TEMA 2: ANLISIS RELACIONADOS

DE

LA

GLUCEMIA

PARMETROS

1. Alteraciones del metabolismo glucdico, la diabetes (clasificacin, sntomas y diagnstico). 2. Glucemia basal. 3. Pruebas de sobrecarga: Curva de glucemia y Test de O'Sullivan. 4. Determinaci n de glucosa: mtodos. 5. Otras pruebas: anlisis de protenas glicosiladas, pptido C, glucosuria, insulinemia y determinacin de cuerpos cetnicos. Apndice: Cromatografa. Introduccin Los hidratos de carbono son compuestos orgnicos formados fundamentalmente por C, O e H a partir de los cuales se puede obtener energa con gran rapidez y que aportan, aproximadamente, el 50% de las caloras que recibimos de la dieta. Se ingieren en forma de polisacridos (ej. almidn), disacridos (ej. sacarosa y fructosa) o monosacridos (ej. glucosa y galactosa). En cualquier caso, se desdoblan en el intestino hasta obtener monosacridos que son absorbidos y transformados en glucosa a nivel heptico. Los niveles de glucosa en sangre (glucemia) se mantienen dentro de unos lmites muy estrechos y constantes gracias, fundamentalmente, a la accin de dos hormonas: la insulina (hipoglucemiante) y el glucagn (hiperglucemiante). As, tras la ingestin aumenta la glucemia pero, en las personas con un correcto metabolismo hidrocarbonado, estos niveles descienden rpidamente (gracias a la liberacin de insulina) de manera que tras 1,5-2 horas la glucemia vuelve al nivel basal. 1. Alteraciones del metabolismo glucdico , la diabetes Aunque las patologas relacionadas con alteraciones del metabolismo glucdico son muy diversas, vamos a centrarnos en los trastornos en la regulacin del nivel de glucosa en sangre Cuando la homeostasis de la glucosa se rompe por disfuncin de cualquier elemento que la mantiene, sobrevienen los sndromes hiper o hipoglucmicos que, como su nombre indican, conllevan el aumento (>120 mg/dL en ayunas) o la disminucin (<45-50mg/dL) de la glucemia, respectivamente. 1.1. Diabetes mellitus

La diabetes mellitus es la causa ms frecuente y grave de hiperglucemia. Es una metabolopata crnica que aparece como consecuencia de la deficiencia absoluta o relativa de insulina. En estas condiciones, la entrada de glucosa en las clulas est disminuida y en consecuencia los niveles en sangre se mantienen elevados (hiperglucemia). Esta deficiencia da lugar a una serie

de complicaciones a largo plazo, lo que origina una gran morbilidad y mortalidad. Existe otro tipo de alteracin denominada disminucin de la tolerancia a la glucosa o tolerancia anormal a la glucosa que se caracteriza por valores de glucemia intermedios entre los normales y los de los diabticos. 1.1.1. Clasificacin: Actualmente la diabetes se clasifica en: Diabetes tipo I (dficit total de insulina). Diabetes tipo II (resistencia a la insulina o defecto secretor con resistencia a la insulina, los enfermos al principio no requieren la administracin de insulina). Diabetes secundaria (enfermedades pancreticas, tumores endocrinos). Diabetes gestacional (se detecta durante el embarazo). 1.1.2. Sntomas La diabetes cursa con polifagia, polidipsia, poliuria, disminucin del peso corporal, hiperglucemia y en ocasiones glucosuria. 1.1.3. Diagnstico Las pruebas ms utilizadas para el diagnstico de la diabetes se basan en la demostracin de una tolerancia anormal a la glucosa. Concretamente s e suele: Determinar la glucemia basal Realizar pruebas de provocacin o sobrecarga en las que se administra al paciente una cantidad conocida de glucosa y se analiza la evolucin de la glucemia. Entra estas pruebas se incluyen la curva de glucemia y el test de OSullivan. Se considera diabetes si se cumple alguno de los tres puntos que se citan a continuacin: Nivel de glucemia > 200 mg/dL acompaado de los sntomas tpicos de la enfermedad. Glucemia en ayunas > 140 mg/dL, obtenida en dos ocasiones Glucemia en ayunas entre 110 y 140 mg/dL y dos curvas de glucemia positivas 2. Determinacin de la glucemia basal

Esta prueba consiste en determinar la glucemia tras un ayuno de 10-16h). En general se considera que: Valores menores de 110 mg/dL son normales. Valores entre 110 y 140 mg/dL son dudosos y deben ser confirmados. Valores mayores de 140 mg/dL son probablemente indicativos de diabetes. 3. Pruebas de sobrecarga: curva de glucemia y test de OSullivan

3.1. Curva de glucemia Esta prueba se realiza para comprobar definitivamente el diagnstico de la diabetes y es obligatoria cuando la glucemia basal es dudosa. Consiste en la medicin de la glucemia en ayuno y a intervalos regulares tras una sobrecarga de glucosa. Concretamente hay que considerar los siguientes aspectos: Durante los tres das previos a la prueba el paciente debe tener una dieta sin restriccin en hidratos de carbono (de al menos 150g de hidratos de carbono/da). Se realiza por la maana, despus de 10-16h de ayuno. Se obtiene una muestra de sangre en la que se determinar la glucemia basal. Se administra (va oral) al paciente 75g de glucosa disueltos en saborizante. (en nios la dosis se ajusta en funcin de su peso 1.75g glucosa/Kg) Se extrae sangre cada 30 minutos durante 2h (puede variar en funcin del protocolo) para evaluar la modificacin de la glucemia a lo largo del tiempo. Cualquier nausea o vmito debe ser anotado. En la imagen inferior se han representado 2 curvas correspondientes a un paciente sano, diabtico y con disminucin de tolerancia a la glucosa.

En un paciente sano: en ningn momento se superan los 200mg/dL En un paciente diabtico: la glucemia a las 2 horas es superior a 200 mg/dL y al menos otro valor intermedio es tambin superior a 200 mg/dL. En un paciente con tolerancia anormal a la glucosa: la glucemia basal es inferior a 140mg/dL en la curva de glucemia el punto final es superior o igual a 140 mg/dL pero inferior a 200 mg/dL, pero algn punto intermedio es superior a 200 mg/dL.

3.2. Test de OSullivan Esta prueba se realiza rutinariamente en mujeres embarazadas (aproximadamente a las 23 semanas de gestacin) como screening inicial para detectar diabticas gestacionales. Consiste en determinar la glucemia basal y 1 hora tras la ingestin, va oral, de 50g de glucosa disueltos en saborizante. Si la glucemia tras 1 hora supera los 140mg/dL es posible que exista diabetes gestacional aunque es imprescindible realizar una curva de glucemia para confirmar el diagnstico. 4. Determinacin de glucosa: mtodos. De todo lo anterior se deduce que para el diagnstico de la diabetes es necesario determinar la glucemia, pero cmo se cuantifica el nivel de glucosa en una muestra? Los mtodos para determinar la concentracin de glucosa se clasifican en dos grandes grupos: a) Mtodos basados en el poder reductor de los hidratos de carbono (reaccin de Benedict, mtodo de la o-toluidina) b) Mtodos enzimticos: son los ms utilizados, utilizan enzimas como reactivos (ej. glucosa oxidasa, hexoquinasa) a fin de aumentar la especificidad. Los dos mtodos que vamos a citar se pueden utilizar para determinar la glucosa en muestras de suero, orina y lquido cefalorraqudeo b.1.) Mtodo de la hexoquinasa: Es el mtodo de referencia y consiste en dos reacciones acopladas.

En la primera reaccin (especfica), catalizada por la enzima hexoquinasa, se fosforila la glucosa formndose glucosa 6-fosfato. La glucosa 6 -fosfato, en una reaccin posterior (reaccin indicadora), se transforma en 6-fosfogluconato producindose NADPH (1 mol por cada molcula de glucosa). La produccin de NADPH origina un aumento de absorbancia a 340nm. El incremento de absorbancia a esta longitud de onda ser directamente proporcional a la concentracin de glucosa.

b.2.) Mtodo de la glucosa oxidasa: Al igual que el anterior consiste en dos reacciones acopladas

En la primera reaccin (reaccin especfica), catalizada por la enzima glucosa oxidasa (GOD), se oxida la glucosa y se genera H2O2 . En la segunda reaccin (reaccin indicadora), la enzima peroxidasa (POD) cataliza la descomposicin del H 2 O2 lo que provoca oxidacin de un cromgeno que pasa de su forma reducida (incolora) a su forma oxidada (coloreada). La aparicin del cromgeno oxidado se evala mediante un espectrofotmetro y ser directamente proporcional a la concentracin de glucosa en la muestra. Este mtodo (GOD/POD) presenta como desventaja que muchos compuestos presentes en el suero u orina (bilirrubina, cido ascrbico y cido rico) pueden ser oxidados por el H2 O2 producido en la reaccin catalizada por la enzima GOD y por tanto interfieren en el resultado (se da un resultado superior al real). Tambin se puede cuantificar la concentracin de glucosa de la muestra utilizando slo la primera reaccin y evaluando la cantidad de oxgeno consumido mediante un electrodo de oxgeno (lo estudiaremos ms adelante). La cantidad de glucosa en la muestra es directamente proporcional a la cantidad de oxgeno consumido. Aspectos prcticos a considerar cuando se analiza la glucemia: 1. Centrifugar la sangre lo antes posible: los eritrocitos y leucocitos consumen glucosa, por tanto , si el contacto con las clulas es prolongado se pueden dar resultados falsamente bajos (a T ambiente puede incluso desaparecer al cabo de 6h). Actualmente, existen tubos con separador de suero que funciona como una interfase entre las clulas y el suero despus de la centrifugacin, haciendo que no sea necesario separar el suero en otro tubo. 2. Si no se van a analizar inmediatamente, se puede refrigerar la muestra o aadir un conservante ej. Fluoruro sdico. 3. La concentracin de glucosa en suero refrigerado es estable durante 3 das. 5. Otras pruebas: anlisis de protenas glicosiladas, pptido C, insulinemia y determinacin de cuerpos cetnicos, glucosuria. 5.1. Anlisis de protenas glicosiladas Las protenas que estn en contacto con concentraciones elevadas de glucosa durante un tiempo prolongado se glucosilan (unin covalente de glucosa a las protenas) generando protenas glicosiladas o glucosiladas.

La glucosilacin depende de la concentracin de glucosa y de la vida media de las protenas. Puesto que la hiperglucemia es caracterstica de la diabetes, la determinacin de protenas glucosiladas se utiliza como indicador restrospectivo del control de la diabetes. En el laboratorio clnico se suelen analizar la glucohemoglobina y fructosamina. 5.1.1. Glucohemoglobina La glucohemoglobina es una fracci n de hemoglobina A (principalmente A1C ) unida, de forma irreversible a la glucosa, que representa, en condiciones fisiolgicas un 6-8% de la hemoglobina total. La vida media de la hemoglobina es de aproximadamente 2 meses, por tanto su cuantificacin nos puede indicar el cumplimiento del tratamiento o el grado de control de la diabetes durante ese perodo de tiempo (la elevacin de glucohemoglobina coincide con elevaciones de la glucemia en los dos meses anteriores). Es una prueba muy especfica pero que no se utiliza para el diagnstico puesto que es poco sensible. Los valores de personas sanas se solapan con los de aquellos que tienen intolerancia a la glucosa y los de stos con los de los pacientes diabticos. En general valores superiores al 12% indican un control deficiente de la diabetes. La determinacin se suele hacer con bemolizado de eritrocitos, para ello: 1. La sangre se recoge con EDTA como anticoagulante. 2. Se centrifuga (ej. 5 min a 3000 rpm) 3. El sedimento (pellet) se resuspende en solucin salina (ClNa 0.9%) y se vuelve a centrifugar. Este paso se repite varias veces (se lava el sedimento). 4. Se lisan los eritrocitos ej. se aade agua destilada y cloroformo se agita enrgicamente y se centrifuga de nuevo. El sobrenadante es el bemolizado de eritrocitos. Los mtodos de determinacin ms utilizados son: 1. Mtodos cromatogrficos (HPLC, cromatografa de intercambio inico, cromatografa de afinidad). Ver el apndice del tema 2. Mtodos inmunolgicos con lectura por turbidimetra (se estudiar en el tema siguiente). 3. Electroforesis (se estudiar en el tema siguiente). 5.1.2. Fructosamina Las protenas plasmticas tambin se glican y, puesto que la vida media de la albmina y protenas plasmticas oscila entre 17 y 30 das, su determinacin nos informa de la tasa de glucemia del paciente en las 2-3 semanas previas a la determinacin (perodo ms corto que la glucohemoglobina). Puesto que la albmina es, con diferencia, la protena srica ms abundante realmente se evala la albmina glucosilada.

Mtodo de determinacin: mtodo colorimtrico (espectrofotomtrico) basado en la reduccin del colorante nitroazul de tetrazolio (por accin de la fructosamina). Fructosamina + nitroazul de tetrazolio 5.2. Pptido C reduccin del colorante
Lectura en espectrofotmetro (530nm)

El pptido C es el resto de cadena polipeptdica que se escinde de la proinsulina al convertirse en insulina. Su aparicin en sangre nos indica que las clulas secretoras de insulina son funcionales. Puesto que los preparados comerciales de insulina no llevan pptido C, permite conocer por ej. si una hiperinsulinemia es de origen exgeno o endgeno . Adems, es frecuente que los pacientes diabticos desarrollen anticuerpos antiinsulnicos que interfieren en los ensayos inmunolgicos para la cuantificacin de insulina, por tanto, se utiliza como alternativa al anlisis de insulina para valorar el funcionamiento de las clulas . Mtodo de determinacin: Inmunoanlisis (lo adelante en el tema) ej. RIA (radioinmunoanlisis). estudiaremos ms

5.3. Insulinemia La determinacin de insulina no suele hacerse de forma habitual puesto que su presencia no asegura que sta sea funcional. Sin embargo, s es til en las hipoglucemias (ej. insulinemia elevada cuando la glucemia es baja puede indicar la existencia de un tumor productor de insulina). Mtodo de determinacin: Inmunoanlisis (lo estudiaremos adelante en el tema) ej. RIA o EIA (enzimoinmunoanlisis). ms

5.4. Determinacin de cuerpos cetnicos En la diabetes, la deficiencia de glucosa en las clulas, activa el catabolismo de los cidos grasos generando mucha acetilCoA. El exceso de acetilCoA da lugar a la produccin de cuerpos cetnicos (cetognesis): acetoactico, y sus derivados acetona y -hidroxibutirato que aparecern en sangre (cetonemia) y orina (cetonuria).
Cetonemia Diabetes Liplisis Acidos grasos Cetognesis Cetonuria

Es una prueba complementaria que corrobora el diagnstico de la diabetes tipo I. Determinacin: Aunque existen otros mtodos (ej. enzimticos), el ms empleado es su determinacin colorimtrica mediante la prueba del nitrofrerricianuro de

sodio. Este procedimiento no detecta -hidroxibutirato y es mucho menos sensible para la acetona que para acetoactico. El fundamento de este mtodo consiste la aparicin de un color rosado o purpreo al reaccionar, fundamentalmente el acetoactico, con ferricianuro de sodio en medio alcalino. La prueba se puede llevar a cabo con una tira reactiva o una tableta slida. Muestra: suero, plasma u orina. Precauciones: Las orinas coloreadas o las muestras hemolizadas pueden dar falsos negativos. La contaminacin bacteriana de la orina aumenta la desaparicin. La acetona es voltil por tanto, la muestra debe refrigerarse. 5.5. Glucosuria La glucosa se filtra en el glomrulo pero es reabsorbida en los tmulos renales con lo que vuelve de nuevo a la sangre y no debe aparecer en orina. Sin embargo, si la glucemia es superior a 160mg/dL se supera el umbral renal para la glucosa y sta aparece en la orina (glucosuria). La glucosuria tiene escaso valor puesto que es poco especfica ej. tambin aparece en patologas cardiacas o renales Determinacin: se utiliza el mtodo GOD/POD en tiras reactivas.

Apndice CROMATOGRAFA La cromatografa agrupa un importante grupo de tcnicas que permiten separar componentes de mezclas complejas. En todas las separaciones cromatogrficas la muestra que se desea separar se disuelve en la "fase mvil" que normalmente est formada por un gas o un lquido. La fase mvil se hace pasar a travs de una "una fase estacionaria", la cual se mantiene fija en una columna o en una superficie slida que acta como soporte. NOTA: Fase mvil: aquella en la cual estn los solutos que se van a separar Fase estacionaria: lecho a travs del que fluye la fase mvil Los componentes fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase mvil. Los componentes con baja afinidad por la fase estacionaria se desplazan con ms rapidez al ser arrastrados por la fase mvil. Una vez que todos los componentes han atravesado la fase estacionaria, salen separados unos de otros lo que permite utilizar las fracciones en procesos de identificacin o cuantificacin. FASES DEL PROCESO CROMATOGRFICO 1. Preparacin de la fase estacionaria 2. Introduccin de la muestra vehiculada por una fase mvil 3. Paso a travs de una fase estacionaria donde se producen las interacciones que ms tarde llevarn a su separacin 4. Elucin (segn en que tcnica) 5. Lectura de los resultados para obtener el cromatograma MECANISMOS IMPLICADOS 1. Adsorcin 2. Reparto 3. Intercambio inico 4. Exclusin molecular 5. Afinidad Cromatografa de adsorcin: poco usada en clnica Cromatografia de reparto: basada en las diferencias de solubilidad de las distintos analitos en dos fases inmiscibles Ejemplo: cromatografa en capa fina (ver la figura): Sobre un cristal u otra superficie se deposita una suspensin uniforme de partculas (ej gel de slice) que ms tarde se seca y activa. En dicha placa se aplica la muestra y se deja secar. Se introduce la placa en una cmara en cuyo fondo hay un disolvente que va subiendo por capilaridad y arrastrar a los componentes de la mezcla en funcin de la solubilidad de los mismos en la fase mvil. Se deja hasta que el frente llegue al final

 Los resultados se visualizan por ejemplo por tincin con colorantes. Aparecern unas manchas que se pueden identificar mediante el uso de patrones o cuantificar mediante densitometra o raspado de las manchas, disolucin y determinacin espectrofotomtrica. Cromatografia de intercambio inico : basada en un mecanismo

electrosttico por atraccin entre iones de distinta carga. En el laboratorio clnico se utiliza en analizadores de aminocidos, separacin de Hb, isoenzimas y esteroides.

Cromatografia de exclusin molecular: basadas en la diferencia de tamao de las distintas sustancias a separar. En clnica se utiliza para purificaciones ej de hormonas.

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Cromatografia de afinidad: basada en mecanismos que implican interacciones especficas entre dos molculas como uniones enzimasustrato, hormona-receptor, antgeno-anticuerpo.

HPLC o cromatografa lquida de alta presin (resolucin) : es un sistema de cromatografa en columna (la fase estacionaria se deposita en una columna) con un sistema inyector de la muestra y un impulsor de la fase mvil que acelera el proceso Preguntas de revisin a) Espectrofotometra

1. Qu expresin matemtica define la relacin entre la concentracin de una sustancia y su absorbancia?

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2. Para trabajar en la zona UV por debajo de 320 nm se precisan cubetas de: a) Vidrio b) Poliestireno c) Polietileno d) Cuarzo e) Plstico 3. Un blanco de suero se emplea: a) Cuando tenemos prisa b) Cuando queremos eliminar interferencias por el reactivo c) Cuando queremos eliminar interferencias por el suero d) Cuando queremos eliminar interferencias de la fuente de luz e) Cuando hay que hacer una curva de calibracin 4. Un blanco de reactivo se emplea: a) Cuando tenemos prisa b) Cuando queremos eliminar interferencias por el reactivo c) Cuando queremos eliminar interferencias por el suero d) Cuando queremos eliminar interferencias de la fuente de luz e) Cuando hay que hacer una curva de calibracin 5. Desviaciones de la ley de Beer (desviaciones en la relacin lineal entre concentracin de una solucin y absorbancia) se producen cuando: a) Se miden concentraciones muy elevadas de cromgeno b) La radiacin incidente no es monocromtica c) La luz es transmitida por otros mecanismos d) La cubeta est sucia e) Todos los anteriores 6. La curva de calibracin: a) Describe la relacin entre transmitancia y absorbancia b) Describe la relacin entre absorbancia y concentracin c) Describe la relacin absorbancia y velocidad de reaccin d) b y c son correctas 7. La longitud de onda a la que se mide una reaccin es: a) Aquella a la que el cromgeno tienen menos absorcin b) Aquella a la que el cromgeno tiene el mximo de absorcin. c) Aquella a la que la lmpara da ms luz. d) Aquella a la que se lee ms deprisa 8. Construya una curva de calibracin para una tcnica de determinacin de glucosa en suero con los siguientes datos: A Concentracin (mg/dl) 0.05 50 0.1 100 0.150 150 0.250 250 0.500 500 0.600 800 A partir de ella: a) Calcule la concentracin de glucosa en un suero que da una lectura de 0.125 b)Qu hara con un suero que diera una lectura de 0.7? Interpolara la lectura sin ms o lo diluiras?

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c) Cul se considerara el limite de linealidad con arreglo a esta curva de calibracin? Por qu? 9. Vamos a hacer una determinacin de glucosa en sangre, y para ello recurrimos al empleo de una solucin estndar de glucosa de concentracin 100mg/dl. Una vez llevada a cabo la lectura obtenemos los siguientes datos: Absorbancia del estndar: 0,2 Absobancia del problema-1: 0,4 Absorbancia del problema-2: 0,8 Absorbancia del problema-3: 1,5 a) Con estos datos, calcular las concentraciones que tendran los tres sueros problema. b) Sabiendo que el lmite de linealidad de la tcnica es de 600mg/dl habra que diluir alguna muestra y repetir la determinacin? Cules diluira y qu factores de dilucin empleara? Por qu? c) Diluimos la muestra nmero tres al 1/5, y repetimos la determinacin. Ahora, la lectura que obtenemos es de 0,320 Cul ser la concentracin real de glucosa en ese suero? b) Otros contenidos tericos del tema 1. Al hacer una determinacin de glucosa es conveniente separar la clulas lo antes posible por qu? qu tipo de error cometeramos si no lo hiciramos? 2. Un paciente tiene una glucemia basal de 120mg/dl Qu prueba llevara a cabo para confirmar una posible diabetes? Cmo realizara dicha prueba? 3. Cules son los dos mtodos enzimticos ms utilizados para la determinacin de glucosa en una muestra de suero? 4. Qu utilidad tiene la cuantificacin de protenas glicosiladas? 5. Cules son las dos determinaciones de protenas glicosiladas ms utilizadas en el laboratorio clnico? 6. Cite algn mtodo para analizar hemoglobina glicosilada 7. En los mtodos anteriores Qu se utiliza como muestra? a) Suero b) Plasma c) Sangre completa d) Hemolizado de eritrocitos 8. Cmo se llama la presencia de cuerpos cetnicos en orina? Cmo se determinan habitualmente? a) Por cromatografa de afinidad b) Mediante espectrofotometra c) Mediante electroforesis d) Mediante inmunodifusin 9. Hemos determinado la glucosa en una muestra de orina recibida en el laboratorio por medio de dos tcnicas: a) mtodo de Benedict b) mtodo GOD/POD. Los resultados obtenidos han sido: a) 200 mg/dL, b) 150mg/dL. A qu puede ser debida la disparidad de ambos valores. 10. Qu determinaciones haras a un paciente que llega al laboratorio para controlarse? 11. Qu determinaciones haras a un paciente para diagnosticar una diabetes?

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12. A un paciente le han solicitado una determinacin de hemoglobina glicada para averiguar si tiene diabetes Es correcta la peticin? Por qu? 13. A las cinco de la tarde llega una muestra de sangre al laboratorio que se extrajo a las ocho de la maana, para determinar la glucosa, y que se haba dejado olvidada encima de la mesa desde entonces. Qu debemos hacer? Por qu? 14. Un paciente viene al laboratorio para hacerse un anlisis de glucosa, y nos explica que ha desayunado hace 20 minutos Qu debemos hacer? Por qu?

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