PRACTICA 5. CROMATOGRAFA Objetivo.

Conocer la tcnica como de cromatografa y los factores experimentales que la afectan Comparar la cromatografa con los procesos unitarios utilizados anteriormente en cuanto a la eficiencia como mtodos de separacin y purificacin.

Introduccin.

La cromatografa es una tcnica de separacin de solutos de una mezcla, que se basa en la diferente velocidad con que se mueve cada uno de los solutos a travs de un medio poroso, arrastrados por un disolvente en movimiento. A este disolvente se le llama fase mvil y el medio poroso puede ser la fase estacionaria, o bien servir de soporte a esta fase. Se habla de cromatografa en columna cuando la fase estacionaria o su soporte estn contenidos en una columna. La separacin cromatogrfica constituye un proceso dinmico que permite un intercambio continuo por desplazamiento de una fase con respecto a la otra. El diferente reparto de solutos entre las fases mvil y estacionaria es la causa de la separacin de los solutos. El soluto que tiene mayor afinidad por la fase estacionaria se mover con mayor lentitud. La fase mvil se llama eluyente. Cuando emerge por la salida de la columna se llama eluato. El proceso que consiste en hacer pasar un lquido o un gas a lo

largo de la columna de cromatografa se llama elucin. El volumen de elucin (ve) es el volumen de fase mvil que se requiere para eluir un soluto dado de la columna cromatogrfica. Se puede clasificar las cromatografas en 5 grandes grupos: Cromatografa de Reparto. Cromatografa de Adsorcin. Cromatografa de Intercambio Inico. Cromatografa de Exclusin. Cromatografa de Afinidad.

Cromatografa de Reparto: Est basada en la separacin o reparto de una mezcla de solutos entre la fase mvil (disolvente) y la fase estacionaria soportada sobre un slido adecuado, de acuerdo a las distintas solubilidades de estos solutos en ambas fases. Si el disolvente es un lquido se denomina cromatografa lquida. Son cromatografa de reparto la cromatografa en papel y la cromatografa en capa fina (TLC). La cromatografa en papel se utiliza para la separacin de cantidades mnimas de soluto y tambin como un criterio de pureza. Se basa en la diferente velocidad con que se mueve cada uno de los solutos a travs de una fase estacionaria que es el agua retenida sobre un soporte slido e inerte (celulosa), arrastrado por un disolvente en movimiento. Una vez realizada la cromatografa, la posicin de los componentes se determina mediante una tcnica que permita visualizarlos. Es comn revelar el cromatograma mediante reacciones que originen productos coloreados. Los componentes de una mezcla se pueden identificar por su migracin con respecto al solvente mvil en condiciones definidas en relacin con el comportamiento de patrones. El cromatograma no es alterado por la presencia de otros solutos. Se calcula la razn de migracin del soluto con respecto a la fase mvil ( Rf ) que se compara con la de los patrones (Ec. 2.1).

Rf

distancia recorrida por el soluto distancia recorrida por la fase mvil

Ecuacin 1

El Rf debe calcularse de acuerdo a la distancia recorrida por el soluto, desde su punto de partida hasta el punto medio de la posicin de ste una vez corrida la cromatografa, y la distancia recorrida por la fase mvil, tambin medida desde el punto de partida del soluto hasta el frente del solvente en el papel.

Como los Rf son constantes en condiciones definidas y controladas permiten identificar los componentes de una mezcla de solutos, en la medida que los Rf de muestras y patrones se obtengan en un mismo experimento.

b.

Cromatografa de Adsorcin:

Est basada en la diferente adsorcin y posterior desorcin de sustancias contenidas en un disolvente mvil (lquido o gas) sobre un slido estacionario. No se debe confundir la adsorcin que es un fenmeno de superficie que se manifiesta por el aumento de concentracin de la interfase que rodea al medio estacionario, con la absorcin que consiste en la penetracin de una sustancia en el seno de otra. Ejemplos de cromatografa de adsorcin son la cromatografa en columna de almina y de carbn activado, la placa de slica gel. c. Cromatografa de Intercambio Inico:

La fase estacionaria es una matriz polimrica porosa que posee grupos inicos unidos covalentemente y contraiones mviles que pueden ser intercambiados por iones arrastrados por la fase mvil (lquido). d. Cromatografa de Exclusin Molecular:

Las molculas pueden ser separadas tambin sobre la base de sus diferentes tamaos al pasar a travs de una columna que contiene partculas hidratadas de geles porosos. Se encuentra en el mercado un buen nmero de materiales para estos fines, cuya composicin y porosidad son controladas cuidadosamente, de modo que molculas de tamao relativamente parecido puedan ser separadas mediante la adecuada seleccin del tamao del poro gel (tabla 1). El Sephadex consta de partculas pequeas de dextrano formadas por una red tridimensional de cadenas de polisacridos ramificados. Es altamente polar debido a su alto contenido de grupos hidroxilos, por ello se hincha considerablemente cuando se coloca en agua. La mezcla de molculas grandes y pequeas se colocan sobre la superficie libre superior del gel. A medida que la muestra desciende por la columna, las molculas pequeas difunden dentro del gel teniendo que recorrer un

camino ms largo, mientras que las molculas grandes pueden ser completamente excluidas de los poros del gel. Eventualmente se obtiene una separacin completa en la que las molculas grandes salen primero de la columna y por ltimo las ms pequeas.

El resultado de la columna cromatogrfica se expresa en la forma de un diagrama de elucin que muestra la variacin de la concentracin del soluto en el eluyente versus el volumen del eluyente que ha pasado por la columna. De este diagrama se obtiene el volumen de elucin.

El volumen de elucin (Ve) no es un criterio para definir el comportamiento de un compuesto, ya que vara con el volumen total de la columna ( Vt) y la forma como la columna ha sido empaquetada. Para ello se utiliza la constante Kav (Ec. 2.2).

K av

v v v v
e t

0 0

Ecuacin 1.1

En cromatografa de exclusin el volumen de la fase mvil se llama volumen intersticial (V0). El valor de V0 se determina haciendo pasar por la columna una molcula grande e inerte de peso molecular superior al lmite de exclusin del gel. El azul de dextrano 2000, un colorante con peso molecular de 2*106, se utiliza generalmente con este propsito. Cuando no se dispone de la informacin adecuada para este clculo, el Vo se puede estimar como el 35% del volumen total de la columna (Vt). El volumen total de la columna se calcula a partir de las dimensiones de la columna (Vt = r2 h ). Nota: Polaridad de los compuestos orgnicos en orden creciente: Hidrocarburos < olefinas < flor < cloro < nitro < aldehdo Aldehdo < ester < alcohol < cetonas < aminas < cidos < amidas

Cromatografa de gases

La cromatografa de gases es una tcnica cromatogrfica en la que la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatogrfica. La elucin se produce por el flujo de una fase mvil de gas inerte. A diferencia de los otros tipos de cromatografa, la fase mvil no interacciona con las molculas del analito; su nica funcin es la de transportar el analito a travs de la columna. Existen dos tipos de cromatografa de gases (GC): la cromatografa gas-slido (GSC) y la cromatografa gas- lquido (GLC), siendo esta ltima la que se utiliza ms ampliamente, y que se puede llamar simplemente cromatografa de gases (GC). En la GSC la fase estacionaria es slida y la retencin de los analitos en ella se produce mediante el proceso de adsorcin. Precisamente este proceso de adsorcin, que no es lineal, es el que ha provocado que este tipo de cromatografa tenga aplicacin limitada, ya que la retencin del analito sobre la superficie es semipermanente y se obtienen picos de elucin con colas. Su nica aplicacin es la separacin de especies gaseosas de bajo peso molecular. La GLC utiliza como fase estacionaria molculas de lquido inmovilizadas sobre la superficie de un slido inerte. Cromatografa lquida La Cromatografa lquida, tambin conocida como Cromatografa de lquidos, es una tcnica de separacin y no debe confundirse con una tcnica cuantitativa o cualitativa de anlisis. Es una de las tcnicas analticas ampliamente utilizada, la cual permite separar fsicamente los distintos componentes de una solucin por la absorcin selectiva de los constituyentes de una mezcla. En toda cromatografa existe un contacto entre dos fases, una fija que suele llamarse fase estacionaria, y una mvil (fase mvil) que fluye permanente durante el anlisis, y que en este caso es un lquido o mezcla de varios lquidos. La fase estacionaria por su parte puede ser almina, slice o resinas de intercambio inico que se encuentran disponibles en el mercado. Los intercambiadores inicos son matrices slidas que contienen sitios activos (tambin llamados grupos ionognicos) con carga electrosttica (positiva o negativa). De esta forma, la muestra queda retenida sobre el soporte slido por afinidad electrosttica. Dependiendo de la relacin carga/tamao unos constituyentes de la mezcla sern retenidos con mayor fuerza sobre el soporte slido que otros, lo que provocar su separacin. Las sustancias que permanecen ms tiempo libre en la fase mvil, avanzan ms rpidamente con el fluir de la misma y las que quedan ms unidas a la fase estacionaria o retenidas avanzan menos y por tanto tardarn ms en salir o fluir. ste es el principio fundamental de la cromatografa. Un ejemplo notable es la cromatografa de intercambio inico. Las columnas ms utilizadas son las de slice. Cromatografa de intercambio inico

La cromatografa de intercambio inico (o cromatografa inica) es un proceso que permite la separacin de iones y molculas polares basadas en las propiedades de carga de las molculas. Puede ser usada en casi cualquier tipo de molcula cargada, incluyendo grandes protenas, pequeos nucletidos y aminocidos. La solucin que debe inyectarse es usualmente llamada "muestra" y los componentes separados individualmente son llamados analitos. Es usada a menudo en purificacin de protenas, anlisis de agua o control de calidad.

Propiedades de los Reactivos

Reactivos que usamos en esta prctica: Slica-gel para la columna El gel de slice o cido silcico es uno de los ms utilizados, es dbilmente cido, su pH oscila entre 4-5. Con lo cual no se deber utilizar con sustancias que se corrompan con los cidos. Los geles de slice normales suelen contener impurezas de hierro y/o aluminio, este factor tambin se debe tener en cuentas respecto al uso de componentes. El tamao del grano suele ser de 10 a 40 micras () y el tamao de poro vara de 20 a 150. Generalmente lleva incorporado un agente aglomerante, yeso (sulfato de clcico semihidratado), para proporcionar firmeza al adsorbente. Tambin han sido incorporados dos indicadores del ultravioleta, juntos o por separados (amarillo y/o verde), en diversos tipos de gel de slice. Se trata de un adsorbente polar, pero puede ser tratado con hidrocarburos para neutralizar los grupos -OH, de forma que se haga apto para separar componentes lipfilos (esteroides, cidos grasos, ceras, vitaminas liposolubles, etc.). A este proceso se le denomina cromatografa de fase reversa. Propiedades de los Reactivos Punto de Ebullicin Punto de Congelacin Frmula
(C) (C)

Reactivo Metanol Acetato de etilo Hexano

Inflamabilidad ++++ ++++ ++++

CH3OH CH3COOCH2CH3 C6H14

65 77.2 68

-198 -84 -195

Nota: La polaridad de los reactivos est indicada en orden descendente.

Resultados

Rf

distancia recorrida por el soluto distancia recorrida por la fase mvil

Rf= AcOEt: CH3CH2OH 7:3 Rf= O.4? Rf= 1.4/3.8 = 0.37

Discusin de resultados
En nuestra cromatoplaca obtuvimos una mancha grande, esto se debi a que no dejamos secar entre una aplicacin con el capilar y otra.

Comprobamos la importancia del cuidado al inyectar la columna, pues si se derrama por las paredes de la columna la tcnica no se desarrolla adecuadamente, no se observa la separacin de las distintas fases, recordemos que esta separacin es importante para identificar la posicin de las fases y colectarlas. Es importante tener cuidado al trazar nuestras marcas gua en la cromatoplaca, hay que usar un lpiz con punta muy suave, pues de lo contrario una punta afilada podra cortar la cromatoplaca. En la separacin por cromatografa en placa fina de una mezcla de colorantes, no se observa la separacin, consideramos necesario su revelacin por medio de UV. En nuestra columna cromatogrfica se apreci muy claramente la separacin de las fases, los primeros tubos que colectamos eran muy coloridos, y gradualmente fueron perdiendo esta caracterstica, lo que nos indica la separacin por volmenes.

Anlisis
La primera mezcla que usamos, la de hexano: Acetato de etilo 1:1 es poco polar por lo que al hacerla pasar por la columna, eluyeron las sustancias no polares, mientras que las polares quedan adheridas a la matriz de la columna, es decir al slica-gel; al cambiar la mezcla a acetato de etilo: metanol 1:1 de mayor polaridad, las molculas polares van movindose al reemplazarse su interaccin con la slica-gel por interaccin con la mezcla acetato de etilo: metanol 1:1. As observamos una mayor separacin.

Cuestionario
1. Indicar qu precauciones se deben tener al empacar una columna de cromatografa. Al agregar la suspensin de slica-gel es una mezcla de hexano:acetato de etilo 1:1 hay que golpear ligeramente con los dedos para que el empacado sea uniforme.

Mantener un goteo uniforme en la llave de salida del disolvente, pero hay que tener cuidado de no dejar la slica-gel sin disolvente. Mantener siempre el nivel del eluyente 0.5cm por arriba del nivel del adsorbente. La columna se llena hasta tres cuartas partes de su capacidad. Es importante conocer la polaridad del adsorbente para as elegir la polaridad del disolvente. 2. Indicar qu fracciones se separaron por cromatografa en columna, de los extractos de espinaca, jitomate y cmo se identificaron. De los jitomates obtuvimos licopenos, y de las espinacas: pigmentos, caroteno, clorofila a y clorofila b.; y mediante cromatografa en capa fina, obtuvimos la separacin de sus componentes al pasar el disolvente por el punto aplicado, y por cromatografa en columna obtuvimos fracciones coloridas, las cuales indicaban el grado de separacin. 3. Escriba qu conclusiones se obtienen de la cromatografa en capa fina y de la cromatografa en columna? En la cromatografa plana la separacin se realiza por distancias mientras que en columna se hace por volmenes (de las fracciones separadas) En la cromatografa en columna la separacin de varias muestras, se realiza de forma secuencial, por lo que si tenemos p. ej. dos muestras cada una de ellas deber someterse individualmente al mismo proceso de introduccin en la columna; en la cromatografa de placa fina por el contrario, la separacin de varias muestras se puede realizar de forma simultnea, y todas ellas sometidas al mismo tiempo al proceso separativo esto supone un ahorro de tiempo considerable. 4. Definir los siguientes trminos: Adsorcin: Se llama adsorcin al fenmeno de acumulacin de partculas sobre una superficie. La sustancia que se adsorbe es el adsorbato y el material sobre el cual lo hace es el adsorbente. La adsorcin se utiliza para eliminar de forma individual los componentes de una mezcla gaseosa o lquida. El componente a separar se liga de forma fsica o qumica a una superficie slida. El componente eliminado por adsorcin de una mezcla gaseosa o lquida puede ser el producto deseado, pero tambin una impureza. Este ltimo es el caso, por ejemplo, de la depuracin de gases residuales. El slido recibe el nombre de adsorbente, y el componente que se adsorbe en l se denomina adsorbato. El adsorbente se debera ligar, en lo posible, slo a un

adsorbato, y no los dems componentes de la mezcla a separar. Otros requisitos que debe cumplir el adsorbente son: una gran superficie especfica (gran porosidad) y tener una buena capacidad de regeneracin. Un adsorbente muy utilizado es el carbn activo. La adsorcin se favorece por temperaturas bajas y presiones altas. Cromatografa de adsorcin: El slido adsorbe al componente que inicialmente estaba en fase mvil (liquida o gaseosa) (Fuerzas de Van der Waals).

Particin: Fenmeno de reparto entre las dos fases debido a su solubilidad. La solubilidad es una medida de la polaridad y de otro tipo de interacciones moleculares.

Eluyente: Se trata de un disolvente que se usa para llevar los componentes de una mezcla a travs de una fase estacionaria.

Eluato: solucin o sustancia obtenida por un proceso de elucin. [Elucin: extraccin de una sustancia absorbida desde un lecho poroso o columna de cromatografa con un disolvente adecuado]

Disolvente: Un disolvente es una sustancia que permite la dispersin de otra en su seno. Es el medio dispersante de la disolucin. Normalmente, el disolvente establece el estado fsico de la disolucin, por lo que se dice que el disolvente es el componente de una disolucin que est en el mismo estado fsico que la disolucin. Tambin es el componente de la mezcla que se encuentra en mayor proporcin. Las molculas de disolvente ejercen su accin al interaccionar con las de soluto y rodearlas. Se conoce como solvatacin. Solutos polares sern disueltos por disolventes polares al establecerse interacciones electrostticas entre los dipolos. Los solutos no polares disuelven las sustancias no polares por interacciones entre dipolos inducidos. El agua es habitualmente denominada el disolvente universal por la gran cantidad de substancias sobre las que puede actuar como disolvente.

Fase mvil: La fase mvil puede ser un lquido o un gas, y su funcin es transportar a los componentes de la mezcla a travs del sistema cromatogrfico.

Fase estacionaria: Esta fase permanece fija y consiste en partculas, generalmente slidas, pequeas y con una superficie microporosa, de forma que presenta un amplio desarrollo superficial. Puede estar empaquetada en forma de columna o extendida en forma de capa. En ocasiones es necesario un tratamiento qumico de la fase estacionaria para conseguir unas partculas de tamao y poro adecuados.

Rf.: Relacin de frentes. Es el cociente de la divisin fs/ fd (distancia recorrida por el soluto entre distancia recorrida por el disolvente. Se utiliza con fines de identificacin de compuestos cando se tienen patrones de referencia. 5.- Hacer una comparacin entre la cristalizacin, extraccin, destilaciones y cromatografa, en cuanto a la eficiencia como mtodos de separacin y purificacin. La cristalizacin es un mtodo de purificacin de slidos el cual es muy buen mtodo solo para slidos y con un buen rendimiento. El mtodo de extraccin se utilizo para la separacin liquido-liquido, en base a la eleccin de un buen disolvente, la extraccin resulta muy eficiente para este tipo de separacin. Las destilaciones requieren de mucho cuidado y tiempo, ya que como vimos en prcticas anteriores una destilacin lenta y con un nmero de mayor de platos tericos, en comparacin a una destilacin simple y muy rpida, muestra la destilacin fraccionada mayor eficacia. Cada mtodo tiene buena eficiencia segn se utilice en el proceso correcto, es decir, depende del estado de agregacin de la sustancia a separar y purificar, as como del estado en el que se encuentren los contaminantes y los disolventes utilizados.

6.-Establecer una distincin clara entre cromatografa en columna y capa fina e indicar en que casos es preferible alguno de los mtodos Un proceso cromatografico en columna tiene ventaja de ser separacin a capa preparativa, y no es de aplicacin analtica como la cromatografa en capa fina, es decir la cromatografa en capa fina sirve solo para verificar la pureza de un compuesto, de hecho, si es una sustancia que se separo por columna cromatografa, se puede llevar a cromatografa de capa fina verificar la pureza de cada fraccin obtenida de la columna.

Conclusiones
La cromatografa es la tcnica ms eficiente al compararla con destilaciones, cristalizacin, o extracciones, esto porque es aplicable a la gran mayora de las sustancias. La cromatografa en columna, nos permite usar una gran cantidad de la sustancia a separar, y la cromatografa en capa fina, nos permite realizar separaciones mltiples, al mismo tiempo, y sometidas al mismo proceso separativo.

Bibliografa
Tcnicas de bioqumica y biologa molecular. David Freifelder. Editorial Revert, 1991. ISBN: 8429118195. Cap. 8: Cromatografa. Pg. 179 Skoog, Douglas A. y Leary, James J. (1994), Anlisis Instrumental, Madrid: McGraw-Hill.