Manual de Procedimientos para Inmonología. Banco de Sangre

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA INMONOLOGA. BANCO DE SANGRE
TRABAJO PROFESIONAL
QUE PARA OBTENER EL TITULO DE:
QUMICA FARMACUTICA BILOGA P R E S E N T A: VIANEY HERNNDEZ SALINAS
ASESORA: QFB. MARTHA PATRICIA CAMPOS PEN
CUAUTITLAN IZCALLI, EDO. DE MEX.

DEDICATORIA
2009
LE DOY LAS GRACIAS A TODA LA GENTE QUE ME APOYO EN LA REALIZACIN DE ESTE TRABAJO POFESIONAL
A MI FAMILIA EDWIIN MI ESPOSO, POR TODO SU AMOR, SUSTENTO Y COMPRENSIN SEBASTIAN MI ADORADO HIJO, POR DARME LAS FUERZAS PARA CONTINUAR
A MIS PADRES MARA GRISELDA POR SU RECUERDO OSCAR POR SU EJEMPLO
A MIS HERMANAS NUBIA Y PAOLA POR SU CARIO A BENIGNO, MINERVA, IRED, IRVING Y DELFINA POR SU PREOCUPACIN
PROFESORES QFB MARTHA PATRICIA CAMPOS PEN MI ASESORA, POR TODA LA PACIENCIA Y ENSEANZA DR. ANDRS ROMERO, DR. VCTOR ZENDEJAS, QFB. GUADALUPE REBOLLAR Y QFB. LADISLAO PALOMAR POR BRINDARME SU VALIOSO TIEMPO Y EJEMPLO
AL INCMNSZ POR PERMITIRME SER PARTE DE SU GENTE
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA INMUNOHEMATOLOGA BANCO DE SANGRE
NDICE Pgina Generalidades I. Prlogo I.I. Introduccin III. Objetivo, Meta y Alcance IV. Mensaje del Usurio V. Marco Jurdico VI. Seguridad de las Muestras VII. Definiciones VIII. Instalaciones y Procedimientos
1 2 7 8 9 10 11 12
TEMA 1. CONTROL DE CALIDAD DE REACTIVOS
1. 1 Responsabilidades 1. 2 Aplicacin clnica 1. 3 Suministros 1. 4 Reactivos 1. 5 Equipo necesario 1. 6 Procedimiento del ensayo 1. 7 Marcado y empaque 1. 8 Formatos, referencias y bibliografa
18 18 18 18 19 20 23 24
TEMA 2. GRUPO SANGUINEO ABO AUTOMATIZADO
2. 1 Responsabilidades 2. 2 Principio 2. 3 Aplicacin clnica 2. 4 Recoleccin de la muestra 2. 5 Factores de rechazo 2. 6 Condiciones de manejo y almacenamiento 2. 7 Reactivos 2. 8 Control de calidad 2. 9 Procedimiento del ensayo 2. 10 Resultados 2. 11 Interferencias y limitaciones del mtodo 2. 12 Formatos, referencias y bibliografa
25 25 27 28 29 30 30 31 33 34 34 35
TEMA 3. GRUPO SANGUINEO Rh Pgina
3. 1 Responsabilidades 3. 2 Principio 3. 3 Recoleccin de la muestra 3. 4 Reactivos 3. 5 Control de calidad 3. 6 Equipo necesario 3. 7 Procedimiento del ensayo 3. 8 Resultados 3. 9 Formatos, referencias y bibliografa
36 36 37 39 39 41 41 42 43
TEMA 4. PRUEBAS PRETRANSFUSIONALES
4. 1 Responsabilidades 4. 2 Principio 4. 3 Recoleccin de la muestra 4. 4 Reactivos 4. 5 Equipo necesario 4. 6 Procedimiento del ensayo 4. 7 Formatos, referencias y bibliografa
44 44 45 47 47 48 50
TEMA 5. ANTICUERPOS IRREGULARES SU IMPORTANCIA EN MEDICINA TRANSFUSIONAL
5. 1 Panel de 10 clulas 5. 2 Formatos, referencias y bibliografa
57 58
TEMA 6. RASTREO DE ANTICUERPOS IRREGULARES MTODO LION EN TUBO Pgina 6. 1 Responsabilidades 6. 2 Principio 6. 3 Recoleccin de la muestra 6. 4 Reactivos 6. 5 Equipo necesario 6. 6 Procedimiento del ensayo 6. 7 Resultados 6. 8 Interferencias y limitaciones del mtodo 6. 9 Formatos, referencias y bibliografia 59 59 60 62 65 65 65 68 69
TEMA 7. RASTREO DE ANTICUERPOS IRREGULARES MTODO CON ALBMINA
7. 1 Responsabilidades 7. 2 Principio 7. 3 Recoleccin de la muestra 7. 4 Reactivos 7. 5 Equipo necesario 7. 6 Resultados 7. 7 Interferencias y limitaciones del mtodo 7. 8 Formatos, referencias y bibliografia
70 70 72 74 75 76 76 78
TEMA 8. PRUEBA DE COOMBS Pgina 8. 1 Responsabilidades 8. 2 Principio 8. 3 Recoleccin de la muestra 8. 4 Reactivos 8. 5 Control de calidad 8. 6 Equipo necesario 8. 7 Procedimiento del ensayo 8. 8 Resultados 8. 9 Formatos, referencias y bibliografia 79 79 81 83 84 85 85 89 90
TEMA 9. PROCEDIMIENTO PARA CRIOPRESERVACIN DE CLULAS PROGENITORAS HEMATOPOYTICAS
9. 1 Propsito y alcance 9. 2 Introduccin 9. 3 Instrucciones y procedimiento 9. 4 Material y equipo requerido para criopreservar CPH 9. 5 Espcimen a criopreservar 9. 6 Procedimientos previos a la criopreservacin de CPH 9. 7 Procedimiento para criopreservar 9. 8 Procedimiento para determinar el No. De CMN de las CPH 9. 9 Procedimiento para determinar la viabilidad celular de las CPH 9.10 Limpieza y asepsia de la campana de flujo laminar 9.11 Verificacin de la esterilidad del proceso 9.12 Procedimiento para descongelar CPH criopreservadas 9.13 Abreviaturas 9.14 Formatos, referencias y bibliografia
91 92 100 101 103 105 113 114 115 116 116 120 127
NDICE DE TABLAS Pgina TABLA 1. Avidez TABLA 2. Especificidad TABLA 3. Titulo de reactivos TABLA 4. Sistema de grupo sanguneo ABO TABLA 5. Tipo y volumen de muestra requerida TABLA 6. Identificacin del control TABLA 7. Tipo y volumen de muestra requerida TABLA 8. Identificacin del control TABLA 9. Tipo y volumen de muestra requerida TABLA 10. Tipo y volumen de muestra requerida TABLA 11. Identificacin del control TABLA 12. Tipo y volumen de muestra requerida TABLA 13. Tipo y volumen de muestra requerida TABLA 14. Identificacin del control TABLA 15. Volumen mnimo y mximo al criopreservar CPH TABLA 16. Valores de DMSO plasma para la medicin exacta Del DMSO al 20 % 20 21 22 25 29 31 37 39 45 60 63 72 82 84 105 108
NDICE DE FIGURAS
FIGURA 1. Tarjeta de gel FIGURA 2. Tarjeta de gel para grupo sanguneo ABO y Rh FIGURA 3. Tarjeta dianagel FIGURA 4. Ejemplo de procedimiento FIGURAS 5 Y 6. Preparacin de suspensin de eritrocitos FIGURA 7. Albmina al 22% FIGURA 8. Suero de Coombs FIGURA 9. Perfil de la temperatura durante el proceso de Congelamiento FIGURA 10. Esquema de la localizacin dentro del contenedor de N2 (l) FIGURA 11. Esquema de la localizacin dentro del marco metlico (RACK)
27 28 30 42 47 71 80 98 111 111
NDICE DE FORMATOS Pgina FORMATO I. Material necesario para la Criopreservacin de CPH FORMATO II. Registro del procedimiento de Criopreservacin de CPH FORMATO III. Registro de temperatura y nivel de N2 (l) FORMATO IV. Registro del contenedor de N2 (l) cilindros Infra 121 123 125 126
I. PRLOGO
El proceso de la etapa universitaria es un proceso complicado, en la que en muchas ocasiones hay que dedicar parte de nuestro tiempo libre a las actividades que engloban una licenciatura del rea de ciencias de la salud. Despus de concluir el 100 % de crditos, los estudiantes egresados de licenciatura tienen que realizar un procedimiento de gran importancia, llamado Titulacin, con la cual se da por concluida la etapa de la carrera. Es gracias a los avances que han realizado en el departamento de exmenes profesionales al ampliar las opciones de titulacin que permitan al alumnado concluir con dicho proceso. Mi alternativa es la de Trabajo Profesional, es de gran ayuda en mi situacin personal, que desde antes de concluir mis estudios superiores, me incorpore al rea laboral, lo que desde luego obtener el grado, me permitir seguir avanzando en estudios posteriores que desee realizar sin dejar de mencionar en mi rea de trabajo.
En la actualidad hay que estar bien preparados para enfrentar la problemtica que se nos presenta a los que concluimos la trayectoria, pues las oportunidades son escasas, y en gran medida de difcil acceso, es por ello que para formar parte, del rea del Banco de Sangre de una Institucin de prestigio como es el Instituto Nacional de Ciencias Medicas y Nutricin Salvador Zubirn, que es mi caso particular, no solo hay que mostrar lo aprendido durante la formacin acadmica, que considero la mejor carta de presentacin, adems es necesario agotar todas las herramientas con las que se cuenta en la actualidad, como el conocer un segundo idioma, como el ingles, el manejo de computadora e Internet entre otros.
II. INTRODUCCIN
La realizacin de un examen de laboratorio se lleva a cabo en 3 etapas igualmente importantes que son, en el siguiente orden: etapas pre-analtica, analtica y postanaltica. Este documento se refiere a la segunda de ellas; la etapa analtica. En el Servicio de Medicina Transfusional se ha enfatizado la necesidad de metodologas exactas y precisas, para realizar las pruebas pretransfusionales en el menor tiempo posible para coadyuvar a la salud del paciente.
La altamente sofisticada y bien controlada tecnologa actual de laboratorio es menos til si las muestras a las que les practicarn los anlisis llegan al laboratorio con errores debidos a mala identificacin de las muestras o a tcnicas de recoleccin deficientes. Hoy en da es ms probable que los errores ocurran durante la toma y manejo de las muestras, que en el propio procedimiento de laboratorio. Algunos estudios demuestran que el 8% de los errores al rotular la muestra con el nombre, edad, sexo y nmero de identificacin del paciente no son detectados a pesar de los extensos procedimientos de revisin en manuales. Los errores sistemticos son difciles de detectar y controlar. El uso de este manual podra ayudar a minimizar muchos de estos problemas.
Uno de los factores que influye en la atencin mdica que se otorga, es la disponibilidad de sangre y sus derivados en las cantidades necesarias y con las caractersticas de calidad y seguridad que garanticen, el cumplimiento de las normas de salud vigentes. Una certificacin, en general, asegura la calidad de un producto, de un organismo o de una persona. Pone de manifiesto que se poseen los niveles de competencia para ejercer correctamente y dar adecuadamente las prestaciones que se le suponen. La certificacin es el conjunto de pruebas que permiten la obtencin de un certificado que da fe de la calificacin de un profesional en un momento dado de su carrera.
La Certificacin asegura a un profesional que posee determinados niveles de conocimiento y de habilidades que le permiten ejercer su profesin en las mejores condiciones.
No es un diploma acadmico ni sustituye a ningn ttulo. No es para aquellos que empiezan su vida profesional, sino para los que ya estn trabajando. Por eso, slo pueden ser candidatos aquellas personas que en la actualidad sean profesionales que tengan una experiencia de al menos dos aos. Al margen de consideraciones acadmicas, valora, sobre todo, el grado de adecuacin a los requerimientos de la prctica profesional y sus perspectivas de desarrollo. Adems, dota a la profesin de una herramienta de valoracin de los niveles de competencia en el conjunto del sector, clarifica, ayuda en la definicin de los perfiles de los candidatos a un puesto de trabajo, aportando por ello elementos de mayor transparencia y seguridad en el funcionamiento del mercado laboral.
El Banco de Sangre es la unidad operativa, responsable de la disposicin de productos sanguneos con oportunidad y en ptimas condiciones, para la realizacin de los diferentes procedimientos mdicos que se les prescriben a los pacientes en los servicios asistenciales. En casi todos se lleva a cabo la recoleccin, conservacin,distribucin de la sangre y sus compuestos. La participacin de los donadores voluntarios es
fundamental para mantener un nmero suficiente de unidades sanguneas, tan necesarias en la atencin a pacientes. Tiene el compromiso de cubrir los requerimientos de sangre de pacientes, donadores y mdicos, mediante el mejoramiento continuo de los procesos y tecnologa desarrollada, y aplicados por personal altamente calificado La certificacin es un requisito fundamental en la prctica mdica, el tener acceso a un Banco de Sangre que asegure la credibilidad de los resultados y que el producto satisfaga las necesidades y expectativas de servicio de mdicos y pacientes, disminuyendo al mnimo el porcentaje de error, por lo que es indispensable que dispongan de un sistema de garanta de la calidad, atendiendo a su enorme responsabilidad sanitaria y social. La calidad en estos, no puede ser menospreciada y el objetivo de aplicar un sistema de gestin de la calidad a travs de las Normas Internacionales de Estandarizacin (ISO), ayudar a sistematizar el trabajo, cumpliendo estrictamente los estndares.
Por lo anterior, todo el personal que trabaja en este lugar y en especial los responsables de gestin y direccin, deben asegurarse que se cumpla con los requisitos de calidad, normatividad que se ofrezcan productos vlidos a los enfermos, as como mejorar la seguridad de los productos, la productividad y los costos, tras obtener la Certificacin de la Calidad ISO 9001-2000. La certificacin, es un logro importante y trascendental, el cual nos impulsar a continuar con una mejora constante y ascendente del servicio que prestamos para beneficio de los pacientes, y claro, sin olvidar a los donadores. En la actualidad, el implementar un sistema de gestin de la calidad, resulta indispensable, para contar con servicios de excelencia, an cuando el proceso que se lleva a cabo en una poca especialmente difcil donde los recursos materiales son escasos y donde no mucha gente piensa en trabajo en equipo y en superacin.
SANGRE La sangre es un tejido lquido que recorre el organismo transportando clulas, y todos los elementos necesarios para realizar las funciones vitales (respiracin, sntesis, defender de agresiones) todo un conjunto de funciones complejas e importantes para la vida. La cantidad en una persona est relacionada con su edad, peso, sexo y estatura, en un adulto se considera que hay entre 4.5 y 6 litros. Todos los rganos del cuerpo humano funcionan gracias a sta que circula por arterias, venas y capilares. Est formada por diversos componentes: GLBULOS ROJOS O HEMATES Son las clulas sanguneas ms numerosas y la hemoglobina que contienen es la responsable de su color rojo. Se forman en la mdula sea, que se halla dentro de los huesos del esqueleto, desde donde son liberados al torrente sanguneo. Su funcin es transportar el oxgeno desde los pulmones a los diferentes tejidos del cuerpo para que las clulas respiren, y tambin eliminan los residuos producidos por la actividad celular (p.ej. anhdrido carbnico). GLBULOS BLANCOS O LEUCOCITOS Son los encargados de proteger al organismo contra los diferentes tipos de microbios. Cuando hay una infeccin aumenta su nmero para mejorar las defensas. Unos se forman en la mdula sea y otros en el sistema linftico (bazo, ganglios, etc). PLAQUETAS Son las clulas sanguneas ms pequeas. Se producen tambin en la mdula sea y viven unos 6-7 das. Intervienen cuando se produce rotura, se adhieren rpidamente en ese lugar para que cese la hemorragia, dando tiempo a la formacin del cogulo definitivo.
PLASMA Es un lquido compuesto de agua, protenas, sales minerales y otras sustancias necesarias para el funcionamiento normal del organismo y en donde se encuentran "nadando" las clulas sanguneas. Entre las sustancias de importancia que transporta el plasma estn las siguientes.
La Albmina. Es una protena que ayuda a mantener el agua del plasma en una proporcin equilibrada.
Las Globulinas. Son los anticuerpos encargados de la defensa de nuestro organismo frente a las infecciones. Su disminucin acarrear una disminucin de las defensas.
Factores de Coagulacin. Son imprescindibles para evitar las hemorragias. La ausencia de algn factor de coagulacin puede ocasionar trastornos hemorrgicos ya que se dificulta la formacin del cogulo.
Otras protenas transportan sustancias necesarias (grasas, azcares, minerales, entre otras) para el normal funcionamiento de las clulas.
III. OBJETIVO
Este manual tiene como objetivo principal, contener las polticas y ensayos inmunohematolgicos, como una estandarizada de procedimientos con el fin de obtener resultados ptimos en menor tiempo, recopilados a travs de la experiencia laboral para dar respuesta inmediata a las necesidades de los pacientes que requieren una
transfusin segura y de calidad. METAS Lograr la efectividad de los Servicios de Medicina Transfusional acorde con las necesidades de nuestra poblacin en aras de un desarrollo sustentable. ALCANCE
Aplica a todo el personal que labora en el laboratorio de inmunohematologa, as como las relacionadas con el rea afn.
IV. MENSAJE DEL USUARIO
Este documento ha sido elaborado con el objeto de uniformar las actividades y procedimientos relacionados con el laboratorio de inmunohematologa.
Para su preparacin se han tomado como base, el manual de procedimientos operativos (tcnicas), el manual de la AABB (American Association of Blood Banks) de los Estados Unidos de Norte Amrica y los insertos de reactivos del fabricante, adems de referencias bibliogrficas.
El documento incluye el protocolo completo de los pasos que deben seguirse en el servicio de inmunohematologa del Banco de Sangre, para llevar a cabo las pruebas solicitadas.
Describe
adems las instalaciones en donde se llevan a cabo estas pruebas
(pretransfusionales) tanto en pacientes externos como hospitalizados, as como el procedimiento para llevar a cabo las pruebas pretransfusionales.
Finalmente se presenta un programa para el entrenamiento del personal que realiza estas pruebas pretransfusionales.
Con la implementacin de estas prcticas se busca la estandarizacin en la realizacin de estas tcnicas en el menor tiempo posible para beneficio del paciente.
V. MARCO JURDICO
Constitucin Poltica de los Estados Unidos Mexicanos. D.O.F. 5-II-1997, sus Reformas y adiciones.
Ley Orgnica de la Administracin Pblica Federal D.O.F. 29-XII-1976 y sus Reformas.
Ley General de Salud. D.O.F. 7-II-1984 y sus reformas.
Ley Federal de Entidades Paraestatales D.O.F 4-II-1998 y sus Reformas.
Ley para el Fomento de la Investigacin Cientfica y Tecnolgica. D.O.F. 21-V-1999
Ley de los Institutos Nacionales de Salud. D.O.F. 26-V-2000
REGLAMENTOS
Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Prestacin de Servicios de Atencin Mdica. D.O.F. 14-V-1986
Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Investigacin para la Salud. D.O.F. 6-I-1987
Reglamento de la Ley Federal de Entidades Paraestatales. D.O.F. 7-IV-1995
Decretos por el que se aprueba el Programa de Reforma del Sector Salud 1995-2000. D.O.F. 11-III-1996
Decreto por el que se reforma la Ley General de Salud. D.O.F. 26-V-2000
NORMAS OFICIALES MEXICANAS
Norma Oficial Mexicana NOM-003-SSA2-1993 para la disposicin de sangre humana y sus componentes D.O.F. 16-I-1995.
NOM 087 SSA2.
VI. SEGURIDAD DE LAS MUESTRAS Al trabajar las muestras de sangre deben observarse las precauciones universales. Todo espcimen pudiera estar infectado con los virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) o de la Hepatitis B, entre otras.
VII. DEFINICIONES
En el contexto de esta publicacin, los trminos listados abajo se definen como sigue:
(1) Espcimen o muestra de un paciente: Un volumen de sangre colectada adecuadamente, para realizar una o ms pruebas de laboratorio. Regularmente es una alcuota de sangre anticoagulada, de plasma, o suero.
(2) BBS: Blood Bank Sof 2000 es un software de administracin en Medicina Transfusional vanguardista para la administracin del Servicio, que permite un registro confiable, de donadores y receptores de sangre humana.
(3) Rastreo de anticuerpos irregulares: Prueba que se realiza de rutina a todos los tubos primarios que llegan al Servicio.
(4)Identificacin de anticuerpos irregulares: Prueba que se realiza a los sueros que resulten con rastreo positivo.
VII. INSTALACIONES Y PROCEDIMIENTOS
Aqu se describen cuales son los sitios potenciales en donde se pueden realizar las pruebas pre - transfusionales: MESA DE PRUEBAS CRUZADAS
Aqu se realizan todas las pruebas pretransfusionales a los pacientes, cuenten o no con registro del Instituto, a quienes sus mdicos tratantes les hayan solicitado concentrados eritrocitarios, plasma fresco congelado, plasma envejecido, crioprecipitados
concentrados plaquetarios y/o plaquetafresis. No hay programacin de citas, en este mismo sitio se trabajan muestras urgentes y ordinarias as como las cirugas electivas, inmediatamente despus de terminar las pruebas pretransfusionales del paciente utilizamos el sistema BBS para ingresarlos. Eventualmente, tambin acuden al laboratorio de inmunohematologa pacientes ambulatorios que son referidos de otras Instituciones pblicas y/o por mdicos particulares. El acceso es por la puerta nmero 4 del INCMNSZ que da a la calle Martn de la Cruz S/N ubicada entre Vasco de Quiroga y Viaducto Tlalpan. Tiene un horario de funcionamiento de 7:00 hr. a 18:00 hr. por la puerta 2 despus de esta hora.
Esta Unidad fue inaugurada en enero de 1995. Cuenta con rampas de acceso e instalaciones para discapacitados, un mostrador de registro para los pacientes as como sala de espera y sanitarios.
A continuacin se describirn las instalaciones con que cuenta, as como algunos procedimientos.
Flujo de atencin al personal que trae las muestras.
Los pasos que deben seguir al llegar al laboratorio de inmunohematologa son:
1) Entregar al qumico o tcnico responsable de la mesa solicitud y tubo piloto. 2) Esperar a que ambo sean revisados. 3) Si los datos son correctos se le indicar que registre su solicitud en la libreta de control de unidades y sus componentes. 4) Una vez concluidos los pasos anteriores el qumico responsable informar al mensajero en cuanto tiempo estarn listas sus pruebas pretransfusionales. 5) Para la realizacin de pruebas pretransfusionales ver la Pg. 48. MESA DE GRUPOS SANGUNEOS DE DONADORES
Muestras para grupo sanguneo AB0 y Rh. En caso de que sean donadores:
1) El qumico o tcnico responsable de realizar grupos sanguneos recoge las muestras en el rea de donadores. Son dos tubos por donador uno para biometra hemtica y grupo sanguneo y otro para serologa.
2) Los estos deben contener los siguientes datos: nombre completo y nmero de predonante, fecha, nombre del estudio (ej. B-H., Historia clnica etc.)
3) Para ver la realizacin de grupos sanguneos refirase a la pagina 33.
SITUACIONES ESPECIALES
Paso 1: Revisar la solicitud de laboratorio
Cada una de ellas para exmenes de laboratorio debe ser introducida en el sistema de software para poder identificar y obtener la hoja de trabajo, etiquetas, y otros suministros de cada paciente.
Debe contener por lo menos la siguiente informacin: Nombre completo del paciente Nmero de expediente o de registro Fecha Nombre del mdico Ubicacin del paciente Hemoderivados solicitados Antecedentes transfusionales
Paso 2: En caso de errores
Si hay errores en la solicitud o tubo piloto tales como: Apellidos mal escritos Registros diferentes Tachones o enmendaduras
Entonces la muestra no ser procesada, salvo la autorizacin por escrito del jefe de Servicio de Medicina Transfusional o por el mdico residente a cargo del paciente.
Paso 3: Reacciones Transfusionales
La mayora de las reacciones transfusionales en este instituto (cerca de 98%) se deben a leucocitos y a medicamentos, sin embargo cuando estas se presentan, estos son los pasos a seguir en el laboratorio de inmunohematologa:
El mdico tratante o enfermera a cargo deber enviar un tubo piloto y una biometra hemtica al laboratorio. Aqu se le realizaran de nueva cuenta las pruebas pretransfusionales, qu adems incluyen un Coombs directo con la finalidad de saber si el paciente est hemolizando.
Una vez que se constat el motivo de la reaccin y se tiene la certeza de que la reaccin transfusional no fue por incompatibilidad AB0 se puede transfundir nuevamente al paciente si as lo requiere.
Para la realizacin de reacciones transfusionales ver manual de procedimientos operativos.
INTERFERENCIAS Y LIMITACIONES DEL MTODO
FACTORES QUE AFECTAN LOS RESULTADOS DE LABORATORIO
Muestras lipmicas Muestras hemolizadas Muestras coaguladas Muestras insuficientes (menos de 4.5mL de volumen) Reactivos que presentan turbidez o hemlisis
Las que presenten uno o ms de los factores arriba mencionados solo se procesaran previa autorizacin del jefe de servicio. A los resultados de laboratorio inesperados y no buscados se les llama frecuentemente errores de laboratorio. An cuando los procedimientos analticos hayan sido realizados en forma correcta y precisa, diversas variables pueden afectar los resultados. El conocimiento de stas y la estandarizacin de los procedimientos de las pruebas de laboratorio son esenciales para la correcta interpretacin y el uso ptimo de los datos. Las principales causas pueden estar relacionadas a factores no analticos tales como la toma, manejo y transporte de las muestras. Los factores no biolgicos, como la inadecuada identificacin del paciente, y factores biolgicos, como la postura del paciente y la hora de la toma de la muestra, contribuyen juntos al error del laboratorio total.
PROGRAMA DE ENTRENAMIENTO
Se puede pensar, inicialmente, que cualquier individuo inteligente puede llevar a cabo las pruebas del laboratorio de inmunohematologa. Sin embargo, aquellos que estn familiarizados con est saben que eso no es verdad. La Medicina Transfusional es un procedimiento complejo que requiere conocimientos y experiencia para realizarlo correctamente. Por esta razn, una institucin debe establecer criterios para la seleccin adecuada del personal. El programa de entrenamiento debe contener instrucciones didcticas y entrenamiento emprico.
OBJETIVOS DEL PROGRAMA DE ENTRENAMIENTO
Despus del entrenamiento, el entrenado debe ser capaz de realizar las siguientes tareas:
Realizar grupos sanguneos AB0. Realizar pruebas pretransfusionales y describir como se llevan a cabo, as como del rastreo de anticuerpos irregulares fuera del sistema Rho y Coombs directo. Identificar los diferentes formatos y solicitudes asociados Medicina Transfusional. al Servicio de
Fraccionar hemoderivados a partir de sangre total, como Concentrados de Eritrocitos, Plasma Fresco Congelado, Concentrado Plaquetario,
Crioprecipitados, y Plasma sin factor VIII. Etiquetado, almacenamiento y distribucin de todos los componentes sanguneos obtenidos en esta rea. Llevar a cabo el control de calidad de reactivos de forma manual y automatizada. Conocer perfectamente cada una de las reas del servicio. Identificar cada uno de los equipos de refrigeracin y saber que producto se almacena en ellos. Saber a qu temperatura se deben almacenar cada uno de los hemoderivados ya fraccionados. Saber a qu temperaturas se conservan cada uno de los insumos y reactivos que son utilizados rutinariamente en el laboratorio de inmunohematologa. Saber utilizar el software de administracin.
CONTROL DE CALIDAD
De manera rutinaria se realizan pruebas de especificidad y avidez a los sueros hemoclasificadores y potencia al abrir el lote. Al equipo automatizado tambin se le realiza de forma rutinaria un rastreo de
anticuerpos irregulares con dos muestras conocidas una negativa y otra con rastreo positivo. En el caso de grupos sanguneos se lleva a cabo evaluando tres muestras de individuos con grupos sanguneos previamente conocido.
FASE PRE ANALTICA TEMA 1. CONTROL DE CALIDAD DE REACTIVOS

1.1 RESPONSABILIDADES Es responsabilidad del Jefe de Medicina Transfusional y del Coordinador (a) el proporcionar ste documento al personal de nuevo ingreso y a todo aquel que lo requiera. Es responsabilidad de todo el personal de inmunohematologa conocer y seguir este procedimiento.
1.2 APLICACIN CLNICA En Medicina Transfusional es primordial ya que est es la base de todo inmunoensayo y se lleva a cabo de manera habitual. Cada da se hacen pruebas de especificidad, avidez y potencia al abrir el lote de los sueros hemoclasificadores.
1.3 SUMINISTROS La siguiente lista describe los suministros que deben estar disponibles en el laboratorio de para llevarlo a cabo manera habitual.
1.4 REACTIVOS Antisueros hemoclasificadores tienen las siguientes caractersticas: Caducidad mnima de un ao, con certificacin ISO 9001, FDA o mayor Eritrocitos con fenotipo conocido al 3-5% caducidad de 3 a 4 semanas Tarjetas con gel sephadex para pruebas cruzadas, grupos sanguneos y fenotipos Solucin salina fisiolgica al 0.9% Solucin I (diana sol I) Solucin II (diana sol II) Solucin de lavado A (diana fluid A) Solucin de lavado B (diana fluid B)
1.5 EQUIPO NECESARIO
MATERIAL DE VIDRIO Pipetas Pasteur Tubos de 12x75 mm Frascos goteros estriles
EQUIPOS Centrifugas de mesa Incubador de calor seco
OTROS Guantes: Son de ltex, no estriles. Si algn trabajador es susceptible de desarrollar dermatitis al usarlos por largos perodos de tiempo, debe intentar usar de vinil u otro tipo de plstico. Contenedores desechables para punzo-cortantes:
En este sitio debe haber disponibles contenedores desechables para material punzocortante en el cual se coloca el material de vidrio usado que se haya roto. Estn fabricados de plstico rgido y tienen una pestaa para desatornillar la aguja. Adems estn claramente marcados como residi bio peligrosos, de acuerdo con la NOM 087 SSA. Bulbos de hule o ltex Gogles
1.6 PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO AVIDEZ
La avidez de los reactivos hemoclasificadores para determinar grupos sanguneos del sistema ABO, en la prueba en placa y a temperatura ambiente, debe ser tal, que la aglutinacin de los eritrocitos del tipo correspondiente se inicie en el tiempo mximo que se especfica para cada subgrupo, contados a partir del momento en que se ponen en contacto suero y eritrocitos y el tamao de los cmulos aglutinados no debe ser menor a 1mm de dimetro. TABLA 1. AVIDEZ GRUPO SANGUNEO O SUBGRUPO DE LOS ERITROCITOS ENSAYADOS A1 A2 A1B A2B B A1B A2B A1 A2 B NMERO DE ESPECIMENES AL AZAR EN PRUEBAS 2 2 1 2 3 1 1 2 2 3 TIEMPO MXIMO EN SEGUNDOS PARA QUE INICIE LA AGLUTINACIN 15 20 15 30 15 15 15 15 20 15 30 0 R1r Rr
SUERO
Anti - A
Anti - B
Anti - AB
Anti - D
ESPECIFICIDAD
El producto debe estar libre de aglutininas diferentes a las especificadas en la etiqueta y libre de efectos o substancias indeseables tales como la presencia de hemolisinas o la tendencia a producir el fenmeno de rouleaux.
Este control se lleva a cabo de manera habitual y se hace como una determinacin de grupo sanguneo ABO en tubo con eritrocitos con fenotipos conocido al 3-5%.
Lavar con solucin salina fisiolgica al 0.9% eritrocitos del grupo O, A, B y A2 y variantes dbiles del grupo A. Preparar una suspensin salina del 3-5% de cada uno de los eritrocitos. Colocar igual volumen de la suspensin de eritrocitos y del reactivo, en un tubo de tamao adecuado (los eritrocitos deben lavarse tres veces y resuspender en solucin salina fisiolgica al 0.9 % para obtener la suspensin del 3-5%).
Centrifugar 30 segundos de 3000 a 3500 rpm. Leer. Los reactivos debern contener nicamente las aglutininas especificadas en la etiqueta.
TABLA 2. ESPECIFICIDAD
CLULAS CONOCIDAS
SUERO
A1
A2
R1r
Rr
Anti - A
4+
4+
Anti - B
4+
Anti - AB
4+
4+
4+
Anti - D
4+
POTENCIA
El titulo mnimo de los reactivos hemoclasificadores aceptable para cada grupo o subgrupo de eritrocitos por prueba, se indica en la siguiente tabla: TABLA 3. TITULO DE REACTIVOS
SUERO
Anti - A
Anti - B
GRUPO SANGUNEO O SUBGRUPO DE LOS ERITROCITOS DE PRUEBA A1 A2 A1B A2B B A2 B A1 A2 B R1r Rrr
NMERO DE ESPECIMENES PROBADOS
TIEMPO MXIMO EN SEGUNDOS PARA QUE INICIE LA AGLUTINACIN 256 128 128 8 256 128 256 64 256 64 0
2 2 2 3 2 2 2 2 2 2 2
Anti - AB Anti - D
TITULO
Hacer diluciones dobles seriadas de los reactivos hemoclasificadores solucin salina fisiolgica al 9%.
en
Colocar tubos de ensaye de 12x75 mm en una gradilla y agregar igual volumen de la dilucin del suero y de la suspensin de eritrocitos a cada tubo y mezclar. Centrifugar 30 segundos de 3000 a 3500 rpm. Resuspender suavemente las clulas y bajo iluminacin apropiada leer microscpicamente sin demora.
Los ttulos de aglutinacin se realizan siempre por duplicado y debern ser reproducibles. Si existen diferencias en las lecturas de dos tubos con la misma dilucin del suero, deber repetirse la prueba.
Lecturas. Los sueros sin diluir ms los eritrocitos no se consideran diluciones. La aglutinacin se lee en los tubos con suero que se ha diluido antes de la adicin de la suspensin de eritrocitos.
1.7 MARCADO Y EMPAQUE
Las etiquetas en el envase primario informacin:
y secundario deben contener la siguiente
Nombre del producto Nombre y domicilio del fabricante y distribuidor Nmero de lote Nmero de registro de la SSA Fecha de expiracin Temperatura de almacenaje Volumen
Debe cumplir con las especificaciones sealadas en la NOM- 008-SCFI-1993.
1.8 FORMATOS, REFERENCIAS Y BIBLIOGRAFA
Asociacin Argentina de Hemoterapia e Inmunologa. 2004. Manual Tcnico. Ed. Biomote. Argentina. p. 22, 23, 25,25.
Documento M29-T de la NCCLS.1997. Proteccin de los Trabajadores de Laboratorio de Enfermedades Infecciosas Transmitidas por sangre, lquidos corporales y tejidos. p.15,16.
Documento H18-A de la NCCLS. NOM-003 SSA2-1993. Procedimientos Para el Manejo y Proceso de Muestras de Sangre. p. 12, 14, 15,16.
Documento M29-T de la NCCLS 2000, Proteccin de los trabajadores de laboratorio de enfermedades infecciosas transmitidas por sangre, lquidos corporales y tejidos. p. 210 216.
Manual de Procedimientos Operativos
Norma Oficial Mexicana NOM-003-SSA2-1993. Para la disposicin de sangre humana y sus componentes D.O.F. 16-I-1. p. 102,103, 105 114.
NOM-008-SCFI-1993.
FASE ANALTICA
TEMA 2. GRUPO SANGUNEO ABO AUTOMATIZADO
2.1 RESPONSABILIDADES
El Coordinador de Inmunohematologa debe asegurarse que este procedimiento se cumpla. Es responsabilidad de los qumicos y tcnicos laboratoristas cumplir con lo descrito en este procedimiento.
2.2 PRINCIPIO
La determinacin de los grupos sanguneos se realiza mediante una reaccin antgenoanticuerpo. El sistema de grupos sanguneos ABO es nico en cuanto a que una persona que carezca de los antgenos A y/o B en los eritrocitos, regularmente tiene anticuerpos en el suero dirigidos al antgeno o antgenos faltantes. TABLA 4. SISTEMA DE GRUPO SANGUNEO ABO
GRUPO SANGUNEO
ANTIGENOS ANTICUERPOS PRESENTES PRESENTES EN LOS EN SUERO GLOBULOS ROJOS
Ninguno
Anti - A y Anti - B
Anti - B
Anti - A
AB
AyB
Ninguno
Para realizar el grupo sanguneo de una persona se prueban directamente los eritrocitos con reactivo Anti-A, y Anti-B ( prueba con eritrocitos o prueba directa). La
confirmacin de los resultados se hace utilizando eritrocitos de grupo A y B ( prueba srica o prueba inversa ). Algunas pruebas adicionales facilitan la identificacin de subgrupos por ejemplo: La distincin serolgica de las clulas A1 y A2 utilizan lectina de las semillas de Dolichos biflorus.
En la dilucin apropiada, esta lectina reacciona como Anti-A1 y aglutina los eritrocitos A1, pero no los A2. El 80% de los individuos del grupo A o AB posee globulos rojos que se aglutinan en presencia de anti-A1 y, por lo tanto, se clasifica como A1 o A1 B. El 20% restante, con eritrocitos que se aglutinan en presencia de Anti-A, pero no de anti-A1, se clasifican como A2 o A2 B.
PRINCIPIO DEL MTODO
La tecnologa de microtipificacin en gel se basa en la separacin por tamao de los eritrocitos aglutinados, durante un proceso de centrifugacin en un gel poroso. Los eritrocitos van perdiendo elasticidad en sus membranas de forma que los aglutinados grandes quedan atrapados en la zona superior y los pequeos se distribuyen a lo largo de la columna. Las tarjetas tienen 8 columnas compuestas por un gel de sephadex que sirve como soporte para evitar que los eritrocitos aglutinados crucen hasta el fondo del pocillo, de tal forma que solo los eritrocitos libres podrn migrar formando un pequeo botn al final del pocillo.
FIGURA 1. TARJETA DE GEL
Tarjetas de Gel
Cmara de Reaccin
Sobrenadante
Gel de Sephadex o Poliacrilamida
2.3 APLICACIN CLNICA
El sistema de grupo ABO sigue siendo el ms significativo en Medicina Transfusional. Es el nico en el cual el suero de la mayora de las personas no expuestas a eritrocitos humanos poseen anticuerpos recprocos constantes y previsibles. A causa de estos anticuerpos, la transfusin de sangre ABO incompatible podra provocar hemlisis intravascular grave, as como tambin las otras manifestaciones de las reacciones hemolticas transfusionales agudas. Las pruebas de deteccin de la incompatibilidad ABO entre los receptores y donantes constituyen la base de los estudios pretransfusionales.
FIGURA 2. TARJETA DE GEL PARA GRUPO SANGUNEO ABO Y Rh
2.4 RECOLECCIN DE LA MUESTRA
PREPARACIN DEL PACIENTE
No es necesario el ayuno del paciente y/o donante para la realizacin de este estudio
TIPO DE MUESTRA:
Suero Eritrocitos
VOLUMEN REQUERIDO:
Sangre total: ptimo, 7 mL Mnimo 4 mL
TABLA 5. TIPO Y VOLUMEN DE MUESTRA REQUERIDO
TIPO DE MUESTRA ptimo
VOLUMEN
Mnimo
4.0 mL Suero 3.0 mL Eritrocitos (3-5%)
1.0 mL 0.5 mL
RECIPIENTE DE RECOLECCIN La muestra debe ser recolectada en un tubo con tapn morado que contiene anticoagulante (EDTA), o en un tubo sin anticoagulante con datos especiales para el Servicio de Medicina Transfusional.
IDENTIFICACIN DE LA MUESTRA La muestra debe estar perfectamente identificada, conteniendo en la etiqueta nombre completo, nmero de registro, fecha de la toma, y ubicacin del paciente en caso de no pertenecer a la consulta externa.
2.5 FACTORES DE RECHAZO Las muestras deben ser rechazadas si cumplen con por lo menos uno de los siguientes puntos: Presencia de macro partculas Muestras mal etiquetadas Volumen insuficiente Muestras coaguladas
Cuando una muestra es rechazada, el coordinador y/o responsable de rea (o el responsable del turno) deber dar aviso al mdico encargado del servicio (o al MIP), solicitando una nueva muestra o cancelando el anlisis y llenar un reporte de productos no conformes (FR-AC-05) como se establece en el procedimiento general de control de producto no conforme (PG-AC-04).
2.6 CONDICIONES DE MANEJO Y ALMACENAMIENTO La muestra debe estar contenida en tubos siempre cerrados y en posicin vertical. Se recomienda separar fsicamente el suero de las clulas dentro de las 2 horas siguientes a la recoleccin de la muestra. El anlisis se realiza dentro de la primera hora de llegada de la muestra. Despus del anlisis se almacenan durante las primeras 72 hrs. entre 2C y 8C. Si la muestra requiere salir del laboratorio debe ser colocada en contenedores rgidos de plstico perfectamente bien cerrados, los cuales deben de proporcionarle seguridad y facilidad de transporte a la muestra. Las tarjetas diana donors/ donantes deben almacenarse cerrados entre 2C y 8C. Las condiciones de almacenamiento distintas a las recomendadas pueden producir resultados errneos. Estabilidad de las tarjetas diana en gel.
El reactivo es estable hasta la fecha de caducidad que aparece en la etiqueta si se almacena entre 2C y 8C. No congelar. 2.7 REACTIVOS MATERIALES FIGURA 3. TARJETAS DIANAGEL DONORS/ DONANTES
FORMA AUTOMATIZADA INGREDIENTES ACTIVOS
Tarjetas diana en gel Anti-A (marca Grifols) Tarjetas diana en gel Anti-B (marca Grifols) Tarjetas diana en gel Anti-AB (marca Grifols) Todos los reactivos deben utilizarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
PREPARACIN Previa centrifugacin de las tarjetas de reactivos dianagel donors/donantes
FORMA AUTOMATIZADA: No requiere de preparacin
ACEPTABILIDAD La aceptabilidad de un reactivo est determinada por los resultados obtenidos en el control de calidad 2.8 CONTROL DE CALIDAD TABLA 6. IDENTIFICACIN DEL CONTROL NOMBRE DEL CONTROL PRUEBA DIRECTA reactivo: Anti - A Anti - B Anti-AB Anti - D PRUEBA INDIRECTA Clulas al 3-5 % : Clulas A1 Clulas A2 Clulas B Clulas O NIVEL TIPO DE MUESTRA
Antisueros, tarjetas
II
Eritrocitos
PREPARACIN DEL CONTROL
No requiere preparacin
FRECUENCIA DE USO DE CONTROLES
Deben analizarse los 2 niveles de controles todos los das que se procese el analito
ACEPTABILIDAD Y ACCIONES CORRECTIVAS
En caso de que una corrida sea rechazada, debe repetirse el ensayo, si despus de ello no se corrigen los valores, deben indagarse las posibles causas de error, como pueden ser entre otros factores: almacenamiento inadecuado del reactivo, muestras de sangres viejas, suspensiones muy diluidas o muy concentradas, tiempo y temperatura de incubacin inapropiada. Si al observar estos detalles persiste, debe buscarse alguna falla sencilla en el equipo, si el continua lo conveniente es dar aviso al servicio tcnico especializado del proveedor del instrumento.
REGISTRO Y ALMACENAMIENTO DE LOS DATOS DE CONTROL DE CALIDAD
El Sistema Operativo del equipo Wadiana
tiene la capacidad de almacenar los
resultados de Control de Calidad obtenidos cada vez que este se procese. De esta manera, se puede observar en pantalla el valor obtenido.
ALTERNATIVAS EN AUSENCIA DE CONTROLES COMERCIALES
En caso de no contar con controles comerciales debe usarse una muestra de eritrocitos y de sueros de los grupos A, B, AB, Rh, O.
EQUIPO NECESARIO
Centrfuga Guantes desechables Gradillas Sistema Wadiana Solucin salina fisiolgica al 0.9% Bulbo de hule Pipetas Pasteur
2.9 PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO
Una vez recibida la muestra debe ser centrifugada durante 5 minutos a 3500 rpm. Las muestras de suero deben ser procesadas sin ningn tratamiento previo y conforme lo especificado segn el Manual del Sistema Wadiana.
PROCEDIMIENTO
1. Muestra tomada en tubo con tapn morado con anticoagulante (EDTA). 2. Centrifugar la muestra durante 5 minutos a 3000-3500 rpm. 3. Colocar el reactivo diana sol. 1 en la posicin num. 9 del Sistema Wadiana. 4. Posteriormente colocar las tarjetas diana gel donors/ donantes. 5. Verificar las soluciones de lavado 1, 2. 6. Especificar en el equipo que prueba se va a realizar (grupo sanguneo). 7. Identificar la muestra (nombre completo). 8. Realizar el inicio de la prueba. Nota: el tiempo de anlisis es de 10 minutos.
2.10 RESULTADOS
REPORTE DE RESULTADOS:
Los resultados obtenidos del equipo pueden ser capturados manualmente o transmitidos al Sistema del Paciente Ambulatorio (SIPAM) y/o en el programa Blood Bank y son validados y liberados por el responsable de turno. En la validacin de los resultados se revisa que los resultados obtenidos sean congruentes y que no queden espacios libres en la pantalla sin capturar.
CRITERIOS DE REPETICIN
Deben repetirse ensayos discrepantes.
VALORES CRTICOS
No estn establecidos los valores crticos para estos anlisis.
2.11 INTERFERENCIAS Y LIMITACIONES DEL MTODO
La empresa LICON analiz las siguientes sustancias para determinar su interferencia con esta metodologa.
Entre las sustancias que causan interferencia se encuentran: muestras viejas, muestras hemolizdas, que la dilucin de eritrocitos que hacemos para nuestro anlisis estn muy concentradas o muy diluidas, reactivo mal almacenado, caducado, etc.
Brecher ME. 2002. Technical Manual. Fourteenth edition. Maryland, USA: American Association of Blood Banks; p. 230,235.
Malvasi Graciela N.2003. Tcnicas de Diagnstico y Seguimiento en el Laboratorio de Inmunoserologa - Gua De Trabajos Prcticos. p. 35, 45,47-49.
Malvasi Graciela N. 2006. Tcnicas de Diagnstico y Seguimiento n l Laboratorio de Inmunoserologa Gua De Trabajos Prcticos. p. 82, 84, 98, 102,103,105.
Ivan Roitt. Jonathan Brostoff. David Male. 1997. Inmunologc. 4 Edicin. Harcourt. p. 215,233- 235
Mandell-Douglas Bennet. 1991. Enfermedades Infecciosas. Ed. Mdica Panamericana. p. 33, 37, 48, 59,60.
Manual ABB. p. 350.
Manual del Sistema Wadiana de LICON.
Mollison PL, Engelfriet CP, Contreras M.1997. Blood Tranfusion in Clinical Medicine. Tenth edition. London, UK: Blackwell Science; p.507, 508,509-512.
Norma Oficial Mexicana NOM-003-SSA2-1993. Para la Disposicin de Sangre Humana y sus Componentes D.O.F. p.16-I-1995.
Reporte de control de producto no conforme (FR-AC-05)
TEMA 3. GRUPO SANGUNEO Rh

El Coordinador de Inmunohematologa debe asegurarse que este procedimiento se cumpla. Es responsabilidad de los qumicos y tcnicos laboratoristas cumplir con lo descrito en este procedimiento.
3.2 PRINCIPIO
El antigeno D es altamente inmunognico y se ha reportado que estimula la produccin de anti-D en un 50-85% en individuos D negativos que han sido expuestos a sangre D postiva . Los anticuerpos Anti-D tienen importancia considerable ya que pueden originar la severa enfermedad Hemoltica del Recin Nacido (HDN) y reacciones hemolticas trasfuncionales. El antgeno D y la forma dbil del antigeno D
(denominado Du) son comnmente considerados en la seleccin rutinaria de sangre para transfusin.
La deteccin ptima de clulas D dbiles por anti-D requiere la aplicacin de una prueba indirecta de antiglobulina. El trmino comnmente utilizado. Rh (+) y Rh (-) se requiere especficamente a la presencia y ausencia del antgeno D.
DESCRIPCION DEL MTODO :
El reactivo hemoagrupador en esta prueba se basa en el principio de la hemoaglutinacin. La incubacin de clulas rojas a probar con el reactivo hemoagrupador Anti-D origina una reaccin especfica antigeno anticuerpo si el antgeno D correspondiente est presente en las clulas prueba, la deteccin visible de la reaccin se observa por aglutinacin de las mismas.
La no-aglutinacin indica un resultado negativo, y dentro de las limitaciones de esta prueba, indica la ausencia del antigeno D correspondiente.
No es necesario el ayuno del paciente y/o donante para la realizacin de este estudio
TIPO DE MUESTRA
Suero Eritrocitos
TABLA 7. TIPO Y VOLUMEN REQUERIDO
VOLUMEN
Mnimo
Suero
4.0 mL
1.0 mL
Eritrocitos (3-5%)
3.0 mL
0.5 mL
RECIPIENTE DE RECOLECCIN
La muestra debe ser recolectada en un tubo sin anticoagulante con datos especiales para el Servicio de Medicina Transfusional.
IDENTIFICACIN DE LA MUESTRA La muestra debe estar perfectamente identificada, conteniendo en la etiqueta nombre completo, nmero de registro, fecha de la toma, y ubicacin del paciente en caso de no pertenecer a la consulta externa.
FACTORES DE RECHAZO Las muestras deben ser rechazadas si cumplen con por lo menos uno de los siguientes puntos:
Presencia de macro partculas Muestras mal etiquetadas Volumen insuficiente
Cuando una muestra es rechazada, el Coordinador y/o responsable de rea (o el responsable del turno) en turno da aviso al mdico encargado del servicio (o al MIP), solicitando nueva muestra o cancelando el anlisis y llenar un reporte de productos no conformes (FR-AC-05) como se establece en el procedimiento general de control de producto no conforme (PG-AC-04). La muestra debe estar contenida en tubos siempre cerrados y en posicin vertical. Se recomienda separar fsicamente el suero de las clulas dentro de las 2 horas siguientes a la recoleccin de la muestra. El anlisis se realiza dentro de las dos primeras horas de llegada la muestra.
Despus del anlisis se almacenan durante las primeras 72 hrs. entre 2C y 8C. Si la muestra requiere salir del laboratorio debe ser colocada en contenedores rgidos de plstico perfectamente bien cerrados, los cuales deben de proporcionarle seguridad y facilidad de transporte a la muestra.
3.4 REACTIVOS
FORMA AUTOMATIZADA
INGREDIENTES ACTIVOS
Tarjetas dianagel donnors/ donantes (marca Grifols) Tarjetas Coombs (marca Grifols) Tarjetas phenotype Rh
PREPARACIN
Previa centrifugacin de las tarjetas de reactivos dianagel donors/donantes
FORMA AUTOMATIZADA: No requiere preparacin 3.5 CONTROL DE CALIDAD TABLA 8. IDENTIFICACIN DEL CONTROL NOMBRE DEL CONTROL Control R 1R 1 positivo Control rr negativa NIVEL I II TIPO DE MUESTRA Suero Suero
Deben analizarse los 2 niveles de controles todos los das que se procese el analito.
ALMACENAMIENTO Almacenar los frascos goteros sin abrir entre 2oC y 4oC. Una vez abiertos, los controles que se utilizarn en un plazo de 30 das pueden almacenarse entre 2oC y 8oC de uso de los controles.
LMITES DE ACEPTABILIDAD Y ACCIONES CORRECTIVAS
En caso de que una corrida sea rechazada, debe repetirse el ensayo, si despus de ello no se corrigen los valores, deben indagarse las posibles causas de error, como pueden ser entre otros factores: reactivo, sol.1, sol.2, mal almacenamiento del reactivo.
Si al observar estos detalles persiste, debe buscarse alguna falla sencilla en el equipo, si continua lo conveniente es dar aviso al servicio tcnico especializado del proveedor del instrumento.
El Sistema Wadiana tiene la capacidad de almacenar los resultados de Control de Calidad obtenidos cada vez que se procesa un control. De esta manera, se pueden observar en pantalla el valor obtenido.
EVALUACIN EXTERNA DE LA CALIDAD
Panel del Centro Nacional Siglo XXI.
En caso de no contar con controles comerciales debe usarse una muestra de suero de un paciente normal y otra de un paciente patolgico alto.
Centrfuga Guantes desechables Gradillas Sistema Wadiana Solucin salina fisiolgica al 0.9% Bulbo de hule Pipetas Pasteur
Una vez recibida la muestra deben ser centrifugadas durante 5 minutos a 3000 rpm. Las muestras de suero deben ser procesadas sin ningn tratamiento previo y conforme lo especificado segn el Manual del Sistema Wadiana.
PROCEDIMIENTO:
1. Muestra tomada en tubo con tapn morado con anticoagulante (EDTA). 2. Centrifugar la muestra durante 5 minutos a 3000-3500 rpm. 3. Colocar el reactivo diana sol.1 en la posicin nm. 9 del sistema Wadiana. 4. Posteriormente colocar las tarjetas dianagel donors/ donantes. 5. Verificar las soluciones de lavado 1, 2. 6. Especificar en el equipo qu prueba se va a realizar (grupo sanguneo). 7. Identificar la muestra (nombre completo). 8. Realizar el inicio de la prueba.
FIGURA 4. EJEMPLO DE PROCEDIMIENTO
Nota: El tiempo de anlisis es de 10 minutos.
3.8 RESULTADOS
REPORTE DE RESULTADOS
Los resultados obtenidos del equipo pueden ser capturados manualmente o transmitidos al Sistema del Paciente Ambulatorio (SIPAM) y/o en el Programa Blood Bank y son validados y liberados por el responsable de turno.
Deben repetirse ensayos discrepantes.
VALORES CRTICOS
No estn establecidos los valores crticos para estos anlisis.
De Jess Linares G. 2001. Inmunohematologa y Transfusin. Ed.Viamonte; p. 72- 75,235-239.
Graciela N. Malvasi. 2003. Pruebas de Laboratorio en el Estudio de Anemias Hemolticas. p. 25,25.
John G.Kelton. 20000. Transfusin Sangunea. Ed. DOYMA. Barcelona Espaa; p. 56, 58, 59, 310, 311, 316, 317, 318.
Manual del Sistema Wadiana de LICON, insertos de los antisueros.
Radillo-Gonzlez A. 1999. Medicina Transfusional. Mxico. Prado; p. 88,89, 302,303, 3309-313.
Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Investigacin para la Salud D.O.F. 6-I-1987
Reporte de control de producto no conforme (FR-AC-05).
Rodrguez-Moyado H, Quintanar-Garca E, Meja- Arregu MH. 20004. El Banco de Sangre y la Medicina Transfusional. Primera edicin. Mxico, Editorial Panamericana; p. 433-436,502-507.
Vives L, Aguilar J, Aguilar L. 1997. Manual de Tcnicas de Laboratorio en Inmunohematologa. Segunda edicin. Barcelona, Espaa: Masson; p. 105-112.
TEMA 4. PRUEBAS PRETRANSFUSIONALES

El Coordinador de medicina transfusional debe asegurarse que este procedimiento se cumpla. Es responsabilidad de los qumicos y tcnicos laboratoristas cumplir con lo descrito en este procedimiento.
4.2 PRINCIPIO
La seleccin de la compatibilidad del donante y receptor en la transfusin, se basa en la compatibilidad de los grupos sanguneos ABO y Rh, es decir, en la comprobacin de la ausencia de anticuerpos preformados contra los antgenos de las clulas del donante en el suero del receptor (lo que se denomina prueba cruzada).
Esta incluye tcnicas que permiten demostrar la ausencia de anticuerpos especficos regulares e irregulares de importancia clnica en el suero del receptor.
PRUEBA MAYOR (anticuerpos en el suero del receptor, contra los eritrocitos del donador).
(PRUEBA MENOR) particularmente cuando se pretenda transfundir sangre total proveniente de donador con antecedentes de aloinmunizacin transfusiones previas). (embarazos o
La prueba menor ha sido eliminada en algunos bancos de sangre, ya que rutinariamente a los donadores de sangre se les realiza determinaciones serolgicas de los anticuerpos ms comunes.
La presencia de anticuerpos de baja incidencia en el plasma de los mismos, probablemente no cause una reaccin transfusional al ser diluidos en el plasma del receptor.
Desde la introduccin de la prueba por Ottenberg en 1908, se han realizado muchas modificaciones, con la finalidad de proveer al paciente el mximo de seguridad y beneficio realizndose modificaciones en los medios de reaccin, en la temperatura y en el periodo de incubacin, seleccionando procedimientos con el menor costo y un mnimo de detecciones de incompatibilidad in vitro que no tendrn un mayor significado in vivo, por esta razn la incubacin de la prueba a temperatura ambiente est siendo eliminada.
APLICACIN CLNICA
Valoracin de la prescripcin (indicacin) de la transfusin. Es obligacin del mdico responsable del banco de sangre valorar cada una de las solicitudes recibidas, ya que en muchos casos se encuentra que la indicacin de la transfusin no est justificada.
Suero del receptor y Eritrocitos de donador. TABLA 9. TIPO Y VOLUMEN REQUERIDO
TIPO DE MUESTRA
VOLUMEN
Suero
2 Gotas
Eritrocitos
1 Gota
RECIPIENTE DE RECOLECCIN En un tubo con tapn morado con anticoagulante EDTA que proporciona el banco de sangre. IDENTIFICACIN DE LA MUESTRA La muestra debe estar perfectamente identificada, conteniendo en la etiqueta nombre completo, nmero de registro, cama del paciente, fecha de la toma. FACTORES DE RECHAZO Las muestras deben ser rechazadas si cumplen con por lo menos uno de los siguientes puntos: Muestra coagulada Muestra hemolizada Muestra mal etiquetada Volumen insuficiente
CONDICIONES DE MANEJO Y ALMACENAMIENTO
La muestra debe estar contenida en tubos siempre cerrados y en posicin vertical. Se recomienda separar fsicamente el suero de las clulas dentro de las 2 horas siguientes a la recoleccin de la muestra. Si no se analizan las muestras de suero dentro de las primeras 8 horas, deben almacenarse entre 2C y 8C.
La muestra debe ser manipulada slo por personal autorizado. Debe ser transportada bien cerrada y en posicin vertical, en gradillas de tamao adecuado al tubo, o en su defecto a travs de un sistema de transporte neumtico.
Si la muestra requiere salir del laboratorio debe ser colocada en contenedores rgidos de plstico perfectamente bien cerrados, los cuales deben de proporcionarle seguridad y facilidad de transporte a la muestra.
4.4 REACTIVOS
1. Solucin salina fisiolgica al 0.9% 2. Glbulos rojos del donante, en suspensin al 3- 5% en solucin fisiolgica 0.9%
FIGURAS 5 Y 6. PREPARACION DE SUSPENSION DE ERITROCITOS
3. Suero del paciente (obtenido en los tres das previos a la transfusin, s el paciente se encuentra dentro de la ventana de inestabilidad serolgica).
Centrfuga Guantes desechables Gradillas Solucin salina Albmina, LISS, PEG ( polietilenglicol ) Antiglobulina humana (poli inespecfico IgG C3).
Una vez recibida la muestra de sangre debe ser centrifugada durante 5 minutos a 3500 rpm.
La prueba cruzada puede ser dividida en tres fases:
FASE I. SALINA RPIDA:
1. Coloque 2 gotas de suero del paciente en un tubo de 12 x 75 mm previamente etiquetado. 2. Aada 1 gota de la suspensin de clulas de glbulos rojos de la unidad a ser transfundida. 3. Mezclar y centrifugar durante 30 segundos a 3500 rpm. 4. Observar en busca de hemlisis, resuspender con suavidad las clulas y examinar la presencia de aglutinacin. En general no se requieren lecturas microscpicas. 5. Leer, interpretar y registrar los resultados de la prueba.
FASE II. 37C:
La prueba continua incubndose a 37C utilizando algunos de los medios de reaccin entre los cuales podemos mencionar:
ALBUMINA solucin al 22% : Aadir 3 gotas e incubar por lo menos 30 minutos, centrifugar 30 segundos y leer, despus se realizan tres lavados con solucin salina fisiolgica al 0.9% y llevar el procedimiento hasta la fase de Coombs. La albmina podra influir en el segundo estadio de la aglutinacin, por
reduccin de la carga negativa neta de los eritrocitos o alteracin de la tensin superficial intercelular, favoreciendo as la aglutinacin de las clulas recubiertas de anticuerpos.
PEG (polietilenglicol). Aadir 2 gotas e incubar por lo menos 15 minutos con este reactivo no se centrifuga se procede a realizar los lavados tres veces con solucin salina fisiolgica al 0.9%.
FASE III. ANTIGLOBULINA HUMANA: aadir 2 gotas de anti gamma globulina humana
Proceder a
(Anti IgG - C3d) a cada botn lavado de clulas, mezcle bien y centrifugue por 15 segundos a 3500 rpm. Resuspender las clulas mediante una agitacin suave. Lea macroscpicamente (Si es necesario) para la aglutinacin y anote los resultados. Si el botn se disuelve la prueba es negativa o prueba compatible. Si hay aglutinacin la prueba es positiva o prueba incompatible.
Banco Central de Sangre, Centro Mdico Nacional Siglo XXI 2002. Instituto Mexicano del Seguro Social. Editorial Prado. p. 103- 115.
Brecher ME. 2002. Technical Manual. Fourteenth edition. Maryland, USA: American Association of Blood Banks; p. 253-263.
De Jess Linares G. 2001. Inmunohematologa y Transfusin. Ed.Viamonte; p. 62, 63, 65, 66, 219, 220.
Malvasi Graciela N. 2003. Pruebas de Laboratorio en el Estudio de Anemias Hemolticas. p. 210 - 215.
Meja-Arregu
MH.
2004.
Resolucin
de
Problemas
Transfusionales
Relacionados con Concentrados Eritrocitarios. Gac. Med. Mex. 2004; 140 (Supl 3); p. 25-p34.
Mollison PL, Engelfriet CP, Contreras M.1997. Blood Tranfusion Cinical Medicine. Tenth edition. London, UK: Blackwell Science; p. 97-102, 244 -251.
Radillo-Gonzlez A. 1999. Medicina Transfusional. Mxico. Prado; p. 137-147, 266.
Rodrguez-Moyado H, Quintanar-Garca E, Meja- Arregu MH. 20004. El Banco de Sangre y la Medicina Transfusional. Primera edicin. Mxico, Editorial Panamericana; p. 159-160.
TEMA
5.
ANTICUERPOS
IRREGULARES,
SU
IMPORTANCIA
EN
MEDICINA TRANSFUSIONAL
La Medicina Transfusional es una herramienta muy importante en las reas de la salud. Los concentrados sanguneos funcionan como un mecanismo auxiliar en el proceso respiratorio de pacientes a quienes una condicin patolgica les impide elaborar eficientemente sus propias clulas sanguneas, o bien, en pacientes con prdida sangunea grave en quienes el vital lquido es requerido para recuperar o mantener el equilibrio del cuerpo. No obstante en su utilidad, se reconocen efectos nocivos ocasionados por reacciones transfusionales, cuya aparicin puede ser inmediata o tarda.
El efecto inmediato va de leve a grave y se puede manifestar en forma de urticaria, fiebre o choque anafilctico. Se atribuye a factores tales como la contaminacin bacteriana del componente transfundido o la respuesta inmune debida a la introduccin de un antgeno desconocido por el paciente, se debe a anticuerpos contra las diferentes clulas sanguneas, de tal forma que se identifican anticuerpos contra antgeno, componentes leucocitarios, plaquetarios, eritrocitarios o del sistema HLA.
Entre los anticuerpos antieritrocitos el ms nocivo es el que provoca la incompatibilidad por sistema ABO: ha ocasionado aproximadamente 40 % de las muertes por incompatibilidad. Los generadores de este problema son la confusin al asignar la bolsa de sangre al receptor y el etiquetado equivocado de las muestras para las pruebas pretransfusionales.
Para conocer la naturaleza de los anticuerpos presentes en una reaccin transfusional es muy importante disponer de todos los antecedentes que afectan o provocan la produccin de los mismos, como los que se ocasionan despus de la transfusin y, cuando se habla de mujeres, los gineco obsttricos, para indagar respecto a una probable enfermedad hemoltica del recin nacido (EHRN).
Las que son tardas los efectos son adversos producidos por la transmisin de microorganismos contenidos en la sangre del donador. Desde el punto de vista de la inmunohematologa, los anticuerpos contra antgenos sanguneos se clasifican como sigue: Anticuerpos contra los propios antgenos del individuo: autoanticuerpos contra antgenos, eritrocitos y plaquetas, y los producidos en enfermedades autoinmunes, como las de la colgena. En este contexto podemos considerar a los anticuerpos autoinmunes como anticuerpos irregulares o adquiridos, y dividir a los aloanticuerpos de la siguiente forma: Regulares naturales: los producidos contra el sistema ABO (anti-A y anti-B). Irregulares naturales: anti A1, anti-M, anti-N, anti-P1. anti-E, entre otros. Irregulares adquiridos o inmunes: antisistema Rh Hr (anti-D, anti-c, anti-C, y otros), anti-Kell, anti-Duffy. En este contexto, los anticuerpos del sistema ABO aparecen una vez que el individuo entra en contacto con el medio ambiente donde se encuentran microorganismos como algunas bacterias coliformes que contienen sustancias qumicas con estructuras parecidas a las de este sistema.
Por anticuerpos regulares debemos identificar a los que existen en todos los individuos y que stos tendrn durante toda su vida. Los anticuerpos irregulares son los que no estn de esa manera, aunque en el caso de los naturales no se conoce a ciencia cierta qu o cmo se induce su produccin.
Los adquiridos se conocen tambin como inmunes y son el resultado de la exposicin a antgenos desconocidos por el individuo al momento de la transfusin o en las mujeres por el embarazo; estos anticuerpos son dirigidos contra antgenos de sistemas diferentes al ABO. Los anticuerpos naturales regulares son preferentemente inmunoglobulinas de la clase IgM, las cuales fijan de manera tan eficiente el complemento que pueden provocar lisis intravascular y ocasionar insuficiencia renal o incluso la muerte del paciente.
Los anticuerpos adquiridos o inmunes son generalmente inmunoglobulinas IgG, las cuales producen hemlisis extravascular en el bazo o en el hgado mediante fagocitosis del complejo eritrocito anticuerpo.
Los aloanticuerpos irregulares (adquiridos) ms comunes en nuestra poblacin son los que involucran a los sistemas MNSs, P1, Kidd (Jka, Jkb), Duffy (Fya, Fyb), Kell, Lewis y Diego.
De acuerdo con la temperatura ptima de reaccin, estos anticuerpos se dividen en anticuerpos fros y anticuerpos calientes.
Los anticuerpos fros van dirigidos contra los sistemas MN, Lewis y P1, con ptima reaccin a temperaturas entre 4C y 22C; estos son generalmente inmunoglobulinas tipo IgM y ocasionalmente tipo IgG, y debido a esa temperatura de reaccin carecen de importancia clnica salvo que su reaccin ocurra tambin a 37C, es decir, que acten como anticuerpos calientes.
Entre estos slo los dirigidos contra los antgenos M y N han sido asociados con EHRN, cuya severidad va desde leve a moderada. Los llamados anticuerpos calientes tienen una temperatura ptima de reaccin a 37C, a veces visible pero en otras ocasiones slo evidente hasta agregar anti gamma globulina humana (suero de Coombs). Estos tienen una relevante importancia clnica ya que se les asocia con reacciones transfusionales de intensidad moderada a severa, que pueden ocasionar la muerte; adems, son causantes de hemlisis en los recin nacidos, quienes en ocasiones requieren
exsanguinotransfusin.
El laboratorio clnico funciona como un servicio de apoyo muy importante en la medicina transfusional para la teraputica, por lo que se ha desarrollado el rea de inmunohematologa cuyo valor radica en la identificacin de los anticuerpos irregulares derivados de los procesos de inmunizacin, sean transfusiones, por embarazos o de naturaleza autoinmune.
Para un ptimo funcionamiento de esta rea del laboratorio es importante conocer las caractersticas ya descritas del comportamiento de los anticuerpos, as como otras ms:
La afectacin que sufren por el efecto de medios de baja fuerza inica (LISS, polietilenglicol y otros), por el de productos qumicos o enzimas (ficina, tripsina, quimiotripsina, ditiotreitol, papana, stalidasa, bromelasa, y otras) o de otras sustancias. De esta manera conocemos que algunos anticuerpos de este tipo se ven afectados o son destruidos.
Las reacciones antgeno-anticuerpo pueden observarse in vitro mediante:
Hemlisis: La unin se traduce en lisis de los eritrocitos en presencia del complemento (siempre que el anticoagulante empleado no capture los iones Ca y Mg necesarios para la activacin del complemento).
Aglutinacin: Los anticuerpos que reaccionan en medio salino se conocen como completos o aglutinantes (comnmente tipo IgM). Como ya se coment, existen diferentes elementos que influyen en la reaccin antgeno anticuerpo y que deben conocerse para utilizarlos adecuadamente en la bsqueda de anticuerpos irregulares:
a) Aglutinacin en medio macromolecular: Hay anticuerpos que aglutinan mejor cuando se suspenden en una solucin de macromolculas (albmina, dextrn, gelatina, polivinilpirrolidona); aqu la albmina en concentracin de 22% a 30% incrementa la constante dielctrica del agua, lo que disminuye el potencial zeta. Hay evidencia de que el dextrn y el PVP potencializan la reaccin con puentes de polmeros.
b) Prueba de Coombs: Este procedimiento es til para poner de manifiesto anticuerpos incompletos o sensibilizantes.
c) Soluciones de baja fuerza inica: Reducen la barrera electrosttica facilitando la reaccin antgeno anticuerpo.
d) Enzimas: Potencializan la reaccin antgeno anticuerpo reduciendo la superficie de carga y removiendo estructuras que interfieren en el acceso de las molculas del anticuerpo.
e) Centrifugacin: Acelera la reaccin antgeno anticuerpo, por la fuerza que produce la misma.
f) Temperatura: Afecta la reaccin antgeno-anticuerpo de acuerdo con la temperatura ptima de reaccin: 4C a 22C para los fros, o 37C para los calientes.
g) Proporcin de antgeno y anticuerpo: Es importante en la bsqueda de la zona de equivalencia de la reaccin antgeno-anticuerpo. Es fundamental tener un panel de clulas (eritrocitos) donde estos importantes fenotipos ya hayan sido tipificados para usarlos en la identificacin del anticuerpo correspondiente.
En el Servicio de Inmunohematologa, se emplean las tcnicas siguientes para la identificacin de anticuerpos irregulares de forma manual: Tcnica salina: previamente lavados, los eritrocitos del panel de fenotipo conocido o de la sangre de donacin se ponen en contacto con el suero problema a razn de una gota de clulas resuspendidas de 2 a 3 % por dos del suero problema. Para iniciar el proceso se centrifugan y se leen; posteriormente se incuban a una temperatura de 22C durante media hora a una hora cuando se sospecha una enfermedad por anticuerpos fros de tipo autoinmune; centrifugar y leer para descartar o confirmar este diagnstico.
El siguiente paso es incubar a 37C por 30 minutos, empleando el mayor tiempo cuando se sospecha sensibilizacin por transfusin o embarazos previos. Centrifugar, leer y finalmente lavar los eritrocitos tres veces con solucin salina fisiolgica 0.9% para retirar totalmente las protenas sricas y al final agregar suero de Coombs; centrifugar y leer.
Tcnica en solucin salina de baja fuerza inica o LISS (low ionic strenghsaline): Los eritrocitos previamente lavados y suspendidos en una dilucin entre 2 y 3 %, se lavan una vez con dos a tres gotas de solucin de LISS, se decantan a sequedad y se agregan dos gotas de LISS ms dos gotas del suero problema; homogenizar y agregar dos gotas ms de LISS, incubar por 15 minutos a 37C, lavar nuevamente tres veces con solucin salina y agregar suero de Coombs; centrifugar y leer. Tcnica enzimtica con bromelina (bromelasa): Por el fuerte efecto que tiene esta enzima sobre los eritrocitos, los tiempos de incubacin se reducen. El procedimiento es de la siguiente forma: a los eritrocitos lavados se les agrega el suero problema en la proporcin ya descrita ms una gota de la enzima (bromelina); se incuban, centrifugan y se leen. Despus se incuban a 37C por 15 minutos; se centrifugan y se leen. Para finalizar, se lavan en la forma ya mencionada y se les agrega suero de Coombs; se centrifugan y se leen. Tcnica en albmina: En esta tcnica se procede de forma parecida a la salina, slo que se omite el paso de la incubacin a 22C, respetndose tambin los tiempos de incubacin. Como reactivo adicional se agrega en cada tubo dos gotas de solucin albuminosa al 22%. Todas las pruebas se fundamentan en las caractersticas mencionadas previamente para las reacciones antgenoanticuerpo. En cualquier tcnica los resultados se deben anotar inmediatamente e interpretar en conjunto al final.
5.1 PANEL DE 10 CLULAS
Se elaboran clulas de donantes con fenotipo conocido en el que se han incluido los ms comunes de nuestra poblacin. ste consta generalmente de grupos sanguneo O, factor RhOD positivo y de factor RhOD negativo; de cuatro donadores para determinacin de grupo en el sistema ABO (A1, A2,B, O); de dos donadores grupo O para diferenciacin de factor RhO D (una factor positivo y otra factor negativo); clulas de un donador grupo O, las cuales sern sensibilizadas, es decir, se les pegar un anticuerpo de naturaleza IgG, generalmente un anti-D, y otras del mismo grupo O sin sensibilizar que funcionan como control negativo; stas dos ltimas servirn para controlar el suero de Coombs.
Debe trabajarse con sumo cuidado teniendo siempre en cuenta que de nuestro trabajo depende la vida de muchos pacientes, y que nosotros podramos ser la causa de una pronta recuperacin o de una complicacin mayor. Nos corresponde poner nuestro mayor empeo para obtener resultados ptimos; Por eso, cada tcnica debe ser trabajada de acuerdo con los parmetros establecidos, por ejemplo: el sistema Duffy es sensible a los medios de baja fuerza inica y susceptible de ser destruido por algunas enzimas, lo que pudiera conducir a resultados errneos. La importancia de la albmina, radica en que puede magnificar reacciones del sistema Rh-Hr, sin embargo, la tcnica ms empleada es la salina, ya que nos permite observar adecuadamente las reacciones y nos apoya en las otras tcnicas, sobre todo cuando se observa ms de una poblacin de anticuerpos antieritrocitos, adems de ser altamente confiable.
Para reacciones in vitro y dado que el sistema de complemento en algunas reacciones antgeno-anticuerpo es imprescindible, se recomienda que se trabaje con muestras frescas para no permitir que ste se consuma hasta desaparecer. Cabe aclarar que los factores del complemento son protenas que actan en cascada e interactan con los anticuerpos antieritrocitarios, ya sea para la lisis del complejo mencionado (C9) o para facilitar la funcin de las clulas fagocticas (C3).
De Jess Linares G. 2001. Inmunohematologa y Transfusin. Ed.Viamonte; p. 62, 63,65, 66, 219, 220.
Kelton G. John. 20000. Transfusin Sangunea. Ed. DOYMA. Barcelona Espaa; p. 56, 58, 59, 310, 311, 316, 317, 318.
Malvasi N. Graciela. 2003. Pruebas De Laboratorio en el Estudio de Anemias Hemolticas.
Meja-Arregu MH. 20004. Resolucin de Problemas Transfusionales
N Malvasi Graciela. 2006. Tcnicas de Diagnstico y Seguimiento en el Laboratorio de Inmunoserologa Gua De Trabajos Prcticos. p. 12, 14, 18,19.
Radillo-Gonzlez A. 1999. Medicina Transfusional. Mxico. Prado; p.137-147, 266.
Relacionados con Concentrados Eritrocitarios. Gac Med Mex 2004; 140 25 - 34.
Rodrguez-Moyado H, Quintanar-Garca E, Meja- Arregu MH. 20004. El Banco de Sangre y la Medicina Transfusional. Primera edicin. Mxico, Editorial Panamericana; p. 159-160.
Roitt Ivan. Jonathan Brostoff. David Male. 1997. Inmunologa. 4 Edicin. Harcourt. p. 156, 157, 159.
TEMA 6. RASTREO DE ANTICUERPOS IRREGULARES

(MTODO LO-ION EN TUBO)
6.1 RESPONSABILIDADES El Coordinador de Medicina Transfusional debe asegurar que este procedimiento se cumpla. Es responsabilidad de los qumicos y tcnicos laboratoristas cumplir con lo descrito en este procedimiento.
6.2 PRINCIPIO
El uso de gamma LO-ION, en lugar de las soluciones de albmina bovina para los procedimientos de anticuerpos, crea un ambiente de baja fuerza inica que incrementa la proporcin del anticuerpo captado durante la incubacin y as es mayor la reactividad, ya sea como hemoaglutinacin directa o en pruebas de antiglobulina indirecta. Al mismo tiempo, la incorporacin de compuestos de alto peso molecular incrementa la habilidad de muchos anticuerpos para dar reacciones de aglutinacin directas con las clulas que posean el antgeno apropiado.
Aplicacin clnica Este estudio consiste en el rastreo que permite identificar a los pacientes que presentan en su suero anticuerpos antieritrocitarios dirigidos contra antgenos que no son del sistema ABO. Esta prueba est indicada como parte de las pruebas de compatibilidad sangunea pretransfusional, en mujeres Rh negativo, como parte del estudio de la EHRN, en estudios de la anemia hemoltica autoinmune, entre otras ms.
Preparacin del paciente:
Ayuno necesario de 8 horas
Tipo de muestra: Sangre total TABLA 10. TIPO Y VOLUMEN REQUERIDO
VOLUMEN TIPO DE MUESTRA
ptimo
Mnimo
7.0 mL Sangre total
5.0 mL
RECIPIENTE DE RECOLECCIN La sangre debe ser recolectada en un tubo de BH. Proporcionado por el Servicio de Medicina Transfusional con la etiqueta correspondiente. IDENTIFICACIN DE LA MUESTRA La muestra debe estar perfectamente identificada, conteniendo en la etiqueta nombre completo del paciente, nmero de registro, fecha de la toma y ubicacin exacta, indicando servicio y nmero de cama.
FACTORES DE RECHAZO Las muestras deben ser rechazadas si cumplen con por lo menos uno de los siguientes puntos: Muestras lipmicas o hemolizadas Presencia de macro partculas Muestras sobre etiquetadas Muestras con etiquetas tachadas o corregidas Volumen insuficiente Recipiente distinto al proporcionado
Cuando una muestra es rechazada, el Coordinador y/o responsable de rea (o el responsable del turno) debe comunicar al mdico encargado del servicio (o al MIP), solicitando nueva muestra o cancelando el anlisis y llenar un reporte de producto no conforme (FR-AC-05) como se establece en el procedimiento general de control de producto no conforme (PG-AC-04).
CONDICIONES DE MANEJO Y ALMACENAMIENTO La sangre se extrae por una tcnica asptica, mediante una puncin limpia y sin problemas de toma. Se coloca en el tubo proporcionado por el Servicio de Medicina Transfusional, correctamente etiquetado. Debe de centrifugarse inmediatamente y ser procesada en ese mismo da. Despus de terminar los estudios la muestra se debe de conservar y almacenar en su tubo original debidamente tapado y en refrigeracin entre 2C y 8C por un tiempo no mayor de 72 horas.
La muestra debe ser manipulada slo por personal autorizado. Debe ser transportada bien cerrada y en posicin vertical, en gradillas de tamao adecuado al tubo, o en su defecto a travs de un sistema de transporte neumtico. Si sta requiere salir del laboratorio debe ser colocada en contenedores rgidos de plstico perfectamente cerrados, los cuales deben de proporcionarle seguridad y facilidad de transporte.
6.4 REACTIVOS
MATERIALES
Pipetas Pasteur Tubos de ensaye de 12 x 75 10 x 75 mm Bulbos Gradillas Marcador con tinta indeleble Pluma (tinta azul o negra) Papel parafilm Cronmetro Contenedor de plstico con hipoclorito de sodio al 5 % en cantidad suficiente Contenedor desechable de punzo cortantes Libreta de pruebas de Banco de Sangre Reactivo de clulas rojas para la deteccin de anticuerpos Solucin salina fisiolgica al 0.9 % Reactivo de anti-IgG, C3d (suero de Coombs) Reactivo de clulas rojas sensibilizadas Reactivo de clulas rojas no sensibilizadas Reactivo de Gamma LO-ION
PREPARACIN
Los eritrocitos del panel se preparan cada vez que se utilicen realizando tres lavados con solucin salina fisiolgica al 0.9 % y resuspender es sta a una concentracin aproximada de 3% a 5%. De igual manera se preparan los eritrocitos sensibilizados y no sensibilizados, proporcionados en el mismo.
ACEPTABILIDAD
La aceptabilidad de un reactivo est determinada por los resultados obtenidos en el control de calidad.
ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD
Las condiciones de almacenamiento distintas a las recomendadas pueden producir resultados errneos. El reactivo es estable hasta la fecha de caducidad que aparece en la etiqueta si se almacena entre 2C y 8C. No congelar.
CONTROL DE CALIDAD
TABLA 11. IDENTIFICACIN DEL CONTROL
NOMBRE DEL CONTROL Suero No. 1 Suero No. 2 Clulas sensibilizadas Auto testigo
NIVEL 5 mL 5 mL 10 mL No aplica
TIPO DE MUESTRA Suero Suero Clulas Suero-clulas
Los sueros control se analizan al inicio de cada lote de eritrocitos del panel 10 Siglo XXI. Para los reactivos de Inmunohematologa es diario al inicio del da.
ALMACENAMIENTO Almacenar los frascos sin abrir entre 2oC y 8oC.
PROCEDIMIENTO DE USO DE LOS CONTROLES
Los controles de sueros conocidos proporcionados se procesan de la misma manera que cualquier muestra de pacientes, realizando el procedimiento descrito.
La aceptabilidad de la prueba se basa en que los resultados del control de calidad se cumplan de acuerdo a los procedimientos descritos. Las acciones correctivas necesarias sern tomadas por el coordinador del rea.
Todos los datos obtenidos del control de calidad se registran en los formatos correspondientes.
En caso de no contar con controles comerciales se puede utilizar muestras de sueros ya conocidos y caracterizados plenamente en el laboratorio, tanto de un paciente con anticuerpos irregulares positivos como uno con anticuerpos irregulares negativos. Los sueros son congelados en alcuotas de 200L cada una de ellas ser procesada con la frecuencia y aceptabilidad de un control.
Centrifuga clnica Centrifuga serolgica Clay Adams Bao Mara Guantes desechables Gradillas Lentes de seguridad
PREPARACIN DE LA SUSPENSIN DE ERITROCITOS DE LA MUESTRA Y DEL PANEL (3-5 %). Tomar 4 gotas del concentrado eritrocitario de la muestra y de cada clula del panel 10 y colocarlos en un tubo de vidrio, previamente identificados Adicionar solucin salina fisiolgica al 0.9 % hasta que est lleno el tubo y homogenizar completamente Centrifugar durante 1 minuto Decantar el sobrenadante Repetir el lavado dos veces ms En el ltimo lavado, quitar el exceso de solucin salina Con pipeta Pasteur, tomar una gota del concentrado eritrocitario, trasvasarlo en otro tubo de vidrio debidamente identificado y agregar 24 gotas de solucin salina fisiologca al 0.9 % y homogenizar.
MTODO
a) Preparar una serie de 10 tubos identificados con el nmero de cada clula del Panel 10 . Incluir un autotestigo b) Con pipeta Pasteur agregar 2 gotas de suero de la muestra en cada tubo c) Agregar una gota de la suspensin de eritrocitos de cada clula del panel a cada tubo correspondiente d) Agregar una gota de la suspensin de eritrocitos del paciente en el tubo autotestigo e) Mezclar y centrifugar 30 segundos a 3500 rpm f) Resuspender suavemente el botn de clulas, tubo por tubo. Leer y anotar si existe o no aglutinacin g) Agregar a cada tubo dos gotas de LO-ION mezclar y centrifugar 30 segundos a 3500 rpm h) Observar tubo por tubo si existe hemlisis. Leer y registrar la presencia de hemlisis i) Resuspender completamente el botn de clulas mediante agitacin suave e incubar a 37C durante 10 minutos (mximo 30 minutos) j) Luego de la incubacin, lavar en tres ocasiones con solucin salina fisiolgica al 0.9 %, centrifugando durante 1 minutos en cada lavado k) Eliminar el exceso de solucin salina fisiolgica al 0.9 % en el ltimo lavado y agregar dos gotas de suero de Coombs a cada tubo, se mezcla suavemente y se centrifuga durante 30 segundos a 3500 rpm l) Se resuspende suavemente el botn de clulas a contraluz tubo por tubo y leer la aglutinacin. Registrar los resultados m) En los tubos en donde no se observ aglutinacin con el suero de Coombs, agregar una gota de clulas rojas sensibilizadas, mezclar suavemente y centrifugar durante 30 segundos a 3500 rpm n) Despus de la centrifugacin resuspender el botn de clulas por agitacin suave y leer a contraluz la aglutinacin, tubo por tubo. Registrar los resultados o) El registro de todos los datos y observaciones realizados durante la prueba se harn en la libreta de registro de estudios del Banco de Sangre con el formato y organizacin establecidos.
6.7 RESULTADOS
CLCULOS Y CONVERSIONES
Con los datos obtenidos al final de la prueba se realiza la lectura mediante comparacin con la carta de identificacin de anticuerpos correspondiente proporcionada en el Panel 10 para la identificacin de l o los anticuerpos encontrados.
REPORTE DE RESULTADOS
Los resultados obtenidos pueden ser capturados manualmente en el formato correspondiente ya establecido o transmitidos al Sistema del Paciente Ambulatorio (SIPAM) va electrnica (interfase) y son validados y liberados por el Coordinador de Medicina Transfusional o el responsable de turno.
En la validacin de los resultados se revisa que los resultados obtenidos sean congruentes y que no queden espacios libres en la pantalla sin capturar. Una vez que los resultados son liberados en el SIPAM, son impresos durante la noche en el departamento de archivo clnico y son archivados en el expediente del paciente.
INTERVALOS DE REFERENCIA
Los intervalos de referencia para la identificacin de anticuerpos irregulares son: NEGATIVO POSITIVO. Nombre del anticuerpo identificado.
Cuando se tenga el antecedente de que esta misma prueba ha resultado positiva anteriormente en el paciente. Cuando la discrepancia obtenida en el estudio, pudiera ser debida a la aplicacin de la gamma-globulina anti-D en mujeres Rh negativo en un periodo anterior no mayor de tres meses.
Cuando despus de un resultado negativo en la fase de Coombs, no se observe aglutinacin con las clulas de control de Coombs (clulas sensibilizadas) despus de la centrifugacin.
Factores como materiales contaminados, tiempo o temperatura inadecuada o examinacin de la aglutinacin impropia pueden dar resultados falsos. La utilizacin de plasmas o sueros viejos para las pruebas, puede ocasionar fallas en la deteccin de anticuerpos dependientes de complemento. El suero o plasma de prueba puede contener un anticuerpo dirigido a un antgeno no representado en el reactivo de clulas, o bien, puede contener un anticuerpo que es muy dbil para ser detectado mediante los medios y/o mtodos de prueba empleados.
En casos raros la presencia en el suero o plasma de anticuerpos dirigidos a un antibitico puede causar reacciones falsas. Se ha reportado anticuerpos para la Neomicina y el Cloranfenicol.
Las fases de lavado de las pruebas deben de ser llevadas a cabo sin interrupcin, y el resultado final debe ser interpretado inmediatamente que se termine con la prueba.
La prueba de Control de Coombs no nos da una absoluta seguridad de que no se presenten resultados falsos al realizar las pruebas. Pueden ocurrir sin ser detectados errores debido a la inadecuada agitacin, incubacin, etc.
Burtis Carl A., 1996. Fundamentals of clinical chemistry, 4 ed. Ed. W.B. Saunders Company, U.S.A: p. 351-359.
De Jess Linares G. 2001. Inmunohematologa y Transfusin. Ed.Viamonte; p. 62, 63,65, 66, 219, 220.
G.Kelton John. 2000. Transfusin Sanguinea. Ed. DOYMA. Barcelona Espaa; p. 46, 48, 69, 210, 451, 456, 457, 518.
Mandell-Douglas Bennet. 1991. Enfermedades Infecciosas. Ed. Mdica Panamericana. p. 73, 77, 78, 79,80.
Mollison PL, Engelfriet CP, Contreras M.1997. Blood Tranfusion in Cinical Medicine. Tenth edition. London, UK: Blackwell Science; p. 205, 206,208, 319,322.
Malvasi Graciela. 2003. Tcnicas de Diagnstico y Seguimiento en el Laboratorio de Inmunoserologa - Gua De Trabajos Prcticos. p. 45,47, 72, 73, 77, 78,79.
Radillo-Gonzlez A. 1999. Medicina Transfusional. Mxico. Prado; p. 17-47, 48, 66.
Reporte de control de producto no conforme (FR-AC-05).
TEMA 7. RASTREO DE ANTICUERPOS IRREGULARES

(MTODO CON ALBUMINA)
El Coordinador debe asegurar que este procedimiento se cumpla. Es responsabilidad de los qumicos y tcnicos laboratoristas cumplir con lo descrito en este procedimiento.
7.2 PRINCIPIO
La habilidad de los anticuerpos de los grupos sanguneos de producir una aglutinacin directa de las clulas rojas sanguneas antgeno-positivas, depende de la distancia de separacin del puente de las clulas en suspensin, los anticuerpos IgG, son incapaces de ligar el espacio entre las clulas rojas suspendidas en una solucin electroltica; existen varias teoras que pueden explicar la habilidad de potencialidad de la albmina en la aglutinacin directa por IgG. La descrita por Pollack y colaboradores en la que explican que la albmina reduce el potencial zeta por disposicin de algunos sistemas de pruebas, realmente liga algunos anticuerpos Rh incompletos para que produzcan una reaccin en las pruebas de aglutinacin directa. La presencia de albmina bovina tambin ha sido reportada para mejorar la sensibilidad de la prueba de aglutinacin indirecta para un gran nmero de anticuerpos especficos de los grupos sanguneos.
DESCRIPCION DEL REACTIVO
La albmina es preparada de suero o plasma bovino, y est disponible en solucin al 22 % o al 30 %, se adiciona azida de sodio a una concentracin de 0.1% como conservador. El pH es de 3.3 +/ - 0.1. Estos productos generalmente no contienen caprilato de sodio, una solucin de cido graso, que es usada como estabilizador durante el tratamiento caliente como una parte en el proceso de fabricacin. En algunas ocasiones los aditivos del sistema de prueba que contienen caprilatos pueden causar resultados falsos - positivos.
FIGURA 7. ALBMINA BOVINA POLIMERIZADA 22%
Cuando el suero de pacientes contiene anticuerpos para caprilato o algunos otros con una cadena corta de cidos grasos, la formacin de los complejos albmina inmunoglobulina causa aglutinacin de algunas clulas rojas sanguneas. Esta aglutinacin es algunas veces vistas solo en la fase de antiglobulina pero es observada ocasionalmente en la prueba despus de la incubacin a 37oC. Esta causa puede ser sospechosa si un suero da positivo con todas las clulas (incluyendo el control). Mantenga a 1oC - 8oC cuando no se use. No se congele, mantenga su esterilidad, no se use si esta marcadamente turbio.
APLICACIN CLNICA
Para la potencializacin de anticuerpos incompletos en los procedimientos en la deteccin de anticuerpos.
No se necesita preparacin especial del paciente
CONDICIONES DE LA MUESTRA
Muestras no contaminadas, muestras sanguneas viejas
TIPO DE MUESTRA
Suero, Plasma o clulas rojas TABLA 12. TIPO Y VOLUMEN REQUERIDO
VOLUMEN
Mnimo
Suero
1.0 mL
0.5 mL
La sangre se extrae por una tcnica asptica y el suero es separado para ser probado tan pronto como sea posible.
IDENTIFICACIN DE LA MUESTRA
La muestra debe estar perfectamente identificada, conteniendo en la etiqueta nombre completo, nmero de registro, fecha de la toma, iniciales del flebotomista y ubicacin del paciente en caso de no pertenecer a la consulta externa.
FACTORES DE RECHAZO
Las muestras deben ser rechazadas si cumplen con por lo menos uno de los siguientes puntos:
Muestras lipmicas Presencia de macro partculas Muestras mal etiquetadas Volumen insuficiente
CONDICIONES DE MANEJO Y ALMACENAMIENTO
El suero es separado para ser usado tan pronto como sea posible, si la prueba se dilata, las muestras para la identificacin de anticuerpos, deben conservarse de 2oC a 8oC por un tiempo no mayor de 48 horas. El suero puede mantenerse por un tiempo mayor de 48 horas. El plasma de muestras anticuaguladas puede usarse si se desea, pero el operador debe estar enterado que esto puede dar resultados falsos o detectar anticuerpos dependientes de complementos. Si son requeridas clulas rojas para la prueba se pueden obtener las muestras utilizando EDTA, heparina u oxalato y stas deben ser probadas antes de 48 horas. Las clulas rojas sanguneas de muestras coaguladas pueden ser probadas dentro de 21 das despus de su recoleccin. Las clulas rojas de donadores unitarios deben ser probadas hasta antes de la fecha de caducidad.
7.4 REACTIVOS
Reactivo de clulas sanguneas para la deteccin e identificacin de anticuerpos antiglobulina humana Clulas control Coombs Albmina bovina al 22%
MATERIALES
Tubos para prueba de 10 x 75 mm Pipetas Solucin salina fisiolgica 0.9 % Bao Mara a 37C Centrifuga Cronmetro
PREPARACIN
La albmina es preparada de suero o plasma bovino, y est disponible en solucin al 22 % o al 30 %, adicionada con azida de sodio una concentracin de 0.1% como conservador. El pH es de 3.3 +/ - 0.1.
ACEPTABILIDAD
ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD
Los cartuchos de reactivo deben almacenarse cerrados entre 1C y 8C, no se congelan, mantenga su esterilidad, no se use si esta marcadamente turbio.
Las condiciones de almacenamiento distintas a las recomendadas pueden producir resultados errneos. El reactivo es estable hasta la fecha de caducidad.
Centrfuga Guantes desechables Gradillas
PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO
Colocar dos gotas del suero del receptor en tres tubos marcados I, II y AC (autocontrol) Agregar una gota de las clulas I, II y AC a sus respectivos tubos Aadir tres gotas de albmina al 22% a cada uno de los tubos Incubar 30 minutos a 37C Centrifugar 30 segundos a 3500 rpm Examinar la hemlisis y reconocer si se presenta Resuspender las clulas agitando suavemente con la mano
Lavar los tubos tres veces con solucin salina fisiolgica 0.9% llenando completamente el tubo y decantando con cuidado la solucin salina entre lavado y lavado; y resuspender las clulas perfectamente cuando se adicione la solucin salina fisiolgica para el siguiente lavado.
Decantar la salina fisiolgica 0.9 % completamente en el ltimo lavado Aadir una o dos gotas de anti globulina humana en el botn seco de clulas Mezclar bien centrifugar
Un minuto 1000 rpm 15 segundos a 3500 rpm El tiempo apropiado dependiendo de la calibracin de la centrifuga
Resuspender las clulas con un movimiento suave Leer la aglutinacin y anotar los resultados de la prueba.
7.6 REPORTE DE RESULTADOS
Si no hay aglutinacin o hemlisis en la prueba del paciente y el donador pueden ser considerados compatibles. Esto est sujeto a la apariencia de la aglutinacin comparativa de las clulas control de Coombs.
Si las clulas control de Coombs no aglutinan, la prueba compatible debe repetirse.
No todas las soluciones de albmina bovina son igualmente efectivas en su habilidad para una aglutinacin potencial por anticuerpos Rh incompletos. Un procedimiento de control cualitativo apropiado puede ser seleccionando un anticuerpo incompleto dbilmente reaccionante para usarse sobre una base para confirmar la habilidad potencial de albmina bovina. El suero seleccionado debe ser probado contra clulas positivas y negativas para el antgeno relevante. La prueba contra clulas negativas provee seguridad de que la misma albmina no acumula clulas rojas sanguneas humanas normales.
Otros factores que pueden dar resultados falsos incluyen los siguientes:
Contaminacin de las muestras sanguneas reactivas y/o materiales adicionales Muestras sanguneas viejas, las pruebas pueden dar reacciones ms dbiles que las que se obtienen con muestras frescas Una concentracin mayor de la suspensin de clulas Inadecuada incubacin de tiempo o temperatura Centrifugacin inadecuada. Una excesiva centrifugacin puede tener dificultad en resuspender el botn celular en la prueba en tubo; un botn no muy claro y fcilmente dispersarse la aglutinacin
Una lectura inadecuada de la aglutinacin.
Inserto de la prueba de Albmina Bobina 22% o 30 %.
Mollison PL, Engelfriet CP, Contreras M.1997. Blood Tranfusion in Cinical Medicine. Tenth edition. London, UK: Blackwell Science; p. 403, 404, 423, 425. 436, 441.
Malvasi Graciela. 20006. Tcnicas de Diagnstico y Seguimiento en el Laboratorio De Inmunoserologa Gua De Trabajos Prcticos. p. 42, 43, 44, 45, 67, 68,71.
Norma Oficial Mexicana NOM-003-SSA2-1993. Para la disposicin de sangre humana y sus componentes D.O.F. 16-I-1995.
Vives L, Aguilar J, Aguilar L. 1997. Manual de Tcnicas de Laboratorio en Inmunohematologa. Segunda edicin. Barcelona, Espaa: Masson; p. 204, 308, 309,310.
TEMA 8. PRUEBA DE COOMBS

El Coordinador de inmunohematologa debe asegurar que este procedimiento se cumpla. Es responsabilidad de los qumicos y tcnicos laboratoristas cumplir con lo descrito en este procedimiento.
8.2 PRINCIPIO
La reaccin de Antiglobulina, fue descrita por Moreshi. En 1908, y fue aplicado por Coombs y sus colaboradores en 1945 en la serologa de grupos sanguneos. Cuando se utiliza el suero de animales inmunizados con protena humana en la deteccin de los llamados anticuerpos incompletos, la capacidad del suero antiglobulina para reaccionar con componentes del complemento humana unidos a los glbulos rojos fue reportado en 1957 por Dacie y sus colaboradores. La prueba de antiglobulina Coombs es un procedimiento importante para la deteccin de inmunoglobulina y/o complemento unido a los glbulos rojos. La prueba de antiglobulina directa se utiliza para demostrar los anticuerpos y/o complemento unido a los glbulos rojos in vivo, y la prueba de antiglobulina indirecta despus de la incubacin del suero y los glbulos rojos, demuestran los anticuerpos y/o complemento unido in vitro.
Cuando los anticuerpos incompletos (usualmente IgG) entran en contacto con los glbulos rojos que poseen los antgenos apropiados, stos se unirn a la superficie de las clulas y permanecern unidos durante la serie de lavados con solucin salina fisiolgica 0.9% para eliminar la protena humana unida. Se puede detectar entonces la presencia de la protena resultante a travs de una prueba de lavado de clulas con un reactivo hecho de suero de conejo inmunizado con la protena humana adecuada, o de anticuerpos monoclonales secretados por hibridomas derivadas de ratn inmunizado y de un cultivo medio fluido.
La aglutinacin de glbulos rojos por Anti-IgG en la prueba de antiglobulina directa e indirecta, indica que las clulas estn cubiertas con anticuerpos. Algunos reportes sugieren que el IgG puede fallar ocasionalmente en la deteccin de anticuerpos que se demuestren por el uso de un reactivo de antiglobulina humana poli especfica y los anticuerpos no detectados por Anti-IgG pueden ser clnicamente significativos en algunos casos. El usuario debe ser consiente que la informacin cientfica actual no es completamente un soporte para el uso excesivo de Anti-IgG para pruebas de rastreo de anticuerpos y para pruebas de compatibilidad.
Un paso crucial en el procedimiento de la prueba de antiglobulina son los lavados de clulas antes de aadir la antiglobulina humana. Los lavados eliminan la protena humana unida, que de otra manera pudieran neutralizarla.
DESCRIPCIN DEL REACTIVO
Anti-globulina humana, Anti-IgG,
Gamma Clone (verde o incoloro) contiene un
anticuerpo murino monoclonal IgM secretado por hibridomas de la lnea celular 16H8 cultivada en un medio fluido, este anticuerpo est destinado para reaccionar con un eptope en el dominio CH3 de la regin Fc de IgG humano.
FIGURA 8. SUERO DE COOMBS MONOCLONAL-POLIESPECFICO (ANTI-IgG,-C3D)
El sobrenadante del cultivo del tejido que contiene el anticuerpo monoclonal se diluye en una solucin amortiguadora apropiada para facilitar la resuspensin del botn de clulas despus de la centrifugacin. El producto final se ajusta a un pH 7.0 + 0.1 y contiene azida de sodio a una concentracin final de 0.1% como conservador. Advertencia: La azida de sodio puede reaccionar con las tuberas de plomo y cobre formando azidas metlicas explosivas. Enjuague con un gran volumen de agua para prevenir la formacin de azidas explosivas. El Gamma-Clone Anti-IgG Verde contiene una mezcla de Acid Blue #1 y Acid Yellow #23. Estos reactivos de diagnstico estn destinados para utilizarse como se indica en cualquiera de los mtodos descritos en este instructivo. No se diluye. No se use despus de la fecha de caducidad. Mantngase de 1C a 8C cuando no se use. No se congele. Tenga cuidado de mantener la esterilidad. No se use si est turbio. Precaucin: No pipetee este producto con la boca.
No se requiere una preparacin previa del paciente para obtener la muestra. La sangre debe obtenerse por medio de una tcnica asptica, y preferentemente debe probarse mientras est fresca. Si ocurre un retraso en la prueba, la muestra debe conservarse de 1C a 8C. Para la prueba de antiglobulina directa se debe extraer la sangre con o sin anticoagulante cuando se va a realizar la prueba con Anti-IgG.
TIPO DE MUESTRA Suero, eritrocitos
TABLA 13. TIPO Y VOLUMEN REQUERIDO
VOLUMEN TIPO DE MUESTRA
ptimo
Mnimo
4.0 mL Suero
2.0 mL
RECIPIENTE DE RECOLECCIN La muestra debe ser tomada en un tubo vacutainer con EDTA.
IDENTIFICACIN DE LA MUESTRA La muestra debe estar perfectamente identificada, conteniendo en la etiqueta nombre completo, nmero de registro, fecha de la toma, iniciales del flebotomista y ubicacin del paciente en caso de no pertenecer a la consulta externa.
FACTORES DE RECHAZO
Las muestras deben ser rechazadas si cumplen con por lo menos uno de los siguientes puntos:
Muestras lipmicas Presencia de macro partculas Muestras mal etiquetadas Volumen insuficiente
CONDICIONES DE MANEJO Y ALMACENAMIENTO La muestra debe estar contenida en tubos siempre cerrados y en posicin vertical. Se recomienda separar fsicamente el plasma de las clulas dentro de las 2 horas siguientes a la recoleccin de la muestra. Si no se analizan las muestras de suero dentro de las primeras 8 horas, deben almacenarse entre 2oC y 8C. Si no se analizan las muestras dentro de las primeras 72 horas, deben congelarse entre 15oC y 20oC.
8.4 REACTIVOS
INGREDIENTES ACTIVOS
Suero de Coombs Poliespecifico
PREPARACIN
No requiere de preparacin
ACEPTABILIDAD
ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD Los frascos goteros de reactivo deben almacenarse cerrados entre 2oC y 8C.
8.5 CONTROL DE CALIDAD TABLA 14. IDENTIFICACIN DEL CONTROL NOMBRE DEL CONTROL Eritrocito sensibilizados Eritrocitos no sensibilizados NIVEL 1 2 TIPO DE MUESTRA Eritrocitos Eritrocitos
En cada corrida de una muestra se realiza el control de calidad
ALMACENAMIENTO Se almacena de 2oC - 8C
PROCEDIMIENTO DE USO DE LOS CONTROLES
Se maneja de la misma manera que una muestra problema
Se acepta cuando pasa el control de calidad En caso de que una corrida sea rechazada, debe repetirse el ensayo
Se registra en la bitcora de control de calidad
EVALUACIN EXTERNA DE LA CALIDAD
Clulas del panel del siglo XXI en muestras de suero.
En caso de no contar con controles comerciales debe usarse una muestra de suero de un paciente normal y otra de un paciente patolgico alto. Los sueros son congelados en alcuotas de 200 L; cada una de ellas ser procesada con la frecuencia y aceptabilidad de un control.
Centrfuga Guantes desechables Gradillas Tubos de ensaye de 12X 75 mm
Una vez recibida la muestra de suero debe ser centrifugada durante 5 minutos a 3500 rpm. Para la deteccin de glbulos rojos sensibilizados in vitro Este procedimiento puede ser utilizado para la deteccin e identificacin de anticuerpos inesperados y para pruebas de compatibilidad.
Cuando se prueban los glbulos rojos con reactivos especficos para el uso de pruebas de antiglobulina indirecta (incluyendo Anti-D en la prueba para D dbil), realice la prueba de acuerdo con el procedimiento explicado en el inserto para el uso del reactivo en particular. En el caso de las pruebas para la deteccin de anticuerpos inesperados, siga las instrucciones dadas para los reactivos de glbulos rojos o para cualquier aditivo que se utilice. En cualquiera de los casos revise estas instrucciones dadas para la fase de antiglobulina. Note que las clulas conocidas que tengan una prueba de antiglobulina directa positiva, no pueden usarse en la prueba de antiglobulina indirecta.
1.- Por cada muestra a probar, etiqueta un pequeo tubo de prueba 12 x 75 mm 10 x 75 mm, si va a realizar una prueba a temperatura ambiente, se deber preparar el juego de tubos por duplicado.
2.- Colocar 2 o 3 gotas del suero en cada tubo.
3.- Aada una gota de la suspensin de clulas a cada tubo. Las clulas deben ser lavadas por lo menos una vez y resuspenderse en salina fisiolgica a una concentracin de 3-5%. El reactivo de glbulos rojos se puede utilizar directamente del frasco. Alternativamente pueden prepararse en la forma recomendada por el fabricante, o por medio de un procedimiento que sea efectivo para el usuario. Si utiliza un procedimiento de baja fuerza inica en el que las clulas estn resuspendidas en una solucin de baja fuerza inica revise las instrucciones del fabricante, las cuales toman preferencia sobre este paso.
4.- Si se utiliza un aditivo como Albmina Bovina al 22% 30% un aditivo de baja fuerza inica, como Gamma LO-ION, Gamma PeG, adalo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Note que este paso no es aplicable si las clulas fueron resuspendidas en la solucin de Baja Fuerza Inica (LISS) en el paso 3.
5.- Mezcle y centrifugue el tiempo apropiado a la calibracin de la centrfuga Nota: La fuerza centrfuga aplicada a las mezclas de suero y clulas es la mnima requerida para producir un botn compacto de clulas y un sobrenadante claro. Una centrifugacin excesiva dificulta la resuspensin del botn de clulas, asimismo una centrifugacin inadecuada puede producir una aglutinacin que se dispersa fcilmente. Cada laboratorio debe calibrar sus propias centrfugas para determinar el tiempo ptimo y velocidades de centrifugacin para los diferentes sistemas de prueba.
Como una gua, un minuto a 1000 rpm, es usualmente adecuado tanto para pruebas con salina rapida como con albmina. A 3500 rpm las pruebas de solucin salina fisiologica 0.9% usualmente requieren 15 segundos, mientras las pruebas de albmina requieren 30 segundos por la mayor viscosidad de la mezcla de prueba.
6.- Examine para hemlisis y registre si hubiere. Nota: Asumiendo la ausencia de contaminacin bacteriana o qumica, la hemlisis puede indicar una reaccin antgeno/anticuerpo. Algunos anticuerpos capaces de producir hemlisis tienen especificidad en el grupo AB, Lewis, Kidd o sistema Vel.
7.- Resuspenda las clulas por medio de una agitacin suave y registre el resultado.
8.- Incube las muestras con solucin salina fisilogica al 0.9% (si se realizaron) por 15 minutos a temperatura ambiente (23C 3C) y los otros tubos por 15 minutos (o de acuerdo a las instrucciones del fabricante) a 37C 1C.
9.- Mezcle y centrifugue el tiempo apropiado a la calibracin de la centrifuga. 10.- Repita los pasos 6 y 7, registrando los resultados apropiadamente (ej 37C salina, 37C albmina, 37C LO-ION.
11.- Descarte los tubos etiquetados para las pruebas con solucin salina fisiolgica 0.9 % a temperatura ambiente si se realizaron.
12.- Lave las clulas de todos los tubos incubados a 37C por lo menos 3 veces con los tubos llenos de salina, teniendo cuidado de decantar la solucion salina fisiologica entre los lavados y resuspender las clulas por completo cuando se le aada la solucion salina fisiolgica para la siguiente lavada.
13.- Decante la solucin salina fisiolgica 0.9% completamente en seguida de la ltima lavada.
14.- Aada 1 2 gotas de Gamma Clone Anti-IgG, verde o incoloro, al botn de clulas y mezcle.
15.- Centrifugue inmediatamente por:
a) 1 minuto a 1000 rpm b) 15 segundos a 3500 rpm o c) El tiempo apropiado de acuerdo a la calibracin de la centrfuga.
16. Resuspenda las clulas mediante agitacin suave, observar la aglutinacin y registre los resultados de la prueba.
17.- Confirme las pruebas negativas como se explica en el paso 8, en el procedimiento de la prueba de antiglobulina directa. Si la centrifugacin del tubo, como en el paso 15 se retrasa ms de un minuto desde la adicin del Gamma Clone Anti-IgG para lavar el botn, la prueba debe repetirse, an cuando la prueba de control de Coombs de un resultado positivo.
8.8 RESULTADOS
Se entregan aproximadamente en las dos primeras horas
Reporte de resultados
Los resultados obtenidos del equipo pueden ser capturados manualmente o transmitidos al Sistema del paciente Ambulatorio (SIPAM) va electrnica (interface) y son validados y liberados por el Coordinador de Qumico o el responsable de turno.
Anderson - Cockayne. 1993. Qumica Clnica. Editorial interamericana Mc Graw. p. 54, 57.66, 68,69.
Brecher ME. 2002. Technical Manual. Fourteenth edition. Maryland, USA: American Association of Blood Banks; p. 504,505,506,545,546, 563,564.
De Jess Linares G. 2001. Inmunohematologa y Transfusin. Ed.Viamonte; p. 50,51, 62,63,64,77,78.
Inserto para la prueba de Coombs, laboratorios Gamma.
Malvasi Graciela. 20006. Tcnicas de Diagnstico y Seguimiento en el Laboratorio de Inmunoserologa Gua De Trabajos Prcticos. p. 21, 25, 32,45.
Radillo-Gonzlez A. 1999. Medicina Transfusional. Mxico. Prado; p. 137-147, 266.
Rodrguez-Moyado H, Quintanar-Garca E, Meja- Arregu MH. 20004. El Banco de Sangre y la Medicina Transfusional. Primera edicin. Mxico, Editorial Panamericana; p. 177, 178-181.
Vives L, Aguilar J, Aguilar L. 1997. Manual de Tcnicas de Laboratorio en Inmunohematologa. Segunda edicin. Barcelona, Espaa: Masson; p. 445-471.
TEMA 9. PROCEDIMIENTO PARA
CRIOPRESERVACIN DE
CLULAS PROGENITORAS HEMATOPOYTICAS

9.1 PROPSITO Y ALCANCE
PROPSITO
Criopreservar las Clulas Progenitoras Hematopoyticas (CPH) provenientes de sangre perifrica movilizada y de Mdula sea, obtenidas mediante procedimientos de Afresis y en el quirfano, respectivamente; conservando su viabilidad, esterilidad y funcionalidad, para ser transplantadas posteriormente en pacientes con anomalas hematolgicas.
ALCANCE
Todos los usuarios podrn seguir este procedimiento para la criopreservacin y el transplante de CPH.
9.2 INTRODUCCIN
ANTECEDENTES Los transplantes de Clulas Progenitoras Hematopoyticas (CPH) se consideran, hoy da, el tratamiento de eleccin para una gran variedad de enfermedades tanto malignas como no malignas. El uso de estas en su forma autloga tiene como objetivo restablecer las funciones hematopoyticas en pacientes sometidos a altas dosis de quimioterapia, radioterapia, o ambas, y por tal motivo, la conservacin de los precursores hematopoyticos a temperaturas bajas y en condiciones ptimas garantizan su almacenamiento durante el tiempo que sea necesario, con la mnima prdida de sus capacidades de autorregulacin y diferenciacin. Por lo anterior, los bancos de sangre o el Servicio de Medicina Transfusional son los responsables de recolectarlas y procesarlas, y debern de contar con manuales de procedimientos actualizados para mantener un sistema de calidad, y asegurar que los procedimientos, el almacenamiento y la distribucin de los productos se ajusten a los requerimientos y lineamientos internacionales para satisfacer las necesidades de atencin a los pacientes.
CONDICIONES GENERALES PARA LA PRESERVACIN DE LA ULTRA ESTRUCTURA Y FUNCIN CELULAR La resistencia al fro y al congelamiento depende de un gran nmero de diferentes factores. En primer lugar el descenso repentino de la temperatura puede tener un efecto adverso en ciertas clulas: una forma de choque trmico, que puede ocurrir tanto por arriba y por debajo del punto de congelamiento. Tambin, la formacin de cristales de hielo, dentro y fuera de las clulas pueden acarrear un gran dao fsico. Otra consecuencia de la formacin del hielo es un cambio del medio ambiente extracelular, en donde el congelamiento del agua tiene como resultado un incremento en la concentracin de sales de la solucin, elevndose a un nivel especfico que corresponde al punto eutctico (eutctico, a adj. Dcese de una mezcla de cuerpos slidos, cuya fusin se realiza a una temperatura constante, como la de los cuerpos puros. El Pequeo Larousse Interactivo, 2000).
Un incremento tal en la concentracin de los electrolitos permite la deshidratacin celular. Es de notar que las clulas que son ms resistentes, son las mismas que son ms resistentes en bajar su temperatura.
CHOQUE TRMICO
El choque trmico puede ocurrir cuando ciertas clulas son enfriadas repentinamente, incluso en la ausencia de cristalizacin. El rango crtico oscila entre +15C y 0C, aunque tambin puede ocurrir entre 0C y -80C. El choque trmico comienza en la membrana como un resultado de:
Contraccin diferencial de varios componentes de la membrana Rompimiento mecnico Cambios conformacionales en la topografa de la membrana
El dao infligido no depende significativamente del perfil catinico en el fluido extracelular, sin embargo, el perfil aninico es mucho ms importante. Los aniones ms importantes, del menos daino al ms daino, son el acetato, cloruro, nitrato, yoduro y sulfato. El choque trmico pude ser minimizado por:
Agentes crioprotectores La presencia de ciertos fosfolpidos (fosfatidil serina) Enfriamiento lento Acondicionamiento previo en medios con alta concentracin de sales.
UMBRAL DE DESHIDRATACIN
La mayora de las clulas de los vertebrados son susceptibles incluso a una deshidratacin parcial (tanto a una temperatura normal o baja). Dependiendo del tipo celular especfico y de la especie, las clulas no pueden tolerar la prdida de ms del 20 al 80% de su lnea basal de contenido de agua, establecindose as un lmite del umbral de deshidratacin, en el cual las estructuras celulares sufren un dao irreversible.
La correlacin entre la resistencia de las clulas a la deshidratacin y su resistencia a las bajas temperaturas es un reflejo de los efectos en el balance inico. Esto es, el incremento en la concentracin de sales que acompaa a la cristalizacin es el responsable de los efectos ms dainos. El incremento en la concentracin de sales induce la precipitacin de protenas daando la estructura lipoproteca de la membrana. Al mismo tiempo, la cristalizacin de los amortiguadores electrolticos puede inducir grandes cambios del pH. El incremento en la concentracin de ciertos iones y compuestos tiene efectos txicos en el interior celular. El congelamiento tambin puede afectar la naturaleza coloidal del medio intracelular, un efecto que puede ser reversible o irreversible. El sistema coloidal puede separse en dos fases distintas con molculas de agua asociadas, siendo eliminadas de las macromolculas orgnicas de tal manera que posteriormente se agregan y se vuelven vitrificadas.
VELOCIDAD DE CONGELAMIENTO Y CALENTAMIENTO
El mtodo ideal del congelamiento y la velocidad ptima de enfriamiento dependen de varios factores conflictivos, muchos de los cuales son pobremente entendidos. Las condiciones ideales son a menudo determinadas por pruebas de ensayo y error, dando como resultado protocolos, en donde se establece la velocidad del enfriamiento; s la temperatura debera de ser disminuida en intervalos de tiempo; qu agente crioprotector es empleado; etc. El objetivo es prevenir el choque trmico, los efectos adversos de la excesiva concentracin de sales, y el dao al medio coloidal de la clula. En las velocidades de enfriamiento para uso rutinario, la cristalizacin y el inicio (seeding) siempre comienzan en el compartimiento extracelular. La extensin del tiempo de las clulas durante el punto eutctico, por ejemplo, el tiempo transcurrido en que son expuestas a una alta concentracin de sales La velocidad de congelamiento intracelular El tamao y la forma de cualquier cristal de hielo formado
Si el enfriamiento es lento, el crecimiento de los cristales de hielo en el compartimiento extracelular es tal que las clulas se contraen y son expuestas a altas concentraciones de sales.
Subsecuentemente, la fase lquida se congela a la temperatura eutctica. Si el enfriamiento es muy rpido, el agua en el interior de las clulas forma pequeos cristales de forma irregular que son relativamente inestables. Si las clulas son descongeladas subsecuentemente muy lentamente, estos cristales se agregarn a una forma ms grande, formando cristales ms estables, los cuales pueden causar dao. El incremento en la concentracin de sales que acompaa al proceso de congelamiento causa contraccin celular, y si contina por encima de cierto umbral, permite la permeabilizacin de iones en la membrana. Por ello, la viabilidad celular depende de la velocidad de enfriamiento. La mayor sobrevida a una cierta velocidad disminuir conforme esta velocidad se incrementa. La velocidad ideal es disminuyendo lentamente la temperatura, que permita a las clulas perder suficiente agua para prevenir el congelamiento intracelular prematuro. Sin embargo, si la velocidad es demasiado lenta, las clulas sern expuestas a altas concentraciones de sales por un largo periodo de tiempo. Adems, el rango ideal de enfriamiento depende del volumen crtico de las clulas que es definido por:
La permeabilidad de la membrana celular al agua El rea de la superficie de la membrana
El factor principal que causa la perdida de la viabilidad es la formacin de cristales de hielo intracelular, y especialmente la agregacin de estos cristales durante el descongelamiento. A una velocidad lenta de enfriamiento la alta concentracin de sales resultante ejerce efectos adversos cuando el agua intracelular - que tiene un alto potencial qumico - difunde hacia el exterior celular y se congela en el compartimiento extracelular. Los porcentajes ms altos de sobrevida son obtenidos en una variedad de velocidades de enfriamiento referida como la zona de transicin, en el cual el efecto de ambos mecanismos es mnimo.
FENMENO A TEMPERATURAS BAJAS
Hay un gran consenso de informacin acerca de los cambios biofsicos y bioqumicos que ocurren en las clulas vivientes en temperaturas inferiores a los 0C. Se puede concluir que, a no ser que la temperatura de almacenamiento sea demasiada baja, algunas clulas continuarn viviendo y su tiempo de sobrevida depender de su radio metablico residual que ser lentamente desacelerado a una mayor o menor extensin.
A temperaturas entre 0C y -40C, que no es lo suficientemente baja para la preservacin eficientemente de ciertos tipos celulares, la difusin procede y esto puede modificar el balance inico en el medio. A temperaturas ms bajas, estas soluciones de electrolitos son solidificados en eutcticos. La estructura cristalina del hielo puede cambiar tambin (con el crecimiento de cristales o recristalizacin) provocando un serio dao fsico a estructuras biolgicas importantes.
PRESERVACIN A TEMPERATURAS BAJAS
En el mundo de los seres vivos, la temperatura de -70C es considerada el umbral de temperatura ms bajo en el cul ningn proceso vital est permitido. Cuando se contempla el almacenamiento a largo o muy largo plazo, temperaturas por debajo de este umbral deben ser empleadas. Muchos investigadores, conservan clulas almacenadas en presencia de algn agente crioprotector (por ejemplo, Dimetilsulfxido [DMSO] o glicerol), para prevenir cualquier dao, al momento en que son almacenadas a temperaturas inferiores de 130C. En la prctica, es difcil creer que cualquier proceso daino puede ocurrir todava a esta temperatura en la cual el agua es vitrificada. Algunas clulas particularmente lbiles, deben almacenarse a temperaturas extremadamente bajas de 196C, como es el caso del nitrgeno liquido N2 (l).
MEDICIN DE LA TEMPERATURA
Debido a que la velocidad de congelamiento y descongelamiento pueden tener un mayor impacto en la viabilidad de las clulas y tejidos, deben de ser medidas en una forma cuantitativa. La mejor manera de realizarlo es generar una curva completa que describa el proceso de congelamiento y descongelamiento. Para esto, debe realizarse lo siguiente:
1. El enfriamiento antes de que el congelamiento inicie 2. El tiempo de sper-enfriamiento y sus parmetros 3. El inicio de la cristalizacin y la duracin de la meseta de la fase de transicin 4. El rango en el cual la temperatura desciende despus de la fase de transicin
Esta curva es referida como el perfil de la temperatura del sistema en consideracin y puede ser normalizada a una referencia medible para su fcil manipulacin. El parmetro ms fcil de estimar en el rango de enfriamiento, es el tiempo en que la temperatura cae desde 5C, (al punto en el cual la mayor parte del cambio de fase o eutctico procede, con su correspondiente liberacin del calor latente de fusin) hasta 50C. Sobre este rango, la temperatura tiende a volverse lineal en funcin del tiempo. Ver figura 1.
(*) Sper-enfriamiento: Durante el proceso de congelamiento, el sper-enfriamiento constituye una fase importante y crtica del perfil de temperatura. En trminos prcticos, la manera en que una solucin es enfriada por debajo de su punto de congelacin puede determinar cmo ocurrir el inicio de la formacin de cristales de hielo y por ende la forma de cristalizacin.
FIGURA 9. PERFIL DE LA TEMPERATURA DURANTE EL PROCESO DE CONGELAMIENTO CONTROLADO.
Congelamiento ideal
Incremento en la velocidad de enfriamiento
AGENTES CRIOPROTECTORES Las causas principales de la destruccin celular son la formacin de hielo intracelular, y la exposicin a altas concentraciones de sales. El xito durante el congelamiento depende en mantener un volumen de agua suficiente en la fase lquida, tanto en los compartimientos intracelular y extracelular, para mantener los electrolitos en solucin. El inicio y la subsecuente cristalizacin pueden ser inhibidas por la inactivacin del punto del potencial de condensacin por medio de un envenenamiento qumico. Los agentes usados para este fin son capaces de unirse a las molculas del agua a travs de puentes de hidrgeno y son llamados como crioprotectores, son muy diversos en su estructura qumica pero todos actan de la misma forma. Cualquiera que sea su estructura, todos son muy solubles en agua y por su capacidad de formar puentes de hidrgeno con las molculas de agua, disminuyen el punto de congelamiento de cualquier solucin en la cual son incluidos. La segunda propiedad importante de estos agentes es de que no son txicos a las clulas. La toxicidad en este caso es muy difcil de definir a consecuencia de las condiciones externas, tan opuestas a la naturaleza del producto en s mismo. En la prctica, la toxicidad depende de la concentracin del agente crioprotector, la tonicidad del medio, y de cmo las clulas estn en contacto con el agente.
Las dems variables que determinan la extensin a la cual un aditivo en particular ser capaz de proteger a las clulas de un sistema biolgico dado, dependen de factores tales como el peso molecular del compuesto y su habilidad de atravesar la membrana celular.
En trminos generales los agentes crioprotectores modulan las propiedades eutcticas de una solucin de tal manera que la cantidad de hielo formado y en consecuencia, la concentracin de sales es reducida. Por disminuir el punto de congelamiento del fluido extracelular, inhiben el flujo de agua intracelular, previniendo as la disminucin del volumen celular a su mnimo volumen crtico. Por reducir la retraccin celular, estos agentes atenan la hiperconcentracin del fluido intracelular y por ello inhiben la precipitacin de las protenas. En la prctica, una solucin salina isotnica (9 gramos de NaCl por litro) en presencia de 1% de DMSO alcanzar una concentracin de 50 g/L a una temperatura de -5C. En presencia de 5% de DMSO, esta concentracin no ser alcanzada hasta que la temperatura haya descendido a -20C y a una concentracin de 10% del crioprotectante no se alcanzar hasta los -50C. La cantidad del dao inducido en las clulas durante el congelamiento depende de dos factores conflictivos, y ambos dependen de la velocidad de enfriamiento: a velocidades que son demasiado lentas, altas concentraciones de sales sern generadas, a velocidades que son demasiado rpidas, el hielo se formar en el interior de las clulas. La mxima viabilidad es obtenida por el enfriamiento a una velocidad, en la zona de transicin, en el cual el efecto combinado de ambos mecanismos es minimizado. Como regla general, el agente crioprotector parece proteger a las clulas a velocidades de enfriamiento lento en el cual el dao asociado con los efectos de la solucin predominan. Basadas en observaciones empricas, se ha demostrado que el resultado de incrementar la concentracin de un agente crioprotector (por ejemplo, glicerol o DMSO) en la suspensin celular siendo enfriada a diferentes velocidades, es trasladar el radio ptimo ms inferior acoplado con un incremento del rango general de sobrevida, y se ha documentado que los problemas asociados con el congelamiento intracelular no son afectados por la presencia del agente crioprotector. Con referencia a la nocin de la zona de transicin descrita anteriormente, se pude decir que el agente crioprotector presente durante el congelamiento, traslada la zona entera en la direccin de rangos ms bajos por disminuir el umbral asociado con el dao causado por la combinacin de las altas concentraciones de sales y del hielo intracelular.
9.3 INSTRUCCIONES Y PROCEDIMIENTO
Los principales factores que se deben tener en cuenta con el procedimiento de criopreservacin son: la concentracin celular, el medio crioprotector, el programa de congelamiento y el sistema de almacenamiento. La suspensin celular inicial de una muestra de CPH obtenida de sangre perifrica movilizada no debe de exceder de 2-3 x 10 7 clulas por mililitro. El medio crioprotector puede variar, pero es recomendable que contenga una fuente nutritiva, que puede ser albmina humana, suero o plasma autlogo u homlogo, en una concentracin final de al menos 10%. El agente crioprotector de eleccin es el DMSO a una concentracin final del 10%, la adicin debe de realizarse lentamente y a una temperatura de 4C. Para tal efecto, se procede a preparar la solucin crioprotectora con DMSO al 20%, adicionando un volumen igual de la cosecha de CPH y de la solucin crioprotectora, resultando una concentracin final al 10% y siempre manteniendo a una temperatura de 4C.
Una vez terminada la mezcla, se transfiere a una bolsa de congelamiento que debe estar constituida por un material plstico no lipoflico (poliolefina o tefln-kapton) para evitar el dao a las membranas celulares, y adems debe de ser lo suficientemente resistente a bajas temperaturas (-196C). La bolsa se introduce en un soporte de aluminio que mantenga comprimidas ambas superficies, proporcionando as un espesor y forma homognea de la muestra que facilite un correcto intercambio de calor. El programa de congelacin puede variar, pero en trminos generales debe incluir primero una fase de estabilizacin a una temperatura de 4C, seguida de un descenso constante de la misma a un ritmo de 1-2C/min. En el momento previo al punto eutctico, se debe inducir un descenso prolongado de la temperatura de la cmara para compensar la liberacin del calor latente de fusin. Una vez superada la fase de transicin, el ritmo de enfriamiento debe permanecer constante entre 1-2 C/min. Las clulas congeladas pueden almacenarse en un contenedor de N2 (l), en su fase lquida, donde la temperatura se mantiene constante a 196C. Si la muestra se mantiene en la fase gaseosa, la temperatura puede oscilar entre 100C y 140C.
OBSERVACIONES
El Dimetilsulfxido es potencialmente txico para las clulas en temperaturas por arriba de 0C, por ello su adicin y los pasos subsecuentes deben de realizarse lo ms rpido posible en todo el procedimiento, tanto en la preparacin de los reactivos, como en la preparacin de las muestras biolgicas se deben de mantener a una temperatura de 4C y con asepsia en la campana de flujo laminar. En el laboratorio se han realizado experimentos de criopreservacin usando la prensa para la bolsa criognica, incluida en el equipo CryoMed Freezeer, el casete de aluminio (Canister), y los sensores de temperatura, superficial, o dentro de la muestra, con lo cual hemos observado que el proceso se ve afectado por estas configuraciones y por tal motivo es necesario elegir el programa adecuado al momento de criopreservar las CPH segn la manera que se elija al congelar las muestra.
9.4 MATERIAL Y EQUIPO REQUERIDO PARA CRIOPRESERVAR CPH
1. Bata quirrgica 2. Cubre bocas 3. Gorro quirrgico 4. Guantes estriles 5. Campos estriles 6. Tijeras inoxidables estriles 7. Pinzas inoxidables estriles (Rocher) 8. Gasas estriles 9. Torundas de algodn (jabn, alcohol, isodine) 10. Alcohol isoproplico al 70% 11. Desinfectante (glutaraldehdo, fenol al 5%, o formaldehdo) 12. Isodine 13. Frascos estriles (100 mL) o matraz Elermeyer de 250 mL 14. Probeta graduada estril (100 mL) 15. Acopladores para toma de muestras (Sampling Site Couplers, Fenwal 4C-2405) 16. DMSO estril (Sigma, Cat D-2650) o USP (Sigma, Cat. D-1435) 17. Jeringas desechables estriles de 5, 10, y 20 mL 18. Agujas estriles del No. 18G
19. Bolsa criognica de 250 mL (OriGen, Cryostore, Cat. CS 250n) 20. Casete de aluminio (Canister) para bolsa criognica a 4C 21. Equipo para congelamiento controlado CrioMed Freezer 22. N2 (l) a baja presin 23. Guantes criognicos 24. Frascos para hemocultivo y de hongos/micoplasma (peditricos, 1-3 mL) 25. Tubos para Biometra Hemtica (BH) 26. Hielo frppe 27 Refrigerantes envueltos en papel 28. Azul Tripano al 0.4% 29. Cubre y porta objetos 30. Microscopio ptico 32. Sellador dielctrico 33. Bolsas para desechos 34. Etiquetas de identificacin 35. Crioviales estriles 36. Campana de Flujo Laminar 37. Depsito para almacenamiento con N2 (l) 38. Formato del material necesario para criopreservar CPH (Formato I) 39. Formato de registro del procedimiento para criopreservar CPH (Formato II) 40. Marcos metlicos (Racks) numerados N2 (l) 41. Diagrama del sitio de almacenamiento en el depsito de N2 (l) 42. Pipetas automticas de 200 y 1000 L 43. Puntas para pipetas automticas de 200 y 1000 L 44 Solucin Salina Fisiolgica 0.9%
9.5 ESPCIMEN A CRIOPRESERVAR Clulas progenitoras hematopoyticas (alognicas o autlogas) movilizadas de sangre perifrica y obtenidas mediante afresis. Mdula sea autloga obtenida en quirfano.
Si es necesario, la suspensin celular es primero concentrada en forma manual o por una tcnica automatizada (seguir el procedimiento apropiado).
9.6 PROCEDIMIENTOS PREVIOS A LA CRIOPRESERVACIN DE CPH
Realizar la limpieza y desinfeccin de la campana de flujo laminar, la esterilizacin con luz ultravioleta (U.V.) del material que no se puede esterilizar con vapor (por ejemplo, bolsas criognicas, DMSO, tubos de BH, etc.), dejar 15 minutos y encender la lmpara de luz U.V. Colocar un letrero que indique que est encendida.
Solicitar el plasma del paciente (aprox. 100 ml) obtenido durante la afresis al equipo de enfermera y mantenerlo a 4C. Rotular las bolsas criognicas y el casete de aluminio (canister). Colocar una etiqueta de identificacin en la porta-etiqueta de la bolsa criognica. Sellar con el sellador dielctrico en varios puntos la porta- etiqueta. .
La informacin de la etiqueta debe contener la siguiente informacin: Nombre del donador No. de unidad o identificacin (por ejemplo, expediente) Fecha Producto celular (por ejemplo, CPHSP alognica, MO o CPHSP autloga reducida), si es autloga: SOLO PARA USO AUTOLOGO No. de secuencia de la bolsa criognica, (por ejemplo, 1 de 3).
Apartar las bolsas criognicas hasta que se necesiten. Rotular una bolsa criognica como bolsa control y apartarla hasta su uso. Rotular los frascos de cultivo, BH y crioviales con la informacin del paciente. Rotular el casete de aluminio (canister) con una etiqueta con la de paciente. Verificar el nivel de N2 (l). Abrir la vlvula del N2 (l), y encender el equipo de congelamiento y elegir el programa que va ser utilizado. Colocar canister en el congelador hasta su uso. Anotar el nmero de lote, la fecha de caducidad y la casa comercial del DMSO y de las bolsas criognicas en el Formato del registro del procedimiento criopreservacin de CPH (Formato II). de informacin
9.7 PROCEDIMIENTO PARA CRIOPRESERVAR Pesar la bolsa que contienen las CPHSP al terminar su recoleccin. Restar el peso de la bolsa vaca (bolsa transfer de 600 mL de equipo CobeSpectra = 32g; bolsa de recoleccin de equipo CS-3000 = 25g) y dividir el resultado entre la densidad especfica de las CPH (d= 1.066) para obtener el volumen aproximado. Con este valor se puede calcular la cantidad de bolsas criognicas que sern necesarias para la criopreservacin de las clulas.
Ejemplo,
Peso de la bolsa con CPHSP = Peso de la bolsa transfer de 600 mL = -
133 g 32 g __________ 101 g CPHSP
Densidad especfica de las CPHSP =
1.066 g/mL __________ 94.74 mL de CPHSP
En la siguiente tabla se muestran el volumen mnimo y mximo permitido al criopreservar CPH en las bolsas criognicas de diferentes capacidades (Nota. Los datos fueron tomados de las bolsas Cryostore de Origen Biomedical, pero se puede aplicar a cualquier bolsa con las mismas dimensiones y capacidades).
TABLA 15. VOLUMEN MNIMO Y MXIMO PERMITIDO AL CRIOPRESERVAR CPH Cdigo del Producto CS 50 CS 250 CS 500 Volumen, a congelar Min Max 10 a 20 30 a 70 55 a 100 Volumen Nominal 50 250 500 Largo, cm 11.4 15.2 19.0
Ancho, cm 7.6 12.7 12.7
Tomando en cuenta la capacidad de las bolsas criognicas, el volumen de CPH se dividira en 3 bolsas criognicas con un volumen de 31.58 mL (ms un volumen igual de solucin crioprotectora con DMSO al 20%).
Si el volumen de la cosecha es mayor a 140 mL, el volumen deber ser reducido, segn el protocolo establecido en el Servicio de Medicina Transfusional. Si el volumen de la cosecha es igual o menor a 140 mL, colocar la bolsa dentro de la campana de flujo laminar. Realizar la asepsia de uno de los puertos de entrada y colocar un acoplador de toma de muestra en el puerto y realizar su asepsia correspondiente.
Si no se cuenta con dicho acoplador, realizar la asepsia del tubo de recoleccin de la bolsa de CPH para puncionarlo con una jeringa con aguja del calibre 18G. En este momento se puede realizar la asepsia de los puertos de entrada de las bolsas criognicas y de los frascos de hemocultivo. De igual forma, realizar la asepsia de un extremo de tubo de la bolsa del plasma para poder tomar el volumen indicado para preparar la solucin crioprotectora.
Usando una jeringa de 5 mL con aguja del calibre 18G retirar 2 mL de la suspensin celular y depositar 1 mL en un tubo de BH (Tubo morado con EDTA), rotulado previamente. Realizar el recuento celular en el equipo CellDyn 3500 y determinar el nmero de clulas Mononucleares en la muestra.
Inocular 1 mL de la suspensin celular en un frasco de hemocultivo, rotulado previamente como pre-congelamiento o pre-DMSO. Tomar las jeringas de 20 mL con aguja del calibre 18G y llenar completamente a un volumen de 20 ml cada una. Usar las jeringas necesarias para recolectar el volumen total de CPHSP. La ltima jeringa contendr menos de 20 ml.
Tapar la aguja con su capuchn cuidadosamente y retirar la aguja de la jeringa (desechar la aguja en un contenedor de punzo cortantes). Unir cada jeringa a una bolsa criognica. Dispensar la suspensin celular hacia la bolsa, dejando la jeringa unida. Comenzar con la bolsa criognica # 1.
Repetir el procedimiento con las otras bolsas criognicas. Anotar el volumen de cada bolsa criognica en el formato del registro de procedimiento. Dispensar a la bolsa control un volumen igual al de la bolsa de CPH con mayor cantidad de la solucin control (se puede utilizar plasma). Colocar las bolsas criognicas entre los refrigerantes e incubar durante 30 minutos.
Calcular la cantidad de la mezcla crioprotectora (plasma autlogo con DMSO al 20%) para que al ser mezclada 1:1 con las clulas.
Volumen de cosecha de CPH + volumen bolsa control = volumen de solucin crioprotectora + 10 mL de excedente.
Ejemplo:
70 mL para CPH + 20 mL para la bolsa control = 100 mL de solucin crioprotectora (90 mL para bolsas + 10 mL excedente).
Por lo tanto se DMSO.
prepara el volumen de solucin = 80 mL de plasma + 20 mL
En la siguiente tabla se muestran los clculos de diferentes volmenes de solucin crioprotectora: TABLA 16. VALORES DE DMSO-PLASMA PARA LA MEDICIN EXACTA DEL DMSO AL 20%.
Volumen Total (mL) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 160 170 180 190 200 250 300
DMSO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 32 34 36 38 40 50 60
Plasma 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 76 80 84 88 92 96 100 104 108 112 116 120 128 136 144 152 160 200 240
Anotar el volumen de la solucin crioprotectora de cada bolsa criognica en el Formato del registro del procedimiento de criopreservacin. Anotar el volumen total de cada bolsa en el Formato del registro. Colocar un reloj con alarma a los 30 minutos y otro a los 20 minutos. A la alarma de los 20 minutos preparar la solucin. Con la probeta estril medir la cantidad del plasma autlogo fro (a 4C) y depositarlo en un frasco estril en hielo. Con una jeringa de 20 mL tomar la cantidad necesaria de DMSO y adicionar al plasma mezclando perfectamente para evitar desnaturalizar las protenas del plasma debido a la reaccin exotrmica.
Iniciar el programa correspondiente del congelador programable y permitir que se enfre a 4C. A la alarma de los 30 minutos tomar con una jeringa de 20 mL la cantidad necesaria de la solucin crioprotectora. Retirar la jeringa vaca de la suspensin de CPH, con prontitud adicionarla en cada bolsa criognica, empezando con la bolsa control y posteriormente a las bolsas con las clulas, mezclar perfectamente. Usar el mbolo de la jeringa para retirar la mayor cantidad posible de aire y tomar aproximadamente 2.5 mL de la mezcla.
Colocar 0.5 mL en un criovial rotulado, 1 mL en el tubo de BH, rotulado previamente como post-DMSO, para corroborar su viabilidad. Mantener el tubo a 4C. Inocular 1 mL de la mezcla en el frasco de hemocultivo, rotular como post-DMSO.
Sellar la lnea de la bolsa criognica que contiene la jeringa tres veces con un sellador dielctrico. Cortar con tijeras en medio de la lnea sellada y desechar la lnea unida y la jeringa.
Secar rpidamente cada bolsa criognica y colocarla dentro del canister previamente enfriado a -20C; por ejemplo, colocar la bolsa #1 canister #1. Cuando corte la lnea sea cuidadoso en no dejar cualquier gota de CPH en el rea de sellado. La presencia de clulas en un extremo abierto de la lnea despus del sellado debe de ser evitada ya que puede contaminar el N2 (l) en el tanque de depsito. Ver observaciones para otras opciones para congelar las bolsas criognicas usando una prensa para congelamiento del equipo CryoMed Freezer.
Colocar los canister y el criovial en la cmara de enfriamiento. Distribuir individualmente los canister en una gradilla metlica para que se lleve a cabo el proceso en las mismas condiciones del congelamiento.
Coloque la bolsa control dentro de un canister e inserte el sensor de la temperatura en uno de los puertos de muestreo. Tener cuidado de no dejar aire para evitar un registro inadecuado del proceso de congelamiento. Cerrar con cuidado el canister para evitar maltratar el sensor de la temperatura, y colocarlo en la gradilla metlica. Ver observaciones para otras opciones para congelar las bolsas criognicas usando una prensa para congelamiento del equipo CryoMed Freezer.
Cerrar la puerta de la cmara de enfriamiento y oprimir el botn de RUN del equipo. Registrar el programa utilizado para el congelamiento controlado y el tiempo de inicio en el Formato del registro de procedimiento (formato II).
Al final del proceso de congelamiento presionar el botn stop para silenciar la alarma del equipo. Registrar el tiempo final. (formato I). Abrir la puerta de la cmara de enfriamiento, remover los canister y el criovial de las CPH y colocarlos en el depsito de almacenamiento con N2 (l) en la fase de lquida o de vapor. Anotar el No. del marco metlico (rack), la fase de almacenamiento de N2 (l) y el sitio dentro del depsito de N2 (l) en el Formato del registro del procedimiento de criopreservacin , segn el siguiente diagrama:
FIGURA 10. ESQUEMA DE LA LOCALIZACIN DENTRO DEL CONTENEDOR DE N2 (l).
FIGURA 11.ESQUEMA DE LA LOCALIZACIN DENTRO DEL MARCO METLICO (RACK)
Imprimir la grfica del registro de temperatura y rotular con la identificacin del paciente. La carta de congelamiento ser parte del registro permanente del proceso. La grfica del congelamiento no deber mostrar un cambio inusual o inesperado en la temperatura.
La curva apropiada del calor latente de fusin deber de estar por debajo de 0C. Cerrar la puerta de la cmara de enfriamiento y accionar el botn de calentamiento (warm) para descongelar la cmara. Al terminar, retirar la bolsa control y almacenarla a -20C y apagar el equipo de congelamiento.
Limpiar la campana de flujo laminar y tirar todo el material desechable en las bolsas correspondientes.
9.8 PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR EL NO. DE CMN DE LAS CPH
Encender el equipo para Biometra Hemtica, Cell-Dyn 3500.
Evaluar los controles alto, normal y bajo, y establecer si el equipo no muestra valores fuera del rango para dichos controles. Si algn valor est por afuera de estos rangos ser necesario calibrar el equipo segn el manual del usuario.
Procesar por duplicado la muestra rotulada como pre-DMSO que se obtuvo de la cosecha de CPH. Si los valores estn por encima del rango de deteccin del equipo diluir la muestra de CPH 1:10 con solucin salina fisiolgica. Obtener el promedio de los valores y reportarlos en el formato del registro del procedimiento de criopreservacin.
Calcular el No. De CMN presentes en la muestra y la dosis / Kg de peso, como sigue:
Leucocitos Totales = valor de leucocitos obtenido del Cell-Dyn (K/L) x 1000000 x Dilucin (si se realiza) x Volumen de la cosecha.
CMN Totales = % de Linfocitos Cell-Dyn + % de Monocitos Cell-Dyn 100 x Leucocitos Totales.
Dosis de CMN/Kg = CMN totales peso del donador.
Anotar los resultados en el formato del registro del procedimiento de criopreservacin.
9.9 PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR LA VIABILIDAD CELULAR DE LAS CPH MATERIAL REQUERIDO:
Portaobjetos Microscopio ptico Pipeta automtica de 50 L Puntas para pipeta automtica Tubos de ensayo de 12 x 75 mm Cmara de Neubauer Cubreobjetos para cmara de Neubauer
REACTIVOS: Azul de Tripano al 0.4 %
PROCEDIMIENTO:
Verificar que el material este completamente limpio. Rotular un tubo de ensaye de 12 x 75 mm con el nombre donador y CPHR y otro con el nombre del donador y CPH post-DMSO. Adicionar a cada tubo 50 L de la CPH de la cosecha y de la muestra post-DMSO, respectivamente. Adicionar en cada tubo 50 L de la solucin de Azul Tripano al 0.4% y mezclar perfectamente. Adicionar la muestra en la cmara de Neubauer y contar el nmero de clulas vivas y muertas con el microscopio ptico (40X). Reportar el porcentaje de viabilidad de las muestras en el formato del registro del procedimiento de criopreservacin.
9.10 LIMPIEZA Y ASEPSIA DE LA CAMPANA DE FLUJO LAMINAR Debido a que las CPH son recolectadas en un ambiente abierto y porque muchos de los pasos de su procesamiento no pueden ser realizados en un sistema completamente cerrado, hay numerosas oportunidades para la contaminacin con microorganismos. Por esto, se debe asumir un mtodo estricto de asepsia que deber de ser realizado en el rea de trabajo dentro de la campana de flujo laminar. Cultivos bacterianos y de hongos debern ser realizados en las diferentes etapas del procesamiento para determinar si cualquiera de las tcnicas y/o materiales en uso estn comprometiendo la pureza de estas. MATERIAL Y EQUIPO REQUERIDO:
Solucin desinfectante PRESEPT (Code Nr. SPW50, Johnson & Johnson) Alcohol al 70% Fenol al 5 % Guantes desechables Cubre bocas Lentes de Proteccin Gasas estriles
PROCEDIMINETO:
Realizar la limpieza de la superficie del piso, techo y paredes con la solucin de Dextrn-Hipoclorito de Sodio. Encender la luz de la campana de flujo laminar, realizar la desinfeccin de las cuatro paredes de sta con la solucin PRESEPT humedecer las gasas estriles con etanol al 70 % y pasar por toda el rea, desinfectar con la solucin de Fenol al 5 %. Dejar actuar por 15 minutos.
Encender el motor y dejar durante 30 minutos como mnimo. Posteriormente encender la luz U.V. y dejar actuar durante 15 minutos. Colocar un letrero indicando que la luz est encendida.
9. 11 VERIFICACION DE LA ESTERILIDAD DEL PROCESO
Mantener la esterilidad es una consideracin importante en el procesamiento y criopreservacin de las CPH. Se ha reportado contaminacin en pacientes que han recibido transplantes alognicos y autolgos. Los microorganismos identificados fueron flora normal encontrada en la piel. La contaminacin puede ocurrir durante la coleccin de las mismas y en varias etapas durante el procedimiento. La disponibilidad de sistemas semicerrados de recoleccin reduce oportunamente la contaminacin, sin embargo la esterilidad debe ser monitoreada con cultivos bacterianos y de hongos. La identificacin del organismo y su sensibilidad debera de ser realizada en los cultivos que resultaran positivos. Aunque el mayor propsito de esta prueba es la proteccin del paciente, tambin suministra informacin epidemiologa til acerca de las actividades de laboratorio y del transplante en general.
9.12 PROCEDIMIENTO PARA DESCONGELAR CPH CRIOPRESERVADAS Las clulas criopreservadas son descongeladas en un bao mara entre 37C y 40C inmediatamente antes de infundirlas y administrarlas a travs de un catter central. Aunque la infusin de DMSO ha sido asociada con cierta toxicidad incluyendo nauseas, vmitos, rubor, incremento en la frecuencia cardiaca y presin sangunea, y elevacin de las transaminasas en suero, muchos investigadores creen que la manipulacin de las clulas descongeladas pueden provocar prdida celular inaceptable.
MATERIAL NECESARIO:
Bao Mara Cronmetro Agua estril Solucin desinfectante PRESEPT (Code Nr. SPW50, Johnson & Johnson) Disolver una tableta de 5 g en 3 litros de agua Alcohol al 70% Fenol al 5 % Refrigerantes Tubos de vidrio de 12 x 75 mm Frascos para Hemocultivo y Hongos Microscopio ptico Porta y cubre objetos Azul de tripano al 0.4% Campos quirrgicos Contenedor de N2 (l) porttil Ropa quirrgica Gasas estriles Tijeras estriles Acoplador para toma de muestra Jeringas desechables estriles de 10 mL y 20 mL Agujas estriles del calibre 18G Torundas de alcohol e isodine Guantes estriles Cubre bocas
PROCEDIMIENTOS PREVIOS PARA DESCONGELAR LAS CPH
Localizar en el depsito de almacenamiento de N2 (l) las bolsas criognicas con las CPH correspondientes al paciente que va a ser reinfundido. Verificar perfectamente que los datos de las bolsas concuerden con los datos del paciente que se va a transfundir, Determinar la cantidad de CMN y/o clulas CD34 de cada bolsa criognica. Transferir los canister de la fase lquida a la fase gaseosa del depsito de N2 (l), por lo menos 12 horas antes de la reinfusin. PROCEDIMIENTO:
Realizar la desinfeccin del bao mara con la solucin desinfectante PRESEPT con la ayuda de gasas estriles y la asepsia con una solucin de Fenol al 3 %. Dejar actuar por espacio de 30 minutos cubrir con un campo quirrgico y trasladar el bao al pie de la cama del paciente al que se van a reinfundir las CPH.
Localizar las clulas criopreservadas y acomodar las bolsas de mayor a menor concentracin en el depsito de N2 (l) porttil, trasladar el contenedor al rea donde se llevar a cabo la reinfusin y conectar el bao mara a una toma de corriente elctrica. Adicionar agua estril y dejar que alcance la temperatura de 40C. Adicionar el antisptico.
A la indicacin del mdico responsable, seleccionar la primera bolsa con mayor concentracin de CPH del contenedor porttil de N2 (l) y verificar una vez ms los datos de identificacin de la bolsa y del paciente. Introducir la bolsa al Bao Mara y con una leve agitacin dejar que se descongele, aproximadamente 1 minuto y 50 segundos. Este tiempo puede variar segn el volumen de las clulas y de las caractersticas de la bolsa criognica.
NOTA: No descongelarlas completamente, sino hasta el punto en que se note la apariencia de una moneda de 10 pesos en el centro de la bolsa.
Retirar la bolsa criognica del Bao Mara y colocarla entre dos refrigerantes. Realizar la asepsia de uno de los puertos de entrada con las TORUNDAS de alcohol e isodine e insertar el equipo de transfusin para su reinfusin en el paciente. Otra opcin sera, colocar un acoplador de toma en el puerto de entrada y con la ayuda de una jeringa de 20 mL con aguja del calibre 18G, tomar las CPH e iniciar la reinfusin en alguna de las lneas de soluciones que tenga el paciente.
Vigilar los signos vitales y reacciones que pudiera presentar el paciente. En cada una de las bolsas realizar la asepsia de una esquina y cortar con las tijeras estriles un extremo de las bolsas. Tomar el sobrenadante remanente para realizar los cultivos bacterianos (hemocultivo y hongos) y la viabilidad de stas despus de descongelarlas. El DMSO es toxico para las clulas a temperaturas mayores de 4C, por tal motivo, conservar todas las muestras en los refrigerantes.
9.13 ABREVIATURAS EDTA BH CMN CPH CPHSP NaCl Dx DMSO C Hto HB Kg MO L N2 (l) SP SSF Tx U. V. Anticoagulante, Etilendiaminotetraactico disdico Biometra Hemtica Clulas Mononucleares Clulas Progenitoras Hematopoyticas Clulas Progenitoras Hematopoyticas de Sangre Perifrica Cloruro de Sodio Diagnostico clnico Dimetilsulfxido Grados Centgrados Celsius Hematocrito Hemoglobina Kilogramo Mdula sea Microlitro Nitrgeno Lquido Sangre perifrica Solucin Salina Fisiolgica al 0.9% Tratamiento Ultra violeta
MATERIAL NECESARIO PARA LA CRIOPRESERVAR CPH FORMATO I
PREPARADO 1. Bata quirrgica 2. Cubre bocas 3. Gorro quirrgico 4. Guantes estriles 5. Campos estriles 6. Tijeras inoxidables estriles 7. Pinzas inoxidables estriles (Rocher) 8. Gasas chicas estriles 9. Torundas de algodn (jabn, alcohol, isodine) 10. Alcohol isoproplico al 70% 11. Desinfectante (glutaraldehdo, fenol al 5%, o formaldehdo) 12. Isodine 13. Frascos estriles (100 mL) o matraz Elermeyer de 250 mL 14. Probeta graduada estril (100 mL) 15. Acopladores para toma de muestras (Sampling Site Couplers, Fenwal 4C-2405) 16. DMSO (Dimetilsulfxido) USP (Sigma, Cat. D-1435) o estril (Sigma, Cat 17. Jeringas desechables estriles de 5, 10, y 20 mL 18. Agujas estriles del No, 18G 19. Criobolsa de poliolefina o tefln de 250 mL o 500 mL 20. Canister para criobolsas de poliolefina a 4C 21. Equipo para congelamiento controlado Criomet 22. Nitrgeno lquido N2 (l) a baja presin (22 PSI dewars) criognicos 24. Frascos para hemocultivo (peditricos, 1-3 mL) 25. Tubos para Biometra Hemtica 26. Hielo frppe 27 Refrigerantes envueltos en papel 28. Azul Tripano al 0.4% 29. Cubre y porta objetos
30. Microscopio ptico 32. Grapas metlicas y rodillo 33. Sellador dielctrico 34. Bolsas para desechos 35. Etiquetas de identificacin 36. Crioviales estriles 37. Campana de Bioseguridad 38. Depsito para almacenamiento con Nitrgeno lquido 39. Formato del material necesario para criopreservar CPH (Formato I) 40. Formato de registro del procedimiento para criopreservar CPH (Formato II) 41. Racks numerados 42. Diagrama del sitio de almacenamiento en el depsito de N2 (l) 43. Pipetas automticas de 200 L y 1000 L 44. Puntas desechables para pipetas automticas de 200 y 1000 L 45, Solucin Salina Fisiolgica 46. Conocer la ubicacin del material y reactivos 47. Leer el manual de procedimientos 48. Leer las instrucciones sobre el uso de la bolsa criognica 49. Contenedor para desechos punzo cortantes potencialmente infecciosos 50. Recipiente y bolsas para los desechos 51. Masking tape.
RESPONSABLE DEL PROCESO: ________________________________________________
FECHA: _____________________________________________________________________
REGISTRO DEL PROCEDIMIENTO DE CRIOPRESERVACION DE CPH FORMATO II
IDENTIDAD DE LA MUESTRA Nombre: OSEGUERA MARTINEZ JOSE ANGEL Edad: 37 Dx: TUMOR GERMINAL MEDIASTINO Registro: S/R Tx. para Movilizar SP: NEUPOGEN 300 g/12 HRS X 5 DAS Equipo de Afresis: CS-3000, VACIADO DE CAMARAS No. Procedimiento realizado: 1 Serologia: VIH HVC NEG
NEG NEG
Peso: 68 Kg Cama: Externo Gpo Sanguneo/Rh: 0 positivo Vol. Sanguneo Procesado: HVB
14.161 L NEG
VDRL
CITOMETRA HEMTICA DEL PACIENTE Leucocito K/L Neutrfilos %: Linfocitos% Monocitos%: Eosinfilos% Basfilos% Eritrocitos M//L Hb g/dl Hto % Plaquetas K/L CMN K/L Clulas CD34 clulas/L
CLASE DE RECOLECCIN Afresis: X Mdula sea: Otros: Autloga: X Autloga: Alognica: Alognica: Proceso adicional: Proceso adicional:
CRIOPRESERVACIN No. Unidad: 14507 (pre-donante) Bolsa criognica: Cryostore CS 250 n DMSO: (DMSO) HYBRI-MAX Volumen CPH: 95 ml (BOLSA 1) Volumen Sol. Criognica (DMSO 20%) Volumen Total Sitio en Reservorio: II Fase en N2 (l): Lquida Programa Cryomed: Caducidad: 8 2009 Caducidad: 03/07 Bolsa 2: 35 ml Bolsa 2: 35 ml Bolsa 2: 70 ml Bolsa 2 Rack No: 2A
9v.19
Lote: C 14098 Lote:35K23334 Bolsa 1: 35 ml Bolsa 1: 35 ml Bolsa 1: 70 ml Bolsa 1 Rack:

No: 1A
Marca: OriGen Marca: Bolsa 3: 25 ml Bolsa 3: 25 ml Bolsa 3: 50 ml Bolsa 3 Rack:

No: 3A
Hora de inicio del proceso: 11:10 Hr
Hora final: 14:00

Hr
RESULTADOS DE LA COSECHA DE CPH Leucocitos: Neutrfilos Linfocitos: Monocitos Eosinfilos: Basfilos: Fecha de Recoleccin: Volumen de Recoleccin: Leucocitos Totales: CMN Totales: : Clulas CD34 Totales: : CMN/Kg: : Clulas CD34/Kg: :
166.0 23.0 13.1 38.6 0.151 25.2 04/04/2006 95 15770 8152.9 361.95 119.89 5.32
K/L %: % % % % mL (x 106) (x 106) (x 106) (x 106/Kg) (x 106/Kg)
Eritrocitos: Hb: Hto: Plaquetas: CMN: Clulas CD34:
M//L 2.26 g/dl 9.86 % 232.0 K/L 85.82 K/L 3810 clulas/L
1.43
Viabilidad precongelamiento: 95 Viabilidad post-DMSO: 65 Viabilidad post-descongelamiento: Hemocultivo cosecha: Hemocultivo post-DMSO: Hemocultivo post-descongelamiento:
% % %
Observaciones: _____________________________________________________________________________ Nombre del Receptor: _____________________________________________________________________________ Mdico Solicitante: _____________________________________________________________________________ Realiz procedimiento: _____________________________________________________________________________ Vo.Bo. Dr. _____________________________________________________________________________ Fecha _____________________________________________________________________________
REGISTRO DE LA TEMPERATURA Y NIVEL DE N2 (l) DEL CONTENDOR FORMATO III
FECHA HORA
TEMPERATURA (C)
NIVEL DE N2 (l)
OBSERVACIONES
Nivel mnimo para cubrir los diferentes espacios de marco de aluminio (Rack) para bolsas de 500 mL: Nivel A = 9 pulgadas; Nivel B = 16 pulgadas; Nivel C = 22 pulgadas; Nivel D = 28 pulgadas.
REGISTRO DEL NIVEL DE N2 (l) DE LOS CILINDROS INFRA FORMATO IV CILINDRO INFRA 1
Fecha Hora Nivel Cambio Observaciones Fecha Hora
CILINDRO INFRA 2
Nivel Cambio Observaciones
9.14 FORMATOS, REFERENCIAS Y BIBLIOGRAFAS

Boletn ISO 9001; 2000. I: Nm. 1, 2002. Hospital Universitario Dr. Jos Eleuterio Gonzlez, mayo.
Clark DA, et al. Medical schools and hospitals. Interdependence for service. J Med Educ 1985; 60:22-38.
Clark DA y Sheps CG. Administracin de hospitales universitarios. OPS. Boletn nm. 58.
Conde E, Sierra J, Iriondo A et al. 1994. Prognostic factors in patients who received autologous bone marrow transplantation for non-Hodgkin's lymphoma. Report of 104 patients from the Spanish Cooperative Group GEL/TAMO.Bone Marrow trasnspl; 14:279-286.
Freedman A., Gribben J., Neuberg D., et al 1996. High dose therapy and autologous bone marrow transplantation in patients with follicular lymphoma during firt remission. Blood 88: 278.
He Y, Wheatley K, Clark O, et al. 2003 Early versus deferred treatment for early stage multiple myeloma. Cochrane Database Sits Rev (1): CD004023.
Hot M, Hellquist L, Holmberg E, et al. 2003. Initial versus deferred melphalanprednisone therapy for asymptomatic Rajkumar SV, Gertz MA, Lacy MQ, et al. Thalidomide as initial therapy for early-stage myeloma. Leukemia 17 (4): 775-9.
Juliusson G, Celsing F, Turesson I, et al.200. Frequent good partial remissions from thalidomide including best response ever in patients with advanced refractory and relapsed myeloma. Br J Haematol 109 (1): 89-96.
L, Cabanillas F, Rodrguez J, et al. 1998. Gallium scan after 2nd. and 4th. chemotherapy cycle is predictive in poor prognosis aggressive non-Hodgkin's lymphomas: Study of 113 cases. Blood :(Abstr).
Philip T, Guglielmi C,Hagenbee et al . 1995. Autologous
bonemarrow
transplantation as compared wiyh salvage chemotherapy in relapses of chemotherapy.sensitive non Ho JanIFEk M, Kaplan M, Neuberg D, et al: Early restaging gallium scans predict outcome dgkin lymphoma. New England Journal of Medicine, 333; 1540-45.
Rajkumar SV, Hayman S, Gertz MA, et al. 2002. Combination therapy with thalidomide plus dexamethasone for newly diagnosed myeloma. J Clin Oncol 20 (21): 4319-23.
Richardson P, Schlossman R, Jagannath S, et al. 2004. Thalidomide for patients with relapsed multiple myeloma after high-dose chemotherapy and stem cell transplantation: results of an open-label multicenter phase 2 study of efficacy, toxicity, and biological activity. Mayo Clin Proc 79 (7): 875-882.
Schlegelberger B, Zwingers T, Harder L et al. 1999. Clinicopathogenetc significance of chromosomal abnormalities in patients with blastic peripheral Bcell lymphoma. Blood, 94:3114-3120.
Sierra J, Conde E, Montserrat E. 1993. Autologous bone marrow transplantatio for non-Hodgkin's lymphoma in first remission. Blood 81:1968-1969.
Ship An, Abellof KH, Antman G et al.1999. International Consensus conference on high-dose therapy with hematopoietic stem cont/cell transplantation in aggressive non Hodgkins lymphomas report of the jury. Journal of Clinical Oncology, 17: 423-29.
COMENTARIOS FINALES
El objetivo primordial de los Bancos de Sangre y Servicios de Medicina Transfusional es la calidad en todos sus aspectos. Los procedimientos habituales incluyen el control de los reactivos, la eficiencia del laboratorio, el mantenimiento de los equipos y la documentacin de los errores y accidentes.
Para describir los componentes de un sistema de calidad, se utilizan los criterios de la Organizacin Internacional de Estandarizacin (ISO). En el presente trabajo se aplican los principios bsicos inmunolgicos para el estudio de los antgenos presentes en los elementos formes de la sangre y su comportamiento serolgico. Se presentan las tcnicas importantes del estudio de los grupos sanguneos y sus anticuerpos, que ayudan a que la transfusin sangunea se convierta en un procedimiento seguro y confiable.
El Manual de Procedimientos para Inmunohematologa Banco de Sangre. Fue realizado despus de sintetizar la informacin necesaria para obtener un trabajo escrito que, de forma sencilla inclu los conceptos y procedimientos que se realizan de manera rutinaria en el departamento donde laboro. Esta herramienta se presenta actualizada bibliogrficamente y sobre todo haciendo hincapi en los mtodos y equipos modernos utilizados. Gracias a la experiencia que se me ha permitido obtener durante ms de cinco aos en el Servicio de Medicina Transfusional puedo decir que los Bancos de Sangre tienen como principal preocupacin el uso correcto de los componentes de la sangre, la cual tiene un amplio uso en hemoterapia as como en la industria mdico-farmacutica, por lo que debe estar libre de agentes infecciosos. Aunque el uso de este componente contribuye a salvar numerosas vidas, tambin puede convertirse en un riesgo potencial para la salud cuando no est sometida a un estricto control de calidad.
Con mucho entusiasmo puedo comentar que el laboratorio de inmunohematologa es sobradamente variado e interesante, en donde los estudiantes de la carreta de Qumico Farmacutico Bilogo nos podemos desenvolver ampliamente gracias a la seguridad obtenida durante formacin universitaria. Mi trabajo me ha permito un crecimiento significativo, ya que cada da la aplicacin de la tica y responsabilidad dejan un buen sabor de boca, considero que al ser parte del rea laboral del sector salud ponemos un granito de arena para contribuir a salvar una vida.

Manual de Procedimientos para Inmonología. Banco de Sangre

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN

QUE PARA OBTENER EL TITULO DE:

QUMICA FARMACUTICA BILOGA P R E S E N T A: VIANEY HERNNDEZ SALINAS

ASESORA: QFB. MARTHA PATRICIA CAMPOS PEN

CUAUTITLAN IZCALLI, EDO. DE MEX.

A MIS PADRES MARA GRISELDA POR SU RECUERDO OSCAR POR SU EJEMPLO

AL INCMNSZ POR PERMITIRME SER PARTE DE SU GENTE

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA INMUNOHEMATOLOGA BANCO DE SANGRE

TEMA 1. CONTROL DE CALIDAD DE REACTIVOS

TEMA 2. GRUPO SANGUINEO ABO AUTOMATIZADO

TEMA 3. GRUPO SANGUINEO Rh Pgina

TEMA 4. PRUEBAS PRETRANSFUSIONALES

TEMA 5. ANTICUERPOS IRREGULARES SU IMPORTANCIA EN MEDICINA TRANSFUSIONAL

5. 1 Panel de 10 clulas 5. 2 Formatos, referencias y bibliografa

TEMA 7. RASTREO DE ANTICUERPOS IRREGULARES MTODO CON ALBMINA

TEMA 9. PROCEDIMIENTO PARA CRIOPRESERVACIN DE CLULAS PROGENITORAS HEMATOPOYTICAS

IV. MENSAJE DEL USUARIO

adems las instalaciones en donde se llevan a cabo estas pruebas

Ley Orgnica de la Administracin Pblica Federal D.O.F. 29-XII-1976 y sus Reformas.

Ley General de Salud. D.O.F. 7-II-1984 y sus reformas.

Ley Federal de Entidades Paraestatales D.O.F 4-II-1998 y sus Reformas.

Ley para el Fomento de la Investigacin Cientfica y Tecnolgica. D.O.F. 21-V-1999

Ley de los Institutos Nacionales de Salud. D.O.F. 26-V-2000

Reglamento de la Ley Federal de Entidades Paraestatales. D.O.F. 7-IV-1995

Decreto por el que se reforma la Ley General de Salud. D.O.F. 26-V-2000

NORMAS OFICIALES MEXICANAS

NOM 087 SSA2.

VII. INSTALACIONES Y PROCEDIMIENTOS

Flujo de atencin al personal que trae las muestras.

Los pasos que deben seguir al llegar al laboratorio de inmunohematologa son:

3) Para ver la realizacin de grupos sanguneos refirase a la pagina 33.

Paso 1: Revisar la solicitud de laboratorio

Paso 2: En caso de errores

Paso 3: Reacciones Transfusionales

Para la realizacin de reacciones transfusionales ver manual de procedimientos operativos.

INTERFERENCIAS Y LIMITACIONES DEL MTODO

FACTORES QUE AFECTAN LOS RESULTADOS DE LABORATORIO

OBJETIVOS DEL PROGRAMA DE ENTRENAMIENTO

FASE PRE ANALTICA TEMA 1. CONTROL DE CALIDAD DE REACTIVOS

1.5 EQUIPO NECESARIO

MATERIAL DE VIDRIO Pipetas Pasteur Tubos de 12x75 mm Frascos goteros estriles

EQUIPOS Centrifugas de mesa Incubador de calor seco

1.6 PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO AVIDEZ

NMERO DE ESPECIMENES PROBADOS

1.7 MARCADO Y EMPAQUE

Las etiquetas en el envase primario informacin:

y secundario deben contener la siguiente

Debe cumplir con las especificaciones sealadas en la NOM- 008-SCFI-1993.

1.8 FORMATOS, REFERENCIAS Y BIBLIOGRAFA

Manual de Procedimientos Operativos

TEMA 2. GRUPO SANGUNEO ABO AUTOMATIZADO

ANTIGENOS ANTICUERPOS PRESENTES PRESENTES EN LOS EN SUERO GLOBULOS ROJOS

PRINCIPIO DEL MTODO

FIGURA 1. TARJETA DE GEL

2.3 APLICACIN CLNICA

FIGURA 2. TARJETA DE GEL PARA GRUPO SANGUNEO ABO Y Rh

2.4 RECOLECCIN DE LA MUESTRA

PREPARACIN DEL PACIENTE

Sangre total: ptimo, 7 mL Mnimo 4 mL

TABLA 5. TIPO Y VOLUMEN DE MUESTRA REQUERIDO

TIPO DE MUESTRA ptimo

4.0 mL Suero 3.0 mL Eritrocitos (3-5%)