UNIVERSITATEA DE TIINE AGRONOMICE I MEDICIN VETERINAR BUCURETI Facultatea de Horticultur

TEZ DE DOCTORAT
BIOTEHNOLOGII MODERNE CU APLICAII N OBINEREA MICELIULUI UTILIZAT PENTRU CULTIVAREA INTENSIV A CIUPERCILOR PLEUROTUS

REZUMAT

CONDUCTOR TIINIFIC PROF. UNIV. DR. GHEORGHE CMPEANU DOCTORAND ALEXANDRU VALENTIN ZGREAN

BUCURETI 2011 0

REZUMAT LA TEZA DE DOCTORAT CU TITLUL

BIOTEHNOLOGII MODERNE CU APLICAII N OBINEREA MICELIULUI UTILIZAT PENTRU CULTIVAREA INTENSIV A CIUPERCILOR PLEUROTUS Cultura ciupercilor comestibile cunoate n ntreaga lume o dezvoltare fr precedent, manifestndu-se, n multe ri, ca o adevarata industrie de profil. Tehnologiile de cultur sunt dependente de condiiile existente, soluiile aplicate variind ntr-o gama larg, ncepnd cu cele empiric-tradiionale i ajungnd la cele asistate de computer. Datorit importanei lor economice, speciile de Pleurotus cultivate constituie cel mai dinamic grup de ciuperci din punct de vedere al rspndirii culturii i al volumului produciei nregistrate la nivel global n ultimul deceniu. Astfel, dac la sfritul anului 1998 speciile de Pleurotus realizau 14% din producia mondial de ciuperci cultivate, dup numai 10 ani, n 2008 ponderea lor a ajuns la 25%, ceea ce nseamn o cretere cu peste 170% n aceast perioad. O asemenea dezvoltare spectaculoas a culturii ciupercilor Pleurotus implic o evoluie similar a produciei de material biologic folosit pentru nsmnare n ciupercrii, cunoscut la noi sub denumirea de miceliu comercial sau, mai simplu, miceliu. n acest context, am considerat oportun alegerea ca subiect al prezentei teze de doctorat, a unei teme de cercetare care s investigheze posibilitile de utilizare i mbuntire ale biotehnologiilor implicate n obinerea, caracterizarea i propagarea in vitro a culturilor pure de Pleurotus, cu aplicabilitate direct n producerea miceliului comercial. Teza de doctorat cu titlul Biotehnologii moderne cu aplicaii n obinerea miceliului utilizat pentru cultivarea intensiv a ciupercilor Pleurotus este structurat n dou pri principale, una teoretic i cea de-a doua, experimental. Prima parte prezint Aspecte teoretice privind ciupercile Pleurotus i miceliul lor: stadiul cunoaterii i biotehnologii aplicate n producie i este alctuit din 4 capitole desfurate pe parcursul a 52 de pagini, coninnd 3 tabele i 24 figuri. Partea a doua, intitulat Cercetri experimentale realizate n cadrul tezei de doctorat, cuprinde 6 capitole prezentate n 141 de pagini, cu 29 tabele i 58 figuri. Bibliografia cuprinde un numr de 185 titluri de specialitate, fcnd trimitere i la adresele de pe internet. n prima parte a tezei sunt prezentate sintetic informaii din literatura de specialitate privind stadiul actual al cercetrilor aferente tematicii abordate. Capitolul I Ciupercile Pleurotus - taxonomie, specii cultivate, particulariti biologice focalizeaz zona de interes a documentrii pe poziia taxonomic i pe clasificarea acestora.

Conform sistematicii actuale, ciupercile Pleurotus fac parte din cea mai evoluat ncrengtur/filum de fungi - Basidiomycota, ordinul Agaricales, familia Pleurotaceae, genul Pleurotus. Principalele specii i varieti cultivate sunt: P. ostreatus, P. pulmonarius, P. ostreatus var. columbinus, P. ostreatus var. florida, P. cornucopiae var. citrinopileatus, P. eryngii, P. sajor-caju. Particularitilor lor biologice i tehnologice sunt determinate de structura genetic i puternic influenate de caracteristicile ciclurilor de via i reproducere, specifice acestor bazidiomicete heterotalice tetrapolare. n capitolul II, intitulat Cultura ciupercilor Pleurotus - perspectiv istoric i economic, se face o prezentare succint a etapelor de dezvoltare ale culturii ciupercilor Pleurotus, pe plan mondial i naional, susinut de date statistice. Principalele etape ale biotehnologiei producerii acestor ciuperci sunt descrise n capitolul III, denumit Tehnologia general de cultivare a ciupercilor Pleurotus. Cultura modern impune o separare strict a zonelor n care se produc miceliul, substratul de cultur i, respectiv, ciupercile. Progresul tehnic i tiinific nregistrat n domeniu face ca, n cadrul sistemului tehnologic intensiv-industrial, substratul s fie introdus n ciupercrie dezinfectat termic i nsmnat (FAZA II), sau deja incubat (FAZA III). Capitolul IV, intitulat Miceliul de Pleurotus i biotehnologii implicate n producerea acestuia, prezint partea de documentare de cel mai mare interes pentru subiectul tezei. La obinerea miceliului comercial particip un ansamblu de biotehnologii interdependente, desfurate n etape succesive. Procesul urmrete asigurarea puritii biologice a produsului final miceliul - i meninerea nealterat a puritii genetice i varietale a genotipurilor reprezentate prin sue/tulpini ori hibrizi de Pleurotus. Metodele/secvenele biotehnologice mai des utilizate sunt urmtoarele: transferul micelian (pentru propagare), cultura de esut plectenchimatic, culturile monosporale i plurisporale (multisporale). Dei sunt considerate convenionale, ele prezint un real potenial de modernizare prin mijloacele tehnice tot mai performante de care dispun astzi, n ntrega lume, laboratoarele specializate n producerea miceliului. Activitile de cercetare i producie privind miceliul ciupercilor Pleurotus, desfurate la noi n ar, au vizat aspecte destul de diferite, n funcie de obiectivele propuse, de dotarea tehnic disponibil i de fondurile alocate. n acest context, am considerat oportun alegerea ca subiect al prezentei teze de doctorat, a unei teme de cercetare care s investigheze o direcie foarte puin i fragmentar abordat la noi pn n momentul de fa, dar de importan major pentru producerea miceliului utilizat la nsmnare.

Scopul prezentei teze de doctorat este de a stabili unui protocol de lucru fiabil i argumentat tiinific, pentru obinerea i caracterizarea culturilor pure de Pleurotus sp., care s poat fi aplicat cu succes n etapa iniial a producerii miceliului utilizat pentru nsmnare. Ipoteza de lucru de la care am pornit se refer la faptul c, n ciuda unor cercetri privind producerea miceliului de Pleurotus, efectuate n ar, au rmas neinvestigate sectoare importante ale acestui domeniu, printre care i cel al biotehnologiilor utilizate pentru obinerea i caracterizarea in vitro a culturilor pure. Obiectivele specifice cercetrilor prezentate n cadrul tezei sunt: Colectarea, identificarea i caracterizarea morfotaxonomic a materialului biologic primar, respectiv un eantion de genotipuri de Pleurotus sp. cu origini diferite; Stabilirea valorilor optime de temperatur i pH i selectarea mediului de cultur potrivit pentru cultivarea in vitro a miceliului de Pleurotus. Obinerea, caracterizarea i multiplicarea in vitro a culturilor pure de miceliu de Pleurotus prin utilizarea urmtoarelor metode/secvene biotehnologice: transfer micelian, culturi de esut, culturi plurisporale (multisporale), culturi monosporale. Selectarea suportului granulat potrivit pentru propagarea in vitro a miceliului noilor sue de P. ostreatus ca etap de baz n cadrul biotehnologiei producerii miceliului pentru nsmnare. Stabilirea unui substrat lignocelulozic adecvat creterii miceliului experimental n vederea testelor de fructificare n ciupercrie. Verificarea n ciupercrie a stadiului reproductiv al miceliului noilor tulpini de P. ostreatus, urmrindu-se: timpurietatea, morfologia bazidiocarpilor i capacitatea de producie, n relaie cu natura substratului de cultur i regimul termic de fructificare. Cea de-a doua parte a tezei cuprinde cercetrile proprii. Prima etap din cadrul acestora este descris n capitolul V, denumit Cercetri privind obinerea i caracterizarea morfotaxonomic a materialului biologic primar: bazidiocarpi de Pleurotus cu origini diferite. Conform obiectivului stabilit, au fost colectate 16 genotipuri specimene de bazidiocarpi de Pleurotus cu origine diferit: din flora spontan i, respectiv, dintr-o cultur experimental nsmnat cu tulpini provenite din Colecia ICDLF Vidra. Identificarea dup cheile de determinare i caracterizare morfotaxonomic a permis urmtoarea ncadrare: P.ostreatus , 8 bazidiocarpi (426s, 426s/I, 426s/II, P80-1, 7bis/I, 7bis/II, 421/I, 421/II); P.ostreatus var. florida, 4 (308/III, 308/IV, 362/II, 362/III); P. sajor - caju, 2 (392/I, 392/II); P.cornucopiae var. citrinopileatus , 2 (386/I, 386/II). Pentru diferenierea ntre specii/ varieti i ncadrarea taxonomic corect a specimenelor, caracterele

macromorfologice care i-au dovedit utilitatea au fost: forma i mrimea fructificaiilor, modul de 3

apariie, solitar sau n buchet, aspectul lamelor himenoforului, inseria piciorului la plrie i, mai ales, culoarea acesteia. Cercetrile efectuate asupra carpoforilor au fost completate cu studiul bazidiosporilor colectai de la acetia, prin metoda amprentelor sporale (sporograme). Au fost obinute elemente suplimentare valoroase n sprijinul ncadrrii sistematice corecte a materialului biologic primar. Cercetrile privind colectarea i caracterizarea morfotaxonomic a bazidiosporilor de Pleurotus sp. prezint un caracter de noutate la noi n ar, att sub aspectul materialului biologic studiat, ct i prin metodele utilizate. O meniune special trebuie fcut pentru observaiile i determinrile efectuate n cmp de microscopie fotonic i cu fluorescen, acestea din urm fiind, se pare, primele realizate la noi, pe spori de Pleurotus. n preparatele tratate cu acridin-orange i vizualizate n lumin UV la microscopul cu epifluorescen, sporii s-au colorat n galbenportocaliu, evideniind i stadiul monocariotic, cu materialul genetic colorat n galben-verzui intens (verde - culoare specific pentru fluorescena emis de legturile fluorocromului acridin-orange cu moleculele de ADN dublu catenar). Capitolul VI, intitulat Studiul influenei unor factori ecofiziologici asupra creterii i dezvoltrii in vitro a miceliului de Pleurotus este structurat n patru subcapitole. Primele trei descriu cercetrile efectuate n cadrul unui modul experimental unitar, privind efectul pe care-l exercit temperatura, natura mediului de cultur i pH-ul acestuia, asupra creterii miceliului de P.ostreatus. Cel de-al patrulea subcapitol nsumeaz concluziile pariale desprinse din analiza rezultatelor celor 3 experiene de tip bifactorial, corespunztoare primelor subcapitole. Din analiza datelor obinute, reiese c viteza de cretere a miceliului de Pleurotus este determinat de genotip (tulpin) i puternic influenat de cei trei factori verificai n experimente. Rezultatele prezentate confirm pe cele obinute de ali cercettori i se explic, n principal, prin efectul pe care l exercit aceti factori asupra cantitii i activitii enzimelor lignocelulozolitice produse i excretate de miceliu n mediul de cultur. Pentru toate cele 5 sue experimentale verificate la temperaturile de 18C, 20C, 22C, 24C, 26C, 28C i 30C ( 0,5C), rata maxim de cretere s-a nregistrat n intervalul termic 2630C, cu un optim situat aproape de mijlocul acestuia. Experiena privind creterea miceliului pe mediu cu extract de cartofi i dextroz-agar (CDA/PDA), la diferite valori de pH iniial (5,5; 6,0; 6,5; 7,0), a demonstrat preferina miceliului de Pleurotus pentru medii cu reacie slab acid spre la neutr, cu valori optime de 6,5, urmate de 6,0. Dei mediul PDA a asigurat cele mai mari rate de cretere pentru toate tulpinile verificate,

diferenele fa de urmtorul clasat, mediul cu extract de mal-agar (MEA), au fost nesemnificative statistic. Acest fapt a justificat alegerea mediului MEA, mai accesibil i mai uor de preparat dect PDA, ca mediu de cultur preferat n cadrul experimentelor ulterioare. Capitolul VII, cu titlul Cercetri privind obinerea de noi izolate de Pleurotus i caracterizarea lor n cultur in vitro deine o pondere nsemnat n cadrul seciunii experimentale a tezei. n cuprinsul acestuia sunt prezentate cercetrile care utilizeaz principalele biotehnologii implicate n obinerea, caracterizarea i propagarea prin multiplicare in vitro a culturilor pure de miceliu de Pleurotus: transferul micelian (pentru propagare), culturile de esut, culturile plurisporale (multisporale) i culturile monosporale. Conform obiectivului principal urmrit, plecnd de la carpoforii i sporii lor caracterizai anterior, experimentele din capitolul VII s-au concretizat n obinerea i caracterizarea in vitro a 56 de noi izolate de Pleurotus. Prin metoda culturii de esut plectenchimatic au fost izolate 2 sue de P.ostreatus 426s (tip slbatic) i P80-1(din tulpin comercial). Aplicnd biotehnologia culturilor multisporale, n urma germinrii bazidiosporilor nsmnai n mas pe plci Petri cu mediu de cartof-dextroz-extract de drojdie-agar (PDYA) i mal-pepton micologic-agar (MMPA), au fost obinute 14 izolate viabile noi: 6 de P.ostreatus , 4 de P.ostreatus var.florida, 2 de P.sajor-caju i, respectiv, 2 de P.cornucopiae var. citrinopileatus . Toate culturile au prezentat, la examenul microscopic, miceliu vegetativ prevzut cu anse n crlig, aceasta constituind confirmarea fr dubii a stadiului dicariotic fertil. Culturile monosporale constituie surse importante de variabilitate pentru programele de ameliorare privind speciile heterotalice de ciuperci, cum sunt cele de Pleurotus. Pentru utilizarea acestei biotehnologii, s-au folosit amprentele sporale 426s/I (tip slbatic) i 421/I (din tulpin comercial), de la care s-au obinut n total 42 izolate presupus homocariotice. n urma examinrii microscopice, 37 izolate s-au dovedit a fi homocariotice, cu cte un singur nucleu/celul i cu miceliul lipsit de anse n crlig, restul de 5 fiind depistate ca dicariotice (anse prezente). n urmtoarea etap a cercetrilor a fost verificat posibilitatea de a obine culturi dicariotice fertile prin fuzionarea hifelor izolatelor monosporale. Pentru aceasta s-a folosit metoda confruntrii perechilor de fragmente miceliene dispuse fa n fa, pe medii agarizate. Din cele 16 perechi de monocarioni verificate, doar 3 s-au dovedit compatibile i numai una dintre acestea, 421/I/8 x 426s/I/10, s-a evideniat prin cretere mult mai rapid dect izolatele parentale i prin miceliul aerian-uniform, cu densitate medie. Aceste argumente au stat la baza propagrii ei prin pasaje periodice i utilizrii n experimentele ulterioare viznd capacitatea de fructificare, alturi de izolate de P. ostreatus obinute prin celelalte biotehnologii descrise.

n capitolul VIII sunt prezentate Cercetri privind creterea miceliului de Pleurotus pe suporturi/substraturi granulate i lignocelulozice. Obiectivul principal a fost selectarea suportului granulat potrivit pentru propagarea in vitro a suelor de P.ostreatus - ca etap de baz n cadrul biotehnologiei producerii miceliului pentru nsmnare. Cercetrile au urmrit i alegerea unui substrat lignocelulozic adecvat creterii miceliului suelor experimentale pentru testele de fructificare n ciupercrie. Pentru ndeplinirea obiectivelor propuse, din bogatul sortiment de culturi pure de Pleurotus obinute i caracterizate anterior - 4 specii, 56 sue a fost selectate, din raiuni practice, un numr restrns de 11 sue aparinnd unei singure specii, reprezentative pentru gen - P. ostreatus. Un argument important a fost faptul c aceasta reprezint principala specie cultivat din cadrul genului Pleurotus i este cea mai adaptat la condiiile climatice din Romania, putnd fi mai uor de gsit i recoltat din flora spontan. n plus, este notorie preferina ei pentru temperaturile sczute la fructificare (12-16C), fapt care o singularizeaz printre celelalte reprezentante ale genului Pleurotus, specifice unor zone geoclimatice mai calde. Capacitatea de cretere a miceliului, verificat la cele 11 tulpini experimentale, pe 2 variante de suport granulat cariopse de gru (Triticum aestivum) vs. cariopse de orz (Hordeum vulgare), a fost determinat n cadrul unei experiene de tip bifactorial cu 22 variante. Singura su cu rata de cretere mai mare ca martorul 421(8,64 mm/zi gru, 8,82 mm/zi orz) a fost 421/I (9,45 mm/zi gru, 9,47 mm/zi orz), cu diferene foarte semnificative pe ambele suporturi granulate. Diferenele foarte mici dintre creterile nregistrate pe cele dou variante de suport granulat i faptul c suportul din boabe de orz necesit o pregtire mai atent i o sterilizare mai prelungit dect cel de gru, au determinat opiunea ca miceliul folosit pentru nsmnrile ulterioare s fie produs pe suport din cariopse de gru. Cercetrile au continuat cu verificarea creterii miceliului celor 11 tulpini de P.ostreatus pe 2 substraturi specifice stadiului reproductiv, pregtite din subproduse agricole comune: S1 (paie de gru) i S2 (amestec din paie de gru + ciocli de porumb, n proporii egale). Rezultatele, care au evideniat creteri mai mari pe substratul din amestec de paie i ciocli, se explic prin aportul crescut de lignin i hemiceluloze asigurat de acetia. Capitolul IX, denumit Cercetri privind testarea capacitii de fructificare a miceliului noilor tulpini de P.ostreatus n ciupercrie reprezint, prin coninutul su, o continuare fireasc a seciunilor anterioare din cadrul prii experimentale a tezei. Pentru verificarea comportamentului la fructificare al noilor sue de P.ostreatus, a fost efectuat o selecie necesar n rndul acestora, innd cont de posibilitile practice de lucru, fiind promovate doar 6 tulpini (5 noi + 1 martor, tulpin comercial) din cele 11 vizate. Criteriul

principal luat n considerare a fost ca fiecare dintre cele 4 biotehnologii utilizate pentru obinerea i propagarea noilor culturi de miceliu, s fie reprezentat prin 1-2 tulpini corespunztoare, n cadrul sortimentului selectat: transfer micelian (421-martor), cultura de esut plectenchimatic (426s, P801), culturi multisporale (426s/I, 421/I), culturi monosporale (421/I/8 x 426s/1/10). Experimentele s-au desfurat n ciupercria intensiv-bizonal din Lehliu a firmei S.C. Chido Art Investment S.R.L, pe baza unei convenii de colaborare. Primele rezultate au fost obinute n urma unui ciclu complet (60 zile, din care 40-42 de recoltare), realizat n cultur restrns (microcultur). Au fost stabilite principalele caracteristici morfologice ale carpoforilor celor 5 sue noi de P. ostreatus, alturi de martorul 421 tulpin comercial. Tulpina 421/I s-a evideniat prin mrimea, forma i culoarea fructificaiilor. Urmtoarele dou experimente, de tip bifactorial, s-au desfurat n condiii de producie, pe cantiti mari de substrat celulozic nsmnat. Rezultatele obinute pe parcursul a 2 cicluri de culturi comparative, cu regimuri termice diferite, 17-20C i, respectiv 12-16C, pe cele 2 tipuri de substrat, S1 i S2, au demonstrat influena exercitat asupra capacitii de producie de ctre genotip (tulpin) n strns interdependen cu substratul de cultur i temperatura la fructificare. n ambele cicluri de culturi comparative, efectuate pe cantiti mari de substrat, cte2.304 kg/ciclu, cea mai productiv s-a dovedit a fi sua cu origine multisporal 421/I, singura care a realizat pe fiecare dintre cele dou substraturi, S1 i S2, recolte superioare martorului 421, cu diferene foarte semnificativ asigurate statistic. n plus, a fost demonstrat influena exercitat de compoziia substratului asupra produciei de ciuperci, toate suele experimentale realiznd recolte mai mari pe substratul S2 (paie + ciocli) dect pe S1 (paie). Analiza privind influena combinat a tulpinii i regimului termic asupra produciei, n ambele cicluri de cultur, a relevat recolte mai mari nregistrate de toate suele n ciclul 2 (1216C) fa de ciclul 1 (17-20C), cu diferene pozitive asigurate statistic la 4 din cele 5 tulpini noi. Avnd n vedere rezultatele obinute, a fost formulat recomandarea ca noua tulpin P.ostreatus 421/I, care, prin caracteristicile de timpurietate, morfologia carpoforilor i capacitate de producie, s-a plasat pe primul loc n cadrul sortimentului verificat, s fie verificat suplimentar i, ulterior nscris pentru testare la ISTIS n vederea omologrii i acceptrii n cultur. Demersul tiinific iniiat prin cercetrile incluse n aceast tez se constituie ntr-un pas nainte, cu caracter novator, spre creterea nivelului de performan al cercetrii aplicative romneti n domeniul obinerii i propagrii in vitro a culturilor pure de miceliu de Pleurotus sp. n capitolul X, sunt prezentate ntr-o manier sintetic, concluziile generale desprinse n urma analizei rezultatelor obinute pe parcursul desfurrii experimentelor i, pe baza lor, sunt formulate recomandri pentru mbuntirea performanelor n activitatea din domeniu.

Elemente de originalitate sunt prezente n fiecare capitol din seciunea experimental a tezei i vizeaz mai multe aspecte, prezentate n cele ce urmeaz: Cercetrile privind colectarea i identificarea-caracterizarea morfotaxonomic a carpoforilor i a bazidiosporilor de Pleurotus prezint un caracter de noutate la noi n ar att sub aspectul materialului biologic studiat 16 specimene de carpofori din 4 specii/varieti de Pleurotus, ct i din perspectiva metodelor utilizate. Trebuie subliniate observaiile i determinrile biometrice efectuate n cmp de microscopie fotonic (coloraie cu bleu-coton n lactofenol Amann) i cu fluorescen (coloraie cu acridin-orange i vizualizare n UV), acestea din urm, n mod deosebit. Verificarea, ntr-un cadru experimental unitar, a influenei combinate exercitate de temperatura de incubare, pH-ul i natura mediului de cultur, asupra creterii i dezvoltrii in vitro a miceliului de P. ostreatus. Cercetrile s-au realizat pe un eantion de 5 sue noi de P. ostreatus (421, 421/I, 426s, 426s/I i P80-1), crescute la diferite valori termice (18C, 20C, 22C, 24C, 26C, 28C, 30C), pe 3 medii de cultur (PDA, MEA, WEA) cu pH uri diferite 5,5; 6,0; 6,5; 7,0. Utilizarea n acelai modul experimental a 4 metode/secvene biotehnologice diferite, n scopul obinerii i propagrii prin multiplicare in vitro a culturilor pure de miceliu de Pleurotus sp.: transfer micelian, culturi de esut, culturi multisporale, culturi monosporale. n total, au fost obinute, 56 noi izolate de Pleurotus sp. metodologia folosit dovedindu-se fiabil i putnd fi considerat un protocol de lucru care poate fi aplicat cu succes n oricare alt cercetare de acest tip. A fost verificat creterea miceliului unui sortiment de 11 noi sue de P. ostreatus, pe dou tipuri de suport granulat: unul din cariopse de gru (Triticum aestivum) i cellalt din cariopse de orz (Hordeum vulgare). Verificarea comportamentului noilor sue nsmnate pe substraturi celulozice diferite, pentru alegerea celui mai apt s susin colonizarea miceliului cu vitez maxim. Au fost utilizate 2 variante bazate pe materii prime reprezentate prin subproduse agricole comune: a) paie de gru; b) amestec paie de gru +ciocli de porumb, n proporii egale. A fost evaluat comportamentul la fructificare a unui eantion de 6 noi sue de P. ostreatus (5 + 1 martor, tulpin comercial), obinute i caracterizate in vitro prin biotehnologii diferite. Dup testarea preliminar a fructificrii pe substraturi lignocelulozice n cultur restrns (microcultur), cele 6 tulpini de P. ostreatus au fost verificate n condiii de producie, n cadrul a dou cicluri succesive de culturi comparative cu regimuri termice diferite (17-20C i 12-16C). Una dintre noile tulpini obinute, P.ostreatus 421/I, s-a evideniat prin performane notabile privind creterea miceliului vegetativ in vitro i prin producia de ciuperci, ceea ce o recomand pentru verificri ulterioare n vederea lurii n eviden pentru testare la ISTIS i omologare.