Cuantificacin de azcares reductores por el mtodo de DNS

Este procedimiento se fundamenta en la reaccin de los grupos reductores de los azcares con el reactivo oxidante cido dinitrosaliclico (DNS). El reactivo consiste en una disolucin formada por los siguientes compuestos: cido dinitrosaliclico (cido 2-hidroxi-3,5-dinitrobenzico), que acta como oxidante; Sal de Rochelle (tartrato sdico-potsico), que impide la disolucin de oxgeno en el reactivo y hidrxido sdico, que aporta el medio requerido para que se produzca la reaccin redox. De esta forma, el cido 2-hidroxi-3,5-dinitrobenzico se reduce, en presencia del grupo reductor de la glucosa, formando el cido 3-amino-5-nitrosaliclico, mientras que el grupo aldehdo reductor se oxida, para formar un grupo carboxlico. En este mtodo analtico el DNS est en exceso frente a los grupos reductores y en todas las muestras se adiciona la misma cantidad, de tal forma que mayores concentraciones de azcares reductores provocan una mayor coloracin de la muestra. Estas diferencias de coloracin pueden determinarse por espectrofotometra visible, a la longitud de onda de mxima absorbancia de 540 nm. Preparacin del reactivo del cido 3,5 dinitrosaliclico en caliente Se pesan 5 g de cido 3,5 dinitrosaliclico (DNS), 150 g de Tartrato de Na-K y 8 g de NaOH. Se disuelve el NaOH en 200 mL de agua destilada y se aade en agitacin el Tartrato de Na-K lentamente. Se completa con agua destilada hasta 400 mL y se comienza a aadir lentamente el cido 3,5 dinitrosaliclico. Se deja en agitacin toda la noche, se enrasa a 500 mL y se filtra. Se guarda en frasco color ambar, bajo refrigeracin. La preparacin del reactivo DNS en caliente se hace con agitacin magntica y calentamiento (Bello et al., 2006).

Preparacin de solucin Buffer Mcilvaine, 0.1 M, pH 5 Pesar 2.548 g de C6H8O7.H2O (cido ctrico monohidratado) y 3.656 g de Na 2HPO4 (Fosfato de sodio dibsico) y enrrasar a 250 mL con agua destilada con agitacin constante hasta disolucin total. Solucin patrn de Glucosa: Preparar una solucin de glucosa con una concentracin de 1 g/L, para la cual se disuelve 0.1 g de glucosa en 100 mL de solucin tampn Mcllveine, pH 5 (tabla a).
Tabla a. Curva patrn. Volumen de solucin patrn y agua destilada agregados a cada tubo, as como la concentracin de cada uno.

Tubo 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

mL de solucin patrn de glucosa 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

mL de agua destilada 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0

Volumen total 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Concentracin de glucosa (mg/L)* 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

* (0.1 mL de solucin patrn) (1000 mg/L <1 g/L>) = 100 mg/L * (0.2 mL de solucin patrn) (1000 mg/L) = 200 mg/L * (0.3)(1000)= 300 mg/L

Curva patrn de glucosa A partir de la solucin patrn de glucosa y agua destilada se preparan 10 tubos con diferentes concentraciones como se indica en la tabla a. Realizar por triplicado. A cada uno de los tubos se le agrega 1 mL del reactivo DNS y se agita en vortex. Calentar en agua hirviendo por 5 minutos. Dejar enfriar y agregar 8 mL de agua destilada. Utilizar como blanco una solucin de agua destilada ms el reactivo DNS*. Leer absorbancia de cada tubo a 540 nm. 2

*Se prepara un el blanco para lectura en el espectrofotmetro, en un tubo se agrega 1 mL de agua destilada y 1 mL de DNS, se introduce en agua hirviendo 5 min, se agregan 8mL de agua destilada, se lee en el espectrofotmetro y se registra la absorbancia a la longitud de onda de 540 nm.

Preparacin de las muestras

La tcnica de DNS cuantifica como mximo una concentracin de azcar de 1 mg/mL, por lo tanto, la solucin estndar deber tener esa concentracin.

Es importante mencionar, que si se tiene la sospecha de que la muestra problema posee una concentracin mayor a 1 mg/mL, ser necesario realizar una dilucin de la misma, previa a la determinacin, para asegurar que las lecturas podrn ser interpoladas en la curva patrn.

1. De las muestras se toma 1 mL (se le agrega 27 mL de agua destilada <con este volumen se obtiene una dilucin de 1000 veces> dilucin al dcimo) Ejemplo: a. 1 mL de muestra se agrega en 9 mL de agua (dilucin 10 veces) b. 1 mL de dilucin a se agrega en 9 mL de agua (dilucin 100 veces) c. 1 mL de dilucin b se agrega en 9 mL de agua (dilucin 1000 veces) 2. Posteriormente se prosigue la metodologa igual que los estndares. 3. Los tubos debern leerse a 540 nm, calibrando con el blanco, el cual contiene todos los reactivos, excepto el problema. Es decir, contiene 1 mL de agua destilada y 1 mL de DNS.

Bello, G. D., Carrera, B. E., y Daz, M. Y. 2006. Determinacin de azcares reductores totales en jugos mezclados de caa de azcar utilizando el mtodo del cido 3,5 dinitrosaliclico. ICIDCA. Sobre los Derivados de la Caa de Azcar. 2:45-50.