todo.

- HEMOGLOBINA:

-Oxidacin del Fierro con KMnO4 H2O2 a Fe+3. -Reaccin seudoperoxidsica y colorantes cidos.

- HEMOSIDERINA:

a) Perls (Azul de Prusia), cido mineral diludo + FerroCN +3 (Fe + Protena) = Ferroc. FRRICO (Azul de Prusia). b) Azul de Turnbull: Fe+2 + FerriCNFERROSO (Fe+3 Se reduce con
Sulfuro de Amonio).

23

-CEROIDE:

Lisocromo(+); Fluorescencia(+):amarillo-verde.

LIPDICOS:
(lipopigmentos)

-LIPOFUCSINA: PIGMENTOS
NO HEMOGLOBINMICOS

Lisocromo(+);Schmorl(+) Fluorescencia(+): caf-rojiza. PAS (+). Derivados de la vitamina A.

CAROTENOIDES:

Mtodos de REDUCCIN : -Schmorl (FerriCN FerroCN) - Fontana-Masson (Argentfin) Formacin de QUELATOS: -Quelatos con Fe+2 a partir de Sulfato Ferroso, luego: FERRICN de K FERRICN Fe+2 .

MELANINA:
Pigmento derivado del metabolismo de la Tirosina y el triptofano

- Reaccin -

de la DOPA oxidasa (Congelacin; 37C; pH 7,4)

DECOLORACIN:con H2O2; KMnO4; Ac. Ascrbico. Utilidad en ICQ.

24

HISTOQUMICA DE ENZIMAS.
Las enzimas podemos considerarlas como biocatalizadores orgnicos. Que las diferencia de aquellos inorgnicos?. El que sn eficientes y especficos. Eficientes en el sentido, de que las cantidades que actan son del orden de los micromoles y dentro de la especificidad, existe una relativa y otra absoluta (una enzima, un sustrato). Adems, las enzimas presentan capacidad de regulacin, todo depender de la va metablica donde sta se encuentre. Las enzimas presentan una subunidad cataltica y otra regulatoria. En histoqumica nos interesamos en, ya sea, su localizacin o bin, actividad. Otras veces, los dos aspectos a la vez. La inmunohistoqumica nos aporta bastante informacin en cuanto a la enzima como protena antignica. (generamos anticuerpos anti- enzima). A partir de esta informacin , no podemos obtener informacin de su actividad, slo su localizacin. En la histoqumica de enzimas, nosotros detectamos la actividad de la enzima, agregndole su sustrato y ese sustrato por accin enzimtica puede sufrir hidrlisis; reduccin; oxidacin y se obtiene un producto.

Las reacciones enzimticas pueden representarse a traves de las siguientes euaciones tipo:

25 Es de gran importancia que el producto final coloreado se forme rapidamente, sin difusin del mismo, ya que representa fielmente actividad y localizacin. Para que esto ocurra, la concentracin del agente capturante en la mezcla de incubacin debe ser la suficiente y correcta para esa reaccin enzimtica (si es mucha, el agente capturante puede inhibir a la enzima y unirse inespecficamente a grupos aninicos del tejido; si no es la suficiente: parte del producto de reaccin primario (PPR) sin reaccionar, puede unirse a otras estructuras del tejido y dar reaccin inespecfica). La reaccin A es la ms eficiente: El producto final de la reaccin (PFR) es insoluble y colororeado. Debe ser altamente insoluble (la mayora de las veces en agua, pero soluble en solventes orgnicos). En la reaccin B, la localizacin suele ser deficiente por difusin de los productos, es ms larga. La reaccin C es la de mayor especificidad, ya que presenta menor nmero de pasos, pero no siempre es factible de realizar. En microscopa electrnica se suele aplicar este tipo de reaccin, ya que es la ms fidedigna de localizacin.Este tipo de reacciones es caracterstica de xido reductasas. En ella el sustrato es soluble e incoloro cuando se halla oxidado e insoluble y coloreado en estado reducido. Se trata de una reaccin sencilla que da buena localizacin.

PREPARACIN DEL TEJIDO PARA HISTOQUMICA ENZIMTICA.

Antes de realizar la reaccin enzimtica en clulas y/o tejidos debemos preparar el material de estudio.La intencin siempre va dirigida a: Mantener la localizacin de la enzima. Conservar la actividad de la enzima.

Con la intencin de conseguir la localizacin, podemos sacrificar la actividad de la enzima. La fijacin qumica representa una oportunidad para desnaturalizar la enzima que queremos chequear. La temperatura; el pH y el tipo de fijador, son variables que debemos considerar estrictamente en histoqumica de enzimas. Muchas de las enzimas que deseamos estudiar son solubles, por lo que la fijacin contribuye directamente a la insolubilizacin de las mismas. Tambin nos interesa contar con una buena morfologa. Es decir, sacrificamos actividad por localizacin.

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EN HISTOQUMICA SE DETECTA LA ACTIVIDAD ENZIMATICA! Importante: PRESERVAR LA ENZIMA; INMOVILIZARLA E INMOVILIZAR EL PRODUCTO OBTENIDO POR LA ENZIMA. FIJACIN. No todas las enzimas resisten la fijacin qumica de los tejidos (la desnaturalizacin , junto con alterar la estructura III y IV, modificara estructuralmente el sitio activo de la enzima). Para estudios de enzimas oxidativas, por ejemplo, utilizar tiempos cortos de fijacin y trabajar a baja temperatura es prioritario. Hay enzimas que si resisten la fijacin bastante bin (tiempos ms prolongados y en fro). Todas las fijaciones que se hagan con enzimas, ya sea por tiempos largos o cortos se realizan en fro. Podemos resumir, con respecto a los objetivos de la fijacin en Histoqumica enzimtica, que son la de: Conservar morfologa. Insolubilizar a la enzima. Aumentar la permeabilidad de la clula.

La fijacin permite hacer permeable la clula a los productos presentes en la mezcla de incubacin (sobretodo en clulas enteras). MTODOS PARA LA CONSERVACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA: 1.- Congelacin-Desecacin. 2.- Tejido sin fijar; corte por congelacin; fijacin post-corte y post-reaccin. 3.-Breve fijacin previo al corte por congelacin. 4.- Enzimas que resisten fijacin y congelacin. Se deben elegir bien los fijadores a utilizar y cuidar los procedimientos posteriores. El Formaldehdo neutralizado; Alcohol Acetona. Las fijaciones siempre a baja temperatura (4 C).

27 En el caso de enzimas que resisten la inclusin, utilizar parafinas con pto. de fusin entre 50-52C, por tiempo breve, cuidando la temperatura. El Glutaraldehdo se utiliza SLO en algunos casos. Algunos de los protocolos consideran: -Fijar el tejido a 4C por tiempos que van de las 2 a 6 horas. -Cortar el tejido en fresco y despus postfijar 10 min en acetona fra (la ms utilizada) Formaldehdo neutro por 15 min. TIPOS DE ALTERACIONES PRESENTES EN TEJIDOS SIN FIJAR INJURIA CAUSA EFECTO SOLUCIN ANOXIA Privacin del aporte sanguneo (Oxgeno) -Congelacin y Deshielo. -Almacenamiento a T ambiente. -Sobrecalentamiento de cortes durante el secado. OSMTICA Dao mitocondrial Extraccin y congelacin inmediata del tejido.

-Prdida de factores -Conservar idealmente a-70C; solubles (cofactores) 20C. -Reduccin de la actividad enzimtica. -Prdida de la actividad enzimtica -Conservar cortes de cristato a -20C-Guardar cortes, mientras se secan a 4C (hmedo). soluciones

TRMICA

Tumefaccin mitocondrial: -Prdida de enzimas -Proteccin con Aumento de la permeabilidad. solubles y cofactores hiperosmticas.

SIEMPRE QUE SE FIJA UN TEJIDO PARA ESTUDIO ENZIMTICO, UNO DEBE CONSIDERAR LA PRDIDA DE ACTIVIDAD ENZIMTICA, LO QUE ES MS O MENOS CONSIDERABLE SEGN LA ENZIMA A ESTUDIAR.

CLASIFICACIN DE LAS ENZIMAS .Segn la reaccin qumica que realizan.

A.- OXIDO-REDUCTASAS: Catalizan reacciones en donde existe transferencia de electrones (xido-reduccin).Ejps: Dehidrogenasas ; Peroxidasas. B.- TRANFERASAS: Catalizan reacciones en las que hay transferencia de grupos qumicos (radicales completos). Estos pueden ser grupos metilos ; monosacridos; Fosfatos.

28 C.- HIDROLASAS: Rompen uniones agregando una molcula de agua (hidrolizan uniones). Se pueden romper enlaces C-O ; C-C; C-N; C-O-PO3; C-S. Enlaces ster; glicosdicos; Peptdicos. D.- LIASAS: Rompen los mismos tipos de enlaces anteriores pero por un mecanismo diferente (adicionando grupos a dobles enlaces). Ejp. Piruvato descarboxilasa. E.- ISOMERASAS: Rompen un enlace pero a su vez, generan otro (transfieren grupos qumicos dentro de una misma molcula). Participan en fenmenos de epimerizacin e isomera geomtrica (cis; trans). F.- LIGASAS: Se forman enlaces dependientes de la presencia de ATP. Formacin de enlaces C-N; C-O; C-S; C-C en reacciones de condensacin asociadas a la degradacin de ATP. Ejp. Tirosil ARNt sintetasa.

En relacin a los COFACTORES, Estos pueden ser ORGNICOS (coenzimas) o bin , INORGNICOS (activadores). Las coenzimas en general son derivados de Vitaminas (NAD; FAD; NADP). Los activadores son metales bivalentes como el Mg+2; K+; Fe+2; F+3; Na+, etc. La protena sola es llamada APOENZIMA, con su co-factor, es decir la protena cataltica: HOLOENZIMA. Existen enzimas que siempre se encuentran asociadas a su cofactor (Ez-FAD).La manera en que ejercen su accin los cofactores es: -

Formando un complejo que le otorga a la enzima una conformacin pticamente activa. En el caso de los cofactores inorgnicos, se establece un puente de coordinacin entre el sustrato y la enzima. Sirven como aceptores de electrones algn grupo qumico proveniente del sustrato y de este modo transferirlo a otros grupos que sern el producto final.

En relacin al SITIO ACTIVO DE LA ENZIMA, diremos: Que est constitudo por aminocidos y stos pueden ser: -Esenciales: Al extraerse no producen alteracin en la actividad de la enzima.

29 -Estructurales: Otorgan un microambientepara que se lleve a cabo la reaccin. -Residuos catalticos: Atacan al grupo especfico

I.- HIDROLASAS. Fosfatasas:

Hidrolizan enlaces Fosfo-monosteres; Fosfo-disteres; Piro-fosfatos o

bin, Fosfamida. Fosfatasas especficas: De acuerdo al producto que forman se identifican. Fosfatasas inespecficas (relativas): Se diferencian por el pH al cual actan. Fosfatasas alcalinas: 8,3 9,4 Fosfatasas cidas : 4,5 5,5 Las especficas pueden ser alcalinas como: 5nucleotidasa ; ATP asa a pH 7,2 y sus sustrato especfico es ATP ; Tiaminopirofosfatasa ; Glucosa 6 Fosfatasa; Ribonucleasa bin , cidas inespecficas que catalizan uniones steres entre cidos carboxlicos y una variedad de alcoholes y fenoles (familia de las esterasas, colinesterasas, lipasas, etc).

Las Fosfatasas catalizan la hidrlisis de steres y amidas de cido Fosfrico. I.-FOSFATASA ALCALINA
pH ptimo : 8,8 9,4 Activadores: Mg+2; Mn+2; Zn+2 Inhibidores: EDTA; L-Cistena; Levamisol (ms utilizado); Tetramisol. No se inhiben todas, pero s, la mayora. Localizacin (controles +) : TCP del rin; endotelio de arterias; Chapa estrada intestinal; etc. Pretratamiento del tejido: -Fijacin en OH absoluto a 4C por 18 hrs e inclusin en parafina (1 hora) -Fijacin en Formol neutro 2 4 hrs / 4C (cortes por congelacin) -Formol-Calcio de Baker (Formol neutro + Cloruro de Calcio al 1%) 2 4 hrs. A 4C.

30 Tejido sin fijar se corta en cristato. Tejido sin fijar se monta en portaobjeto y se deja secar por 15 min, luego se fija con acetona fra por 10 min. Tambin se puede utilizar Formalina al 10% por 15 min. La actividad ms efectiva se logra cuando aplicamos congelacin-desecacin congelacin-sustitucin (difcil).

MTODOS DE CAPTURA O COPULACIN SIMULTNEA.

I.- MTODOS QUE UTILIZAN SALES METLICAS Muy utilizado y barato, no siendo el mejor.

Mtodo de Gomori (Modificado en 1952).

Substrato : B-Glicerofosfato; fenilfosfato Naftilfosfato de Sodio Aceptor (Capturador): Ca+2 Producto de la reaccin: SCo (Sulfuro de cobalto) El tejido (Rin en este caso) puede ser fijado en alcohol absoluto por 18 horas a 4C bin en Formol Calcio de Baker por 2 horas.

Se puede utilizar in Magnesio (Mg+2) Manganeso (Mn+2) al 5x10 elevado a la -3 como cofactor. De igual manera Acido Ascrbico al 0,01 M y sales biliares. El pH, sobre 9,2 tiene un mejor rendimiento del pp del Fosfato de Calcio. A pH 8 8,5 se disuelve el Fosfato de Calcio. Bajo pH 9 se obtiene un producto ms soluble (el producto de la enzima con el agente capturante).

31 La reaccin puede ser inhibida por Cistena (Cis); Fenilalanina )Fenil-Ala; Adrenalina. Especificidad: La hemosiderina, tambin da la reaccin y tambin reaccionan los grupos Fosfatos del ADN pero, es posible diferenciarlos (Hemosiderina con Pearls y la reaccin de los Fosfatos del ADN se solubilizan con Tampn Citrato 0,1 M a pH 5. Tambin podra agregarse ms Glicerofosfato).

DIFICULTADES DEL MTODO: Hay difusin de la actividad de la enzima (cuidar el tiempo. Tiempos largos facilitan la difusin) Difusin del Fosfato por lenta unin al Calcio (cuidar la concentracin del Calcio: unin debe ser rpida, sin difusin y que el Calcio no inhiba a la enzima). Si hay poco Calcio, habr difusin del Fosfato, unin lenta al calcio y unin del Fosfato a grupos con carga positiva (+), obtenindose inespecificidad. Disolucin del Fosfato de Ca a pH < 8,5 .

Es una tcnica que la mayora de las veces anda bin, siempre y cuando se controlen las variables (37C).

II.- Tcnica de Burnstone (1958).

MTODOS QUE UTILIZAN SALES DE DIAZONIO CON LA FORMACIN DE UN COLORANTE AZOICO. La ventaja de sta tcnica es que se realiza en un solo paso; es sensible y bastante especfica. Eso s, es cara. Antes de Burnstone se utilizaba Alfa-Naftil Fosfato de la manera siguiente:

Enzima

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Se da en tiempos muy cortos (es una reaccin simultnea), no se necesitan controles ya que los Naftoles no existen en la clula animal. El colorante azoico formado, es bastante ms insoluble que los Fosfatos de Calcio y son tambin mejor medidos por citofotometra. Con la azo-copulacin, se puede trabajar a pHs no tan alcalinos (pH 8 8,5 y no se destruye tanto el tejido) . El mtodo de la Alfa Naftil Fosfato en presencia de Fosfatasa alcalina a pH 8 es ms adecuado para que se produzca la copulacin del Naftol y la Sal de Diazonio . Tiempo de copulacin: Muy rpido y poco controlable. Burnstone, utiliza Naftoles Sustitudos (bun mtodo).

I)

NAFTOL AS-MX ( Un Beta Naftol que tiene sustituda una amida con metilos).

II)

NAFTOL AS-TR

33 I) NAFTOL AS-BI

La copulacin es del orden de segundos (ms controlada); presentando los Naftoles una vida media mayor que los Alfa Beta Naftil. La copulacin se halla favorecida por el pH alcalino. Existe otro mtodo en el que se utilizan Sales de Tetrazolium, y no es muy utilizado en Histoqumica de Fosfatasas Alcalinas . Se utilizan ms en IHQ e HIS. El hallazgo de que a partir del uso de Naftoles Fosfato substitudos del tipo AS permitian la obtencin de productos fluorescentes, permiti una aproximacin distinta y ms efectiva a la visualizacin y localizacin de la histoqumica enzimtica por fluorescencia,lo cual permita la deteccin , an cuando los niveles de actividad fueran muy bajos. Esto ltimo presentaba un solo inconveniente, la difusin del producto. Esto se solucion parcialmente a partir del uso de los Naftoles Fosfato AS-BI o AS-MX y el Fast Red, los cuales hacan posible obtener un producto final fluorescente de color rojo relativamente bin localizado. Los problemas con la difusin de los productos de reaccin enzimtica se mantuvieron debido a que la mayora de los substratos enzimticos y los productos incoloros de hidrlisis que deban copular con una Sal u otro medio de captura para generar un producto fluorescente eran solubles. En sntesis, la resolucin se vea comprometida por la difusin de los productos de reaccin lejos del sitio de la actividad enzimtica antes de precipitar como una sustancia coloreada e insoluble. La tcnica histoqumica basada en compuestos fluorescentes, idealmente deban proporcionar especificidad, buena localizacin y fotoestabilidad. Esto se resolvi utilizando substratos fluorognicos, uno de estos fu el 2-(5-cloro-2-fosforiloxifenil)-6cloro4(3H)quinazolinona ,conocido como ELF-97 fosfato , el que al liberarse del substrato forma un precipitado fluorescente verde amarillento brillante en el sitio de laactividad enzimtica, el cual es visible a la microscopa de florescencia (ver Figura N7).

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II.-FOSFATASAS CIDAS:
El pH al cual trabajan se sita entre 5 a 5,5. Fijar el rin con Alcohol Absoluto a 4C x 18 hrs. Fijar Intestino Delgado en Acetona anhidra a 4 C por 18 hrs. y luego inclusin en parafina.

Tcnica de Gomori por Captura de Metal.

Es el ms utilizado ya que el pH no facilita la copulacin con sales de Diazonio. La reaccin se puede resumir del la siguiente manera:

La reaccin se da en menos etapas y la localizacin de la enzima suele ser ms exacta.

Figura N 7

A*: Sublnea de clulas HeLa en las que se caracteriz a nivel de la ME la ctividad de Fosfatasa Alcalina. Se utiliz BetaGlicerofosfato al 1,5 % en Buffer TRIS 0,2 M a pH 9 como substrato + Nitrato de Pb. Como inhibidor especfico se utiliz Fenilalanina o Homoarginina.Los cortes ,posteriormente fueron includos en Epon y cortados en ultramicrtomo. La actividad enzimtica se verific principalmente a nivel de la membrana plasmtica y lisosomas. B** : Localizacin de actividad enzimtica de Fosfatasa Alcalina endgena en cortes de cristato obtenidos a partir de Intestino de pez cebra por medio de : ELF-97 (E) ; Fast Blue (C); Fast Red (F); BCI/NBT (D). Los controles negativos se obtuvieron por inhibicin con L-Fenilalanina . Para la obtencin de colorantes azoicos como producto final de la reaccin, se utiliz el Naftol Fosfato AS-MX como substrato . * Chi Wei,L et Al. Plasma membrane localization of Alkaline Phosphatase in HeLa cells. J.Histochem & Cytochem. October ,1975 ** Cox,W& Singer,V. A High resolution , fluorescence-based method for localization of endogenous Alkaline Phosphatase activity. . J.Histochem & Cytochem. Vol 47 (11):1443-1455, 1999.

35 Con ste mtodo, al igual que con las alcalinas, utilizaremos siempre el anin Fosfato, la diferencia es que no lo uniremos al Calcio (el Fosfato de Ca es soluble a este pH), utilizaremos una Sal de plomo (varias pueden ser): El anin Fosfato + sal de Plomo = Fosfato cido de plomo, insoluble e incoloro. Fosfato de Pb + Sulfuro de Amonio = Sulfuro de Pb (negro e insoluble en agua y adems en solventes orgnicos).

OJO: Las clulas del Sistema Nervioso presentan metalofilia (Falsos positivos). Si bin el rendimiento de las Sales de Diazonio es inferior con respecto a las Alcalinas, en algo se soluciona este problema utilizando Naftoles Sustitudos (con grupos metilos), lo que los hace ms insolubles que el Alfa- Naftol y ms reactivos tambin. Hay distintos Naftoles sustitudos, los ms conocidos y aplicados son el Naftol AS-MX y el Naftol AS-TR. Al ser ms insolubles, debemos solubilizarlos con Dimetilformamida (DMF). La copulacin ser ms lenta, por lo tanto el tiempo de incubacin ser ms largo (con respecto al Alfa Naftol, en las Fosfatasas Alcalinas) ,sin observarse desplazamientos. Debido a los sustituyentes que presenta, existe mayor afinidad con las protenas y se desplazar menos.

Figura N 8

A.- Actividad de Fosfatasa cida en mucosa intestinal de rata, visualizada en muestras fijadas en Glutaraldehdo y cortadas en cristato por medio de BetaGlicerofosfato de Sodio a pH 5,0, utilizando captura por metal. Vease en A, que la actividad enzimtica (negro) se halla localizada principalmente a nivel la membrana apical del epitelio. B.- Cortes congelados de glndula prosttica humana. Que pnen de manifiesto laactividad de la Fosfatasa cida La mxima intensidad de la reaccin se localiza principalmente a nivel de la membrana apical de las glndulas (Mtodo del DiCloroAlfa-Naftol + DiazoBlue B = Azocopulacin)**.
* Serrano,J. The cytochemical demostration of prostatic acid phosphatase using a new substrate, phosphorylcholine. J.Histochem & Cytochem. May, 1976 ** Gomori,G. Histochemical Methods for Acid Phosphatase.

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Los Naftoles sustitudos son ms estables a pH cidos, debido a que presentan grupos sustituyentes y toleran incubaciones ms prolongadas debido a su escasa solubilidad. Gomori sugiere aumentar la concentracin del Glicerofosfato de 0,005 M a 0,14 M y el Nitrato de Pb de 0,037 M a 0,08 M. Mejores resultados se dan, cuando el sustrato est en relacin 6:1. El producto final ser insoluble; visible y cuantificable.

Respecto a las MEZCLAS INCUBADORAS.

El Sustrato debe hallarse en condiciones de saturacin con el fin de mantener la velocidad mxima de la enzima. Debe utilizarse el Tampn adecuado , ajustando el pH ptimo a la cual la enzima trabaja (los pH van desde cidos como el de las Fosf. Acidas = 5; neutros como el de las oxidasas = 7,2 bien alcalinos como el la Fosf. Alcalina = 8,5 9 ). El tipo de tampn va a depender del pH utilizado, con las Fosfatasas no es conveniente utilizar Buffer Fosfato; utilizamos Acetato Brax.. Con enzimas oxidativas, las coenzimas presentes en el tejido son escasas. Las reacciones de la Deshidrogenasa quitan hidrgenos al sustrato , los que son capturados por la

coenzima y de ah al aceptor artificial de nuestra eleccin . Tambin necesitamos agregar activadores como Mg+2 Mn+2, los ms utilizados: sto
depender de la enzima. La mezcla debe considerar un agente capturador capturante, pudiendo ser este un metal un compuestos reducibles como lo son las sales de Tetrazolium u oxidable como la DAB. La concentracin es crtica, no debe inhibir a la enzima.

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Respecto a los CONTROLES:

Controles negativos se pueden realizar: Por supresin del sustrato en la mezcla incubadora. Si no hay sustrato, la enzima no se manifestar y lo que podemos observar como reaccin, no ser proveniente especficamente de la actividad de la enzima que estamos estudiando. Utilizando inhibidores especficos. Una misma familia de enzimas suele inhibirse con el mismo inhibidor (Fosfatasas alcalinas con Levamisol; otras con cistena, etc).

Desnaturalizacin por calor. Si calentamos por 10 min en agua hirviendo el

corte trozo delgado de tejido fresco, inhibiremos todas las enzimas.

En el caso de las enzimas oxidativas, estas no se trabajan en cortes por congelacin, ya que el CO2 las inhibe (cuando se utilizaba micrtomo de congelacin), es recomendable trabajar en cortes obtenidos a partir de cristato.

II.- OXIDO REDUCTASAS.

SH2 + A

Enzima

S +

AH2

El substrato reducido es oxidado por la enzima, reduciendo al aceptor.

Con respecto a las enzimas oxidativas, diremos que para su estudio es crtico el tiempo que el tejido permanece en hipoxia. La fijacin inactiva a la enzima (cuidado con el desplazamiento) ; la morfologa tambin ser deficiente. Una vez obtenida la muestra, esta debe ser congelada rpidamente. Los cortes tambin deben ser mantenidos en fro. Si congelamos, debemos asegurarnos de que no haya descongelacin (se pierden cofactores solubles). Entonces congelamos, guardamos a -20C (hasta 7 das), ideal a -80C con Isopentano (hasta 1 mes). Por factores osmticos, puede existir aumento de la permeabilidad mitocondrial, con fuga de cofactores coenzimas (NAD; NADP; FAD), para evitar esto ltimo se agregan

agentes protectores como la PVP (polivinilpirrolidona) o la Sucrosa (Sacarosa) al

0,88 M, medios considerados como hiperosmticos.

38 DE ACUERDO AL ACEPTOR, LAS ENZIMAS LAS PODEMOS DIVIDIR EN 3 GRUPOS: a) OXIDASAS: Las hallamos en gral. en la cadena respiratoria (mitocondria). EL ACEPTOR ES ESPECFICO, EL OXGENO.

SH2 +

O2

Oxidasa

S +

H2 O

Estos complejos enzimticos se encuentran en el espesor de la membrana mitocondrial. Estan ordenados de acuerdo a su potencial de accin. En la catlisis participa oxgeno. Aquellos con potencial ms negativo se hallarn al comienzo de la cadena (-0,320 volt) La citocromo oxidasa se compone de 2 grupos Heme y 2 atomos de Cobre (Cu).

LAS SALES DE TETRAZOLIUM utilizadas como aceptores artificiales (para identificar cada complejo) se seleccionan de acuerdo a las diferencias de potencial adecuados, que le otorgan especificidad. b)

PEROXIDASAS:.

-Citocromo C peroxidasas: (oxidan al citocromo C en presencia de perxido de Hidrgeno). -Catalasas: transforman el perxido de Hidrgeno en agua + oxgeno. -Peroxidasas: diversas que corresponden a las verdo-peroxidasas.
Deshidrogenasa

SH2 +

H2O2

S +

2H2 O

Seudoperoxidasas: la hemoglobina da la reaccin (descompone el perxido de hidrgeno a Agua + oxgeno). La reaccin ms antigua conocida es la de ADLER (1904). Trabaj con Benzidina en presencia de perxido de hidrgeno.

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El incoveniente: Soluble en alcohol; Benzol; Tolueno , virando de azul a caf pardo (poco visible). Se utiliza Nitroprusiato de Sodio como un estabilizante. La citoqumica de las peroxidasas son utilizadas como marcadors para diferenciar ciertas entidades patolgicas. La lnea blanca presenta gran cantidad de peroxisomas.

Ejp: Diferenciar leucemias Mieloblsticas de Linfoblsticas: Neutrfilos (+); Eosinfilos (+); Mieelocitos (+); Lnfocitos (-).
c)

DESHIDROGENASAS ANAERBICAS.
Deshidrogenasas que participan en el Ciclo de Krebs.

Existe una gran familia de

EL ACEPTOR NUNCA ES OXGENO, sino NAD; NADP; FAD (Coenzimas).

Deshidrogenasa

SH2 +

A H2

El sustrato es especfico (Deh. Lctica/Ac. Lctico; Deh. Succnica/ Succinato Ac Succnico; etc) EL SUSTRATO SE OXIDA, LA COENZIMA SE REDUCE

40 Recordemos que el FAD se halla unido covalentemente a la enzima (grupo prosttico), por lo que no requiere que la agreguemos a la solucin de incubacin. Distinto es el caso de NAD y NADP, el que puede difundir y bajar su concentracin en la clula.

Succino Dehidrogenasa: Normalmente la accin de esta enzima se acompaa de la

reduccin de su coenzima (FAD) y posteriormente el FAD cde su protn a la cadena respiratoria.

Receptores o aceptores artificiales de protones (sustancias con potenciales de

reduccin similares a la del FAD: Azul de Metileno ; Sales de Tetrazolium).

SAL DE TETRAZOLIUM

FORMAZAN

Compuesto soluble y dbilemnte coloreado

Compuesto insoluble , fuertemnte coloreado e insoluble en lpidos

El potencial redox debe ser el adecuado para que, la substancia que funciona como aceptor artificial, pueda aceptar protones con facilidad. El aceptor (SAL DE T.). debe funcionar como un marcador, o sea al reducirse se conviertan en un producto insoluble y coloreado (FORMAZANES). Una vez reducidas, deben ser estables a la reoxidacin (especialmente durante el montaje de las preparaciones).

41 Los FORMAZANES presentan algn frado de liposolubilidad, por tanto, la idea es que el Formazan sea lo ms insoluble posible en lpidos.

Para el anlisis de la raeccin, es importante el tamao de las partculas de Formazan (en gral. tienden a dar precipitados groseros). Mientras msa fino sea el formazan, mayor resolucin presentar la seal.

La idea general al utilizar Sales de Tetrazolium en la caracterizacin de oxidasas es, reemplazar el aceptor biolgico por un aceptor artificial (Sal de Tetrazolium), la que en estado oxidado no presentan color y es soluble , una vez reducidas, son coloreadas e insolubles (Formazanes). Las Sales de T. recibirn los H+ del FAD (deben presentar un potencial de xido-reduccin mayor que el que presenta el FAD, de modo que el FAD ceda los protones al aceptor artificial.

Figura N 9

A: Sales de Tetrazolium .Actividad de la Succino deshidrogenasa en cortes de cristato , enzima mitocondrial que caracteriza a las fibras musculares aerbicas. Las fibras anaerbicas no presentan depsito de formazan. La marcacin se concentra en la periferia de cada una una de las fibras aerbicas, en relacin al sarcolema por reduccin del NBT. Msculo esqueltico de cerdo. B: Sales Metlicas.La actividad ATPsica es caracterstica de fibras aerbicas y anaerbicas, con una mayor o menor densidad en la fibra muscular. El fosfato clivado del ATP por la enzima, es capturado por una Sal de Cobalto, la cual es posteriormente ennegrecida por la formacin del Sulfuro de cobalto. Las fibras musculares que no presentan marcacin dicen relacin con fibras de contraccin lenta ( cuyas Isoenzimas presentes,tanto en fibras lentas como rpidas fueron inactivadas por el tratamiento previo de los cortes de cristato del tejido con Formaldehdo).

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CARACTERSTICAS DE ALGUNAS SALES DE TETRAZOLIUM Estabilidad frente a la reoxidadcin Inestable Inestable Estable Estable Inestable Inestable Inestable Inestable

Sal de Sensibilidad Tetrazolium 1 TTC 3 INT 3 NT 2 BT 4 NNT 4 NBT 4 NTT 4 TNBT

Color Rojo Prpura Prpura Rojo-Azul Prpura Azul Negro Azul

Soluble en lpidos Insoluble Insoluble Soluble Soluble Insoluble Insoluble Insoluble Insoluble

Precipitado Muy grueso Grueso Variable Variable Fino Fino Fino Fino

CARACTERSTICAS QUE DEBERA PRESENTAR UNA BUENA SAL DE TETRAZOLIUM:

+ 1.- Que sean reductores eficientes (con un potencial redox alto, ms que el aceptor biolgico) 2.- Que las partculas de Formazn sean insolubles en lpidos (inespecificidad). 3.- Que las partculas sean pequeas, para tener una buena localizacin de la actividad enzimtica . 4.- Que sean estables y no alteradas por la luz. La sales con un grupo Tetrazolium dan un color rojo; las que presentan dos grupos son de color azul. Las Sales utilizadas habitualmente son del tipo di- tetrazolium. En relacin a la mezcla incubadora utilizada: Se trabaja a pH= 7 7,2 , para todas las deshidrogenasas se utiliza el mismo pH, de ser ms alcalino habra reaccin inespecfica del NAD NADP. Muchos grupos SH presentes en el msculo, actan como reductores a pH alcalino (> 8,5) lo que ocasionar la reduccin de la Sal de T. de manera inespecfica. A pH = 7, los grupos SH no presentan poder reductor.

43

-El Buffer utilizado es TRIS. -El substrato es generalmente el anin inorgnico como sal sdica (Succinato de Sodio). - La Coenzima es NAD NADP (debe agregrsele, ya que escasea). Con respecto al FAD, no es necesario ( es un grupo prosttico). -Cofactores: generalmente in Mg. - Se le agrega Sucrosa o PVP que contribuyen a la hiperosmolaridad (as no difunden las enzimas). En resumen: para la determinacin de Deshidrogenasas, reemplazamos el aceptor biolgico por un aceptor artificial , que en estado oxidado es incoloro y soluble y en estado reducido, es insoluble y coloreado.

CITOQUMICA DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA A LA ULTRAESTRUCTURA (MET).

EN MICROSCOPA ELECTRNICA LOS ESTUDIOS ENZIMTICOS SE UTILIZAN PARA PRECISAR LOCALIZACIN. SI QUEREMOS MEDIR ACTIVIDAD, DEBEMOS UTILIZAR MTODOS A NIVEL DE LA MICROSCOPA PTICA. Para ello encontramos 2 modalidades: 1.- Demostrar la actividad (histoqumica enzimtica) 2.- Demostracin de la protena (inmunocitoqumica). FIJADORES EN CITOQUMICA ENZIMTICA: -Formaldehdo (a partir de p-Formaldehdo ya que el metanol inactiva algunas enzimas): 4C al 4% y el tiempo sera variable (segn la enzima). -Glutaraldehdo: 0,2 -0,5 % a 4C. -Mezclas de ambos. - Solvente utilizado en la mezcla incubadora: Buffer cacodilato a pH de 7,2 ; 0,1 M. Se trabaja con pequeos trozos de tejido de 20 a 250 micrones de espesor.

44 Los cuales se congelan en Isopentano sumergido en N lquido (almacenaje en Isopentano); Cortes en Cristato a -10 a -20C. Los objetivos de la Histoqumica enzimtica a nivel de la MET, seran muy similares a la microscopa ptica.

- Preservar actividad. - Consevar localizacin.

La ecuacin general para ME, dice relacin con:

SUBSTRATO + ENZIMA

PRODUCTO DE REACCIN PRIMARIO (PRP) + AGENTE CAPTURANTE

PRODUCTO FINAL DE LA REACCIN (PFR) = ELECTRN DENSO

Mezcla incubadora:
Sustrato: A concentracin saturante. Agente capturante: Sales metlicas (Plomo: Aluminio; Cerio) ; Sales de Diazonio; Sales de Tetrazolium. Debe hallarse en concentracin adecuada. Cercano al sitio de reaccin de la enzima. Factores que influyen en lo anterior: espesor del tejido; grado de compactacin del mismo; Fijacin. Temperatura: pH: Osmolaridad: Ms baja que la ptima fisiolgica, si la enzima es abundante. El apropiado para la enzima. Fisiolgica.

45 Tratamientos posteriores a la incubacin: -Si tejido no ha sido fijado, fijarlo con glutaraldehdo. -Si el PFR no presenta el contraste adecuado, intentar aumentarlo (generalmente se utiliza post-fijacin en Osmio) Con respecto a las caractersticas del producto final, podemos decir: -Debe formarse inmediatamente y este debe ser muy insoluble y electrn denso. Podemos tener dos tipos de producto final de reaccin (PFR): -Un pp estable que no presenta un contraste adecuado por lo que debemos tratarlo con Osmio. Ejps: Sales de Diazonio; Sales de T. y DAB. -Un pp estable, no reactivo, con alto contraste electrnico y resistente a tratamientos posteriores ( uso de Sales de Plomo; Aluminio; Cerio; Ferrocianuro Cprico, etc). Efectos de la fijacin en histoqumica enzimtica para ME. -Disminuye inhibe la actividad enzimtica por desnaturalizacin de la protena. -facilita penetracin de reactivos.

ESTUDIO DE FOSFATASAS A LA ME.

Fijacin: Glutaraldehdo al 2% + Sucrosa (2 horas a 4C, si se trata de trozos pequeos) Sustratos: Beta- Glicerofosfato ; Citidn-5-Monofosfato. Agentes capturantes: Pb; Al; Ce. Sales de Plomo (Pb): -Pueden dar reacciones inespecficas por afinidad con estructuras ululares. -Inhibe a las Fosfatasas. -Se obtienen pp groseros (mala localizacin). -Penetran lentamente. -Tcnica de Gomori (1952). Sales de Aluminio (Al): -Ms especfico. -pp finos que no enmascaran estructuras de lisosomas.

46 Cerio (Ce): -Buen capturante de Fosfato. -Reacciones ms uniformes y reproducibles. -Ms especfico. -pp finos. -Poco penetrante (usar cortes delgados de 4 7 micras. -Clulas de cultivo deben permeabilizarse con detergentes.

A.- Demostracin de Fosfatasas cidas con sales metlicas a ME:

B.- Demostracin de fosfatasas alcalinas con Sales de Diazonio:

C.- Demostracin de deshirogenasas con Sales de Tetrazolium:

Enzima

Sustrato + Sales de Tetrazolium(*)

Formazn + Substrato oxidado

SE SUBSTITUYE EL ACEPTOR BIOLGICO (TISULAR) POR UNO ARTIFICIAL (*)

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D.- Demostracin de deshidrogenasas con sales metlicas:

SUBSTRATO + FERRICIANURO DE K
Enzima

FERROCIANURO CPRICO + SUBSTRATO OXIDADO

(Electrn denso) Actividades a desarrollar por el alumno. 1.- Para cada una de las enzimas estudiadas , realice un cuadro de anlisis,en el que se ponga de manifiesto los componentes de la solucin substrato, consignado de manera clara la siguiente informacin: - Enzima. - Modalidad del mtodo ( Captura por metal; Copulacin simultnea; reduccin de sales de T. ). - Substrato. - Agente capturante(cuando corresponda). - Agente copulador (cuando corresponda). - Producto primario de la reaccin (cuando corresponda). - Aceptor artificial (cuando corresponda). - Tampn , pH y T. - Coenzima o aceptor biolgico(cuando corresponda). - Cofactores. - Inhibidores generales o especficos. - Producto final de la reaccin (PFR). - Control (+). - Control (-).

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HISTOENZIMOLOGA O HISTOQUMICA ENZIMTICA: El objetivo es la demostracin de la actividad enzimtica presente en los tejidos.
Para ello se emplean diversas sustancias (cromgenos o sales metlicas) que, bajo la accin de la enzima, adquieren una coloracin determinada o precipitan un producto insoluble poseedor de color, indicativo de la presencia de dicha enzima.
TIPO DE REACCIN que catalizan: HIDROLASAS; OXIDOREDUCTASAS; TRANSFERASAS; LIASAS; LIGASAS; ISOMERASAS.

I) CLASIFICACIN
EL SUSTRATO cuya descomposicin catalizan : FOSTASA ALCALINA : 5NUCLEOTIDASA.

II) FUNDAMENTO GENERAL DE LAS TCNICAS HISTOENZIMOLGICAS:

DEMOSTRACIN DE ACTIVIDAD ENZIMTICA EN UN TEJIDO: CONSERNAR

LOCALIZACIN Y ACTIVIDAD DE LA ENZIMA EN EL TEJIDO.

Solubilidad de la enzima LOCALIZAR CORRECTAMENTE EL PRODUCTO DE LA ACTIVIDAD.

Enzima + Sustrato
(soluble no coloreado) OXIDADO

Producto Primario de la Reaccin (PPR)

COLOREADO (Producto Final Coloreado = PFC) INSOLUBLE Y REDUCIDO . Ejp. Oxido reductasas

PPR NO OPACO O COLOREADO + AGENTE CAPTURANTE Sal metlica o colorante azoico

Producto Final Coloreado (PFC).

E INSOLUBLE.

III)

NIVELES DE OBSERVACIN: 1.- MICROSCOPA PTICA : Sales metlicas ; Sales de Diazonio (Colorantes Azoicos); Sales de Tetrazolium (Formazanes). 2.- MICROSCOPA ELECTRNICA: -Demostracin de actividad enzimtica (citoqumica) demostracin de la protena (ICQ). - Agentes capturantes: Sales de Pb; Al; Ce; Sales de Diazonio; Sales de tetrazolium.

OBJETIVO DE LA FIJACIN EN HISTOENZIMOLOGA: CONSERVAR MORFOLOGA; INSOLUBILIZAR A LA ENZIMA Y AUMENTAR LA PERMEABILIDAD DE LA CLULA.

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IV) PROBLEMTICAS ASOCIADAS A LA TCNICA:

A.- ESTRICTEZ DE LAS VARIABLES : Temperatura; pH; Substratos; Cofactores; inactivadotes; etc. CONTROLES GRALES: B.- FALSOS (-) : NO SE OBSERVA REACTIVIDAD Y DEBERA VERSE.
FALSOS POSITIVOS -Por Eliminacin de actividad enzimtica por calor (60 90C). Ausencia de Sustrato en la mezcla incubadora. FALSOS NEGATIVOS: Incubando simultneamente tanto la muestra problema, en la que se pretende determinar la actividad y el tejido control (testigo), cuya presencia y actividad es certificada. La muestra control nos debiera confirmar la correcta manipulacin tcnica y confirmar la validez del mtodo.

difusin de la enzima.

C.- FALSOS POSITIVOS: -Contaminacin (bacteriana = enzimas homnimas). -Absorcin inespecficas.

EXISTE REACTIVIDAD NO DEBIENDO HABERLA; DEBIENDO OBSERVARSE, ESTA NO PRESENTA LA LOCALIZACIN ADECUADA.

V ) APLICACIONES: La Histoenzimologa ( ) v/s la IHQ. - Resulta ms sencillo certificar la presencia de la enzima, atendiendo a su estructura antignica que a su actividad biolgica. - Vigencia de la Histoenzimologa en :
a.- Biopsia de msculo esqueltico. b.- Deteccin de ganglios y tejido nervioso en Hirschprung. c.- Defectos enzimticos en biopsia yeyunal. d.- Identificacin de clulas del Sistema hematopoytico. e.- Demostracin de mastocitos. f.- Identificacin de actividad osteoblstica.

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VI) FIJACIN, INCLUSIN Y CONSERVACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA: - La actividad enzimtica slo la encontramos presente en clulas y tejidos vivos.
MTODO IDEAL: CRIODESECACIN (Freeze-Drying) y CRIOSUSTITUCIN (Freeze-Substitution), la actividad enzimtica no se altera y el tejido queda includo y listo para ser cortado por congelacin. EN EL CASO DE FIJACIN PRE-REACCIN : -Es posible utilizar FORMALINA TAMPONADA al 10 % / 4 C ; FORMOL CLCICO . -El tejido fresco y congelado en N lquido Isopentano a -50 C. Luego se corta en criostato (- 20 C) y se fija en acetona fra. (favorece la deshidratacin y post coloracin de contraste, sin modificar la actividad de la enzima. CON RESPECTO A LA INCLUSIN , PREVIA OBTENCIN DE CORTES AL MICRTOMO: Imbibicin en medio hidrosoluble (OCT = Optimal Cutting Temperatura) antes de congelar. Inclusin en gelatina o PEG, sin extraccin del agua tisular. Inclusin en parafina de bajo punto de fusin (40 C) y conservacin relativa de la actividad enzimtica. Utilizando como agente deshidratante: Acetona.

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MODALIDADES DE CAPTURA; COPULACIN Y ACEPTORES ARTIFICIALES EN HISTOENZIMOLOGA

I.- MTODO PARA FOSFATASAS ALCALINAS (Gomori modificado): SALES METLICAS.
CH3-OH OH CH2-O---P=O OH CH3-OH I pH :8,9 9,4 _ ENZIMA___ II

Ca Cl2

Ca3(PO4)2 + Co(NO3)2
insoluble e incoloro (soluble) a pH <8,5)

Co3 (PO4)2 + Ca(NO3)2

III IV

+ S(NH4)2

Co S
Negro,insoluble

Lo ms indicado para Fosfatasas cidas II.- MTODO PARA FOSFATASAS ALCALINAS (Burnstone, 1958): MTODO POR COPULACIN SIMULTNEA (AZOCOPULACIN). ONa aN-P=O
Fsfatasa

OH Alk. Na2 HPO4 + + + -NN-

OH
_N=N_

H2O
Naftol Fosfato de Na (Sustitudos) Naftol Sal de Diazonio Colorante Azoico (osmifilo)

No adecuado para Fosfatasas cidas III.- MTODO QUE UTILIZAN SALES DE TETRAZOLIUM: IDENTIFICACIN DE XIDO-REDUCTASAS. COOH CH2 CH2 COOH COOH
Succino-deshidrogenasa FAD CH CH +

+ SAL DE TETRAZOLIUM (N=N

, CCLICA)

FORMAZAN
Aceptor reducido, coloreado e insoluble.

COOH

(OXIDADA , INCOLORA Y SOLUBLE)

Aceptor artificial

(dbilmente osmifilo)

Ac. Succnico

Ac. Fumrico

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SALES METLICAS(Gomori, 1950): Tampn acetato 0,1M pH 5 + Nitrato de Pb + -Glicerofosfato de Na. =Sulfuro de plomo(n)

MTODOS PARA FOSFATASAS CIDAS:

pH : 5 -5,5
Mala Copulacin

SALES DE DIAZONIO(Burnstone, 1962): Naftol Fosfato AS-MX ; N,N-DMF + Tampn acetato 0,1 M, pH 5,2; Fast Blue B.

SALES METLICAS (Gomori, 1952): -Glicerofosfato +Cloruro de Calcio+ Sulfato de Magnesio+ barbital sdico. MTODOS PARA FOSFATASAS ALCALINAS: pH : 8,8 9,4
PROBLEMAS DEL MTODO (sales Metlicas): 1.- Difusin de la actividad de la enzima (no tiempos largos). 2.- Difusin del Fosfato por lenta unin al Calcio (poco calcio, difusin del Fosfato y unin a grupos (+) del tejido. 3.- Disolucin del Fosfato al usar pH < 8,5 (solubilizacin).

SALES DIAZONIO (Gomori, 1951): Naftol Fosfato AS-MX + N,N- DMF + Tampn TRISMaleato 0,05 M, pH 8,7 + Fast Red TR. VENTAJA: UN SOLO PASO; SENSIBLE Y ESPECFICA.

OXIDASAS: SH2 + O2 MTODOS PARA ENZIMAS OXIDATIVAS : (XIDORREDUCTASAS) Mitocondrias Requieren oxgeno; Lbiles a la Anoxia; resisten mal la fijacin

S + H2O Sustrato inespecfico ; Aceptor oxgeno (Citocromooxidasa) A AH2 + S

DESHIDROGENASAS: H2 +

Aceptor nunca es oxgeno (NAD; FAD; NADP); Sustrato especfico.

S + 2 H2O PEROXIDASAS: SH2 + H2O2 Perxido como oxidante (ACEPTOR) y el agua como aceptor. Inespecficas para El sustrato que es el DADOR (CROMOGENO SE OXIDA)

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BIBLIOGRAFA.

1.- Bancroft, J. & Gamble,M. Theory and Pactice of Histological Techniques. ChurchillLivingstone. V Ed. 2001. 2.- Horobin, W. & Kiernan, J.A. . Conns Biological Stains: A Handbook of Dyes, Stains and Fluorochromes for use in Biology and Medicine. 2000. 3.- Kiernan, J.A. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice. 4.- Carson, F. Histotechnology. A self instructional Text. ASCP Press. Chicago. 1990. 5.- Garca del Moral, R. Laboratorio de Anatoma Patolgica. Interamericana-Mc Graw-Hill. 1993. 6.- Vacca, L. Laboratory Manual of Histochemistry. Raven Press.New York. 1985. 7.- Troyer,H. Principles & Techniques of Histochemistry. Boston: Little Brown. 1980. 8.- Klaassen, R. y Cols. Manual de patologa General. Ediciones Universidad de Concepcin. 2000. 9.- Chuaqui, B y Cols. Manual de Patologa General. Ediciones Universidad Catlica.