VALIDACIN DE LA DETERMINACIN DE ACEITE FUSEL (ALCOHOL NBUTANOL E ISOAMLICO) DENTRO DE UNA BEBIDA ALCOHOLICA RON POR CROMATOGRAFA DE GASES

CON DETECTOR FID

DIANA CAROLINA HERNNDEZ NARANJO CYNDI VANESSA SOTO TUMBAJOY EDWIN OROZCO MOSQUERA

UNIVERSIDAD DEL VALLE FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES TECNOLOGA QUMICA ANLISIS INDUSTRIALES SANTIAGO DE CALI 2012

VALIDACIN DE LA DETERMINACIN DE ACEITE FUSEL (ALCOHOL NBUTANOL E ISOAMLICO) DENTRO DE UNA BEBIDA ALCOHOLICA RON POR CROMATOGRAFA DE GASES CON DETECTOR FID

DIANA CAROLINA HERNNDEZ NARANJO CYNDI VANESSA SOTO TUMBAJOY EDWIN OROZCO MOSQUERA

Proyecto final de Anlisis Industriales

PROFESOR DEL CURSO Rubn Snchez Qumico Puro, M.Sc.

UNIVERSIDAD DEL VALLE FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES TECNOLOGA QUMICA ANLISIS INDUSTRIALES SANTIAGO DE CALI 2012

AGRADECIMIENTOS Al laboratorio de anlisis industrial de la Universidad del Valle de Cali por permitirnos el desarrollo de nuestra practica universitaria en el trabajo de validacin, en especial a nuestro profesor y gua Rubn Snchez Andica por su conocimiento y ayuda para que nuestro proyecto se llevara a cabo satisfactoriamente. Tambin queremos agradecer al profesor Junior Sandoval por el conocimiento adquirido en el curso de Estadstica Aplicada al Anlisis Qumico. Y a todas nuestras familias por su comprensin y apoyo durante el trabajo de nuestra validacin.

EPGRAFE La gente solo ve lo que est preparado para ver. Emerson.

TABLA DE CONTENIDO

Pg. LISTA DE TABLAS LISTA DE FIGURAS ANEXOS RESUMEN 1. INTRODUCCIN 1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 1.2 JUSTIFICACIN 1.3 OBJETIVOS 1.3.1 OBJETIVOS GENERALES 1.3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS 2. MARCO TERICO Y ANTECEDENTES 2.1RON 2.2 CONGNERES 2.3 ALCOHOLES SUPERIORES ACEITE FUSEL 2.4 CROMATOGRAFA DE GASES 2.5 EL DETECTOR DE IONIZACION DE LLAMA(FID) 2.6 INYECTOR SPLIT 2.7 COLUMNA CROMATOGRAFICA 2.8 DISEO EXPERIMENTAL 2.9 LA VALIDACIN 2.10 SELECTIVIDAD/ESPECIFICIDAD 2.11 TIEMPO DE RETENCIN 2.12 SIMETRA 2.13 PLATOS TERICOS 2.14 RESOLUCIN 2.15 CONCENTRACIN MNIMA DETECTABLE 2.16 CONCENTRACIN MNIMA CUANTIFICABLE 2.17 SENSIBILIDAD 2.18 PRESICIN 2.19 REPETIBILIDAD 3. PARTE EXPERIMENTAL 3.1 EQUIPOS Y MATERIALES DE LABORATORIO 3.2 CROMATOGRAFO USADO Y CONDICIONES CROMATOGRFICAS 3.3 REACTIVOS 3.4 PREPARACIN DE LA MUESTRAS Y PATRONES 3.4.1 SOLVENTE 3.4.2 SOLUCIN MADRE ALCOHOL N-BUTANOL 10 ppm 3.4.3 SOLUCION MADRE ALCOHOL ISOAMILICO 10 ppm

10 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 13 13 13 13 14 14 14 14 14 15 15 15 15 15 15 15 16 16 16 17 17 17 17 17

3.4.4 SOLUCIN PATRN INTERNO, ISOBUTANOL 15 ppm 3.4.5 PREPARACIN DE LA CURVA DE CALIBRACIN ALCOHOL NBUTANOL 3.4.6 PREPARACIN DE LA CURVA DE CALIBRACIN ALCOHOL ISOAMLICO 3.4.7 PREPARACIN DE MUESTRAS 3.4.8 PREPARACIN DEL DOPAJE 3.5 MODELO ESTADSTICO EXPERIMENTAL 3.5.1 MODELO EXPERIMENTAL REPLICACIN 3.5.2 PARMETROS ESTADSTICOS A VALIDAR 4. DATOS, CLCULOS, RESULTADOS Y DISCUSIN 4.1 DATOS PRIMARIOS 4.2 REPETIBILIDAD PARA EL ESTANDAR INTERNO 4.3 IDONEIDAD DEL SISTEMA CROMATGRAFICO Y ESPECEFIDAD 4.4 SELECTIVIDAD 4.5 CONCENTRACIN MNIMA DETECTABLE Y CUANTIFICABLE 4.6 PRECISIN 4.6.1 REPETIBILIDAD EN N-BUTANOL E ISOAMLICO 4.6.2 REPRODUCIBILIDAD EN N-BUTANOL E ISOAMLICO 4.7 DETERMINACIN DE LA LINEALIDAD EN LAS CURVAS 4.7.1 LINEALIDAD EN CURVA N-BUTANOL 4.7.2 LINEALIDAD EN CURVA ISOAMLICO 4.8 EXACTITUD 4.9 ANLISIS DE CONDICIONES CROMATOGRFICAS 4.10 IMPACTO DE REACTIVOS CONTAMINADOS EN CROMATOGRAMAS 4.11 CONCENTRACIN DE ALCOHOLES SUPERIORES MXIMO PERMITIDO SEGN LA NTC 4118 POR CG 4.12 RESULTADOS 5. CONCLUSIONES 6. RECOMENDACIONES 7. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

18 18 18 18 18 18 18 19 19 19 23 23 25 25 26 26 29 32 32 35 37 37 38 41 41 42 43 43

LISTA DE TABLAS

TABLA 1. Condiciones cromatogrficas en la que fue operado el cromatgrafo. TABLA 2. Pesos en mg usados en reactivos. Soluciones madres TABLA 3. Preparacin muestras TABLA 4. Preparacin dopajes TABLA 5. Resultados curva de estndares de n-butanol, concentracin, tiempo de retencin, rea butanol, rea patrn interno, simetra, base. TABLA 6. Resultados curva de estndares de isoamlico, concentracin, tiempo de retencin, rea butanol, rea patrn interno, simetra, base. TABLA 7. Resultado: butanol en muestras, tiempo de retencin, reas, simetra, base. TABLA 8. Resultado: isoamlico en muestras, tiempo de retencin, reas, simetra, base. TABLA 9. Resultado: patrn interno en muestras, tiempo de retencin, reas, simetra, base. TABLA 10. Resultado: etanol en muestras, tiempo de retencin, reas, simetra, base. TABLA 11. Datos de repetitividad para el patrn interno (alcohol isobutanol) TABLA 12. Parmetros cromatogrficos para los anlisis estudiados. TABLA 13. Parmetros y criterios de selectividad. TABLA 14. Tiempo de retencin de los analitos que se encuentran en la inyeccin de muestra de ron. TABLA 15. Resultados limite de deteccin del butanol e isoamlico TABLA 16. Limite de deteccin y cuantificacin para el n-butanol e
isoamlico

16 19 19 20 20

20 21 21 21 22 22 24 25 25 26 26 27 27 28 29 30 30 31 31 33 34

TABLA 17. Repetibilidad para el n-butanol. TABLA 18. Anlisis de varianzas ANOVA entre los tres grupos de muestra para el n-butanol. TABLA 19. Repetibilidad para el alcohol isoamlico. TABLA 20. Anlisis de varianzas ANOVA entre los tres grupos de muestra para el isoamlico TABLA 21. Reproducibilidad para el n-butanol. TABLA 22. Anlisis de varianza entre los grupos de las tres muestras para el n-butanol TABLA 23. Reproducibilidad del alcohol isoamlico TABLA 24. Anlisis de varianza ANOVA para el isoamlico TABLA 25. Anlisis de varianza ANOVA de la linealidad de la curva de calibracin de estndares de n-butanol. TABLA 26. Anlisis de intercepto, pendiente,

coeficiente de correlacin para la curva de estndares de n-butanol TABLA 27. Anlisis de varianza ANOVA de la linealidad de la curva de calibracin de estndares de isoamlico. TABLA 28. Anlisis de intercepto, pendiente, coeficiente de correlacin para la curva de estndares de isoamlico TABLA 29. Promedio de las ares de dopaje de n-butano e isoamlico y su posteriores concentraciones, y porcentajes de recuperacin. TABLA 30. Descripcin de la columna HP5 TABLA 31. Columnas Idneas para el anlisis de alcoholes superiores. TABLA 32. Promedio de concentraciones halladas de n-butanol e isoamlico en la muestra. TABLA33. Resultado de Idoneidad cromatogrfica para el nbutanol e isoamlico TABLA 34. Resultado precisin en alcuota inyectada y muestra madre TABLA 35. Resultado concentracin promedio de n-butanol e isoamlico con sus respectivos limites de confianza LISTA DE GRAFICAS

35 36 37 38 39 41 41 41 41

GRAFICA 1.Curva de calibracin para el n-butanol GRAFICA 2. Grafica curva de calibracin de estndares de isoamlico.
LISTA DE FIGURAS

32 35

FIGURA 1. Cromatgrama de los analitos que se encuentran en la inyeccin de muestra de ron. FIGURA 2.Cromatgrama de patrn isoamlico contaminado por otros alcoholes.
ANEXOS

23 40

ANEXO 1. Idoneidad y Especificidad del sistema cromatgrafico ANEXO 2. Promedio de tiempo de retencin para analitos de inters ANEXO 3. Limites de deteccin y cuantificacin para el n-butanol e isoamlico ANEXO 4. Anlisis de mnimos cuadrados para la curva de calibracin de estndares del n-butanol. ANEXO 5. Anlisis de mnimos cuadrados para la curva de calibracin de estndares de isoamlico ANEXO 6. Clculos experimentales para el intercepto, pendiente y

44 45 45 46 47 49

coeficientes de correlacin para las curvas de n-butanol e isoamlico en muestras de ron, incluyendo sus lmites de confianza al 95 %. ANEXO 7. Promedio de concentraciones n-butanol e isoamlico en muestras de ron, incluyendo sus lmites de confianza al 95 %. ANEXO 8. Figura cromatgrama tiempo muerto aire

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50

RESUMEN La funcin del proceso de validacin en los laboratorios analticos, es el proporcionar un alto grado de confianza a partir de una verificacin documentada de un debido mtodo especfico cuyo resultado debe cumplir con sus especificaciones predefinidas. Para asegurar la calidad de las bebidas alcohlica cuyo principio activo es el alcohol, principalmente tratndose de alcoholes superiores en el cual se emplea la determinacin de aceite de Fusel cuya normatividad vigente en laboratorios de pruebas y ensayos se trata de la NTC 5157 y la NTC 4118. En el presente informe muestra los resultados arrojados en los estudios de la validacin de la determinacin de alcoholes por aceite de Fusel por cromatografa gaseosa con FID con el fin de garantizar la reproducibilidad, sin incluir tan exitosamente la exactitud de los resultados analticos aplicados a la muestra alcohlica de la bebida Ron viejo de caldas cuyos resultados para el n-butanol e alcohol isoamlico son respectivamente: . Los parmetros de selectividad, especificidad, exactitud, precisin y linealidad que fueron evaluados en este estudio, cumplieron los criterios de aceptacin establecidos en el protocolo de validacin. La documentacin generada durante la validacin; Cromatgramas y las condiciones especificas utilizadas en el cromatografo generado por el software del equipo, se encuentra guardados en el mismo equipo en la carpeta Validacin M (que esta almacenada en la Universidad del Valle, ciencias exactas de Cali).

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1. INTRODUCCIN Es bien sabido que las bebidas alcohlicas fermentadas son bien consumidas por la sociedad colombiana. El ron, que es la bebida de inters de este proyecto, es una bebida obtenida de la fermentacin del jugo o melaza de la caa de azcar, donde dicha fermentacin se da en unos barriles de roble, ya que este le da su sabor particular. Debido a su alto consumo en este pas, el ron como bebida alcohlica consumible posee sus propias NTC(normas tcnicas colombiana), debido principalmente a los productos resultantes de la fermentacin del producto, que en ciertas proporciones pueden causar ligeros estragos en la salud del consumidor, tales como: nauseas, vomito, dolor de cabeza, todos estos sntomas mejor conocidos como la resaca. Es importante controlar estos parmetros de concentracin para evitar intoxicaciones que lleven a la muerte del que la ingiera, dicha mezcla de compuestos son: de composicin mineral (Cu, Fe, Zn, Mg, Mn, Cd, Pb, Ni, Co, Cr, Ca, Ba, Na, Li, Sr), perfil fenlico (cido glico, cido sirngico, miricetina, cido ellgico, siringaldehdo, vainilla, cido vainllico, epicatequina, catequina, escopoletina, coniferaldehdo, sinapaldehdo, trans-resveratrol, quercetina, eugenol, cumarina), contenido de caramelo, composicin de alcoholes (metanol, propanol, isobutanol, 2-butanol, butanol, alcohol isoamlico), contenido de cido acetico, contenido de etil acetato, aldehdos (formaldehdo, butiraldehdo, furfuraldehdo, 5-hidroximetilfurfural, acetaldehdo, crotonaldehdo, propionaldehdo, isobutiraldehdo, benzaldehdo, valeraldehdo, isovaleraldehdo, acrolena) y cetonas (2,3-butanodiona monoxima, ciclopentanona, acetilcetona, acetofenona, acetona, metil-isoamil-cetona), el inters de este proyecto se centra en el aceite de fusel, en especial al alcohol nbutanol e isoamlico, que aumenta su concentracin al haber mayor tiempo de fermentacin, Se producen a travs de la metabolizacin de los compuestos nitrogenados por las levaduras, estos alcoholes, en niveles altos, tienen un alto grado de toxicidad, los vmitos inducidos por desencadenan evitar muertes. Sin embargo, son un importante contribuyente a las resacas. Cuanto mayor sea el peso molecular de los relacionados con el alcohol, la peor es la resaca.

1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA El alcohol es una droga legal consumida por todas las culturas, excepto la musulmana, donde obtienen las bebidas alcohlicas por fermentacin natural o controlada, donde el fermentado constituyen las bebidas primarias tales como el ron y otras ms, donde se hace necesario cuantificar en qu proporcin se encuentran componentes de inters del ACEITE FUSEL dentro de la bebida alcohlica como el ron, aplicando una tcnica analtica confiable y selectiva como es la cromatografa gaseosa.

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1.2 JUSTIFICACIN Es necesario plantear controles de calidad a las bebidas alcohlicas fermentadas, debido a su alto porcentaje de consumo en los ltimos aos, para prevenir problemas de salud relacionados al consumidor. 1.3 OBJETIVOS

1.3.1 OBJETIVOS GENERALES - Determinar el contenido de alcoholes superiores (isoamlico y butanol) por cromatografa gaseoso en una muestra alcohlica fermentada (ron) utilizando patrn interno. 1.3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS - Determinar la toxicidad del aceite fusel dentro de la muestra alcohlica (ron) - Estimar y calcular los criterios de calidad analtica: Exactitud, linealidad, sensibilidad, limite de deteccin, limite de cuantificacin, repetibilidad, reproducibilidad, porcentaje de recuperacin y robustez, del ensayo, con el fin de aprobar un requisito para la validacin de mtodo cromatogrfico. - El objetivo general de cualquier diseo experimental es proporcionar una cantidad mxima de informacin pertinente al problema bajo investigacin.

2. MARCO TERICO Y ANTECEDENTES 2.1 EL RON es una bebida alcohlica que se obtiene a partir de la caa de azcar por fermentacin, destilacin y envejecimiento, generalmente en barricas de roble.

2.2 CONGNERES: sustancias voltiles naturales, diferentes de los alcoholes etlicos y metlicos, los cuales provienen de las materias primas empleadas o que se han originado durante el proceso de elaboracin de una bebida alcohlica. Dentro de los congneres se consideran sustancias tales como: alcoholes superiores, cidos, aldehdos, furfurales, esteres. 2.3 ALCOHOLES SUPERIORES O ACEITE DE FUSEL . Mezcla de alcoholes de tres o ms tomos de carbono que se producen normalmente en la fermentacin alcohlica. Se ha comprobado que dentro del aceite fusel se encuentran los siguientes alcoholes: o Alcohol n-propanol

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o o o o o o o o o o o o o o o

2-propanol Isopropanol N-butanol 2-metilpropanol Isobutanol 2-butanol 2-metil-2-propanol Alcohol isoamlico (3-metilbutanol) Alcohol amlico (2-metilbutanol) 1-pentanol 2-pentanol 3-pentanol 2-metil-2-butanol 3-metil-2-butanol Alcohol neopentilico ( 2,2-dimetilpropanol)

2.4 CROMATOGRAFA DE GASES es una de las tcnicas ms utilizadas internacionalmente para el anlisis de drogas de abuso, debido a que es muy especifica. Para llevar a cabo un anlisis cromatogrfico es necesario que la sustancia de inters sea lo suficientemente voltil como para que su molcula se encuentre en forma de vapor o gas a una temperatura igual o inferior a 400 c y que adems no se descompone a esas temperaturas. La (GC) es una tcnica de separacin, que se puede emplear tanto como tcnica de deteccin, de confirmacin y cuantificacin. Existen varios tipos de detectores y su eleccin depende de varios factores como son el precio, sensibilidad, selectividad, facilidad para operar con l, dificultad para encontrar repuestos. 2.5 EL DETECTOR DE IONIZACIN DE LLAMA (FID) es fcil de usar, barato y tiene respuesta con casi todas las drogas de inters toxicolgico. La respuesta del (FID) depende del nmero de tomos de carbono en la molcula, pero disminuye en los casos que tambin contengan oxgeno o nitrgeno. La mayor aplicacin de este detector es en el anlisis de compuestos voltiles, como el etanol. 2.6 INYECTOR SPLIT El modo de separacin ms extendido en la actualidad se basa en el empleo de columnas capilares. Estas columnas requieren muy pequeos volmenes de muestra. Esto se logra empleando un inyector que incorpora un divisor de flujo (split). Normalmente se introduce en la columna un 1% 2.7 COLUMNA CROMATOGRAFICA EN CG se emplean dos tipos de columnas: las empaquetadas o de relleno y las tubulares abiertas o capilares. Estas ltimas son ms comunes en la actualidad (2005) debido a su mayor rapidez y eficiencia. La longitud de estas columnas es

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variable, de 2 a 60 metros, y estn construidas en acero inoxidable, vidrio, slice fundida o tefln. Debido a su longitud y a la necesidad de ser introducidas en un horno, las columnas suelen enrollarse en una forma helicolidal con longitudes de 10 a 30 cm, dependiendo del tamao del horno. 2.8 DISEO EXPERIMENTAL: es una tcnica estadstica que permite identificar y cuantificar las causas de un efecto dentro de un estudio experimental. En un diseo experimental se manipulan deliberadamente una o ms variables, vinculadas a las causas, para medir el efecto que tienen en otra variable de inters. El diseo experimental prescribe una serie de pautas relativas qu variables hay que manipular, de qu manera, cuntas veces hay que repetir el experimento y en qu orden para poder establecer con un grado de confianza predefinido la necesidad de una presunta relacin de causa-efecto 2.9 LA VALIDACIN el desarrollo experimental debe existir una planeacin, que permita seguir de manera sistemtica cada paso de la investigacin, este proceso se denomina desarrollo experimental y con ello se logra obtener resultados confiables y reproducibles. La validacin comprende la determinacin de una serie de parmetros que demuestren que los resultados del mtodo son confiables y reproducibles. cada uno de los parmetros a validar debe tener un diseo experimental planteado donde se define la hiptesis nula ( ho), la hiptesis alternativa (h1), fijar la probabilidad de error (p) o confiabilidad, los grados de libertad (gdL), modelo matemtico que sea de acuerdo al modelo probabilstico. Posterior al diseo, se compara el valor experimental con el tabulado para aceptar o no la hiptesis planteada. 2.10 SELECTIVIDAD/ESPECIFICIDAD: Se considera selectividad como la habilidad de un mtodo para diferenciar y cuantificar uno o varios analitos en presencia de otros componentes que se sospecha puedan estar presentes en la muestra. La selectividad se evala inyectando varias muestras de solventes comunes que pueden estar presentes en bebidas alcohlicas como el ron. El mtodo se considera selectivo si ninguno de los blancos u otras sustancias analizadas presenta el mismo tiempo de retencin de los analitos de inters. La especificidad est definida como la habilidad que tienen el mtodo para medir de forma inequvoca los analitos de inters en presencia de otros componentes que pudiesen estar presente en la muestra. 2.11 TIEMPO DE RETENCIN: cada analito es retenido durante su recorrido cromatogrfico a un tiempo determinado y ese valor se mantiene mientras no se modifiquen las condiciones cromatogrficas. 2.12 SIMETRA: la distribucin de la cantidad de analito cuando se retiene en la fase estacionaria debe ser normal o gausiana presentndose una seal simtrica en el cromatgrama, sin embargo la incidencia de algunos factores

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hace que la distribucin no sea normal, lo que se refleja en un seal con cola o con efecto de coleo. Lo ideal es que la simetra sea cercana a 1. 2.13 PLATOS TERICOS: Mide el nmero de equilibrios del paso de la fase mvil a la fase estacionaria, su valor es una medida indirecta del ancho del pico para un pico a un tiempo de retencin especfico. La eficiencia de una columna y por ende su poder separativo se mide en funcin de stos. La eficiencia de una columna es una funcin de sus dimensiones (dimetro, longitud y espesor de la pelcula), el tipo de gas portador y su rata de flujo o velocidad lineal promedio, del compuesto y de su retencin. Su determinacin sirve para verificar que un mtodo sigue siendo idneo, controlar el estado de la columna o lo largo de su vida til, para comparar materiales o para optimizar un mtodo analtico. Una columna con un alto nmero de platos entregar un pico ms estrecho y agudo que una columna con un nmero bajo de platos. El nmero de platos tericos es solo vlido para unas condiciones especficas y en lo posible cuando el factor de retencin sea mayor que 5 se debe determinar. 2.14 RESOLUCIN: El trmino resolucin se utiliza para expresar el grado de separacin que hay entre dos picos adyacentes. La literatura recomienda que la resolucin entre analitos debe ser mayor de 2, de esta forma se evita que se puedan presentar falsos positivos. 2.15 CONCENTRACIN MNIMA DETECTABLE : es la cantidad de concentracin de un analito que proporciona una seal igual a la seal del blanco (ySB) ms tres veces la desviacin estndar del blanco SB. 2.16 CONCENTRACIN MNIMA CUANTIFICABLE: concentracin ms baja de un analito que puede ser determinada con aceptable precisin y exactitud. 2.17 SENSIBILIDAD: se refiere a la capacidad de un mtodo de diferenciar algunas variaciones en la concentracin del analito, depende de la pendiente de la curva de calibracin y de la reproducibilidad o precisin de los datos, un mtodo se considera sensible entre ms alta sea su pendiente. Se tomaron las curvas de calibracin utilizadas durante los procesos de anlisis rutinario. 2.18 PRECISIN: es la concordancia mutua entre datos que se han obtenido de la misma forma, e indica la medida del error aleatorio de un anlisis. 2.19 REPETIBILIDAD: se refiere a la concordancia de los resultados recolectados por el mismo investigador, los mismos reactivos, laboratorio e instrumento en un corto periodo de tiempo, se evala determinando el coeficiente de variacin (CV) o desviacin estndar relativa (RSD). CV o RSD = (s/x) * 100 S: desviacin estndar : Media aritmtica.

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3. PARTE EXPERIMENTAL 3.1 EQUIPOS Y MATERIALES DE LABORATORIO: - cromatgrafo de gases AGILENT 6890 GC, equipado con detector de ionizacin de llama (FID), con columna (HP-5). -Sistema de manejo de informacin, estacin de datos cromatogrficos de SOFTWARE DRIVER VERSION 5.02.060.0 - Columna capilar HP 5 de 30m x 0.25m de dimetro interno. - Micropipeta de 100 - 1000 L. - Balanza analtica con divisor de escala 0.0001g. - Inyectora manual de vidrio para CG, 10.0 L - Viales de plstico para inyeccin con la micropipeta. - Balones volumtricos de 25.00, 100.00, 1000.00 mL con boca y tapa esmerilada. -Pipetas volumtricas de 5.00, 10.00, y 20.00 mL -Vasos de precipitacin de 50.00, 100.00 mL 3.2 CROMATOGRAFO USADO Y CONDICIONES CROMATOGRFICAS: - Cromatgrafo usado: AGILENT 6890 GC - Software usado: SOFTWARE DRIVER VERSION 5.02.060.0 Cromatgrafo de gases fue operado en las condiciones que se describen en la TABLA 1.

TABLA 1. Condiciones cromatogrficas en la que fue operado el cromatgrafo. Heater: 200C Pressure : 9.5406 Psi Total flow : He 103.51 mL/min Split ratio 50:1 99.999 mL/min Pressure : 9.5406 Psi Flow : 1.999 mL/min Average : 33 cm/sg velocity

Inyector Mode split Gas settings: He Mode const flow

Columna

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Oven

Detector

Oven temp on 50C Oven Rate Value Hold time Post run 50C 4sg 35C Back detector : FID Heater 250C 2 H flow 40 mL/min Air flow 300 mL/min Make up flow/ HCl 45 mL/min Flame Electrometer 2pA

3.3

REACTIVOS: - Alcohol n-butanol. - Alcohol isoamlico. - Alcohol isobutanol. - Alcohol etanol. - Agua desmineralizada de calidad ISO tipo 1(milliQ o equivalente).

3.4

PREPARACIN DE LA MUESTRA Y PATRONES: 3.4.1 SOLVENTE Como solvente usado se emplea agua MilliQ, agua ultrapura, grado de laboratorio, que ha sido filtrada y purificada por osmosis inversa. 3.4.2 SOLUCIN MADRE ALCOHOL N-BUTANOL 10.00 ppm Se pesa en un baln volumtrico de 1000.00 mL, previamente tarado y se agrega aproximadamente 10 mg de alcohol n-butanol grado analtico, se adiciona con una micropipeta, en seguida se completa con el solvente hasta el aforo del baln y se tapa agitndose, para toda homogenizacin del patrn interno. 3.4.3 SOLUCIN MADRE ALCOHOL ISOAMLICO 10.00 ppm Se pesa en un baln volumtrico de 1000.00 mL, previamente tarado y se agrega 10 mg de alcohol isoamlico grado analtico, se adiciona con una micropipeta, en seguida se completa con el solvente hasta el aforo del baln y se tapa agitndose, para toda homogenizacin del patrn interno.

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3.4.4 SOLUCIN PATRN INTERNO, ALCOHOL ISOBUTANOL 15 ppm Se pesa en un baln volumtrico de 1000.00 mL, previamente tarado y se agrega 15 mg de alcohol isobutanol grado analtico, se adiciona con una micropipeta, en seguida se completa con el solvente hasta el aforo del baln y se tapa agitndose, para toda homogenizacin del patrn interno. 3.4.5 PREPARACIN DE LA CURVA DE CALIBRACIN ALCOHOL NBUTANOL: El rango comprendido de concentracin del alcohol n-butanol es (0.04, 0.12, 0.2, 0.4, 1.2, 2.0, 4.0, 8.0) mg/L, adems se agrega 5 mL de patrn interno a cada punto de la curva, se preparan en balones de 25.00 mL 50.00 mL, para aadir el volumen, se transfiri de la solucin madre alcohol n-butanol a los balones volumtricos con una micropipeta (vase punto 12.1.6) 3.4.6 PREPARACIN ISOAMLICO: DE LA CURVA DE CALIBRACIN ALCOHOL

El rango comprendido de concentracin del alcohol isoamlico es (0.04, 0.12, 0.2, 0.4, 1.2, 2.0, 4.0, 8.0) mg/L, adems se agrega 5.00 mL de patrn interno, a cada punto de la curva, se preparan en balones de 25.00 mL 50.00 mL, para aadir el volumen, se transfiri de la solucin madre alcohol isoamlico a los balones volumtricos con una micropipeta (vase punto 12.1.6) 3.4.7 PREPARACIN DE LAS MUESTRAS: Se transfiere 20.00 mL de muestra (bebida alcohlica, ron), usando una pipeta volumtrica de 20.00 mL, a un baln volumtrico de 25.00 mL, adems se agrega 5.00 mL (pipeta volumtrica) de patrn interno, no se enrasa con solvente, es decir, se inyecta la muestra mezclada con patrn interno. 3.4.8 PREPARACIN DE DOPAJE Se transfiere volumtricamente en un baln volumtrico de 25 mL, 5 mL de solucin alcohol n-butanol 1 ppm, 5 mL de solucin alcohol isoamlico 1 ppm y 5 mL de patrn interno. 3.5 MODELO ESTADSTICO EXPERIMENTAL: 3.5.1 Diseo experimental REPLICACIN: Por esta se entiende que cada tratamiento (o alguno de los tratamientos) debe ser aplicado a varias unidades experimentales. La replicacin sirve para: Proveer un estimado del error experimental, tal estimacin se convierte en la unidad bsica para determinar si las diferencias observadas en los datos son estadsticamente significativas

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Incrementar la precisin por medio de la reduccin de errores estndar. Calcular una estimacin ms precisa del efecto de un factor en el experimento si se usa la media muestral como una estimacin de dicho efecto.

3.5.2 Parmetros estadsticos a validar: - repetividad del patrn interno - idoneidad y especificidad del sistema cromatogrfico: - resolucin (R) - factor de capacidad (K) - factor de simetra (S) - tiempo de retencin (tr) - selectividad - concentracin mnima detectable y cuantificable - precisin: - repetitividad en n-butanol e isoamlico en muestras - reproducibilidad n-butanol e isoamlico en muestras - linealidad - Exactitud - Sensibilidad 4 4.1 DATOS, CLCULOS, RESULTADOS Y DISCUSIN DATOS PRIMARIOS TABLA 2. Pesos en mg usados en reactivos. Soluciones madres Solucin madre n-butanol, mg/L 10/1 Solucin madre isoamlico, mg/L 10/0.100 Solucin patrn interno, mg/L 15/1

TABLA 3. Preparacin muestras Volumen muestra, mL 20.00 Volumen patrn interno 5.00 Baln volumtrico usado 25.00

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TABLA 4. Preparacin dopajes Volumen y concentracin dopaje n-butanol, mL y ppm 5.00 y 1 Volumen y concentracin dopaje n-butanol, mL y ppm 5.00 y 1 Volumen y concentracin dopaje n-butanol, mL y ppm 5.00 y 15

Volumen muestra, mL 10.00

Baln volumtrico 25.00

TABLA 5. Resultados curva de estndares de n-butanol, concentracin, tiempo de retencin, rea butanol, rea patrn interno, simetra, base. Curva, ppm 0,04 0,12 0,2 1,2 4 8 tiempo rea rea rea de (Analito/Patrn patrn simetra butanol retencin Interno) interno N/A N/A N/A N/A N/A 2,494 2,488 2,483 2,467 2,451 0,2 0,39098 0,87121 6,70866 14,2661 2,5 5,2 11,5 85,2 176,9 12,5 13,3 13,2 12,7 12,4 0,384 0,31 0,24 0,218 0,252 0,038 0,0339

base N/A 0,0527 0,0487

TABLA 6. Resultados curva de estndares de isoamlico, concentracin, tiempo de retencin, rea butanol, rea patrn interno, simetra, base. tiempo rea rea rea de (Analito/Patrn patrn simetra butanol retencin Interno) interno N/A N/A N/A N/A N/A N/A 3,772 3,763 3,749 3,741 3,739 3,746 N/A 0,625 1,75 5,1954023 9,1333333 19,1875 38,817308 N/A 6 16,1 45,2 82,2 184,2 403,7 N/A 9,6 9,2 8,7 9 9,6 10,4 N/A N/A 0,384 0,31 0,24 0,218 0,252

curva 1 0,04 0,12 0,2 0,4 1,2 2 4 8

base N/A N/A N/A 0,0527 0,0487 0,452 0,038 0,0339

20

TABLA 7. Resultado: butanol en muestras, tiempo de retencin, reas, simetra, base. # muestras 1 2 3 4 5 6 7 rea 2,3 1,8 2,1 2,4 1,9 4,8 4,4 tiempo de retencin 2,218 2,459 2,461 2,458 2,461 2,451 2,455 Simetra 1,579 1,667 1,996 2,773 2,291 1,169 1,499 base 0,0324 0,0331 0,0336 0,0365 0,0356 0,0548 0,0568

TABLA 8. Resultado: isoamlico en muestras, tiempo de retencin, reas, simetra, base. # muestras 1 2 3 4 5 6 7 rea 2,7 3 3,4 3,8 3,9 4 4 tiempo de retencin 3,786 3,084 3,086 3,079 3,081 3,376 3,377 Simetra 0,479 0,55 0,566 0,663 0,651 0,365 0,377 base 0,024 0,0281 0,0284 0,0365 0,0356 0,0617 0,0648

TABLA 9. Resultado: patrn interno en muestras, tiempo de retencin, reas, simetra, base. # muestras 1 2 3 4 5 rea 3,4 4,2 3,4 3,6 4,1 tiempo de retencin 2,781 2,774 2,778 2,77 2,769 Simetra 1,579 1,667 1,996 2,773 2,291 base 0,0324 0,0331 0,0336 0,0365 0,0356

21

TABLA 10. Resultado: etanol en muestras, tiempo de retencin, reas, simetra, base. # muestras 1 2 3 4 5 rea 6850,8 6521,8 7147,3 7613,2 7599,6 tiempo de retencin 2,28 2,527 2,53 2,526 2,53 Simetra 1,579 1,667 1,996 2,773 2,291 base 0,0324 0,0331 0,0336 0,0365 0,0356

4.2

REPETIBILIDAD PARA EL ESTANDAR INTERNO El estndar interno se utiliza en cromatografa de gases con el fin de poder efectuar una determinacin cuantitativa, ya que la cantidad de analito es proporcional a la intensidad del pico, para ello se realiza una curva de calibracin con estndares de concentracin conocida, cada muestra conteniendo el estndar, esta curva es una dependencia entre la relacin de concentraciones y la relacin de reas (Analito / estndar interno), el estndar garantiza una relacin constante de reas con los analitos presentes en la muestra. Por esto se hace necesario inicialmente evaluar la repetibilidad que presenta el estndar interno en cuanto a sus reas y en su tiempo de retencin. El estndar interno alcohol isobutanol, fue preparado el 02 de Junio de 2012. El estndar presenta una buena repetitividad ya que su desviacin estndar relativa no supera el 5%. TABLA 11. Datos de repetitividad para el patrn interno (alcohol isobutanol) # muestra 1 2 3 4 5 promedio S CV(%) tiempo de retencin 2,781 2,774 2,778 2,77 2,769 2,7744 0,005128353 0,184845464 rea 3,4 4,2 3,4 3,6 4,1 3,74 0,38470768 10,2863016

En la tabla 11 se puede apreciar que las mediciones realizadas al estndar interno presentan buena repetitividad y estabilidad desde su preparacin,

22

presentando un coeficiente de variacin menor del 5%, lo cual indica que el estndar aun esta en optimas condiciones. 4.3 IDONEIDAD DEL SISTEMA CROMATGRAFICO Y ESPECEFIDAD Para determinar la idoneidad y especificidad del sistema cromatgrafico se realizo un anlisis de estadstica extendida sobre un Cromatgrama correspondiente a la muestra, ya que en l se presentan todos los analitos de inters (incluyendo tiempo muerto), los datos presentados en la TABLA 8 son un promedio de los valores reportados en el ANEXO 1 que son extrados directamente del equipo. FIGURA 1. Cromatgrama de los analitos que se encuentran en la inyeccin de muestra de ron.

Observaciones:
(1) El pico del etanol es mucho ms grande debido a su gran concentracin con respecto a los dems. Ntese lo cercanos que estn los picos del etanol y n-butanol

Pico del etanol

(2)

Pico del n-butanol

Pico del patrn interno

Pico del isoamlico

23

TABLA 12. Parmetros cromatogrficos para los anlisis estudiados. Parmetros evaluados Tiempo de retencin (tr) Factor de selectividad (K) Factor de simetra (S) Resolucin (R) Platos tericos (N)
ESTADSTICO

Criterio de aceptacin CV 5 % Entre 1.5 y 10 2 1.5 K S Alcohol n-butanol 2,0612 0,4878 23,664 0,5818 0,0762 13,093 0,841 0,0890 10,578 Isobutanol 2,0612 0,4878 23,664 N 79628,44 6988,84 8,777 202699,95 115383,61 56,924 98163,8646 15713,9174 16,008 105714,83 10830,74 10,245 R 1,9113 0,0837 4,377 16,1964 14,4022 88,923 2,1183 0,1700 8,023 8,7409 3,3766 38,630

tr (min.) 2,4114 0,1081 4,484 3,2232 0,1081 4,484 2,4786 0,111035 13 4,480 2,774 0,0051 0,185

promedio S CV (%) promedio S CV (%) promedio S CV (%) promedio S CV (%)

4,6329 0,1658 3,578 6,4784 0,7299 11,268 4,7508 0,2577 5,423 5,437 0,0119 0,219

Alcohol isoamlico

Alcohol etlico

Tiempo muerto, aire, min: 0.431. vase anexo 8.

En la TABLA 12, se puede observar que los tiempos de retencin para cada analito presentan coeficiente de variacin inferior a 5 %. El factor de capacidad tiene un rango de aceptacin entre 2 y 10, rango que se cumple para todos los analitos. Para todos los analitos se cumple que la simetra es menor de 1, excepto para el butanol e isoamlico aunque no se considera significativo ya que excede muy poco el rango, este parmetro lo que indica que no existen colas en los picos cromatogrficos. Se muestra que el nmero de platos tericos es significativamente alto. En cuanto a la resolucin se sabe que lo ideal es que sea mayor de 2, criterio que aceptan todos los analitos, para el isoamlico la resolucin fue mayor de 15 lo que indica que su separacin muy alejada del resto de los picos.

24

Segn estos resultados se puede considerar que el sistema cromatgrafico es idneo y especifico. 4.4 SELECTIVIDAD Se realizaron corridas de todos los analitos de inters para verificar los tiempos de retencin y determinar posibles interferencias. TABLA 13. Parmetros y criterios de selectividad. Parmetros evaluados Criterio de aceptacin Tiempo de retencin (tr) de los analitos de inters que pueden solaparse entre s mismos. Ninguno de los analitos presenta el mismo tiempo de retencin.

TABLA 14. Tiempo de retencin de los analitos que se encuentran en la inyeccin de muestra de ron. Tiempo de retencin de inters analito butanol isoamlico etanol isobutanol Tr 2,4114 3,2232 2,4786 2,774

Cada dato corresponde al promedio de 7 mediciones, vase ANEXO 2, para el promedio de los datos. En la tabla 14 se observa que no se presentaron interferencias entre el butanol, isoamlico, etanol, e isobutanol.

4.5

CONCENTRACIN MNIMA DETECTABLE Y CUANTIFICABLE Se realiz una corrida de una repeticin de cada una de las concentraciones de que se muestran en la tabla 15, a partir de los resultados obtenidos se pudio determinar que las concentraciones donde se logran determinar las seales de los analitos de manera cuantitativa son de 0,12 ppm para el n-butanol y 0,2 ppm para alcohol Isoamlico, ya que integran sus picos.

25

TABLA 15. Resultados limite de deteccin del butanol e isoamlico # de puntos en la curvas 1 2 3 4 5 6 7 Concentracin terica Butanol, ppm 0,04 0,12 0,2 0,4 1,2 2 4 Concentracin terica isoamlico 0,04 0,12 0,2 0,4 1,2 2 4

Concentracin leda, n-butanol 0,12 0,2 0,4 1,2 2 4

Concentracin leda, isoamlico 0,2 0,4 1,2 2 4

Y aplicndoles a las curvas de calibracin respectivamente de n-butanol e isoamlico TABLA 16. Limite de deteccin y cuantificacin para el n-butanol e isoamlico Limite de deteccin Isoamlico, n-butanol, ppm ppm 0.9 0.1 Limite de cuantificacin n-butano, ppm 3.0 Isoamlico, ppm 0.4

Vase ANEXO 3, para clculos de lmites de deteccin y cuantificacin para el nbutano e isoamlico. 4.6 PRECISIN Este trmino est determinado por dos conceptos, la repetibilidad y la reproducibilidad, que indican las desviaciones en los datos debidas a errores aleatorios durante el proceso. 4.6.1 REPETIBILIDAD EN N-BUTANOL E ISOAMLICO Para evaluar la repetibilidad del n-butanol en las muestras, las que se inyectaron al cromatgrafo, usando la curva de calibracin de estndares de nbutanol, con el fin de observar el coeficiente de variacin en los resultados arrojados.

26

TABLA 17. Repetibilidad para el n-butanol. n-butanol Analista Analista Analista #muestra 1 2 3 0,64117 0,6358 0,64624 0,5053 0,60893 promedio 0,58514 0,5801 0,61698 S CV (%) 0,07099 0,0788 0,04138 12,1328 13,579 6,70664 varianza 0,00504 0,0062 0,00171 0,5244 0,58772

curva usada

rea rea curva rea (Analito/Patrn patrn 1 butanol Interno) interno 0,04 0,12 0,2 1,2 4 8 N/A 0,2 0,390977 0,871212 6,708661 14,26613 N/A 2,5 5,2 11,5 85,2 176,9 N/A 12,5 13,3 13,2 12,7 12,4

Analista 1: Vanessa Soto (muestra: 1, 2, 3) Analista 2: Diana Hernndez (muestra 4, 5) Analista 3: Edwin Orozco (muestra 6, 7) Los valores de coeficiente de variacin fueron levemente altos para el primer y segundo grupo, debindose mayoritariamente a las inyecciones manuales que favorecieron al error aleatorio. Se aplica una prueba estadstica ANOVA, para averiguar si hay una diferencia entre las varianzas de las muestras en diferentes das. Tabla 18. Anlisis de varianzas ANOVA entre los tres grupos de muestra para el n-butanol.

Grupos
Columna 1 Columna 2 Columna 3

Cuenta
3 2 2

Suma
1,75541 1,1602 1,23396

Promedio
0,585136

Varianza
0,00504

0,5800995 0,0062051 0,6169808 0,0017122

Origen de las Suma de Grados de variaciones cuadrados libertad

Entre grupos Dentro de los grupos Total 0,001668 0,017997 0,019666 2 4 6

Promedio de los cuadrados

0,0044993

Probabilidad
0,837535

Valor crtico para F

6,944272

0,0008341 0,1853878

27

La tabla 18 relaciona el anlisis de varianza ANOVA efectuado a los resultados de la tabla 17, donde se observa que el valor F experimental es menor que el valor F critico, lo que indica que no hay diferencia estadsticamente significativa entre concentraciones. Tabla 19. Repetibilidad para el alcohol isoamlico.

Isoamlico #mue Analista 1 analista 2 stra 0,2556 ppm 0,2393 0,2976 prome dio S varian za CV (%) 0,2642 0,0301 0,0009 11,382 0,2876 0,2983 0,0150 0,0002 5,045 0,3083 0,3175 0,0130 0,0002 4,098 0,3089 analista 3 curva usada rea (Analito/ curva 1 Patrn Interno) 0,04 N/A 0,12 0,2 0,4 1,2 2 4 8 Analista 1: Vanessa Soto (muestra: 1, 2, 3) Analista 2: Diana Hernndez (muestra: 4, 5) Analista 3: Edwin Orozco (muestra: 6, 7) Para evaluar la repetibilidad del isoamlico en las inyecciones al cromatgrafo, usando la curva de calibracin de estndares isoamlico, con el fin de observar el coeficiente de variacin en los resultados arrojados. Los valores de coeficiente de variacin fueron levemente altos para el primer grupo, debindose mayoritariamente a las inyecciones manuales que favorecieron al error aleatorio. N/A 0,625 1,75 5,195 9,133 19,188 38,817 rea butanol N/A N/A 6 16,1 45,2 82,2 184,2 403,7 rea patrn interno N/A N/A 9,6 9,2 8,7 9 9,6 10,4

0,3267

28

Tabla 20. Anlisis de varianzas ANOVA entre los tres grupos de muestra para el isoamlico

Grupos
Columna 1 Columna 2 Columna 3

Cuenta
3 2 2

Suma
0,79251 0,59657 0,63506

Promedio
0,26417 0,298285 0,317531

Varianza
0,000904 0,000226 0,000169

Origen de Suma de Grados de las cuadrados libertad variaciones

Entre grupos Dentro de los grupos Total 0,00365 0,002204 0,005854 2 4 6

Promedio de los cuadrados

0,001825 0,000551

F
3,311862

Probabilidad
0,141764

Valor crtico para F

6,944272

La TABLA 20 relaciona el anlisis de varianza ANOVA efectuado a los resultados de la TABLA 19, donde se observa que el valor F experimental es menor que el valor F critico, lo que indica que no hay diferencia estadsticamente significativa entre concentraciones. 4.6.2 REPRODUCIBILIDAD EN N-BUTANOL E ISOAMLICO Para evaluar la reproducibilidad del n-butanol en las muestras ya incluyendo los factores de dilucin que para este caso sera: 25.00 mL (muestra ms patrn interno)/ 20.00 mL muestra, usando la curva de calibracin de estndares de n-butanol, con el fin de observar el coeficiente de variacin en los resultados arrojados, para ver si hubo variacin en los volmenes de muestra ms patrn preparados al momento de ser inyectados al cromatgrafo.

29

TABLA 21. Reproducibilidad para el n-butanol. n-butanol #muestra Analista 1 0,8015 ppm 0,6316 0,7612 promedio S varianza CV (%) 0,7314 0,08874 0,0078 12,133 0,6555 0,7251 0,0985 0,0097 13,579 0,7347 0,7712 0,0517 0,0027 6,7066 Analista 2 0,7948 Analista 3 0,8078 curva usada rea rea curva rea (Analito/Patrn patrn 1 butanol Interno) interno 0,04 0,12 0,2 1,2 4 8 N/A 0,2 0,39098 0,87121 6,70866 14,2661 N/A 2,5 5,2 11,5 85,2 176,9 N/A 12,5 13,3 13,2 12,7 12,4

Analista 1: Vanessa Soto (muestra 1, 2, 3) Analista 2: Diana Hernndez (muestra 4, 5) Analista 3: Edwin Orozco (muestra 6, 7) TABLA 22. Anlisis de varianza entre los grupos de las tres muestras para el nbutanol

Grupos
Columna 1 Columna 2 Columna 3

Cuenta
3 2 2

Suma
2,19426 1,450249 1,542452

Promedio
0,73142 0,72512 0,77123

Varianza
0,007875 0,0096955 0,0026753

Origen de Grados Suma de las de cuadrados variaciones libertad

Entre grupos Dentro de los grupos Total 0,0026 0,0281 0,0307 2 4 6

Promedio de los cuadrados

0,0013 0,00703

F
0,1853878

Probabilidad
0,8375

Valor crtico para F

6,94427

30

TABLA 23. Reproducibilidad del alcohol isoamlico Isoamlico #muestra analista analista analista 1 2 3 0,3195 ppm 0,2991 0,3720 promedio 0,3302 S varianza CV (%) 0,0376 0,0014 11,382 0,360 0,3729 0,0188 0,0004 5,045 0,3854 0,3969 0,0163 0,0003 4,098 0,04 0,12 0,2 0,4 1,2 2 4 8 Analista 1: Vanessa Soto (muestra: 1, 2, 3) Analista 2: Diana Hernndez (muestra: 4, 5) Analista 3: Edwin Orozco (muestra. 6, 7) TABLA 24. Anlisis de varianza ANOVA para el isoamlico 0,3862 0,4084 curva 1 curva usada rea (Analito/Patrn Interno) N/A N/A 0,625 1,75 5,195 9,133 19,188 38,817 rea butanol N/A N/A 6 16,1 45,2 82,2 184,2 403,7 rea patrn interno N/A N/A 9,6 9,2 8,7 9 9,6 10,4

Grupos
Columna 1 Columna 2 Columna 3

Cuenta
3 2 2

Suma
0,99064 0,74571 0,79383

Promedio
0,33021 0,37286 0,39691

Varianza
0,001413 0,000354 0,000265

Origen de Suma de las cuadrados variaciones

Entre grupos Dentro de los grupos Total 0,0057 0,00344 0,00915

Grados de libertad
2 4 6

Promedio de los cuadrados

0,00285 0,00086

F
3,311862

Probabilidad
0,1417641

Valor crtico para F

6,944272

31

4.7

DETERMINACION DE LA LINEALIDAD DE LAS CURVAS La evaluacin de la linealidad de una grfica de calibracin se realiza con la herramienta de regresin lineal, la dispersin de los puntos que componen la grafica se ajustan a una lnea recta empleando el mtodo de los mnimos cuadrados que generan una ecuacin de la forma y = bx + a donde b corresponde a la pendiente y a al intercepto en el eje y, y se obtiene de la relacin de reas del analito y el estndar interno, x es la concentracin tanto del n-butanol como del isoamlico. El valor del coeficiente de correlacin (r) debe ser cercano a 1 para tener una correlacin directamente proporcional.

4.7.1 LINEALIDAD CURVA N-BUTANOL Se evalu la linealidad en la curva realizada de n-butanol, contando con 6 puntos cuyas concentracin (vase punto 3.4.4), donde se aplica una regresin lineal, donde se analiza el intercepto, pendiente, coeficiente de correlacin. GRAFICA 1. Curva de calibracin para el n-butanol

Curva de Calibracin n-butanol

Relacin Area butanol/area patrn interno 16 14 12 10 y = 1,8245x - 0,4934

8
6 4 2 0 -2 0 2 4 6 Concentracion n-butanol, ppm 8 10

32

TABLA 25. Anlisis de varianza ANOVA de la linealidad de la curva de calibracin de estndares de n-butanol. Vase ANEXO 4, donde se aplica un anlisis de mnimos cuadrados a los datos de la TABLA 5. Estadsticas de la regresin Coeficiente de correlacin mltiple Coeficiente de determinacin R^2 R^2 ajustado Error tpico Observaciones ANLISIS DE VARIANZA 0,99616642 0,99234754 0,99043442 0,56282214 6

Grados de libertad
Regresi n Residuos Total 1 4 5

Suma de cuadrados
164,3103624 1,267075047 165,5774375

Promedio de los cuadrados

164,3103624 0,316768762

F
518,7075 9

Valor crtico de F
2,20163E05

Los resultados del anlisis de la varianza ANOVA realizado para la curva de calibracin de estndares de n-butanol que se encuentran en las tablas 24 respectivamente, se observar que el F experimental es mayor que el F critico, por lo que no se rechaza la hiptesis nula, es decir, no hay desvo en la regresin.

33

TABLA 26. Anlisis de intercepto, pendiente, coeficiente de correlacin para la curva de estndares de n-butanol parmetro b Sb T critico Limite de confianza superior Limite de confianza inferior Tb experimental a Sa T critico Limite de confianza superior Limite de confianza inferior Ta experimental r r2 Tr experimental T critico curva de calibracin 1,8245 0,080109 95 % (gdL 4)= 2,78 2,0304 Tb experimental > t critico, se rechaza la hiptesis nula, pendiente es significativamente diferente de cero. comparacin

1,6186 22,77515 -0,4934 0,295527 95 % (gdL 4)= 2,78 0,2661 Ta experimental < t critico, se acepta la hiptesis nula, el intercepto no es significativamente diferente de cero.

-1,2529 -1,669399 0,9962 0,9923 22,775151 95 % (gdL 4)= 2,78

T experimental > T critico, se rechaza la hiptesis nula, el coeficiente de correlacin es diferente a cero.

Vase ANEXO 6, para clculos de los T experimentales del intercepto, pendiente y coeficiente de correlacin para el n-butanol

34

4.7.2 LINEALIDAD CURVA ISOMILICO Se evalu la linealidad en la curva realizada de isoamlico, contando con 6 puntos cuyas concentracin (vase punto 3.4.3), donde se aplica una regresin lineal, donde se analiza el intercepto, pendiente, coeficiente de correlacin. Vase ANEXO 4. GRAFICA 2. Grafica curva de calibracin de estndares de isoamlico. 45 rea isoamilico/area patron interno 40 35 30 25 20 15

Curva de calibracin Isomilico

y = 4,9083x - 0,4903 R = 0,9998

10
5 0 0 1 2 3 4 5 6 concentracin isomilico, ppm 7 8 9

TABLA 27. Anlisis de varianza ANOVA de la linealidad de la curva de calibracin de estndares de isoamlico.

Estadsticas de la regresin
Coeficiente de correlacin mltiple 0,99992154 Coeficiente de determinacin R^2 R^2 ajustado Error tpico Observaciones
Grados de libertad
Regresin Residuos Total 1 5 6

0,99984308 0,9998117 0,19337164 7

Suma de cuadrados
1191,28161 0,18696296 1191,46858

Promedio de los cuadrados

1191,28161 0,03739259

F
31858,7596

Valor crtico de F
1,0473E-10

35

Los resultados del anlisis de la varianza ANOVA realizado para la curva de calibracin de estndares de isoamlico que se encuentran en la TABLA 26 respectivamente, se observar que el F experimental es mayor que el F critico, por lo que no se rechaza la hiptesis nula, es decir, tampoco hay desvi en la regresin. TABLA 28. Anlisis de intercepto, pendiente, coeficiente de correlacin para la curva de estndares de isoamlico

parmetro b Sb T critico Limite de confianza superior Limite de confianza inferior Tb experimental a Sa T critico Limite de confianza superior Limite de confianza inferior Ta experimental r r2 Tr experimental T critico

curva de calibracin 4,9069 0,027199 95 % (gdL 5)= 2,57 4,9768

comparacin

4,8370 180,402288 -0,4870 0,107375 95 % (gdL 5)= 2,57 -0,2110

Tb experimental > t critico, se rechaza la hiptesis nula, pendiente es significativamente diferente de cero.

-0,7629 -4,535440 0,9999 0,9999 180,402288 95 % (gdL 4)= 2,78

Ta experimental < t critico, se acepta la hiptesis nula, el intercepto no es significativamente diferente de cero.

T experimental > T critico, se rechaza la hiptesis nula, el coeficiente de correlacin es diferente a cero.

Vase ANEXO 6, para clculos de los T experimentales del intercepto, pendiente y coeficiente de correlacin para el isoamlico

36

4.8

EXACTITUD TABLA 29. Promedio de las ares de dopaje de n-butano e isoamlico y su posteriores concentraciones, y porcentajes de recuperacin.

# dopajes

promedio reas butanol*-isoamlico**

concentracin terica, ppm

concentracin experimental, ppm

1 2 3 4 promedio

2,9 2 2,45

1,8 1,1 5,9 2,3 2,775

1 1 1 1

1,859876859 0,46607892 1,366592201 0,323422 1,30164086 0,56797672

1,613263453 0,66477963

% recuperacin n-butanol * 161, 32 % recuperacin isoamlico ** 66,48 Este parmetro no se cumpli porque desde el principio se asumi que la muestra no posea cantidades de alcoholes superiores, y debido a que las concentraciones de los dopajes tanto en el n-butanol como del alcohol isoamlico son similares a los hallados en las muestras, se vio afectado los dopajes con los analitos encontrados en la muestra. Vase TABLA 4. Simplemente se dio practicar el dopaje por separado, es decir, sin muestra. 4.9 SENSIBILIDAD Esta dada por la pendiente de las curvas, respectivamente de n-butanol e isoamlico; 1.825 ppm/pA y 4.907 ppm/pA, por las pendientes arrojadas por el anlisis de mnimos cuadrados (vase ANEXOS 5 y 6) en las curvas de calibracin tanto del n-butanol como del isoamlico, se puede observar que la pendiente de la curva de estndares para el isoamlico es ms sensible que la curva de estndares para el n-butanol vindose reflejados en los lmites de cuantificacin para ambos analitos (vase TABLA 16).

37

4.10

ANLISIS DE CONDICIONES CROMATOGRFICAS TABLA 30. Descripcin de la columna HP5 Columna Polaridad Composicin Rango de T (c0) aproximada Aplicacin Semivoltiles, alcaloides, drogas, FAME, compuestos halogenados, pesticidas, herbicidas

HP-5ms, DB-5, HP5

No polar

5% fenil 95% dimetilpolisiloxano

De -60 a 325/350

La columna usada para el anlisis de alcoholes superiores fue la columna capilar HP-5: donde la fase estacionaria de lquidos o de gomas (polisiloxanos y polietilenglicoles), existen tres interacciones fundamentales: dispersin, dipolo y enlace de hidrgeno, La separacin se obtiene cuando las interacciones entre la fase estacionaria y los solutos son distintas. A continuacin se describen las interacciones en la columna HP-5, estn las interacciones de dispersin: constituye la interaccin por antonomasia de todas las fases estacionarias de polisiloxanos y polietilenglicoles. La dispersin se puede resumir en el concepto de volatilidad, ms voltil sea un soluto ms rpido eludir de la columna. Los puntos de ebullicin son considerablemente vlidos al tratar compuestos con estructuras, grupos funcionales o series homlogas similares (como los alcoholes que el de menor punto de ebullicin eludir primero hasta el al de mayor punto de ebullicin ser el ltimo en salir). Para este caso los puntos de ebullicin para el etanol es: 78 C, n-butanol 118 C, alcohol isoamlico 132 C, y del patrn interno (isobutanol) 108. Pero en los cromatgramas arrojados en las inyecciones de las muestras se evidencio que el primer alcohol menor retenido fue el n-butanol y despus el etanol, adems que los picos de estos compuestos estn muy juntos (vase FIGURA 1), debiendo ser al contrario. Estn tambin las interacciones dipolo de la HP5, la columna 5% fenil 95% dimetilpolisiloxano no soporta las interacciones dipolo al ser una columna apolar y las interacciones de enlace de hidrogeno, donde no se puede realizar bien estas interacciones por ser una columna capilar apolar. Como se menciono anteriormente, el orden de salida de los alcoholes puede verse alterado por las polaridades de los alcoholes y la fase estacionaria, adems de por otras interacciones (puentes de hidrogeno que posee los alcoholes). Que en los alcoholes tiende a formar enlaces de vanders walls y puentes de hidrogeno entre ellos, haciendo que su separacin sea menos efectiva y dando ensanchamientos de los picos cromatogrficos, debido a la poca resolucin de la columna HP-5 que no soporta estas interacciones haciendo ms compleja la identificacin de los analitos.

38

A continuacin se presenta en la TABLA 31, la columna que se debi usar para la validacin de alcoholes superiores. TABLA 31. Columnas Idneas para el anlisis de alcoholes superiores. Columna Polaridad Composicin Rango de T (c0) aproximada Aplicacin Alcoholes, cidos orgnicos libres, disolventes, aceites esenciales, aromas y fragancias, herbicidas

Carbowax, DBWAXetr, HPINNOWax

polar

Polietilenglicol

De 20 a 250/260

Las columnas (Carbowax, DB-WAXetr, HP-INNOWax) son las columnas idneas para validar el mtodo ya que las cuales tiene las interacciones de dispersin, dipolo, enlace de hidrogeno que influyen en La separacin, que se obtiene entre la fase estacionaria y los solutos dando una muy buena selectividad: de la columna de distinguir dos molculas del soluto en funcin de las diferencias en sus propiedades qumicas o fsicas. La polaridad en la columna capilar ejerce una influencia muy notable en la retencin del compuesto y, en consecuencia, en la separacin. En los compuestos con una volatilidad similar, la retencin ser ms alta en el caso de los solutos con polaridades similares a la fase estacionaria; es decir, los compuestos polares presentan una mayor retencin en una fase estacionaria polar que en una fase estacionaria menos polar, los cambios en el orden de retencin y elucin pueden atribuirse en gran medida a los cambios en la polaridad de la fase estacionaria.

4.11

IMPACTO DE REACTIVOS CONTAMINADOS EN CROMATOGRAMAS La cromatografa de gases representa una tcnica sensible y exacta para la cuantificacin y separacin de compuestos qumicos, en ese sentido, se debe de tener un especial cuidado con la preparacin de las muestras para obtener buenos resultados empleando el mtodo para la cuantificacin de isobutanol y butanol (alcoholes superiores) en una muestra de ron comercial. Se tuvo el cuidado necesario al inyectarse la cantidad adecuada de muestra, en el menor tiempo posible y conseguir la vaporizacin total de las muestras no gaseosas, adems la muestra utilizada debi cumplir las siguientes condiciones para dar buenos resultados en la separacin de compuestos:

39

Compuestos en estado gaseoso, o bien en estado lquido y slido, con presiones de vapor de por lo menos 0.3 mm de mercurio a la temperatura mxima de la fase estacionaria empleada. No descomponibles por el calor a la temperatura de la separacin. No adsorbibles o descomponibles por el soporte slido de la columna. Detectables a la salida. Todos los disolventes y reactivos a utilizar debern ser de calidad P.A. O, preferiblemente de calidad para anlisis de residuos. Todos los reactivos de calidad P.A. deben ser utilizados, debido a que si no se utilizan estos puede dar lugar a interferencias.

En este ltimo punto mencionado se debe tener bastante cuidado debido a que si no se utilizaron los reactivos mencionados de grado analtico que Son aquellos productos que cumplen con las normas de la ACS (American Chemical Society) son las ms frecuentemente utilizadas, debido a que garantiza confianza en sus resultados; al no utilizar o no tener un fcil acceso a estos reactivos de este grado de calidad se tuvieron ciertos contratiempos debido a que al no cumplir con esta norma da lugar a un desdoblamiento de algunos de los picos del cromatgrama como resultado de un solvente no esperado. Sin mencionar que los reactivos utilizados durante el proceso de anlisis de alcoholes superiores fueron contaminados por otros alcoholes, debido a que otras personas utilizaron los reactivos para otros fines sin tener el cuidado concerniente para no contaminarlos. FIGURA 2. Cromatgrama de patrn isoamlico contaminado por otros alcoholes

40

4.11 CONCENTRACIN DE ALCOHOLES SUPERIORES MXIMO PERMITIDO SUGN LA NTC 4148 POR (CG). TABLA 32. Promedio de concentraciones halladas de n-butanol e isoamlico en la muestra. Promedio concentracin n-butanol en muestra ron, ppm 0,7410 Promedio concentracin isoamlico en muestra ron, ppm 0,9262

Parmetro de aceptacin, ppm 0.5

Vase ANEXO 7, para clculos de los promedios de las concentraciones de butanol e isoamlico en muestra de ron. Hay que recordar que se trabaj con el ron viejo de caldas 5 aos de aejamiento, por lo que significa que las concentraciones arrojadas son las esperadas, debido a que este ron en particular se aejo ms tiempo que los rones normales, por lo tanto mientras ms tiempo de aejamiento mas favorecer al aumento de alcoholes superiores, y aunque el ron es un producto destilado cabe destacar que aunque se destile siempre habr una fraccin de alcoholes superiores que se mezclan con el etanol. 4.12 RESULTADOS VALIDACIN: TABLA 33. Resultado de Idoneidad cromatogrfica para el n-butanol e isoamlico analito n-butanol isoamlico K Cumple cumple S Cumple cumple R Ligeramente desviado < 2 Bastante desviada 16 > 2 Tr Cumple cumple

Selectividad. Vase TABLA 14 Concentracin mnima detectable y cuantificable para n-butanol e isoamlico. Vase TABLA 16 TABLA 34. Resultado precisin en alcuota inyectada y muestra madre analito n-butanol isoamlico repetitividad reproducibilidad No hay diferencia significativa entre los resultados de las 7 muestras

41

Linealidad en n-butanol e isoamlico. Vase TABLA 26 Y 28 Exactitud. Vase TABLA 29 Sensibilidad. Vase PUNTO 4.9 TABLA 35. Resultado concentracin promedio de n-butanol e isoamlico con sus respectivos limites de confianza. Promedio concentracin nbutanol en muestra ron, ppm Vase ANEXO 7. 5. CONCLUSIONES El mtodo aplica todos los parmetros de validacin porque cumple la rigidez estadstica de la metodologa de validacin de mtodos analticos. La prueba de varianza ANOVA fue una herramienta estadstica til a la hora de descartas diferencias significativas entre diferentes muestras inyectadas por distintos analistas. El mayor tiempo de retencin fue para el isoamlico el cual obedece a su punto de ebullicin por ser el mayor, pero el menor tiempo de retencin le correspondi al n-butanol aun as teniendo el segundo tiempo de ebullicin mayor despus del etanol, incluyendo la muy prxima cercana de los picos de n-butanol-etanol, donde se debe a la poca selectividad de la columna, lo cual se debe a las interacciones entre los alcoholes por puentes de hidrogeno en una columna apolar. al tener un alcohol destilado de una fermentacin de la melaza de la caa de azcar, donde el proceso, la sacarosa tiende a formar alcoholes lineales en mayor proporcin que los ramificados notndose una ligera proporcin de concentracin de n-butanol con respecto al alcohol isoamlico. Gracias a la buena repetitibilidad y estabilidad del patrn interno, tanto en las muestras y estndares de las curvas de calibracin (n-butanol e isoamlico), se puede garantizar una buena correlacin entre reas y concentraciones preparadas, para cuantificar de manera confiable las muestras preparadas, reduciendo en gran proporcin los errores aleatorios de la inyeccin manual.

Promedio concentracin isoamlico en muestra ron, ppm

Parmetro de aceptacin, ppm 0.5

42

6. RECOMENDACIONES Verificar que todos los reactivos a utilizar en el anlisis de ACEITE DE FUSEL sean de grado analtico y estn libre de contaminacin. Asegurarse de utilizar la columna adecuada segn el analito a analizar, al igual que las condiciones cromatgrafo. Lavar todos los materiales de laboratorio con agua milliQ, para un anlisis seguro de interferencias. Ser cautelosos a la hora de inyectar el apropiado volumen en el cromatgrafo este debe de estar libre de burbujas de aire. Antes de inyectar las curvas y muestras se debe asegurar de que estas estn libres de contaminantes haciendo una inyeccin de los reactivos a utilizar para el anlisis.

7. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS http://bvs.sld.cu/revistas/far/vol43_2_09/far05209.htm http://profesionseg.blogspot.com/2007/06/usos-de-los-alcoholes-nbutanol.html http://recursosbiblioteca.utp.edu.co/tesisdigitales/texto/61595131H493.pdf http://www.ecured.cu/index.php/Aceite_de_fusel http://es.scribd.com/doc/50501935/NTC5157 http://es.scribd.com/doc/50160019/NTC4118

http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/ciencias/2000352/html/un1/cont_11616.html http://aguardientecaucano.com/uploads/anexos/62f4dadd2d78f1cdb05256d8318e3 89920dc4ec1.pdf

43

ANEXOS ANEXO 1. Idoneidad y Especificidad del sistema cromatgrafico n-butanol

# muestra
1 2 3 4 5 6 7 promedio s

K 4,3364269 4,7053364 4,7099768 4,7030162 4,7099768 4,6867749 4,6960557 4,6329466 0,165787

N 74981,31 88304,14 85835,05 72560,12 76461,57 32007,04 29890,03 65719,89 24436,82

R 1,8615443 1,9990986 1,9975649 1,8128613 1,8853422 1,3794581 1,2646957 1,7429379 0,2973556 Isoamlico

base 0,0324 0,0331 0,0336 0,0365 0,0356 0,0548 0,0568 -

S 1,579 1,667 1,996 2,773 2,291 1,169 1,499 1,85343 0,54184

tr 2,218 2,459 2,461 2,458 2,461 2,451 2,455 2,4232857 0,090592

# muestra
1 2 3 4 5 6 7 promedio s

K 7,7842227 6,1554524 6,1600928 6,1438515 6,1484919 6,8329466 6,8352668 6,4784223 0,7299914

N 398161 192724,1 188918,8 113855,4 119840,4 47902,1 43454,23 157836,6 121440

R 41,875 11,032028 10,84507 8,4657534 8,7640449 9,8055105 9,4135802 14,314427 12,191241 Etanol

base 0,024 0,0281 0,0284 0,0365 0,0356 0,0617 0,0648 -

S 0,479 0,55 0,566 0,663 0,651 0,365 0,377 0,52157 0,12025

Tr 3,786 3,084 3,086 3,079 3,081 3,376 3,377 3,267 0,2675606

# muestra
1 2 3 4 5 promedio s

K 4,2900232 4,863109 4,8700696 4,8607889 4,8700696 4,7508121 0,2576221

N 79231,82 93255,51 90715,7 108320,3 119296 98163,86 15713,92

R 1,9135802 2,0543807 2,0535714 2,2149837 2,3549488 2,118293 0,169953

base 0,0324 0,0331 0,0336 0,0307 0,0293 -

S 0,779 0,772 0,836 0,992 0,826 0,841 0,08896

Tr 2,28 2,527 2,53 2,526 2,53 2,4786 0,1110351

44

Isobutanol

# muestra
1 2 3 4 5 promedio s

K 5,4524362 5,4361949 5,4454756 5,4269142 5,424594 5,437123 0,0118987

N 117877,8 112376,9 109371,9 92149,67 96797,89 105714,8 10830,74

R 15,462963 7,4622357 7,3809524 6,6849315 6,7134831 8,7409131 3,3766254

base 0,0324 0,0331 0,0336 0,0365 0,0356

S 1,579 1,667 1,996 2,773 2,291 2,0612 0,48776

Tr 2,781 2,774 2,778 2,77 2,769 2,7744 0,0051284

ANEXO 2. Promedio de tiempo de retencin para analitos que se encuentran en la inyeccin de las muestras. tiempo de retencin butanol 2,218 2,459 2,461 2,458 2,461 2,451 2,455 promedio S CV (%) 2,423285714 0,090591969 3,738394032 isoamlico 3,786 3,084 3,086 3,079 3,081 3,376 3,377 3,267 0,267560585 8,189794461 Etanol 2,28 2,527 2,53 2,526 2,53 2,529 2,529 2,493 0,093936149 3,767996331 isobutanol 2,781 2,774 2,778 2,77 2,769 2,771 2,767 2,7744 0,005128353 0,184845464

ANEXO 3. Limites de deteccin y cuantificacin para el n-butanol e isoamlico Variable a calcular LD LC resultado n-butanol isoamlico 0,90413096 0,127344328 3,01376987 0,424481095 Ecuacin Usada

45

ANEXO 4. Anlisis de mnimos cuadrados para la curva de calibracin de estndares del n-butanol. n 1 2 3 4 5 6 x 0,4 0,12 0,2 1,2 4 8 2,32 y 0 0,2 0,39097744 0,87121212 6,70866142 14,266129 3,73949667 -1,92 -2,2 -2,12 -1,12 1,68 5,68 0 -3,739 -3,539 -3,349 -2,868 2,9692 10,527 0 3,686 4,84 4,494 1,254 2,822 32,26 49,36 13,984 12,528 11,213 8,2271 8,8159 110,81 165,58 7,18 7,787 7,099 3,212 4,988 59,79 90,06

Variable a calcular

resultado 49,36 165,58 90,06

Ecuacin usada

(2)

0,99598182

1,81238103

-0,41328231 Vase GRAFICO 1 0,08148184 (7)

0,31347753

1,19338117

46

0,54620993

Depende de cual muestra se coloque

Depende de cual muestra se coloque

Limite de confianza intercepto Limite de confianza pendiente

0,80563724

(14)

0,20940834

(15)

ANEXO 5. Anlisis de mnimos cuadrados para la curva de calibracin de estndares de isoamlico.

n 1 2 3 4 5 6 7 x 0,12 0,2 0,4 1,2 2 4 8 2,2742857 1 y 0 0,625 1,75 5,1954023 9,13333333 19,1875 38,8173077 10,672649 2,15428571 2,07428571 1,87428571 1,07428571 0,27428571 -4 5,72571429 5,72571429 -10,672649 -10,047649 -8,92264905 -5,47724675 -1,53931571 -19,6298077 28,1446586 -28,1446586 4,64094694 4,30266122 3,51294694 1,1540898 0,07523265 16 32,7838041 62,4696816 113,90543 8 100,95525 1 79,613666 30,000231 9 2,3694928 6 385,32935 792,12181 1504,2952 4 22,99193537 20,84169488 16,72359364 5,884127934 0,42221231 78,51923077 161,1482741 306,531069

47

Variable a calcular

resultado 62,4696816 1504,29524 306,531069

Ecuacin usada

(2)

0,99993805

4,90316599

-0,46024655 Vase GRAFICO 2 0,0272899 (7)

0,11128361

0,1732726

0,20813013

Depende de cual muestra se coloque

Depende de cual muestra se coloque

48

Limite de confianza intercepto Limite de confianza pendiente

0,28599888

(14)

0,07013505

(15)

ANEXO 6. Clculos experimentales para el intercepto, pendiente y coeficientes de correlacin para las curvas de n-butanol e isoamlico Variable a calcular Tb experimental Ta experimental Tr experimental Resultado n-butanol isoamlico 22,24275945 -1,318379379 22,24275945 179,669594 -4,13579812 179,669594 Ecuacin usada

ANEXOS 7. Promedio de concentraciones n-butanol e isoamlico en muestras de ron, incluyendo limites de confianza al 95 %. concentracin n -butanol muestra, ppm 0,80147 0,63163 0,76117 0,79475 0,6555 0,8078 0,73465 0,7409957 0,07156247 2,45 Resultado n-butanol IC 0,06626777 Isoamlico 0,08283522 ecuacin usada concentracin isoamlico muestra, ppm 1,0018337 0,7895336 0,9514574 0,9934377 0,8193733 1,00975 0,9183151 0,92624297 0,08945363 0.5 ppm

# muestra 1 2 3 4 5 6 7 promedio s T critico (gdL 6) 95% variable a calcular

parmetro aceptado

49

ANEXO 8. Figura cromatgrama tiempo muerto aire

50