AO DE LA INVERSION PARA EL DESARROLLO RURAL Y LA SEGURIDAD ALIMENTARIA UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA - LA MOLINA

INFORME N1
TTULO: Preparacin de una muestra fija de
bacterias para tincin y Tincin simple con colorantes bsicos

Integrantes: Colquehuanca Meja, Eliana Elsye Flores Caldern, Elvis Norabuena Damian, Juan TantahuillcaLandeo, Pat Teresa

Mesa N5

Grupo: Mircoles de 3 a 5 pm

2013

1. Introduccin
La microbiologa es el estudio de los organismos microscpicos (celulares y subcelulares), principalmente de aquellos que se encuentren por debajo del poder de resolucin del ojo humano, estos seres tienen un rango de tamao de 10-5 a 10 mm, por ende es necesario el manejo experimental para observar, describir su morfologa y taxonoma. Para ello se debe tener habilidades de manejo de los instrumentos de laboratorio (principalmente el microscopio), saber las tcnicas bsica de preparacin de una muestra fija de bacteria para tincin, que es un procedimiento preliminar a la mayora de mtodos de tincin a bacterias. Se aprender a realizar el mtodo de tincin simple con colorantes bsicos en cual consiste en destacar el microorganismo completo para que se vean las formas y las estructuras bsicas.

2. Marco terico
La gran mayora de microorganismos son casi incoloros cuando se les observa a travs de un microscopio ptico estndar, para una visualizacin de bacterias de manera adecuada y de sus estructuras internas, se requieren tinciones biolgicas. La introduccin de tinciones a mediados del siglo XIX influy mucho sobre los principales avances en microbiologa.En tamao y forma las bacterias de importancia mdica son microorganismos muy pequeos que se presentan en tres formas generales: esfricos designados como cocos, organismos en forma de bastn designados como bacilos, y de formas espirilas, dentro de estas tres mencionadas anteriormente se encuentran otros microorganismos que adoptan variantes morfolgicas designadas como formas pleomrficas. Las tinciones consisten en preparaciones acuosas u orgnicas de colorantes o grupos de colorantes que proporcionan una variedad de colores a los microorganismos y a los tejidos vegetales y animales, u otras sustancias de importancia biolgica (Koneman, 2008). 2.1. Los colorantes Se pueden clasificar segn su origen o segn su comportamiento qumico. Segn su origen: a. Naturales. Son los colorantes extrados de animales y sobre todo de plantas. Por ejemplo la hematoxilina b. Artificiales. Son los colorantes preparados en mayor parte de alquitrn de hulla.

Segn su comportamiento qumico:

Los colorantes son las sales compuestas por un ion positivo y un ion negativo, uno de los cuales esta coloreado y se conoce como cromforo.(Tortora, 2007). a. cidos o aninicos.El color de los colorantes cidos, est en el ion negativo.Son los colorantes citoplasmticos. Estos no son atrados por la mayor parte de los tipos de bacterias porque la superficie bacteriana con carga negativa repele los iones negativos del colorante, de modo que este tie el fondo en lugar de la estructura bacteriana. Es ejemplo de colorante acido la fucsina cida b. Bsicos o catinicos.El color de los denominados colorantes bsicos esta en el ion positivo.En un pH de 7 las bacterias presentan una carga levemente negativa. Por lo tanto, el ion positivo coloreado en un colorante bsico es atrado hacia la clula bacteriana con carga negativa. Los colorantes bsicos entre los que se encuentran el azul de metileno y el cristal violeta o violeta de genciana, se utilizan con ms frecuencias que los colorantes cidos. c. Neutros. Son sales compuestas de un color cido y un color bsico. Por ejemplo cosinato d. Indiferentes. Son los colorantes insolubles en agua y solubles en alcohol donde no predomina ni la carga positiva ni la carga negativa. Pero no tienen carcter neutro, colorantes de los lpidos, por ejemplo el Sudan III, negro Sudn.(Granados, 1997) 2.2. Fijacin

Todas las tcnicas de tincin exigen una preparacin previa antes de proceder a la tincin en s. Hay que seguir tres pasos: extensin, desecacin y fijacin. De estos depende la calidad de las tinciones (Garca, 1994). a. Extensin Consiste en formar una pelcula de la muestra sobre un portaobjetos perfectamente limpio y desengrasado (conservado en alcohol). La deposicin de la muestra debe ocupar aproximadamente una superficie de 1cm2 .los portaobjetos suelen flamearse antes de su uso para eliminar los restos de grasa y suciedad. La forma de realizar la extensin depende del estado fsico en que se encuentre la muestra: para muestras lquidas basta con depositar una gota en el centro del portaobjetos y extenderla con un asa; para muestras slidas, o colonias procedentes de un cultivo, se deposita con antelacin sobre el portaobjetos una pequea gota de agua, o mejor de solucin salina, en la que se efecta una emulsin.

b. Desecacin

Siempre debe realizarse al aire. Puede favorecerse colocando e portaobjetos sobre el calor suave de una llama de un mechero, pero tomando precauciones para no forzar el proceso de secado. c. Fijacin El proceso de fijacin produce la muerte simultnea de los microorganismos y su adherencia al portaobjetos por su coagulacin de sus protenas plasmticas mediante calor. Tambin preserva diversas partes de los microorganismos en su estado natural con distorsin mnima. Se aplica el colorante, se lo lava con agua y se lo seca con papel absorbente. Si no se realizara la fijacin el colorante podra arrastrar los microorganismos del portaobjetos (Tortora, 2007)

2.3.

Tcnicas de tincin Las principales ventajas de la tcnica de tincin son: Observar ms adecuadamente su morfologa. Proporcionar el contraste preciso y suficiente en cada caso, lo que permitir diferenciar distintos tipos morfolgicos. Establecer una informacin completara sobre sus estructuras internas y/o externas que no podran ser observadas por examen en fresco. Conocer sus caractersticas tintoriales orientndonos hacia un grupo taxonmico u otro en la clasificacin bacteriana. Las tinciones pueden ser: a. Simples. Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de que las clulas tienen una composicin qumica diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente frente a un colorante. El colorante tie las clulas (azul de metileno, safranina) o no (nigrosina). b. Diferenciales. Se basan en el hecho de que distintos tipos de clulas tienen distinta composicin qumica, y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tincin, lo que permite clasificar los microorganismos en diferentes grupos, segn su capacidad de tincin. En este apartado estn dos tinciones de importancia taxonmica y mdica: la tincin de Gram y la de cido-alcohol resistencia (de Ziehl-Neelsen). Estas tinciones utilizan ms de un colorante. c. Selectivas. Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen distinta composicin qumica, de modo que se tien selectivamente con ciertos colorantes. Ejemplo: tincin de esporas, de flagelos, de paredes celulares, de corpsculos metacromticos. Pueden utilizarse uno o ms colorantes.

2.4.

Tcnica de tincin simple

Esta es una tcnica que utiliza un colorante, todas las clulas se observan del color del colorante empleado. Aunque los diferentes colorantes se unen de forma especfica a las distintas partes de las clulas el propsito principal de una tincin simple es destacar el microorganismo completo para que se vean las formas y las estructuras celulares bsicas. El colorante se aplica al extendido fijado por un tiempo determinado, se lava, se seca y examina.

2.5.

Factores que afectan a toda tcnica de tincin Pureza del colorante Concentracin del colorante El pH del colorante Conservacin del colorante Elaboracin del colorante Tcnica empleada Temperatura Cantidad de muestra Realizar correctamente el frotis Tiempo de tincin Soluciones mordientes Observacin de los microorganismos con microscopio de alto poder amplificador Se usa mayormente ocular que aumentan de 10 y objetivo de inmersin, dispositivos que brindan amplificaciones de casi 1000 dimetros. Es sabido que el vidrio y el aire no tienen la misma refraccin, se emplea aceite de inmersin para que no exista aire entre la preparacin y el objetivo. Se procede entonces a descender el objetivo hasta la gota de aceite de manera que no quede aire entre el portaobjetos y la lente (Witton, 1965)

2.6.

3. Parte experimental

EJERCICIO N. 1 PREPARACION DE BACTERIAS PARA TINCIN

UNA MUESTRA FIJA DE

Previo al desarrollo de una tcnica de tincin, el material al ser observado debe ser fijado, es decir adherido a una lmina de vidrio sobre la cual ha de realizarse la tincin. Si la preparacin no es fijada, la muestra tiende a perderse durante el procedimiento de tincin. El procedimiento de fijacin mata al microorganismo, coagula el protoplasma celular y provoca su adhesin a la lmina de vidrio. Un agente de fijacin ideal preserva la estructura de la clula

en la forma y posicin normal sin causar la aparicin de artefactos (estructuras no presentes en la clula viviente). Aunque el calentamiento es el agente de fijacin de uso ms comn, el alcohol y otros agentes qumicos tambin pueden ser usados satisfactoriamente.

MATERIALES. Muestra conteniendo bacterias Asa de klle Lamina porta objetos Mechero de alcohol Piseta con agua PROCEDIMIENTO 1) Lavar perfectamente los portaobjetos, secarlo con papel seda. 2) Prender el mechero y esterilizar el asa klle en la flama del mechero hasta que se ponga al rojo vivo. 3) Dejar enfriar el asa para evitar que al tomar la muestra los microorganismos sean destruidos, despus acercar al mechero el tubo de cultivo, quitarle el tapn y flamear rpidamente la boca del mismo. 4) Colocar una gota de agua destilada sobre una lmina porta objeto completamente limpia. Con ayuda del asa de klle coloque sobre la gota una pequea porcin de la muestra a fijar. Si la muestra que contiene al microorganismo es lquida puede aplicarse directamente sin la gota de agua. 5) Distribuya la gota cargada con la muestra en la lmina hasta formar una pelcula delgada luego seque la lmina al aire o a una razonable distancia sobre la llama del mechero. 6) Cuando la pelcula este seca, pase la lmina a travs de la llama del mechero unas 2 a 3 veces para as fijarlo con calor, cuidando que la pelcula este hacia arriba y que la lmina no se recaliente. La sobre exposicin al calor puede alterar la forma y estructura del microorganismo.

EJERCICIO NRO. 02

TINCION SIMPLE CON COLORANTES BASICOS

La tincin simple constituye una tcnica sencilla y directa que a travs del uso de un colorante, nos permite constatar y diferenciar los microorganismos de su entorno. Los colorantes bsicos, los cuales se utiliza ms comnmente para teir microorganismos, difieren en el grado de reactividad con las clulas, estas generalmente tiene una superficie cargada negativamente cuando el pH del medio es cercano a la neutralidad, entonces se aplica el azul de metileno ( ion positivo) que reacciona con la pared celular por medio de enlaces inicos dbiles que estn cargadas negativamente a la tasa ms baja, tomando de 50 a 60 segundos para teir apropiadamente una preparacin microbiana. El cristal violeta es ms reactivo y generalmente requiere solo 10 segundos. La carbolfucsina es un colorante an ms rpido, requiriendo solo 5 segundos. Su

reactividad es tan grande que ciertamente puede dificultar una tincin apropiada, sobre todo cuando la muestra contiene abundante materia orgnica. MATERIALES. Laminas fijadas de microorganismos Aceite de inmersin Vaso de precipitados de 100 ml Colorantes bsicos Azul de metileno Cristal violeta Carbol-fucsina Papel secante Piseta de agua Soporte para tincin PROCEDIMIENTO 1) Coloque las lminas fijadas de microorganismos sobre el soporte para tincin. 2) Agregue 5 a 6 gotas de cada colorantes dejando que acten por un tiempo de 60 segundos para el azul de metileno; 10 segundos para queel cristal violeta; y 5 segundos para la carbolfucsina. 3) Una vez cumplido el tiempo para los colorantes, lave cada lmina con agua destilada. 4) Seque las lminas al aire o dentro del papel secante. 5) Examine las preparaciones teidas bajo el objetivo de inmersin (100X) de un microscopio compuesto. 6) Elabore esquemas de sus observaciones destacando las diferencias en tamao forma, y agrupaciones que se presenten.

4. Observaciones Despus de haber preparado las muestras en los portaobjetos (frotis) se obtuvieron los siguientes resultados: 4.1. Gnero: Staphylococcus sp. Forma: cocos Agrupacin: racimo Colorante: azul de metilo GA: 1000X

4.2.

Gnero: Bacillus sp. Forma: bastn Agrupacin:estreptobacilo Colorante: fucsina GA: 1000X

4.3.

Gnero: Echerichiacoli Forma: cocobacilo Agrupacin: no tiene Colorante:cristal violeta GA: 1000X

5. Discusin
Segn Koneman(2008) como la mayora de las bacterias carecen de coloracin, es importante teirlas para poder observarlas al microscopio y determinar su tamao, morfologa y disposicin relativa, por tal motivo se utiliz azul de metilo como colorante para la Staphylococcus sp, aunque no se trat de un colorante rpido su uso dificult una tincin apropiada, dando como resultado una baja nitidez. Segn Granados (1997) existen distintos factores que afectan a las tcnicas de tincin, como el no realizar correctamente el frotis o variar el tiempo de tincin, estos factores pudieron haber afectado la observacin de Staphylococcus.

Segn Madigan (2004) a las bacterias esfrica u ovoide se les denomina cocos, a las de forma cilndrica bacilos. Para el caso de la Staphylococcus se observ en forma de cocos, para la E. Coli se trata de una forma ovoide, que tambin incluye la forma cocobacilo. En el caso del Bacillusobtuvimos una forma de bastn.

Segn Madigan (2004) son las caractersticas fsicas y qumicas que un microorganismo necesita para su favorable crecimiento las que generan las comunidades microbianas o agrupaciones donde realizan sus procesos metablicos. Se observ que la E. Coli no se forma agrupaciones porque su tendencia a permanecer unidas es bastante baja. Los Staphylococcus forman en agrupaciones de racimos, es por eso que en la muestra teida de azul de metilo se observ varias colonias de estos microorganismos en grupos con forma de racimos.

6. Conclusin
Los colorantes son muy importantes para la observacin de microorganismosya que proporciona contraste entre el este y el medio que lo rodea, permitiendo diferenciar su morfologa. Aunque se haba recomendado usar el colorante azul de metilo para la tincin de la Staphylococcus sp, se tuvo dificultad para una observacin ntida. La tcnica de tincin simple nos ayuda a ser visibles las formas, tamaos y agrupaciones variadas que presentan las bacterias.

7. Bibliografa

AGUILAR P., J. y F. SENENT. 1986. Cuestiones fsicas. Revert Editorial. Primera Edicin. Sevilla. COVADONGA. 2010.Tcnicas bsicas de Microbiologa. Observacin de bacterias. Madrid. Disponible en:www.revistareduca.es/index.php/biologia/article/download/819/834co nsultada el 01 de setiembre del 2013. GARCIA, P; FERNANDEZ, M y PAREDES, F. 1994. Microbiologa clnica prctica.2 edicin. Editorial Universidad de Cdiz servicio de publicaciones. Cdiz. GRANADOS, R; VILLAVERDE, C. 1997. Ciencia de la Salud Microbiologa. Editorial Paraninfo. Espaa KONEMAN, E;ALLEN, S y JANDA.2008. Diagnostico Microbiolgico. Texto y Atlas en color.6 edicin.Panamericana Editorial.Buenos Aires. MADIGAN, M. et al. 2004. Biologa de los microorganismos. Brock. Pearson-Prentice Hall Editorial. 10a edicin. Madrid. PRESCOTT, L. et al. 2002. Microbiologa. Mc Graw Hill Editorial. 5ta edicin. Madrid. TORTORA, G.et al. 2007. Introduccin a la microbiologa. Panamericana Editorial. 9 edicin. Buenos Aires.

WITTON. 1997. Microbiologa. Primera edicin. Compaa Editorial Continental,SA. Mxico.

CUESTIONARIO
1. Cules son las asociaciones ms frecuentes en bacterias?
Las clulas de muchos procariotas se mantienen juntas despus de la divisin celular formando grupos, y estas asociaciones frecuentes son caractersticas de diferentes organismos. Los cocos que despus de la divisin permanecen unidos en pares se denominan diplococos y los que permanecen unidos en forma de cadena se denominan estreptococos. Los cocos que se dividen en dos planos y permanecen unidos en grupos de cuatro se conocen con el nombre de ttradas, los que se dividen en tres planos y permanecen unidos en grupos de configuracin cbica se llaman sarcinas y los que se dividen en planos mltiples y forman grupos similares a racimos de uva o lminas amplias se denominan estafilococos. Los bacilos se dividen exclusivamente a travs de sus ejes menores, de manera que la cantidad de grupos de bacilos es menor que la de cocos. La mayora de bacilos se observan como bastones aislados. Los diplobacilos permanecen unidos en pares despus de la divisin, mientras que los estreptobacilos forman cadenas. Otros bacilos son ovalados y se parecen mucho a los cocos, por lo que recibieron el nombre de cocobacilos.

Figura1:Disposicin de cocos y bacilos segn las agrupaciones ms comunes.

Fuente: Tortora et al (2007)

2. En qu rango se definen las bacterias?

En conjunto el grupo bacteriano tambin vara en tamao tanto como en forma. Las ms pequeas (como del gnero Mycoplasma) tienen aproximadamente 0.3 m de dimetro. Las nanobacterias un dimetro aproximado de entre 0.2 m y menos de 0.05 m. Otro ejemplo es de la Escherichiacoli, bacilo de tamao medio, mide 1.1 1.5 m de ancho y 2.0 6.0 m de largo. Algunas bacterias son bastante grandes; la cianobacterias Oscillatoria tiene un dimetro de casi 7 m, y algunas espiroquetas pueden alcanzar ocasionalmente una longitud de 500 m. Se ha descubierto una bacteria enorme en el intestino del pez cirujano Acanthurusnigrofuscus. La bacteria Epulopisciumfishelsoni presenta un tamao de 600 por 800 m. ms recientemente se ha descubierto una an ms grande en sedimentos ocenicos, Thiomargaritanamibiensis. En general, las procariotas presentan tamaos que van desde 0.1 0.2 m de ancho a ms de 50 m de dimetro.

Figura 2: Muestra de tamaos comparativos entre distintos procariotas

Fuente: Madiganet al (2004)

3. Cules son las formas bacterianas ms frecuentes?

Aunque es cierto que muchas bacterias tienen una morfologa similar, existen importantes variaciones. La mayora de las bacterias conocidas presentan forma de coco o de bacilo. Los cocos son clulas casi esfricas, que existen individualmente o en agrupaciones caractersticas que son tiles frecuentemente para identificar a las bacterias; en cuanto a los bacilos, son bacterias de forma cilndrica. Otras formas bacterias son una forma semejante a adquiridas por las

bacilos largos retorcidos como espirales o

hlices, denominados espirilos si son rgidos, y espiroquetas cuando son flexibles.

Figura3: Bacterias representativas; observacin con el microscopio ptico en bacterias teidas

(a)Staphylococcus aureus; obsrvense las clulas esfricas en racimos irregulares (x 1000). (b)Enterococcus faecalis; obsrvense las cadenas de cocos (x 200). (c)Bacillus megaterium, bacteria en forma de bacilo formando cadenas (x 600). (d)Rhodospirillum rubrum (x 500). (e)Vibrio cholerae; bacilos curvados com flagelos polares (x 1000). Fuente: Prescott et al (2002)

4. Qu diferencia a una tincin directa de una tincin negativa?

La tincin directa o simple permite observar la forma, el tamao y los agrupamientos de las bacterias usando un nico colorante (normalmente bsico), pues estos microorganismos absorben el colorante. Mientras que en la tincin negativa, uso de colorantes neutros o cidos, la clula bacteriana no absorbe el colorante quedando incolora y transparente, slo se tie el fondo. Y debido a que no necesitan del calor, las morfologas de las clulas no son alteradas.

Figura 4: Tincin simpe con cristal violeta de Staphylococcusaureus.

Figura 5: Tincin negativa con cristal violeta de Staphylococcusaureus.

Fuente: Covadonga (2010)

Fuente: Covadonga (2010)

5. Qu importancia le atribuye a las diferencias en reactividad de los colorantes empleados? Las tcnicas de tincin nos permiten observar microorganismos en funcin de la capacidad de los mismos para retener o no determinadas sustancias colorantes (de acuerdo a la composicin en sus paredes celulares), lo que depende de la carga de la clula y del colorante, por ejemplolos catinicos penetran en el interior de la clula y las tien. Las bacterias, en su mayora tienen afinidad por los colorantes de carcter bsico.
Azul de metileno Reacciona con las clulas cargadas negativamente. Reacciona Cristal violeta con clulas cargadas

negativamente. Para micobacterias de cpsula gruesa y

Carbolfucsina

cerosa son resistentes a la tincin, son llamadas cidos resistentes

6. Cul es la funcin del aceite de cedro?

La funcin del aceite de cedro es restringir el movimiento de la muestra, adems de evitar el rozamiento entre porta-objetos con muestra y el objetivo, generalmente se usa cuando se va a observar con el objetivo 100x. Otra funcin es evitar que la luz se desve.

El ndice de refraccin del aceite de cedro y del vidrio es el mismo de la primera lente objetivo del microscopio, consiguiendo as que los rayos pasen sin sufrir refraccin,

eliminando de esta forma reflexiones totales (figura 6) y mejorando la luminosidad de la imagen. De no tener aceite de cedro, se puede reemplazar con agua, monobromuro de naftaleno entre otros.

Figura 6: Objetivos secos y de inmersin

Fuente: Aguilar y Senent (1986)

7. Cul es la funcin del lente de inmersin?

La lente de inmersin es usada para lograr un mayor aumento (1 000 x) con buena resolucin, para lo que el objetivo es pequeo. Si no se utiliza aceite de inmersin con un objetivo de inmersin la imagen se toma borrosa, con mala resolucin.