ESTABLECIMIENTO IN VITRO DE YEMAS DE MINI ROSA (Rosa spp).

Escuela Politcnica del Ejrcito -ESPE- Departamento de Ciencias de la vida. Ingeniera en Biotecnologa. Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales. Andrango Carla, Naranjo Renato, Olmedo Alejandro, Onofre Emily, Quijia Christian. Sangolqu-Ecuador.

Resumen En el presente trabajo se estudi el cultivo in vitro de minirosa ( Rosa spp). La metodologa utilizada en este estudio consisti en tomar explantes de tallo con yema axilares de minirosa, los cuales fueron desinfectados con una solucin al 2% de detergente durante 20 minutos, despus se sumergi los explantes en cloro al 2,5 % ms tres gotas de Tween 20 durante 10 minutos. Para la siembra se utiliz medio MS enriquecido con 2 mg/L de BAP, 0,5 de mg/L de AIA, 70 mg/L de cido ctrico, 30g/L de azcar y 7 g/L de agar y pH ajustado a 5,7-5,8. Despus de dos semanas de incubacin a 22 C de temperatura, 49% de humedad y 10,068 luxes de intensidad lumnica, se observ la aparicin de organognesis directa (60% de los explantes), organognesis indirecta (10% de los explantes) y tan slo formacin de callo en un (10% de los explantes) en varios medios de cultivo. Palabras clave: Yema. Mini Rosa (Rosa spp), Murashige-Skoog (MS)

INTRODUCCIN Las mini rosas pertenecen a la familia de las rosceas, son ejemplares enanos de follaje espeso, que no suelen sobrepasar los 15 centmetros de altura. Estas plantas son versiones ms pequeas de las rosas comunes (Lutero, 2011). Son reflorecientes formando ramilletes de rosas diminutas, simples o plenamente dobles. Las flores pueden medir entre y 2 pulgadas de dimetro y presentan un rango de colores tan variado como el de las rosas comunes. Las hojas pequeas pueden ser perennes o caducas, pecioladas e imparipinnadas con entre 5 a 9 fololos de borde aserrado y estpulas basales (Germoplanta, 2012). Las rosas son una de las plantas ornamentales ms importantes y son los ms utilizados con fines ornamentales, medicinales y aromticos, lo que las ha convertido en una especie de gran importancia econmica a nivel mundial. Actualmente, las rosas miniatura, se han convertido en una de las plantas ms populares entre los jardineros principiantes quienes

prefieren cultivar rosas que les genere menor esfuerzo y menor cuidado pero sobretodo, que ocupen menos espacio en los jardines. (Jimnez, 2008). Para las especies del gnero Rosa spp., las tcnicas predominantes para su propagacin son las que involucran esquejes o injertos en portainjertos de semilla, pero no aseguran plantas sanas y libres de enfermedades. La dependencia de la temporada y la lenta tasa de multiplicacin son algunos otros factores que limitan considerablemente (Pati et al., 2006). La propagacin in vitro ha recibido considerable atencin en los ltimos aos. La tcnica ms importante de la micropropagacin, reportado por varios investigadores, es la proliferacin de meristemas en el que las yemas apicales o segmentos nodales con una yema axilar se cultivan para regenerar brotes mltiples sin ninguna fase intermedia de callo (Carelli y Echeverrigaray, 2002). El objetivo del presente trabajo fue multiplicar callo de babaco, jigacho y manzana Emilia y establecer in vitro callos de pulpa de manzana

roja, utilizando diferentes medios MS enriquecidos con ciertos reguladores de crecimiento. MATERIALES Y MTODOS El trabajo se desarroll en el laboratorio de Cultivo de Tejido Vegetal de la Facultad de Ingeniera en Biotecnologa perteneciente a la Escuela Politcnica del Ejrcito. Material Biolgico Se utilizaron explantes de tallo con yema axilar de minirosa (Rosa spp). Desinfeccin del explante

RESULTADOS Los resultados fueron analizados luego de dos semanas de la siembra del explante de la minirosa. Se analiz un total de 10 frascos. Estos resultados se los dividi en 3 escalas como se muestra en la Tabla 1. Aquellos frascos que presentaban contaminacin por hongos o bacterias se los incluyo en la primera escala. La segunda escala incluye aquellos frascos donde se produjo organognesis (directa o indirecta), y la tercera escala presenta aquellos explantes que solo presentaron la formacin de callo.
Tabla 1. Resultados y porcentajes de cada Escala.

Escala

Caracterstica

La metodologa utilizada durante este estudio consisti en tomar explantes de tallo con yema de minirosa, los cuales fueron desinfectados con una solucin al 2% de detergente durante 20 minutos, se realiz dos lavados con agua destilada y uno con agua estril, despus se sumergi los explantes en cloro al 2,5 % ms tres gotas de Tween 20 durante 10 minutos. Siembra e incubacin Despus de realizados los tres lavados dentro de la cmara de flujo laminar para retirar los residuos de cloro, se desinfecta los materiales con alcohol al 90% y se utiliza todas las medidas aspticas, se coloc la muestra sobre la superficie estril y se retir las partes del explante quemadas por el cloro al 2,5 %. Dejando expuesta la yema de minirosa. Para la siembra se utiliz medio MS enriquecido con 2 mg/L de BAP, 0,5 de mg/L de AIA, 70 mg/L de cido ctrico, 30g/L de azcar y 7 g/L de agar y pH ajustado a 5,7-5,8. La siembra se realiz de manera que la yema quede de manera vertical en el medio de cultivo. Por ltimo se sellaron los frascos con dos capas de plstico adherente, se asegur con una liga y se rotul cada frasco con el nombre de la muestra, la personas quien realiz la siembra y la fecha para su posterior incubacin a 22 C de temperatura, 49% de humedad y 10,068 luxes de intensidad lumnica.

Contaminacin por hongos Directa

Resultado (# de frascos) 2 6 1 1 10

20 % 60 % 10 % 10 % 100%

2 3 Total

Organognesis Indirecta Solo formacin de callo

Observando los resultados se determina que se obtuvo: contaminacin por hongos en un (20%), organognesis directa (60%), organognesis indirecta (10%) y solo la formacin de callo en un (10%). Se indica ms detallado en el Grafico 1. La imagen 1 muestra los resultados de cada escala.

Grafico 1. Porcentajes de los resultados de cada escala.

contaminaron por hongos. Lo mencionado se observa en la Tabla 2 y Tabla 3.

Tabla 2. Porcentaje de oxidacin-no oxidacin del explante.

Explante

(a)

(b)

Con muy poca oxidacin Sin oxidacin TOTAL

Resultado (# de frascos) 6

Porcentaje

75%

2 8

25% 100%

(c)

(d)

Tabla 3. Porcentaje de formacin y no formacin del callo.

Explante
Imagen 1. Resultados luego de 2 semanas del sembrado del explante. (a) Contaminacin hongos, (b) Organognesis directa, (c) Organognesis indirecta, (d) Formacin nica del callo.

Para los explantes que se obtuvo exitosamente organognesis, se puede diferenciar que se obtuvo organognesis directa en un (85.71%), mientras que se obtuvo organognesis indirecta en un (14.29%) observados en el grfico 2.

Formacin de callo Sin formacin de callo TOTAL

Resultado (# de frascos) 7 1

Porcentaje

87,5 12,5

100%

100.00% 80.00% 60.00% 40.00% 20.00% 0.00%

Series1

El (75%) de explantes viables presentaron oxidacin y el (25%) no presentaron rastros de oxidacin. El (87,5%) de explantes presentaron la formacin de callo y el (12,5%) de explantes no se form callo. Se explica ms detalladamente en el grfico 3 y grfico 4.

Grafico 2. Porcentaje de organognesis: directa e indirecta para los explantes.

Tambin se puede datar en los resultados el porcentaje de oxidacin que presentaron los explantes, oxidacin que se observ en mnima escala; tambin el porcentaje de la formacin de callo, viendo los explantes que presentaron viabilidad y excluyendo aquellos que se

Grafico 3. Porcentaje de oxidacin y no oxidacin del explante.

En la tabla 4 se muestra los resultados de los 10 explantes sembrados. Donde se incluye distintas caractersticas como: muerte del explante, oxidacin, formacin de callo y crecimiento de rgano de manera resumida. DISCUSIN Las distintas tcnicas en cultivo de tejidos han sido ampliamente empleadas para el crecimiento de plantas con fines comerciales y cientficos, lo que implica la obtencin de nuevas plantas a partir de pequeos brotes obtenidos con las debidas condiciones y medio necesario para el fin deseado. Segn Rivera et al. (2002), con este gnero de plantas se ha logrado conseguir xitos en un 90% significativamente en el o los tratamientos empleados para la obtencin de organognesis a partir de Rosa spp. En nuestro trabajo se obtuvo xitos significativos con un porcentaje del 70%, determinando as que esta especie no presenta mayores complicaciones para obtener organognesis a partir de un explante bien sea directa o indirectamente, siempre y cuando se estandarice el mejor protocolo tanto de establecimiento como de preparacin del medio con las hormonas y vitaminas necesarias para obtener el fin deseado, en este caso las citoquininas y auxinas son las hormonas implicadas directamente. De los explantes sembrados e incubados durante dos semanas, se observa que se obtuvo contaminacin fngica en un 20%, hecho que pudo haberse debido a que el operador no realiz correctamente todo el protocolo necesario en la siembra para mantener la asepsia de los explantes. De los explantes que se logr obtener exitosamente la organognesis, y se obtuvo claramente diferenciado los explantes con organognesis directa (85.71%) de los que se observ organognesis indirecta (14.29%); y al estar el medio de cultivo con una mayor cantidad de citoquininas que auxinas, adicionadas, se puede decir que la razn por la cual se observa la formacin de callo previa formacin de brote es que en aquellos explantes la concentracin interna de auxinas es mayor a la de citoquininas, y al tener una concentracin

Grafico 4. Porcentaje de formacin y no formacin del callo.

La Imagen 2 muestra las fotografas de la oxidacin del explante y la formacin del callo.

(a)

(b)

Imagen 2. Resultados luego de 2 semanas del sembrado del explante. (a) Oxidacin del explante, (b) Formacin del callo, sin oxidacin.

Nombre: Minirosa N frasc o 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Contamin acin hongo o bacteria No No No No No No No Si Si No

Fecha de siembra: 13/05/2013 Caractersticas Muerte del explante No No No No No No No Si Si No Oxidaci n Muy poca No Muy poca Muy poca Muy poca No Muy poca ----------------------Muy poca Formaci n de callo Si No Si Si Si Si Si -------------------------------Si

Fecha evaluacin: 27/05/2013

Crecimiento brote Si Si Si Si No Si No --------------------------Si

Tabla 4.- Resumen resultados obtenidos mini rosa: contaminacin, Oxidacin, formacin de callo y de brote.

externa mayor de citoquininas, en el tejido vegetal se nivelaron los niveles para estas 2 hormonas generando una formacin de callo previa formacin de brote (Soomro, Yasmin, Aleem, 2008). Segn Razavirazadeh y Ehsanpour (2008), determinaron que el mejor medio que estudiaron para la obtencin de brotes para poder micropropagar en esta especie fue un medio MS adicionado con BAP (5mg/L), IBA (0.1mg/L) y sucrosa (40g/L), y detallan que la mejor relacin entre citoquininas y auxinas para la obtencin de brotes debe ser alrededor de 20:1 respectivamente para mantener mayor balance de citoquininas externa e internamente en el explante. Por lo que al observar estas concentraciones y relaciones se puede destacar que la relacin entre ambas hormonas empleada no se asemeja mucho en cuanto a cantidades, esta relacin debe darse para que el equilibrio entre las hormonas no se nivele generando una produccin indeseada de callo si lo que se desea es obtener brotes para micropropagar esa especie, ya que en nuestro trabajo se present formacin de callo en (87.5%). Adicionalmente en su estudio datan que aquellos explantes que presentaron oxidacin posterior un tiempo de incubacin se necrosaron y presentaron clorosis debido a los fenoles producidos por el estrs ocasionado al explante en el momento del establecimiento generando una acumulacin de etileno en los cultivos, que produce un bajo intercambio de gases entre frasco de cultivo y el medio. En nuestros explantes se present oxidacin en (75%) pero, en pequea cantidad indicando que el cido ctrico aadido ayud a que no se present una mayor oxidacin, y adicional con lo anteriormente explicado sobre el trabajo indica que el protocolo de establecimiento y preparacin del medio requerido empleado es el indicado para obtener brotes a partir de yemas apicales de Rosa spp., mini rosa; siempre y cuando no se busque micropropagar.

CONCLUSIONES Se logr establecer yemas apicales de Rosa spp. en medio de cultivo MS enriquecido con BAP (2mg/L), AIA (0.5mg/L) y cido ctrico (70mg/L). El 60% de los explantes sembrados presentaron organognesis directa exitosamente, un 10% organognesis indirecta y un 20 % presentaron contaminacin por hongos y en ningn explante se observ contaminacin bacteriana. El 10% de los explantes no presentaron la formacin de rgano, sino tan solo de callo. El 75% de los explantes viables presentaron oxidacin; en cambio el 25% restante no presentaron oxidacin, por lo que la cantidad aadida de cido ctrico ayud a que se presente baja cantidad de oxidacin en los explantes, pero no evit que se presente la misma El 87.5% de los explantes presentaron crecimiento de callo; en cambio el 12.5% restante no present formacin de callo.

RECOMENDACIONES Se recomienda emplear un medio MS enriquecido con citoquininas/auxinas en relacin 20:1, para la realizacin del presente trabajo. Para evitar que el explante se necrose o presente clorosis al haber oxidacin se recomienda hacer un subcultivo para el mismo disminuyendo la cantidad de sales, intensidad lumnica y sumergir el explante en medio lquido por un corto perodo de tiempo.

BIBLIOGRAFA Carelli, B., Echeverrigaray s, J. (2002). An improved system for the in vitro propagation of rose cultivars. Scientia Horticulturae 92: 69 74 Germoplanta, (2012). Mini rosa. [en lnea]. <http://www.germoplanta.com/index.php?option =com_content&view=article&id=29&Itemid=33> [Consulta: 02/06/2013]

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