UNIVERSIDAD TCNICA DE AMBATO FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERA EN ALIMENTOS CARRERA DE INGENIERIA BIOQUIMICA BIOQUIMICA I NOMBRE: Jonathan Gavilanes Lpez;

Cinthya Romero Flores. PROFESOR: Ing. Carlos Moreno. AYUDANTE: Egdo. Oscar SEMESTRE: 5 Ingeniera Bioqumica. TEMA: IDENTIFICACIN DE AMINOCIDOS I. INTRODUCCION

Existen veinte aminocidos que se combinan de muchas maneras diferentes para formar miles de protenas. Cada variacin en el nmero, el tipo y el orden en que se combinan los aminocidos da lugar a una protena distinta. La unin de dos aminocidos da lugar a un dipptido; si se unen tres se forma un tripptido. Cuando se juntan de cuatro a diez aminocidos dan lugar a una cadena peptdica, y cuando se unen ms de diez originan una cadena polipeptdica o polipptido. Las reacciones para la deteccin de aminocidos, actualmente estn acoplados a sistemas de valoracin automtica ya que tiene como objetivo detectar y cuantificar cantidades de aminocidos libres. Los aminocidos, en general reaccionan con la ninhidrina cuando son calentados con un exceso de la misma. Todos los aminocidos que poseen un grupo amino libre reaccionan y forman dixido de carbono, amoniaco, y un aldehdo que contiene un tomo de carbono menos que el compuesto original. Esta reaccin da lugar a la formacin de un producto de color azul o purpura. La ninhidrina es un oxidante energtico que por una desaminacin oxidativa de los aminocidos conduce a la formacin del aldehdo correspondiente y la formacin de ninhidrina reducida o hidrindrantina. La molcula de hidrindrantina, en presencia de ninhidrina condensa a travs del amoniaco produciendo una estructura denominada indanona o purpura de Ruhemann, manifestando un color rojizo, excepto en la prolina, hidroxiprolina y en menor medida para la histidina.

II.

OBJETIVOS

GENERAL Determinar de manera experimental la presencia de aminocidos basndose en las diferentes pruebas de identificacin. ESPECIFICOS Analizar el mecanismo de accin de las distintas pruebas planteadas para la identificacin de aminocidos. Establecer la importancia de la caracterizacin de aminocidos en la industria bioqumica.

III.

MATERIALES Y REACTIVOS Hipoclorito sdico alcalina (solucin al 2% en NaOH AL 5%) Urea (solucin al 40%) HNO3 (conc. que contenga cido glioxilico) H2SO4 (concentrado) Guantes Tubos de ensayo y gradilla Plancha elctrica de calentamiento Bao mara Pipetas Mechero

Aminocidos Albumina de huevo Ninhidrina Etanol al 95% HCl concentrado Nitrito sdico (5%) NaOH (40%) Acetato de plomo (2M) NaOH (2M) - naftol (0,02% en etanol. Mantener en botella ambar) Hielo Hipoclorito sdico alcalina (solucin al 2% en NaOH AL 5%)

IV.

PROCEDIMIENTO DIAGRAMA DE FLUJO N1 SOLUCIONES DE AMINOACIDOS Preparar una solucion madre de los AA al 0,5% en HCl 0,2M (la concentracion esta sujeta a verificacion durante la practica). De estas soluciones de AA, hacer las diluciones correspondientes dependiendo de la determinacion a realizar. De los demas reactivos preparar entre 10 y 25ml.

Elaborado por: Gavilanes J.

DIAGRAMA DE FLUJO N2 RECONOCIMIENTO DE LOS ALFA AMINOACIDOS CON NINHIDRINA Colocar en una gradilla 5 tubos de ensayo, en cada uno de ellos medir 0,1ml de isoleucine, norleucina, (al 0,5% en HCl 0,2M), la muestra problema y albumina (clara de huevo diluida 1/10 con agua destilada bajo agitacion vigorosa) Aadir con mucho cuidado 0,05ml de la solucion de ninhidrina y calentar suavemente en bao maria hasta que se observe un cambio de color.

1 2

Elaborado por: Gavilanes J.

DIAGRAMA DE FLUJO N3 RECONOCIMIENTO DE LOS ALFA AMINOACIDOS CON ACIDO NITROSO Tomar 0,1ml de cada solucion de AA (al 0,5%), de la muestra problema y de la albumna diluida (1/10). Incorporar 0,05ml de HCl concentrado y 0,1ml de nitrito sodico al 5%. Observar los cambios.

Elaborado por: Gavilanes J.

DIAGRAMA DE FLUJO N4 RECONOCIMIENTO DE AMINOACIDOS AROMATICOS REACCIN XANTOPROTEICA Colocar en 3 tubos de ensayo 1ml de tirosina, albumna diluida y la muestra problema. Aadir lentamente y con agitacion 1ml de HNO3 concentrado. Calentar suavemente hasta que hierva. Dejar enfriar y aadir gota a gota, NaOH al 40%. a). adicion de acido y b) NaOH.

Elaborado por: Gavilanes J.

DIAGRAMA DE FLUJO N5 RECONOCIMIENTO DE AMINOACIDOS ZULFURADOS

1
2

Preparacion de la solucion de acetato de plomo (10ml). Disolver acetato de plomo para formar una solucion al 5%. En 3 tubos de ensayo, colocar 1mlde cisteina, albumina sin diluir y la muestra problema. Aadir luego 0,4ml de NaOH al 40% y calentar ligeramente, adicionar de 3 a 5 gotas de acetato de plomo.

Elaborado por: Gavilanes J.

DIAGRAMA DE FLUJO N6 RECONOCIMIENTO DE AMINOACIDOS QUE CONTIENEN INDOL Y PRUEBA DE SAKAGUCHI

En tres tubos de ensayo se coloc 1 ml de Triptofano al 0.02%, albmina (diluida) y de la muestra problema. A continuacin se aadi 2 ml de cido actico concentrado,y se mezclo bien. Luego se aadi cuidadosamente, por las paredes del tubo, 1ml de H2SO4 (concentrado). AMINOACIDOS QUE Se dej reposar por 5min, sin agitar.

CONTIENEN INDOL

PRUEBA DE SAKAGUCHI

Se disolvi 0.01 g de -naftol en 10 ml de etanol al 95%. Y se tom 2 ml de esta solucin, se afor a 10 ml con agua destilada. Se coloc 5 ml de Arg al 0.02% en 1 tubo mantenido en un bao de hielo. Se aadi 1 ml de NaOH 2M, 1 ml de -naftol al 0.02% en etanol y se mezcl. Se enfri en hielo por 3 min. Luego se aadi 1 ml de solucin de hipoclorito sdico (al 2% en NaOH al 5%), se esper 30 segundos, se aadi 1 ml de solucin de urea (40%) y se mezcl completamente.

Elaborado por: Gavilanes J.

V.

DATOS OBTENIDOS Y RESULTADOS

TABLA N1 RESULTADO DE LAS PRUEBAS PARA EL RECONOCIMIENTO DE AMINOCIDOS COLOR OBTENIDO/ OBSERVACIONES REACCIN AA ESTNDAR MUESTRA PROBLEMA ALBMINA FOTOGRAFIA

NINHIDRINA ACIDO NITROSO

XANTOPROTEICA

AMINOCIDOS AZUFRADOS AMINOACIDOS QUE TIENEN INDOL

(HOPKINS-COLE)

RECONOCIMIENTO DE ARGININA (SAKAGUCHI ) FUENTE: Laboratorio de Bioqumica I - FCIAL ELABORADO POR: Gavilanes J.; Romero C.

VI. VII.

DISCUSIN CUESTIONARIO

1. Escribir la reaccin completa que se produce entre el -aminocido y la ninhidrina.

2. Cmo se puede preparar el cido glioxlico (reactivo de Hopkins-Cole) a partir de cido oxlico? El cido glioxlico presente en el reactivo, se forma a partir de la reduccin del cido oxlico con magnesio en polvo o amalgama de sodio. 3. Escriba las frmulas y el smbolo de los AA existentes en su muestra problema. Acido Asprtico (Asp) Cistina (Cys)

VIII.

CONCLUSIONES

IX.

BIBLIOGRAFIA BUTLER J. 2005. SOLUBILITY AND PH CALCULATIONS .Addison Wesley Publishing Company. Washington-DC. Pp1052. GARCIA J. 2009. QUMICA. LOS ELEMENTOS Y SUS REACCIONES. 2 Edicin. Editorial Revert S.A. Mxico. Pp. 206-209. AYALA Y MENDEZ. 2005. BIOMOLCULAS. Primera Edicin. Ed. EGB. Bogot- Colombia. Pp. 19-22 Nelson DL- Cox MM. Lehninger.2006. PRINCIPIOS DE BIOQUMICA. Cuarta Edicin. Ediciones Omega. Barcelona- Espaa. Pp 63-65.