PEMBUATAN PREPARAT DAUN NUSA INDAH (Mussaenda frondosa) Nita Listiyani (3425111402) & Siska Handayani (3425111429) *Corresponding

author: Jurusan Biologi FMIPA Universitas Negeri Jakarta (UNJ). Jl. Pemuda No. 10 Rawamangun, Jakarta Timur. Indonesia. Tel.: +62 21 4894909 E-mail address: biologi2011@yahoo.com

(Disusun untuk Memenuhi Tugas Mata Kuliah Mikroteknik)

BIOLOGI REGULER 2011 FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA

BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Mikroteknik merupakan teknik pembuatan sediaan atau preparat secara mikroskopis, tentunya pendekatan teoritis tidaklah memadai untuk memahami secara menyeluruh mengenai mikroteknik, karena lebih menekankan pemahaman pada wilayah aplikatifnya meskipun pada dasarnya landasan teoritis juga diperlukan dalam rangka memberikan beberapa petunjuk yang harus dilalui agar proses pembuatan sediaan sesuai dengan prosedural kerja dan alasan penggunaan ataupun pemilihan bahan yang akan digunakan dalam pembuatan sediaan mikroskopis. Beberapa metode yang dikenal dalam pembuatan preparat tumbuhan, yaitu metode Whole mount, sediaan irisan, sediaan uraian, sediaan rentang, sediaan gosok, sediaan supravital, sediaan remasan, dan metode paraffin. Pada praktikum kali ini menggunakan daun Mussaenda frondosa dengan metode paraffin, yaitu cara pembuatan preparat permanen dengan menggunakan paraffin sebagai

media embedding dengan tebal irisan kurang lebih mencapai 6 m-8 m. Preparat awetan merupakan salah satu alat untuk mempermudah dalam melakukan pengamatan pada beberapa mata kuliah biologi, salah satunya Anatomi Tumbuhan. Namun, preparat yang tersedia kurang memadai. Oleh karena itu, pada praktikum mikrotek ini akan dibuat preparat awetan jaringan tumbuhan untuk mmempermudah mahasiswa mengamati dan melihat preparat.

B. Perumusan Masalah Bagaimanakah cara pembuatan preparat daun Mussaenda frondosa?

C. Tujuan Penelitian Tujuan penelitian ini adalah untuk menyediakan preparat awetan jaringan tumbuhan bagi keperluan praktikum di Jurusan Biologi.

D. Manfaat Penelitian 1. Menyediakan preparat tumbuhan yang belum ada di laboratorium Jurusan Biologi Universitas Negeri Jakarta. 2. Menambah pengetahuan tentang pembuatan preparat yang baik dan benar. 3. Menambah pengetahuan tentang anatomi tumbuhan.

BAB II KERANGKA TEORI DAN PERUMUSAN HIPOTESIS

A. Deskripsi Teoritik 1. Mikroteknik Mikroteknik atau teknik histologi merupakan ilmu atau seni mempersiapkan organ, jaringan atau bagian jaringan untuk dapat diamati dan ditelaah. Penelaahan umumnya dilakukan dengan bantuan mikroskop, karena struktur jaringan secara terperinci pada galibnya terlalu kecil untuk dapat dilihat dengan mata telanjang. Ruang lingkup yang mencakup materi mikroteknik dapat diperoleh dari sejumlah definisi dan peristilahan yang bisa dipakai, hanya saja sebaiknya kita mencamkan dalam pikiran kita bahwa suatu spesimen mikroteknik dapat merupakan sebagian atau seluruhan dari struktur yang ditetapkan. Selain dilekapkan dengan kaca preparat, spesimen tadi umumnya dilindungi dengan kaca penutup, yaitu sepotong kaca yang sangat tipis ataupun plastik yang tembus pandang yang direkatkan diatas spesimen tersebut (Gunarso, 1989). Sedangkan menurut Amar (2008), Mikroteknik adalah ilmu yang akan mempelajari metode/ prosedur pembuatan preparat mikroskopik.

Mikroteknik merupakan teknik pembuatan sediaan atau preparat secara mikroskopis, tentunya pendekatan teoritis tidaklah memadai untuk memahami secara menyeluruh mengenai Mikroteknik, sebab yang namanya teknik lebih menekankan pemahaman pada wilayah aplikatifnya meskipun pada dasarnya landasan teoritis juga diperlukan dalam rangka memberikan beberapa petunjuk yang harus dilalui agar proses pembuatan sediaan sesuai dengan prosedural kerja dan alasan penggunaan ataupun pemilihan bahan yang akan digunakan dalam pembuatan sediaan Mikroskopis (Zaifbio, 2010) Ada beberapa metode untuk membuat suatu preparat dalam mikroteknik, diantaranya, yaitu: a. Metode whole mounth Menurut (Joyner, 2008 dalam zaifbio 2010) Whole mounth merupakan metode pembuatan preparat yang nantinya akan diamati dengan mikroskop tanpa didahului adanya proses pemotongan. Jadi pada metode ini, preparat yang diamati

adalah preparat yang utuh baik itu berupa sel, jaringan, organ maupun individu. Metode ini mempunyai kelebihan dan kelemahan masing-masing. Kelebihan metode ini adalah dapat mengamati seluruh bagian tanaman dengan jelas tiap bagian-bagiannya. Sedangkan kelemahannya adalah metode ini hanya bisa dilakukan pada tanaman dengan ukuran yang kecil saja tidak bisa tanaman yang besar sehingga metode ini perlu terus dikembangkan dengan melakukan bebagai percobaan (Gunarso, 1989). b. Metoda Sediaan Irisan (Sectioning) Cara pengerjaan melalui irisan atau sayatan ini dianggap sebagai teknik rutin ataupun teknik bagi penyiapan spesimen histologi amaupun patologi. Tebal tipisnya sayatan bergantung pada pengalaman serta tujuan penyiapan spesimen. Tebal sayatan yang umum berkisar antara 6-15 mikron (1 mikron = 0,001 mm). Ukura sayatan juga sangat bervariasi, mulai dari saytaan pembuluh darah yang sangat kecil hingga sayatan otak. c. Metoda Sediaan Uraian (Teasing Preparations) Untuk dapat memisahkan komponen suatu jenis jaringan maupun organ tisu atau jaringan diuraikan dengan menggunakan jarum penguraian. Dengan demikian pengertian teasng ini berarti juga pembedahan dalam skala kecil. Tingkatnya pada pembedahan biasa dan pembedahan mikro yang dilakukan dengan menggunakan jarum pengurai. Teasing ini dilakukan pada jenis sediaan segar yang telah difiksasi dan mengalami pewarnaan. Secara umum jenis tisu yang bisa ditelaah melalui metode ulas ini adalah darah, limfa, cairan sum-sum tulang belakang, semen janan, sediaan air seni, serta beberapa lainnya. (Gunarso, 1989). d. Metoda Sediaan Rentang Pada metoda ini preparat belum difiksasi, diperlakukan sedemikian rupa sehingga disamping jelas juga mendekati keadaan aslinya dengan melalui perentangan. Jenis bahan siapan yang uum direntang saat difiksasi adalah otot, syaraf, jenis jaringan tipis (selaput yang membungkus jantung, hati dan lain-lain) (Gunarso, 1989). e. Metode Sediaan Gosok Jenis jaringan yang keras sifatnya, seperti tulang, gigi, kuku dan beberapa lainnya

mungkin sekali sangat sukar untuk dibuat sediaan sayatan (kecuali bila mengalami berbagai perlakuan khusus sebelumnya). Untuk mengatasi hal diatas tadi, maka umum juga dibuat sediaan dengan metoda gosok. Tulang misalkan tulang paha, terlebih dahulu dipotong-potong hingga ukuran beberapa mili hingga 1 2 cm. Potongan tersebut kemudian digosok pada batu hingga cukup tipis untuk dapat diamati pada mikroskop (Gunarso, 1989). f. Metode Sediaan Supravital Selain jenis-jenis metoda yang dimanfaatkan materi yang mengalami matian dan fiksasi. Untuk pengamatan sel-sel darah yang masih hidup umumnya digunakan zat warna vital seperti Yanus green atau Neutral red, karena sel darah mempunyai kemampuan untuk menghisap zat warna pada konsentrasi yang sesuai. Bila kedua zat warna tersebut dipakai secara bersama-sama maka memungkinkan kita untuk mengamati mitokondria. Hanya saja akan terjadi perubahan yang sangat cepat pada sel, karena sel dapat mati oleh kedua warna tadi secara bersamaan (Gunarso, 1989). g. Metode Sediaan Remasan (Squash) Metode remasan banyak dikakukan untuk penyaiapan pengamatan kromosom baik hewan maupun tumbuhan. Dengan metoda ini bahan diremas atau dihancurkan sehingga masing-masing sel akan terlepas yang memudahkan pengamatan selanjutnya. Jadi tujuan peremasan ini bukan berarti menghancurkan sel-selnya, tapi masing-masing sel bebas terlepas satu sama lain dengan tetap dipertahankan bentuk aslinya. h. Metode Paraffin Metode parafin termasuk metode irisan yang merupakan metode rutin atau standar. Pengamatan secara mikroskopis dari suatu jaringan normal sifatnya maupun yang mengidap suatu penyakit (patologis) akan lebih baik hasilnya dilakukan dari preparat jaringan yang telah dipersiapkan dengan baik, telah dillakukan penyayatan cukup tipis serta diberi pewarnaan yang sesuai, sehingga berbagai elemen yang diteliti lebih mudah untuk diamati (Gunarso, 1989). Adapun tahapan pembuatan preparat metode parafin adalah sebagai berikut :

1. Sampling Merupakan proses awal dalam metode parafin. Pada sampling ini diambil beberapa organ sesuai keperluan. Jika organ terlalu besar maka dipotongpotong terlebih dahulu.

Menurut Eching (2009) Pengambilan jaringan : a) Harus secepatnya di ambil terutama pada kadafer b) Pemotongan harus dengan pisau yang tajam c) Ukuran potongan sebaiknya 1 cm d) Secepatnya difiksasi

Tujuannya untuk mencegah terjadinya perubahan-perubahan pasca mati dan perubahan struktur lain yang dapat menyesatkan dalam pengamatan.

2. Fiksasi Tujuan utama fiksasi adalah memberikan perlakuan tertentu terhadap elemen-lemen jaringan, terutama inti sel atau nukleinya, sehingga dapat diwetkan dalam kondisis yang sedikit banyak mendekati keadaan aslinya. Selain itu, fiksasi juga mencegah terjadinya kerusakan jaringan yang disebabakan oleh mikroorganisme maupun perusakan oleh enzim yang terkandung dalam jaringan itu sendiri, yang dikenal dengan autolisis. Dengan kata lain fiksasi bertujuan : Mematikan (menghentikan proses-proses metabolisme) jaringan dengan cepat sehingga keadaannya sedikit banyak mendekati keadaan aslinya. Mencegah autolysis Menaikkan daya pewarnaan karena adanya bahan-bahan keras yang merupakan komponen cairan fiksatif. Mencegah mengkerutnya globula-globula protein sel

Mempertinggi sifat reaktif gugusan-gugusan karboksilat, amoni primer,sulfihidril

Membuat sel-sel lebih kuat/keras

3. Dehidrasi Dehidrasi adalah proses mengeluarkan air dari dalam jaringan tisu dengan menggunakan bahan-bahan kimia tertentu. Dehidrasi merupaka langkah penting yang memerlukan perlakuan yang prosesnya tidak terputus-putus. Kesalahan yang terjadi akan mengakibatkan terhalangnya proses penamanan dalam parafin yang merupakan proses lanjutan setelah proses dehidrasi tersebut. Sehubungan dengan hal itu maka dehidran yang kita gunakan hedaklah memenuhi beberapa persyaratan sebagai berikut : Harus mampu menarik air dari tisu menggantikan kedudukan air tersebut Dehidran itu sendiri dapat digantikan kedudukannya oleh meduium penjernih Tidak merusak danmengganggu tisu yang telah difiksasi sebelumnya sehingga misalnya tisu akan menjadi terlalu lunakkembali ataupun malah memperkeras tisu tersebut menjadi rapuh Dehidran yang paling umum dalam mikroteknik bagi metode parafin adalah alkohol. Dalam penggunaannya dipakai serangkaian alkohol dengan konsentrasi berbeda, dimulai dengan alkohol 35% - 50% - 70% - 80% - 95% - 100%. Alkohol 70% umum dikenal sebagai Stopping point dengan pengertian tisu dapat disimpan agak lama (biasanya dibiarkan bermalam untuk dilanjutkan pada keesokan harinya maupun hari-hari berikutnya).

4. Penjernihan (Clearing) Tujuan utama proses penjernihan adalah menggatiakn tempat alkohol dalam tisu yang telah mengalami proses dehidrasi dengan suatu solven atau

medium penjernih menjelang proses penanaman sebelum dilakukan proses penyayatan. Setelah kita menggunakan xylol atau benzene pada proses penjernihan ini, pada umumnya tisu akan menjadi transparan : hal ini yang menjadi alasan bahwa hal ini dikenal sebagai proses penjernihan. Lama tisu dalam medium penjernih bergantung pada : Ketebalan serta tingkat kepadatan tisu Jenis reagen yang dipakai Untuk jenis tisu yang melalui proses dehidrasi dengan sempurna, maka proses penjernihan (xylol, benzene) berlangsung selama setengah hingga tiga jam. Bila tisu dibiarkan cukup lama dalam medium penjernih ini, maka besar kemungkinan tisu akan menjadi keras dan rapuh yang tentu menyukarkan dalam penyayatan.

5. Infiltrasi Yang dimaksud dengan infiltrasi yaitu usaha menyususpkan media penanaman kedalam tisu dengan jalan menggantikan kedudukan dehidran dan bahan penjernih. Media penamanam/embedding yang umum dipakai adalah parafin. Parafin dibedakan berdasarkan titik didihnya, jadi ada yang bertitik didih 48C, 54C, 56C dan 58C. Utuk jenis tisu hewan yang biasanya digunakan parafin bertitik didih 58C. Sebelum jaringan masuk kedalam parafin murni maka tisu terlebih dahulu berada dalam xylol : arafin dengan perbandingan 1:3, 1:1, 1:3 da selanjutnya masuk kedalam parafin murni.

6. Penanaman (Embedding) Penanaman merupakan proses memasukkan atau menanam tisu kedalam blok-blok parafin (cetakan) sehingga memudahkan pada proses penyayatan dengan bantuan mikrotom. Beberapa teknik percetakan tersebut menggunakan : Cetakan terbuat dari timah atau logam berat lainnya yang berbentuk L dialas kaca dengan cara ini satu persatu tisu akan dapat dicetak

Cetakan terbuat dari kertas. Sebaiknya disiapkan dari bahan kertas karton atau manila

Cetakan berbentuk bak yang terbuat dari aluminium, dengan cara ini tisu dapat ditanamkan sekaligus

7. Pemotongan (Section) Proses penyayatan mencakup berbagai cara akan menghasilkan sayatan tipis tisu baik yang telah mengalami proses penanaman maupun tidak. Dalam mikroteknik, cara lazim digunakan adalah penyayatan dengan menggunakan mikrotom dengan berbagai peralatan pembantu seperti pisau mikrotom, kuas bulu, spatula, gunting serta pensil penoreh.. Mikrotom merupakan alat khusus yang diracang untuk menyayat material atau tisu-tisu dengan sayatan-sayatan yang cukup tipis untuk penelaahan dengan mikroskop. Dalam metode paraffin, umumnya digunakan paraffin untuk menghasilkan pita paraffin. Untuk memperoleh hasil sayatan yang baik dibutuhkan beberapa persayaratan sebagai berikut : Tisu yang telah dipersiapkan dengan sempurna Pisau yang cukup tajam Pemilihan jenis mikrotom yang tepat Operator yang cukup terampil dan terlatih

8.

Afiksasi (afixing) Afiksasi atau proses perlekatan adalah proses perlekatan atau penetapan sayatan tisu yang pada kaca preparat dengan bantuan media prekat tertentu. Pada proses ini diperlukan berbagai persiapan antara lain : a. Kaca preparat bersih b. Media prekat c. Akuades d. Meja pemanas/hot plate e. Peralata berupa pinset, skapel, gunting, kuas dan lain sebagainya. Dari beberapa jenis formula media prekat yang umum digunakan dalam kerja

rutin adalah media merekat albumin. Mula-mula putih telur dan gliserin dikock hingga rata, busa yang terjadi dibuang dan bila perlu dilakukan penyaringan, kemudian dibubuhkan kristal-kristal thymol yang berfungsi sebagai pencegah berkembangnya jamur dan bakteri serta beberapa tetes akuades sebagai pengencer.

9. Pewarnaan (staining) Pewarnaan bertujuan agar dapat mempertajam atau memperjelas berbagai elemen tisu, terutama sel-selnya, sehingga dapat dibedakan dan ditelaah dengan mikroskop. Motoda pewarnaan yang sering dilakukan dalam pembuata preparat metode parafin adalah metoda pewarnaan Hematoxilin-eosin. Seperti merupakan peraturan, hamatoxillin digunakan terlebih dahulu dan setelah melalui proses diferensiasi, maka barulah eosin digunakan. Pertukaran tempat keduanya tampaknya akan menimbulkan kesukaran, karena pewarna hematoxilin akan mewarnai lebih cepat dari pada pewarna paduannya yang umumnya berperan sebagai counterstain yang intensitas pewarnaanya dapat diatur tanpa mempengaruhi pewarnaan hematoxilin.

10. Mounting Merupakan proses akhir dari pembuatan preparat metoda parafin. Sebelum ditutup secara permanen maka sebaiknya jaringan dilihat pada mikroskop apakah jaringan tersebut sudah dapat diamati dengan baik atau tidak. Pada mounting tutup dengan canada balsem dan gelas penutup. Hindari terbentuk gelembung udara kemudian beri label dan diamati kembali diwabah mikroskop.

2. Tanaman Nusa Indah (Mussaenda frondosa) Bunga nusa indah memiliki batang yang tingginya mencapai sekitar 2-5 meter. Berbentuk bulat, memiliki percabangan yanga rapat, permukaan batang yang kasar, berwarna coklat. Bunga nusa indah juga mempunyai daun tunggal, berhadapan, bertangkai bulat, berbulu, panjang panjangnya sekitar 1-3 cm. Berwarna

hijau kemerahan,helaian daun bentuk oval atau lonjong, ujung dan pangkal runcing, tepi rata, pertulangan menyirip, panjang 8-15 cm, lebar 4-8 cm, permukaan berbulu. Mempunyai susunan bunga majemuk, di ujung cabang atau batang, bentuk malai, kelopak semu bentuk oval, ukuran seperti daun, dasar mahkota bentuk tabung, ujung lepas, 4 helai, warna oranye, permukaan berbulu. Mempunyai biji tunggang, berwarna kuning kecoklatan, dan bijinya berbentuk lanset, kecil, berwarna coklat. Akar dari bunga nusa indah adalah berakar serabut dan berwarna putih kekuningan. Adapun klasifikasi dari tumbuhan Mussaenda sebagai berikut: Kingdom : Plantea Divisi Kelas Ordo Family Genus Spesies : Spermatophyta : Dicotyledoneae : Rubiales : Rubiaceae : Mussaenda : Mussaenda frondosa

Bunga nusa indah (Mussaenda frondosa) dapat dijumpai di halaman muka rumah yang fungsinya mempercantik tampilan rumah tersebut. Namun, tanaman hias yang terkadang bisa tumbuh liar di semak dan lereng bukit ini ternyata memiliki khasiat sebagai obat. Dapat tumbuh pada daerah dataran rendah hingga dataran tinggi atau pada ketinggian 1 meter hingga 1.700 meter di atas permukaan laut. Dapat berbunga pada musim panas dan pemanenan dapat dilakukan sepanjang tahun.

Nilai komersial dari bunga nusa indah belum dapat diketahui karena bunga nusa indah dapat dijumpai di halaman rumah sebagai tanaman hias. Karena bunga nusa indah atau biasa disebut dengan daun putri hanya digunakan sebagai obat tradisional dan belum ada obat herbalnya, jadi boleh di katakan nilai jualnya belum ada.

BAB III METODOLOGI

A. Tujuan Operasional Penelitian 1. Mendapatkan potongan daun Mussaenda frondosa berukuran 0,5 cm. 2. Menanam daun Mussaenda frondosa pada parafin. 3. Mendapatkan potongan preparat daun Mussaenda frondosa dengan menggunakan mikrotom. 4. Mewarnai preparat daun Mussaenda frondosa dengan safranin dan fastgreen. 5. Mendapatkan hasil pewarnaan yang baik.

B. Metodologi Penelitian Metode yang digunakan adalah metode deskriptif.

C. Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada Oktober hingga Desember 2013 di Laboratorium Mikroteknik dan Laboratorium Biokimia Jurusan Biologi Universitas Negeri Jakarta pada hari Senin pukul 15.00 hingga selesai, serta di Laboratorium Histologi Universitas Indonesia.

D. Alat dan Bahan Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah silet, penggaris, oven, beaker glass, gelas ukur, corong, pipet, pinset, botol kaca, penangas, kaki tiga, kertas saring, bunsen, kaset blok, kertas kalender dan aspirator. B a h a n ya n g d i g u n a k a n d a l a m p r a k t i k u m i n i a d a l a h d a u n n u s a i n d a h ( Mussaenda frondosa ), akuades, larutan fiksasi seperti larutan FAA, alkohol 70%, alkohol 96%, xilol, parafin cair, minyak parafin, safranin 1%, larutan A dan larutan B.

E. Metode Kerja Metode kerja yang dilakukan dalam pembuatan preparat daun nusa indah (Mussaenda frondosa) adalah sebagai berikut: a. Proses pembuatan alkohol bertingkat (70%, 80%, 90%, dan 100%) b. Proses pembuatan larutan FAA Larutan terdiri dari 50 cc ethyl alcohol (96%), 5 cc asam asetat glacial, 10 cc formaldehid (37-40%), 35 cc akuades Bahan-bahan yang diperlukan dicampurkan dan dimasukkan ke dalam botol kaca dan simpan selama satu minggu c. Proses fiksasi Siapkan alat dan bahan yang diperlukan Potong daun nusa indah (Mussaenda frondosa) menjadi potongan-potongan kecil (0,5 cm x 0,5 cm) sebanyak 7 potongan Memasukkan bahan yang sudah dipotong ke dalam botol vial, kemudian diberi larutan FAA hingga batang terendam dan diamkan selama satu minggu Melakukan aspirasi menggunakan alat aspirator selama 5 menit atau hingga organ tenggelam Mengganti larutan FAA dengan alkohol 70% yang diberi pewarna safranin 1% sebanyak 5 -7 tetes dan simpan selama 6 hari Lalu pindahkan ke dalam alkohol 96% selama masing-masing 1 jam berturutturut. d. Proses penjernihan atau dehidrasi Masukkan potongan daun nusa indah (Mussaenda frondosa) ke dalam larutan alcohol 70%, 80%,90% dan 100% secara berturut-turut selama 30 menit; lalu masukkan ke dalam larutan xilol 1 dan xilol 2 selama 30 menit; lalu ke dalam minyak parafin. e. Proses infiltrasi Masukkan potongan daun nusa indah (Mussaenda frondosa) ke dalam parafin lunak dengan 2 hingga 3 kali pergantian selama 1 jam

f. Proses penanaman (embedding) Buat tempat penanaman dengan menggunakan kalender yang berbentuk persegi atau persegi panjang (sesuai dengan ukuran organ tanaman yang digunakan) Masukkan parafin cair, diamkan sampai parafin tersebut agak membeku Masukkan bahan ke dalam parafin yang sudah agak membeku. Usahakan bahan diletakkan di tengah-tengah blok Diamkan sampai membeku

g. Proses blocking Pindahkan bahan yang sudah ditanam di blok pada kaset dengan

menempelkannya pada kaset dengan menggunakan parafin h. Proses pembuatan larutan A dan larutan B Larutan A terdiri dari gelatin 1 gram, calcium propionate 1 gram, benzalkonium chloride 1 cc dan air 100 cc. Larutan B terdiri dari chromealum 1 gram, formalin 40% dan air 90 cc. Masukkan semua bahan larutan A ke dalam botol kaca, campur menjadi satu. Demikian juga dengan larutan B. i. Proses penyayatan Sayat bahan dengan menggunakan mikrotom (di Universitas Indonesia) dan silet (Universitas Negeri Jakarta) Sayatan dengan menggunakan mikrotom, hasil berbentuk pita panjang dan dimasukkan kedalam waterbath, lalu tempelkan langsung pada gelas objec Sayatan dengan silet, hasil berupa sayatan. Letakkan sayatan di object glass yang sudah ditetesi dengan larutan A, kemudian tetesi larutan B di atas sayatan dan dilakukan di atas pemanas dengan suhu 40C. j. Proses pewarnaan Preparat dimasukkan ke dalam xilol (xilol 1 dan xilol 2) masing-masing selama 5 menit Lalu masukkan ke dalam alkohol 100%, alkohol 95%, alkohol 90%, alkohol 80% dan alkohol 70% masing-masing selama 5 menit Setelah itu masukkan ke dalam aquades selama 5 menit

Setelah itu masukkan ke dalam haematoxylin sebagai pewarna selama kurang lebih 2 menit Kemudian cuci dengan air mengalir selama 5-10 menit Lalu masukkan ke eosin selama 2 menit. Lalu masukkan ke dalam alkohol 70%, alkohol 80%, alkohol 90% dan 100% masing-masing selama 2 menit Masukkan ke dalam xilol 1 dan 2 masing-masing selama 2 menit Setelah itu, bahan ditutup dengan menetesi canada balsam di atas preparat, setelah itu ditutup dengan menggunakan cover glass. Kemudian lihat preparat dalam mikroskop.

F. Teknik pengumpulan data Data yang diambil berupa gambar mikroskopis dari preparat daun n u s a ( Mussaenda frondosa). indah

G. Teknik analisis data Teknik analilis berdasarkan anatomi preparat daun n u s a i n d a h ( Mussaenda frondosa) yang tampak dalam mikroskop.

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A . Hasil Penelitian

Trikoma

Preparat Daun Nusa Indah Perbesaran 40x (Laboratorium Mikroteknik Universitas Negeri Jakarta)

Preparat Daun Nusa Indah Perbesaran 4x (Laboratorium Histologi Universitas Indonesia)

Preparat Daun Nusa Indah Perbesaran 10x (Laboratorium Histologi Universitas Indonesia)

Preparat Daun Nusa Indah Perbesaran 40x (Laboratorium Histologi Universitas Indonesia)

B . Pembahasan Praktikum kali ini membuat preparat daun nusa indah ( Mussaenda frondosa) d e n g a n menggunakan metode parafin. Digunakan daun nusa indah

( Mussaenda frondosa) untuk mengamati trikoma pada daun nusa indah ( Mussaenda frondosa). T a h a p a w a l yang dilakukan adalah menyediakan bahan-bahan yang akan dibutuhkan selama pembuatan preparat dan membersihkan alat-alat yang akan digunakan. Hal tersebut dilakukan untuk mempermudah pekerjaan praktikan serta terhindar dari kontaminasi agar hasil yang diperoleh maksimal. Setelah dipotong sepanjang 5 cm, jaringan kemudian melalui tahap fiksasi dengan menggunakan larutan FAA (Formalin, Asam asetat glasial, dan alkohol 96%), tahap ini bertujuan untuk menjaga atau mengawetkan seluruh stuktur sel sehingga sedapat mungkin berada dalam keadaan sama atau hampir sama dengan keadaan aslinya pada waktu masih hidup serta memperlambat atau menghentikan proses metabolism sel pada

jaringan. Larutan FAA yang digunakan bertujuan untuk mempercepat penetrasi alkohol dan asam asetat ke dalam jaringan agar pematian dan fiksasi dapat berjalan dengan

cepat, serta merupakan larutan yang stabil dan pengawet yang baik. Faktor-faktor yang berperan dalam fiksatif adalah buffer (pH), suhu yang rendah mencegah autolisis,untuk mendapatkan daya penetrasi yang tinggi digunakan irisan setipis mungkin, perubahan volume, osmolaliitas pada larutan fiksatif, penambahan deterjen sehingga fiksatif cepat masuk, konsentrasi, dan waktu fiksatif. (Botanika, 2008). Setelah difiksasi, jaringan terlebih dahulu dicuci dengan merendamnya ke dalam aquades selama beberapa detik. Hal ini bertujuan untuk menghilangkan larutan FAA yang ada pada jaringan. Kemudian, jaringan melalui tahap dehidrasi dengan menggunakan alkohol bertingkat dengan konsentrasi mulai dari 70%, 80%, 90%, dan 96%. Jaringan direndam ke dalam alkohol bertingkat dengan waktu masing-masing selama 15 menit. Tujuan dari tahap dehidrasi ialah agar kandungan air dalam jaringan agar keluar. Penggunaan dari alkohol bertingkat tersebut agar jaringan kandungan airnya dapat keluar sedikit demi sedikit hingga pada konsentrasi 96% pengeluaran airnya pun maksimal, serta mencegah terjadinya lisis pada sel dalam jaringan tersebut.

Selanjutnya, jaringan direndam ke dalam larutan campuran alkohol 96% : xylol secara bertingkat dengan perbandingan 3:1, 1:1, dan 1:3 masing-masing selama 10 menit yang biasa disebut dengan tahap dealkoholisasi. Tahap ini bertujuan untuk mengeluarkan alkohol yang terdapat di dalam jaringan yang kemudian digantikan oleh larutan xylol yang mampu berikatan dengan parafin. Selain itu, tujuan dari perbandingan pada campuran tersebut dimana campuran alkohol : xylol pertama ialah 3 : 1 agar sel tidak kaget akan penambahan larutan lain sehingga mencegah kerusakan pada sel. Tahap berikutnya ialah penjernihan dimana jaringan direndam ke dalam

larutan xylol murni I dan xylol murni II dengan waktu masing-masing 10 menit. Langkah ini dilakukan untuk mengeluarkan alkohol yang masih tersisa dalam jaringan sehingga larutan dalam jaringan hanya larutan xylol saja. Selanjutnya, jaringan direndam ke dalam campuran larutan xylol : parafin dengan perbandingan 1 : 9. Hal ini dilakukan untuk menghilangkan xylol dari jaringan. Selanjutnya jaringan mengalami tahap infiltrasi,dimana jaringan direndam ke dalam parafin cair murni selama 30 detik yang bertujuan untuk menghilangkan kandungan xylolnya secara maksimum serta untuk merekatkan jaringan. Setelah tahap infiltrasi, dilakukan proses penanaman atau embedding dengan cara merendam jaringan dalam parafin murni selama 15 menit diudara terbuka dan 15 menit di dalam oven, kemudian setelah mencair jaringan dimasukkan ke dalam kertas kubus yang disebut blok dan dituangkan kembali parafin murni kemudian dibiarkan pada suhu kamar agar parafin membeku selama. Hal ini bertujuan agar jaringan dapat dengan mudah terpotong tanpa merusak jaringan batang tersebut. Selanjutnya dibuat kotak keras yang agak tebal dengan ukuran kira-kira 5 X 2,5 X 2 cm(panjang X lebar X tinggi), lalu isi dengan paraffin yang sedang mencair dalam blok paraffin tadi, kemudian sebelum paraffin membeku sepenuhnya, masukkan bahan. Lalu isi lagi dengan paraffin cair hingga penuh dan menutupi seluruh organ. Biarkan permukaan paraffin membeku, kemudian tekanlah seluruh kotak kedalam air sampai paraffin membeku, atau dapat juga dimasukkan kedalam freezer sampai seluruh paraffin sama sekali membeku. Baru setelah itu paraffin dapat dikeluarkan dari kotaknya.

Embedding merupakan proses pelilinan suatu organ dengan menggunakan kotak kertas. Proses ini memudahkan dalam membuat irisan yang sangat tipis dengan menggunakan mikrotom. Beberapa keuntungan menggunakan kotak kertas dalam embedding yaitu bisa membuat arah sayatan dan menandai suatu jaringan. Jaringan atau sampel akan ditanam di ketas kotak, dengan terlebih dahulu parafin membeku pada bagian dasar dalam kotak dan setelah penempelan jaringan dilanjutkan dengan penutupan dengan parafin sampai. Untuk mengiris preparat, digunakan alat mikrotom biasanya dengan ukuran 10 mikron sampai 14 mikron. Irisan akan berbentuk seperti pita-pita. Pemindahan irisan menggunakan kuas kecil yang telah dibasahi ujungnya dengan air (Widjajanto dan Susetyoadi Setjo, 2001). Proses penyayatan (sectioning) diawali dengan pengirisan blok parafin dengan scalpel, sehingga permukaan blok parafin yang akan diiris dengan mikrotom berbentuk segi empat. Letak mata pisau pada mikrotom menentukan hasil yang diperoleh. Hasil sayatan diambil dengan menggunakan kuas secara hati-hati. Pita hasil sayatan ditempel pada kaca objek lalu diletakkan di atas meja penangas ( haeting plate). Meyer albumin memiliki kandungan putih telur dan gliserin dan merupakan pelakat alami yang sangat baik. Dapat juga dengan dimasukkan ke dalam waterbath agar pita paraffin dapat menempel di kaca objek. Agar spesimen dapat menempel sempurna pada kaca objek dibutuhkan rentang waktu yang relative cepat antara peletakkan spesimen pada kaca objek dengan dimasukkan ke waterbath. (Widjajanto dan Susetyoadi Setjo, 2001). Setelah embedding, dilakukan proses pewarnaan. Zat warna yang digunakan tidak hanya satu macam karena tidak semua sel dapat menyerap satu macam zat warna. Pada saat pewarnaan preparat akar inisel dalam jaringan tidak terwarnai. Hal ini dapat disebabkan oleh waktu yang digunakan untuk pemberian warnanya terlalu singkat sehingga zat warna belum terserap sempurna oleh jaringan. Pewarna yang diberikan pada irisan dalam jangka waktu tertentu, kurang atau lebih waktu yang digunakan menyebabkan warna preparat menjadi kurang atau terlalu gelap. Sedangkan hasil preparat yang tidak utuh dapat disebabkan oleh suhu sekitar ruangan yang kurang mendukung saat dilakukan pengirisan selain itu masih tersisanya air atau alkohol dalam jaringan juga dapat menyulitkan dalam pengirisan (Widjajanto dan Susetyoadi Setjo, 2001).

Untuk mewarnai bahan yang telah ditempel tersebut adalah dengan cara merendamkan kaca obyek tersebut kedalam bejana pewaarna (bejana coplin), biasanya dibutuhkan bejana coplin tersebut kira-kira 12 buah, tergantung dengan pewarna yang kita pakai. Masing-masing bejana diberi label dengan nama zat yang berada didalamnya, demikian pula dengan tutupnya.

Selanjutnya diamati dibawah mikroskop apakah trikoma pada daun nusa indah (Mussaenda frondosa) terlihat atau tidak. Karakteristik tumbuhan yang akan diambil spesimennya juga menentukan waktu pada tahap-tahap pemrosesan. Misalnya waktu yang berlebih pada suatu tahap pengecatan akan mengakibatkan suatu warna menjadi terlalu gelap dan mungkin warna lainnya menjadi kurang atau bahkan hilang. Keberhasilan pembuatan preparat permanen ini tergantung pada lima tahap yang utama yaitu fiksasi, dehidrasi, penjernihan, perembesan dan pengeblokan parafin serta pewarnaan. Larutan fiksatif yang dipilih, perembesan parafin yang bagus dan zat warna yang akan digunakan menentukan keberhasilan preparat irisan (Setjo, 2004). Selain itu, dilakukan pula pembuatan preparat di Laboratorium Histologi Universitas Indonesia untuk membandingkan hasil preparat dengan yang sudah dibuat di Laboratorium Mikroteknik Universitas Negeri Jakarta. Hasil yang diperoleh ternyata signifikan. Pada hasil yang dilakukan di Laboratorium Mikroteknik Universitas Negeri Jakarta, saat diamati di bawah mikroskop, hasilnya tidak terlalu jelas. Sedangkan hasil yang lain terlihat jelas sekali. Berdasarkan analisis yang telah kami lakukan, hal ini disebabkan diantaranya karena: a. Larutan yang digunakan di Laboratorium Histologi Universitas Indonesia masih baru sehingga hasil yang diperoleh lebih bagus. Sedangkan larutan yang digunakan di Laboratorium Mikroteknik Universitas Negeri Jakarta mungkin saja sudah terlalu lama, atau mungkin sudah melewati batas pemakaian. b. Paraffin yang digunakan mungkin saja bukan paraffin yang baru. Karena pada saat dibandingkan blok paraffinnya saja sudah berbeda.
c. Alat yang tersedia terbatas sehingga praktikan tidak bisa melakukan praktikum

dengan maksimal

BAB V PENUTUP

A. Kesimpulan Pembuatan preparat awetan dengan metode parafin dimulai dengan proses fiksasi, penjernihan, infiltrasi, penanaman, penyayatan dan pewarnaan. Pada preparat daun nusa indah ( Mussaenda frondosa) t e r l i h a t a d a n y a t r i k o m a . Preparat awetan jaringan tumbuhan adalah salah satu media pembelajaran Biologi yang sangat efektif, khususnya pada praktikum Anatomi Tumbuhan, dalam hal ini untuk melihat bagian trikoma pada daun. Pembuatan preparat merupakan upaya untuk mempermudah pengamatan suatu bahan.

B. Saran Pada saat melakukan proses pemotongan preparat di mikrotom diharapkan ketebalannya sesuai agar tidak terlalu tebal ataupun terlalu tipis. Saat melakukan pewarnaan, dilakukan sesuai dengan prosedur dan waktu yang sudah ditetapkan karena akan berpengaruh terhadap hasil akhir. Dibutuhkan sifat berhati-hati, sabar dan teliti dalam semua rangkaian prosedur pembuatan preparat.

DAFTAR PUSTAKA

Amar. 2008. Materi Mikroteknik. http://amar1286.multiply.com/journal/item/10 (di akses pada tanggal 17 Desember 2013 pukul 01.31) Botanika, 2008, Fixation, Embedding, Sectioning, http://botanika.biologija.org, Diakses pada tanggal 19 Desember 2013 pukul 21.04. Gunarso, Wisnu. 1989. Bahan Pengajaran Mikroteknik. Bogor : DEPDIKBUD Institiut Pertanian Bogor. Imron, Tamyis, A., 2008. Pembuatan Preparat Jaringan Tumbuhan dengan Metode Parafin. Lap.prak mikroteknik Universitas Brawijaya. http://cyber-biology.blogspot.com. Diakses pada tanggal 19 Desember 2013 pukul 20.40.. Widjajanto dan Susetyoadi Setjo. 2001. Mikroteknik Tumbuhan. Malang : Universitas Negeri Malang. Zaifbio. 2010. Preparat Wholemount Kutu Daun Bunga (Triboliun Confusum).

http://zaifbio.wordpress.com/category/mikroteknik/ (di akses pada tanggal 17 Desember 2013 pukul 12.45).

LAMPIRAN GAMBAR

Organ di dehidrasi di alkohol

Pencairan Paraffin

Proses Aspirasi

Organ yang sudah ditanam

Blok paraffin yang sudah membeku

Beberapa tahap Pewarnaan

Keseluruhan Teknik Pewarnaan

Organ yang sudah diwarnai