UNIVERSIDAD ALAS PERUANAS

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA Y CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE ESTOMATOLOGA

MICROBIOLOGA Y PARASITOLOGA GENERAL Y ESTOMATOLGICA

GUIA DE PRCTICA 2014

AUTOR: Mg CD ELOY GAMBOA ALVARADO

DOCENTES COLABORADORES:
Mg Blgo. Nelson O. Rivera Fernndez (Coordinador del Curso). Mg Blgo. Marco Antonio Mesia Guevara Mg Blga. Carmen Lesly Castillo Pampas

RECOMENDACIONES GENERALES 1. El estudiante deber asistir a las clases prcticas correctamente uniformado de blanco y llevando consigo mandil blanco, gorro, mascarilla y guantes descartables. Adems plumn indeleble para escritura en vidrio y lpices de colores. 2. El alumno que incumpla el tem anterior no podr ingresar a sala de prcticas. 3. Est prohibido comer, beber y fumar en sala de prcticas. 4. Sobre la mesa de trabajo slo colocar materiales, gua prctica y libreta de apuntes. 5. Antes y despus de cada prctica el estudiante desinfectar la mesa de trabajo, para lo cual deber contar siempre con un frasco de alcohol yodado, algodn y gasa. 6. Finalizada la prctica el estudiante eliminar los materiales de desecho al depsito correspondiente. 7. Las lminas preparadas debern ser colocadas en una caja para su archivo. 8. Todas las placas y tubos con medios de cultivo ya usados sern colocadas en las canastillas para su autoclavado y desecho. 9. Las lminas coloreadas a desecharse debern ser colocadas en recipientes con boca ancha conteniendo desinfectante. 10. Los cultivos a incubarse debern rotularse con los siguientes datos: a. Nombre o iniciales del estudiante. b. Nombre del microrganismo, nmero de mesa, seccin y fecha. c. Las placas se colocarn en forma invertida, salvo indicacin contraria del docente. d. Los tubos debern estar bien tapados y colocados en gradillas. e. Los alumnos son responsables de colocar los cultivos en las estufas a temperatura y tiempo adecuados. f. Los alumnos son responsables de la observacin macroscpica tras la incubacin. 11. Al finalizar la prctica, el estudiante se responsabiliza de: a. Limpiar los objetivos y platina del microscopio con algodn y alcohol isoproplico. b. Ubicar el objetivo de menor aumento frente al condensador y verificar que no queden lminas sobre la platina. c. Desinfectar la mesa de trabajo. d. Cerrar la vlvula de gas. e. Lavarse las manos con jabn carblico. 12. El protocolo ser controlado por el docente al final de cada prctica.

PRCTICA N 01 EQUIPOS, INSTRUMENTOS Y MATERIALES DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA OBJETIVOS: Identificar y reconocer los principales equipos, instrumentos y materiales utilizados en el Laboratorio de Microbiologa. Familiarizar al estudiante con el manejo y uso adecuado de los equipos, instrumentos y materiales usados en las diversas prcticas de microbiologa. I. EQUIPOS:

MICROSCOPIO Aparato ptico formado por un juego de lentes que permiten la observacin de la imagen de un objeto amplificado. Existen varios tipos, siendo los ms usados el ptico de campo claro (hasta 2000x) y el electrnico (hasta 100000x), adems existen otros con fines especficos como los microscopios pticos de inmunofluorescencia, el de campo oscuro y el de contraste de fases. Es usado para reconocer caractersticas morfolgicas, tintoriales y detectar las diferentes estructuras que poseen los microrganismos. Partes. Mecnica. ptica. Sistema de Iluminacin.

A. Mecnica: a) Pie. b) Platina (Circular o rectangular fija o mvil, el vernier y el sistema de movimiento o tren) c) Tubo ptico, Revlver. d) Sistema de Enfoque: Tornillos Micromtricos y Macromtricos (Cremallera) B. Sistema ptico: a) Oculares: 05 10 20x b) Objetivos: 05 10 40 100x Objetivos de observacin en seco y en inmersin. C. Sistema de Iluminacin: a) Espejo: Plano y Cncavo b) Condensador. c) Diafragma filtros.

d) Fuentes de iluminacin natural y artificial. Para determinar el aumento del microscopio se multiplica la cifra del ocular con la del objetivo; ambas representan el aumento proporcionado por cada lente. Para la observacin microscpica proceda segn el siguiente orden: La eleccin de la iluminacin depende de la fuente de luz, aumentos empleados y otros factores. Enfoque de preferencia con el objetivo de menor aumento, que por lo comn tiene un tope inferior que impide la ruptura de las lminas a observar. Una vez enfocado el objeto, haga rotar el revlver y utilice el objetivo deseado. Al usar el de inmersin, coloque previamente una gota de aceite de cedro sobre la preparacin. Al colocarse el objetivo en posicin debe existir una continuidad entre ellas. Para el enfoque preciso, use tornillo micromtrico. Mantener los ojos abiertos, aunque el microscopio sea monocular. Al terminar la observacin limpie le objetivo con papel especial para lente, algodn o un lienzo fino, embebido con alcohol isoproplico o xilol en pequea cantidad y secar. Las lminas ya observadas, se depositarn en un recipiente de boca ancha con solucin sulfocrmica.

AUTOCLAVE Destinado para la esterilizacin con calor hmedo y presin (121C x 15 a 15 Lbs/pulg2 ). Permite la esterilizacin demateriales de desecho, medios de cultivo, ropa quirrgica, agua destilada, etc. HORNO (Horno Pasteur o Poupinel) Destinado para la esterilizacin a calor seco. La temperatura usual es 160 180C por 1 2 horas. Se esteriliza material de vidrio, de laboratorio e instrumentos metlicos. ESTUFA O INCUBADORA Permite obtener temperaturas fijas permanentes gracias a un termostato. La temperatura se elige segn el requerimiento del microrganismo a cultivar. Generalmente es de 37C. REFRIGERADOR O NEVERA Permite obtener temperaturas bajas y se utiliza con fines de conservacin de microorganismos, medios de cultivo, muestras, reactivos, etc. Por lo general se usa a temperatura de 0 a 4C.

CENTRIFUGA Equipo de diversas capacidades y que permite separar una sustancia slida en suspensin del lquido respectivo. Se puede centrifugar orina o sangre para obtener el sedimento urinario o suero respectivamente. BALANZA Se usa en bacteriologa para pesar colorantes, medios de cultivo, reactivos, etc. Existen de diferentes tipos segn su aplicacin y sensibilidad. BAO MARIA Permite la transmisin indirecta y atenuada de calor, de un lquido sobre una sustancia a travs de un recipiente contenedor. Evita el calor directo. Se usa entre otras cosas para licuar medios de cultivo y para inactivar sueros. Existen diversos modelos segn aplicacin. AGITADOR MECNICO Equipo de diseo diverso y con frecuencia variable por el nmero de veces que oscilan por minuto. Se utilizan para agitar tubos, frascos, pipetas y lminas excavadas. POTENCIOMETRO Equipo destinado a determinar la concentracin de iones H (pH en una solucin). BOMBA DE VACIO Produce presin negativa y se utiliza de preferencia para filtrar muestras de agua potable, a travs de una membrana filtrante donde se retienen las bacterias contaminantes. CONTADOR DE COLONIAS Utilizado para el recuento de colonias en una placa de cultivo, de manera ms exacta y con mayor facilidad. II. MATERIALES DE VIDRIO

Materiales que deben ser de buena calidad, resistir acciones mecnicas y cambios bruscos de temperatura, tener bajo coeficiente de dilatacin y una mnima cantidad de lcali libre. PLACA PETRI Formado por dos cristalizadores, haciendo de tapa el ms grande y de base el ms pequeo. Existen en medidas de 10x60 y 15x100, encontrndose en el mercado incluso con divisiones internas.

PLACAS BREWER Son ms gruesas y pesadas que las anteriores. La tapa encaja perfectamente sobre la base, dejando espacio slo el necesario para colocar el medio de cultivo. Es usado generalmente para el aislamiento y cultivo de microrganismos anaerobios. TUBOS DE PRUEBA (Tubos de ensayo). Presentes en tamaos variados y cuyas medidas se dan en mm del dimetro de la boca y el largo del tubo. Los ms frecuentes son de 13x100 mm, 16x150 mm y 18x150 mm. Una variante de ellos posee tapa de bakelita y se emplea para realizar pruebas bioqumicas, cepario, estudios de fermentacin, reacciones diversas, etc. Los tubos para centrfuga son de paredes gruesas y de fondo cnico, pueden tener graduacin y sirve para reunir el sedimento de los lquidos. MATRACES Y BALONES Recipientes de base esfrica con fondo plano y forma cnica o de globo, con cuello de boca ancha que termina en reborde. Existen con medidas volumtricas desde 50 ml hasta 5000ml, y son empleados para la preparacin de medios de cultivo, colorantes, soluciones, reactivos diversos, etc. PIPETAS De forma tubular y abierta en ambos extremos, graduado en su extremo proximal y son usados para medir soluciones en cantidades pequeas y exactas. Son de diversas clases: Pipetas con bulbo, llamadas as por el abultamiento que presentan en su parte intermedia; Pipetas de sangre, que poseen un pequeo bulbo y graduaciones que permiten relaizar diluciones en citometra hemtica; tambin estn las Pipetas Pasteur que no poseen marcas ni graduaciones y son utilizadas para medir volmenes pequeos. Las pipetas poseen las siguientes abreviaturas: TC (Tocontainer), las que contiene un determinado volumen , pero al vaciar no suministra la totalidad del lquido; y TD (Todeliver), al vaciar la pipeta suministrar la totalidad del volumen especificado. PROBETA De paredes gruesas y graduadas, con base para estabilidad. Existen de diferentes capacidades, de 10 a 1000ml, y son usadas para medir soluciones o sustancias lquidas. FIOLAS Matraces volumtricos con cuello largo y base globosa, poseen una lnea de aforo y son usados para la preparacin de reactivos valorados.

MATRAZ DE PRECIPITADO Recipientes cilndricos de boca ancha y con pico en el borde. Generalmente se usa para preparar soluciones diversas. LAMINAS PORTA Y CUBREOBJETOS Lminas de vidrio rectangulares o cuadrangulares con diferentes dimensiones, las ms comunes son de 65x35 mm y 22x22mm. Son usadas para hacer extensiones y coloraciones de muestras biolgicas y observaciones en fresco. En otros materiales de vidrio pueden considerarse embudos, jeringas hipodrmicas, frascos, goteros, baguetas, perlas de vidrio, etc. III. OTROS MATERIALES

MANGOS DE KOLLE Vstagos de metal con cubierta de ebonita (aislante de calor), en cuyo extremo distal presenta una tuerca para insertar el alambre de platino o micrn que formar el asa de siembra. Usado en la toma de muestras de microrganismos y en la siembra de los mismos. ESPTULAS DE METAL Usado para pesar medios de cultivo y reactivos. Los de nquel no se oxidan. TRIPODE Soporte de tres pies generalmente de metal, empleados para soportar recipientes durante el calentamiento. Entre otros materiales tambin se consideran: soportes universales, agujas hipodrmicas, gradillas para tubos de ensayo, rejillas de asbesto, tapones de jebe, mangueras de jebe, papel indicador de pH, etc. CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4. Dibuje los diferentes equipos y materiales de laboratorio estudiados. Describa y esquematice el modo de usar una pipeta y una placa Petri. Qu material de laboratorio utilizara para medir volmenes pequeos y exactos?. Qu equipo de laboratorio utilizara para esterilizar medios de cultivo?.

PRCTICA N02 COLORANTES Y COLORACIONES BACTERIANAS OBJETIVOS Identificar y reconocer los colorantes y las principales tcnicas de coloracin utilizadas en Bacteriologa. Identificar y reconocer la estructura y morfologa bacterianas.

INTRODUCCION COLORANTE: Sustancia qumica de origen natural o sinttico que otorga color. Por su naturaleza, se clasifican en colorantes naturales y artificiales. Naturales: Son de origen animal y vegetal. Ejemplo: El Carmn es obtenido de la cochinilla, la hematoxilina y el tornasol que son obtenidas de las plantas. Artificiales o Sintticos: Obtenidos como derivados del carbn de piedra o hulla. Son conocidos como anilinas. Ejemplo: azul de etileno, safranina, violeta de genciana, atc.

Por su afinidad tintorial, es decir de acuerdo al comportamiento qumico del colorante, se clasifica en: a) Colorantes cidos b) Colorantes Bsicos. c) Colorantes Neutros. a) Colorantes cidos: Se dice que un colorante es cido o aninico, cuando la parte bsica o catinica es incolora y la parte cida o aninica es coloreada, teniendo afinidad poe le citoplasma. Ejemplo: cido pcrico, Eosina, Fucsina cida, etc. b) Colorantes Bsicos: Son los colorantes que tienen la parte bsica o catinica coloreada y la parte cida o aninica incolora. Tienen afinidad por el ncleo. Ejemplo: Violeta de genciana, Fucsina bsica, Tionina, etc. c) Colorantes Neutros: Son los colorantes que tienen la parte cido y bsica coloreada y tien al ncleo de un color y al citoplasma de otro. Ejemplo: Leishman, Giemsa, Wright, Eosinato azul de metileno, etc. COLORACIN O TINCIN Proceso en el que se produce un intercambio de iones entre los colorantes y los sitios activos de la superficie o del interior de la clula.

Las coloraciones segn el nmero de colorantes pueden ser: A) Simples B) Diferenciales C) Especiales A) COLORACIONES SIMPLES. Son aquellas coloraciones que utilizan un solo colorante para la observacin de la morfologa de los microrganismos. Ejemplos: Coloracin de azul de metileno, Tinta china y la de azul de lactofenol. B) COLORACIONES DIFERENCIALES. Son aquellas coloraciones que utilizan ms de un colorante. Generalmente al primer colorante se le denomina Colorante Primario, mientras que al segundo se le denomina Colorante Secundario o de Contraste. Permiten observar diferencias entre clulas bacterianas o partes de la estructura bacterianas. Ejemplos: Coloracin Gram y Coloracin de ZiehlNeelsen (tambin llamada cido alcohol resistente). C) COLORACIONES ESPECIALES. Cuando se utilizan colorantes que permiten reconocer ciertas estructuras celulares. Ejemplo: Giemsa, Wrigth, Leishman, Vago, etc. PASOS GENERALES DE UNA COLORACIN: a) Extensin: Consiste en colocar la muestra sobre una lmina portaobjetos, extendindola uniformemente. b) Fijacin: Fijar la muestra sobre la lmina portaobjeto utilizando alcohol, ter o flameado suavemente sobre el mechero o simplemente dejarlo al medio ambiente. c) Tincin: Se utiliza el colorante requerido cubriendo la muestra en su totalidad por un tiempo determinado. d) Lavado: Enjuagar usando un chorro suave de agua. e) Secado: Dejar secar la lmina al calor del mechero. f) Observacin: Observar con el objetivo de inmersin usando el aceite de cedro. COLORACION DE AZUL DE METILENO 1. 2. 3. 4. Prepara un frotis con la muestra bacteriana y fijar al calor. Cubrir el frotis con 3 gotas del colorante azul de metileno y dejar actuar por 3 5 minutos. Lavar con chorro tenue de agua y dejar secar. Observar al microscopio con objetivo de inmersin y aceite de cedro.

RESULTADO: Los microrganismos se observan de color azul intenso.

PROTOCOLO

COLORACION SIMPLE

MORFOLOGA DEL MICROORGANISMO

ESQUEMA DE LA OBSERVACIN

AZUL DE METILENO

COLORACIN GRAM 1. Dividir la lmina en 3 partes: 1/3 para rotular y 2/3 para la preparacin del frotis. 2. Con el asa bacteriolgica previamente esterilizada, tomar la muestra y realizar un frotis en el centro de la lmina portaobjeto, extendindola en espiral del centro a la periferia, para obtener una preparacin en capa fina. 3. Fijar la muestra, mediante el secado completo del frotis por flameado con la ayuda del mechero. 4. Colocar la lmina sobre la varilla o puente de coloracin. 5. Cubrir el frotis con 03 gotas de Cristal Violeta (colorante primario), dejar actuar por 2 minutos. 6. Lavar con agua corriente (evitar la cada directa del chorro sobre el frotis). 7. Cubrir con Lugol durante 1 2 minutos. 8. Lavar con agua. 9. Decolorar el frotis con la solucin de Alcohol Acetona (inclinar la lmina y decolorar hasta que no arrastre colorante), mximo por 30 segundos. 10. Lavar con agua. 11. Cubrir con 03 gotas del colorante de contraste Safranina durante 2 minutos. 12. Lavar con agua. 13. Secar a temperatura ambiente o con la ayuda de la llama del mechero. 14. Observar al microscopio con el objetivo de inmersin.

RESULTADO: Las Bacterias Grampositivas se colorean de violeta y las Bacterias Gramnegativas de color rojo grosella o rosado. PROTOCOLO

CATEGORA BACTERIANA

MORFOLOGA BACTERIANA

ESQUEMA DE LA OBSERVACIN

GRAMPOSITIVAS

GRAMNEGATIVAS

COLORACIN DE ZIEHL NEELSEN 1. Cubrir el frotis con 05 gotas de Fucsina Fenicada y calentar la preparacin con el mechero de alcohol hasta apreciar el desprendimiento de vapores, repetir este procedimiento por 03 veces, evitando que hierva el colorante. 2. Lavar con agua corriente. 3. Decolorar con Alcohol cido hasta que se aprecie una coloracin rosada, mximo hasta 01 minuto. 4. Lavar con agua corriente. 5. Cubrir con el colorante de contraste, Azul de Metileno, 03 gotas, durante 01 minuto. 6. Lavar con agua corriente. 7. Secar y observar con objetivo de inmersin. RESULTADO: Las bacterias cido alcohol resistentes se tien de color rojo y las no cido alcohol resistente se tien de color azul. PROTOCOLO

LMINA

MORFOLOGA DEL MICROORGANISMO

ESQUEMA DE LA OBSERVACIN

COLORACIN DE ZIEHL NEELSEN

CUESTIONARIO 1. Qu tipo de colorantes son el azul de metileno, tinta china y el azul de lactofenol? 2. Cules son los componentes del azul de metileno? 3. Qu estructura de la bacteria se colorea con el azul de metileno?

4. A qu se debe que las bacterias Gramnegativas no retengan el complejo cristal violetayodo? 5. A qu se debe que los colorantes bsicos tian el ncleo de la clula? 6. Con qu clase de colorante teira el protoplasma de la clula? 7. Para qu clase de microrganismos es recomendable la coloracin cido alcohol resistente? 8. Cul es la funcin de la fucsina fenicada? 9. A qu se denomina colorante primario y colorante de contraste?

PRCTICA N 03 MEDIOS DE CULTIVO OBJETIVOS Identificar y reconocer los medios de cultivo de uso frecuente en microbiologa. Conocer y describir los requerimientos nutricios necesarios para el crecimiento microrganismos. Preparar y autoclavar medios de cultivo.

de

INTRODUCCIN MEDIOS DE CULTIVO El trmino Cultivo hace referencia al crecimiento de microrganismos, por lo que los medios de cultivo son sustancias nutritivas lquidas o solidas, que sirven en laboratorio para proporcionar sustrato nutritivo para el crecimiento y multiplicacin de los microorgansimos. Sus componentes bsicos deben satisfacer las exigencias nutricionales para el crecimiento microbiano y varian segn el tipo de bacteria. Las condiciones que deben tomarse en cuenta para el crecimiento en medio de cultivo son: Temperatura. Grado de humedad. Presin de oxgeno. pH.

Los medios de cultivo permiten: Crecimiento y desarrollo de microrganismos. Aislamiento e identificacin de los microrganismos. Clasificacin de los microrganismos. Obtencin de productos microbianos. Obtencin de cepas microbianas para la fabricacin de vacunas. Obtencin de toxinas para la sntesis de antitoxinas

Para su crecimiento los microrganismos deben tomar del ambiente que lo rodea, todas las sustancias que requiere para la sntesis de sus materiales celulares y energa. A estas sustancias se les denomina nutrientes y un medio de cultivo debe tener la concentracin adecuada de los mismos acorde a los requerimientos especficos de los microrganismospara los que han sido preparados. Y siendo los microrganismos extraordinariamente diversos, los medios de cultivo son tambin muy diversos en cuanto a nmero y caractersticas nutricias.

AGUA Para la preparacin de medios de cultivo y reactivos diversos, slo debe utilizarse agua destilada o agua desmineralizada, libres de metales disueltos y compuestos bactericidas o bacteriostticos. EXTRACTO DE CARNE Se puede usar cualquier marca de extracto de carne siempre y cuando produzca resultados positivos, lo que no se debe usar es la infusin de carne. PEPTONA Es una protena degradada para su fcil asimilacin por los microrganismos. Se puede utilizar cualquier peptona que previas pruebas conduzcan a resultados satisfactorios en el crecimiento de microrganismos. AZUCARES Todos los azcares usados para la preparacin de medios de cultivo deben ser qumicamente puros y adecuados para propsitos bacteriolgicos. AGAR Agente gelatinoso obtenido de algas marinas y que se emplea de forma granular o fragmentado para la preparacin de medios de cultivo. REACTIVOS GENERALES Todos los reactivos generales utilizados como ingredientes en los medios de cultivo deben ser de grado ACS o de calidad analtica. COLORANTES Para la preparacin de los medios de cultivo slo deben emplearse colorantes certificados. A partir de estos ingredientes es posible preparar un medio de cultivo capaz de permitir el crecimiento y desarrollo de diversos microrganismos hetertrofos. TIPOS DE MEDIO DE CULTIVO A los medios de cultivo se les puede clasificar de las siguientes maneras: I. SEGN SU ESTADO FSICO 1. MEDIOS LIQUIDOS: Son los que se presentan en este estado. Se les denomina Caldos.

2. MEDIO SLIDOS: Se preparan a partir de los medios lquidos , a los cuales se les adiciona un agente gelificante, el Agar agar. Se les denomina Agares. 3. MEDIOS SEMISLIDOS: Se les prepara a partir de los medios lquidos y a los que se les adiciona un agente gelificante pero en menor proporcin que para los slidos. II. SEGN LA FUNCIN QUE CUMPLEN: 1. MEDIOS COMUNES: Son aquellos que poseen los componentes esenciales mnimos para permitir el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. Ejemplos: Agua peptonada, Agar Nutritivo, Agar TSA (Agar Tripticasa Soja), Agar Gelatina, Caldo Nutritivo, etc. 2. MEDIOS ESPECIALES: Son aquellos que se formar a partir de un medio comn al cual se le adiciona diversas sustancias de acuerdo a la finalidad deseada. Pueden ser: 2.1. MEDIOS ENRIQUECIDOS: Cuando se les adiciona sustancias de mayor poder nutritivo como huevos, extracto de levadura, sangre, vitaminas, etc. Sirven para cultivar microrganismos exigentes en sus necesidades nutricionales. de Ejemplos: Agar Sangre: Cuando a un medio comn se le adiciona entre 5 y 10% de sangre. Permite el cultivp de bacterias patgenas. Agar Ogawa o Lowenstein Jensen: Medio enriquecido que permite el cultivo de Mycobacteriumtuberculosis(Bacilo de Koch). Agar Chocolate: Se sintetiza al calentar el agar sangre a temperatura entre 60 80C, tomando el color chocolate caracterstico. Sirve para el crecimiento de Neisseria meningitis (meningococo) y

Neisseriagonorrhoeae (gonococo). Caldo Cerebro Corazn (Brain, Heart Infusin. BHI): Sirve para microrganismos exigentes.

Caldo de Carne, Hemina y Vitamina K: Permite el crecimiento de microrganismos anaerobios exigentes.

2.2. MEDIOS SELECTIVOS: Son medios de cultivo que tienen la finalidad de favorecer el crecimiento y desarrollo de una bacteria y al mismo tiempo inhibir el desarrollo de otras. Para este fin se le adicionan sustancias con efectos INHIBIDORES tales como sal, colorantes, antibiticos o sales biliares. A estos medios tambin se les denomina Medios de Aislamiento. Ejemplos: Agar Mac Conkey, para E.coli y otras enterobacterias. Agar Cetrimide, para Pseudomonas. Agar Manitol Salado, para estafilococos. Agar MitisSalivarius, para estreptococos orales. Agar Clindamicina, para Eikenellacorrodens. Agar GMC (Gelatina, Metronidazol y Cadmio), para el asilamiento de Actynomicesviscosus, Actynomicesodontolyticus. Agar TCBS, para Vibriumcholerae. Agar Sabouraud, para hongos. Actynomicesnaeslundi y

2.3. MEDIOS DIFERENCIALES: Son los medios que permiten evidenciar las actividades bioqumicas de un microrganismo frente a sustrato determinado, cambiando sus caractersticas observables y permitiendo su identificacin. Ejemplos: Medio Ox Ferm, para procesos de Oxidacin y Fermentacin. Citrato de Simmons, para determinar el uso del citrato como fuente decarbono. TSI (Triple Azcar Hierro), para determinar el uso de Lactosa, Glucosa y produccin de H2S. LIA (Lisina Agar), para determinar el metabolismo de la Lisina. Agar Manitol Salado, para determinar la reaccin con el Manitol.

Agar Urea. Agar SIM.

2.4. MEDIOS DE TRANSPORTE: Medios especiales que mantienen viables a los microrganismos y permiten su transporte desde el lugar de muestra hasta el laboratorio. Ejemplos: Medio Cary Blair. Medio Stuart. Medio Amies. Caldo Hajna. Caldo de Tioglicolato.

A veces se combina las caractersticas de cada un de estos medios y por lo tanto el medio resultante ser Enriquecido, Selectivo y Diferencial. Esta clasificacin es flexible y se plantea con fines didcticos.

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO MATERIALES: Agar comn deshidratado. Placas Petri. Tubos de ensayo. Mechero. Algodn. Gasa. Papel kraft. Hilo pavilo. Matraces o balones. Cocina elctrica. Plumn marcador.

PROCEDIMIENTO Pesar los medios respectivos en relacin con los volmenes requeridos. Disolver los medios en agua destilada y hervir en un matraz. Esterilizar en autoclave a 121C/15PSI por 15. Repartir en placas y tubos dentro del rea de seguridad que brinda el mechero. Se comprueba la esterilidad de los medios colocndolos en la estufa a 37C por 24 horas.

CUESTIONARIO 1. Investigue y seale la composicin del Agar Nutritivo y Agar Sangre. 2. Indique 05 medios de cultivo selectivos y su importancia. 3. esquematice las precauciones que se debe tener en la preparacin de los medios de cultivo: pesado, preparado y autoclavado. 4. Esquematice y dibuje lo realizado.

PRCTICA N04 SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS LECTURA E INTERPRETACIN DE COLONIAS OBJETIVOS: Conocer e identificar las diferentes tcnicas de siembra y aislamiento de muestras microbianas en medios de cultivo. Conocer e identificar los tipos y caractersticas de crecimiento bacteriano en medios de cultivo para su identificacin final.

INTRODUCCIN I. SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS

Cuando las bacterias se siembran en un medio de cultivo y en condiciones adecuadas, ocurre un incremento marcado del nmero de clulas. Algunas especies alcanzan una poblacin mxima a las 24 horas y otras necesitan un periodo prolongado para alcanzar su mximo desarrollo. Por esta razn la siembra es uno de los pasos principales e iniciales del estudio completo de un microrganismo y es indispensable ejecutarlo cumpliendo con las mximas condiciones de esterilidad, desde la toma de muestra hasta la siembra, que debe ser efectuada a la brevedad posible. Es necesario precisar algunos trminos: SIEMBRA: Es el procedimiento por el cual se pone en contacto un microrganismo con el medio de cultivo. Si el medio es slido se formarn colonias y si el medio es lquido se observar turbidez, sedimento, pelcula, etc. RESIEMBRA O AISLAMIENTO: Consiste en extraer, con un asa o aguja de klle, una fraccin de colonia y sembrarla en un medio lquido o slido, logrando as la pureza del cultivo. TRANSPLANTE O REPICAJE: Consiste en la separacin primaria de la cepa a un medio de cultivo adecuado contenido en un tubo. Conservndose la cepa pura y por seguidos transplantes en medios especiales, se conocer las propiedades culturales y bioqumicas, logrndose su identificacin especfica de aquella. Los transplantes se pueden realizar: a) b) c) d) De lquido a slido. De lquido a lquido. De slido a lquido. De slido a slido.

COLONIA: Es el conjunto de microrganismos resultantes del crecimiento y multiplicacin en un medio de cultivo slido, y que est constituido por un mismo tipo de microrganismos.

CULTIVO PURO: Cultivo que consta de una sola especie bacteriana a partir de la cual se estudia sus caractersticas morfolgicas, fisiolgicas y bioqumicas. CEPA: Es un cultivo puro plenamente identificado y ubicado en su taxonoma correspondiente. MUESTRA BIOLGICA: Es cualquier material biolgico de origen humano susceptible de conservacin y que alberga microrganismos. Pueden ser: sangre, orina, esputo, heces, LCR, uas, pelos, fluido gingival, paca dental, saliva, abscesos, etc. TCNICAS DE SIEMBRA La tcnica de siembra a utilizar vara segn el medio de cultivo a usar, ya sea lquidos o slidos. Si es lquido la Siembra por Inoculacin ser la indicada; si el medio es slido las tcnicas a usar pueden ser Estra Simple, Por Puntura, Por Incorporacin o Por Dispersin o Agotamiento.

SIEMBRA POR INOCULACIN Con el asa de siembra previamente esterilizada, tomar una cantidad suficiente de inculo y ponerla en contacto con el medio lquido.

SIEMBRA POR ESTRA SIMPLE til para estudio bioqumico y desarrollo bacteriano. Consiste en deslizar suavemente, en zigzag, el asa de siembrasobre el medio de cultivo slido contenido en una placa Petri o tubo.

SIEMBRA POR PUNTURA O PICADURA Sirve para estudio bioqumico bacteriano. Con la aguja de kolle, tomar una pequea cantidad de muestra y sembrar introduciendo la aguja hasta cerca del fondo del tubo que contiene medio slido(a); despus al momento de retirar la aguja de abajo hacia arriba hacer una estra simple(b).

a) b)

SIEMBRA POR INCORPORACIN Tcnica que sirve para el recuento de bacterias y determinar si son anaerbicas facultativas o microaerfilas. Consiste en diluir la muestra y aadir el medio de cultivo licuado y enfriado a 45C, luego repartir la mezcla en placas Petri, dejar enfriar e incubar.

SIEMBRA POR DISPERSION O AGOTAMIENTO Tcnica utilizada para obtener colonias aisladas y consiste en repartir el inculo sobre la superficie del medio slido en zigzag en 4 o 5 campos de la placa o tambin por estra simple en toda la placa.

Giro de placa

45

45 45

45

MATERIALES Agar TSA en placas y tubos. Caldo nutritivo. Mechero. Asas de siembra. Aguja de klle. Hisopos. Solucin salina fisiolgica. Tubos de ensayo Lminas portaobjetos.

PROCEDIMIENTO Identificar la tcnica adecuada para la siembra y proceder a realizarla ya sea en un medio lquido o slido. Siempre con el asa o aguja de siembra esterilizada antes y despus de su uso. La boca de los tubos se flamean al destaparlos y antes de volver a tapar. Las manipulaciones de siembra se deben realizar en el rea de seguridad que brinda el mechero.

Una vez realizada la siembra y rotuladas las placas y tubos, proceder a incubar en la estufa a 37C por 24 horas, al cabo de las cuales se hace la lectura correspondiente.

LECTURA E INTERPRETACIN DE COLONIAS Si se han seguido correctamente las tcnicas de siembra y cultivo, sobre algunos planos del medio, se podr visualizar masas microbianas definidas y separadas entre si, llamadas colonias en medio slido; y turbidez, sedimento, pelcula o flculos en medio lquido. Cada colonia es el resultado de la multiplicacin logartmica de una bacteria depositada en un punto del medio slido, que en condiciones ptimas de crecimiento forman una progenie con sus caractersticas de especie o de grupo, las cuales nos permitirn su identificacin. Las principales caractersticas morfolgicas que presentan las colonias son: FORMA: Circular, elptica, puntiforme y filamentosa. ELEVACIN: Plana, convexa, acuminada, umbilicada. BORDE: Entera, ondulado, dentado, filamentoso. SUPERFICIE: Lisa, rugosa, granulada. TAMAO: Dimetro en milmetros. CONSISTENCIA: Cremosa, membranosa, mucosa. CROMOGENENESIS: Pigmentacin verde, amarilla, roja, etc. GRADO DE TRANSPARENCIA: Transparente, translcido, opaco.

MATERIALES Cultivos en placa Petri, sembradas por tcnicas diversas. Cultivos en medio diferenciales de diferentes microrganismos. Set de coloracin Gram. Lpices. Gradilla. Microscopio. Aceite de cedro.

PROTOCOLO

TCNICA DE SIEMBRA ESTRA SIMPLE DISPERSIN AGOTAMIENTO PUNTURA INOCULACIN

CARACTERISTICAS DE LA COLONIA

DESCRIPCIN DE LA SIEMBRA

MEDIO DE CULTIVO USADO

OBSERVACIN DE COLONIAS

MEDIO DE CULTIVO USADO

FORMA ELEVACIN BORDES SUPERFICIE TAMAO CONSISTENCIA CROMOGNESIS GRADO DE TRANSPARENCIA RESULTADO DE SIEMBRAS REALIZADAS:

CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4. Cul es el fin de usar una siembra por estra simple? Cul es el objetivo de la siembra por estra por dispersin o agotamiento? Para qu sirve la siembra por puntura? De sus placas y tubos sembrados, describa las caractersticas morfolgicas de las colonias encontradas. 5. Esquematice las observaciones de la prctica.

PRCTICA N05 PRIMERA PRCTICA CALIFICADA

PRCTICA N06 METABOLISMO BACTERIANO

OBJETIVOS: Reconocer e identificar los diferentes sistemas enzimticos usados en el metabolismo bacteriano. Utilizar las caractersticas metablicas para el aislamiento e identificacin bacteriana.

INTRODUCCIN La identificacin bacteriana en forma inicial pude realizarse mediante la determinacin de las caractersticas de las colonias y a travs de las diferentes tinciones; sin embargo para identificar una bacteria desconocida a nivel de gnero y especie, no basta con un aislamiento, sino que deben llevarse a cabo ciertos estudios de los sistemas enzimticos que son nicos para cada gnero y especie y sirvan como marcadores de identificacin. A nivel de laboratorio, estos sistemas enzimticos se van a identificar sembrando una porcin de colonia bacteriana aislada en los diferentes medios de cultivos que contienen sustrato e indicadores qumicos especficos que nos permiten detectar cambios de pH o la presencia de subproductos especficos, caractersticas que nos permitirn la identificacin bacteriana. I. REACCIONES DE OXIDACION FERMENTACION DE AZUCARES

MEDIO TSI (Triple SugarIron) Este medio de cultivo fue diseado para la diferenciacin de bacilos gramnegativos, basndose en la capacidad de estas bacterias para fermentar azcares, producir sulfuro de hidrogeno (H2S) y producir Gas. El medio contiene tres carbohidratos: glucosa, lactosa y sacarosa en proporciones de 1:10:10 respectivamente, y para detectar los productos cidos generados, se emplea u indicador de pH, el rojo fenol, cuyo rango de viraje est entre pH 8.4 (rojo) y pH 6.8 (amarillo). Los patrones de fermentacin de los bacilos gramnegativos ante los azcares presentes en el medio, pueden ser fundamentalmente tre: a) Fermentacin de glucosa nicamente. b) Fermentacin de glucosa + lactosa, glucosa + sacarosa o glucosa + ambos carbohidratos. c) No fermentacin de carbohidratos. Como producto de fermentacin de los azucares, se puede formar Gas, que se detecta por la presencia de burbujas, grietas o desplazamientos del medio de cultivo en el tubo.

De igual manera al medio se le ha adicionado Tiosulfato de Sodio como fuente de azufre para generar H2S, y sales de hierro que al reaccionar con el gas forman un precipitado de color negro insoluble denominado Sulfuro ferroso (FeS). MATERIAL Tubo con TSI en plano inclinado. Cepas de control: Escherichiacoli,StaphylococcusaureusySalmonellatyphi.

PROCEDIMIENTO Con el asa de kolle, haga una siembra por puntura en el tubo con TSI. Rotular e incubar a 37C por 24 horas.

INTERPRETACION 1. FERMENTACIN DE AZUCARES Alcalina/alcalina: Lactosa y Sacarosa (-), Glucosa (-)(K/K): Rojo/rojo o anaranjado Ejemplo: Pseudomonas Acida/Acida: Lactosa y Sacarosa (+) y Glucosa (+)(A/A):Amarillo/ amarillo Ejemplo: E. coli, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter, etc Alcalina/Acida: Lactosa y Sacarosa (-) y Glucosa (+)(K/A): Rojo/amarillo Ejemplo: Salmonella (H2S+), Shigella (H2S -), Yersinia.

2. PRODUCCION DE H2S Produccin de pigmento negro en fondo de tubo: No pigmento negro en fondo de tubo:

H2S (+) H2S (-)

3. PRODUCCION DE GAS Presencia de burbujas, grietas o desplazamiento en medio : No burbujas, no grietas, no desplazamientos: II. PRUEBA DE LA CATALASA

Gas (+) Gas (-)

La Catalasa es una enzima que posee la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas y que va a convertir el perxido de hidrgeno (H2O2) en agua y oxigeno, de acuerdo a la siguiente reaccin: 2H2O2 2H2O + O2

El perxido de hidrogeno es uno de los productos finales del metabolismo oxidativo de los carbohidratos y si se acumula es letal para el microorganismo. Esta prueba es vital para la diferenciacin de los estreptococos (catalasa negativa) y los estafilococos (catalasa positiva) MATERIALES Cepas control: S. aureus y Streptococcus o Enterococcus. Solucin de perxido de hidrogeno (H2O2) al 3%. Lminas portaobjeto. Asa de siembra. Gotero.

PROCEDIMIENTO Con el asa de siembra estril, transferir parte el inculo a una lmina portaobjeto. Aadir 1 o 2 gotas de H2O2 al 3%. Observar si se forman burbujas o no inmediatamente despus de aadir las gotas de H2O2 al 3%. Descartar la lmina en un recipiente con desinfectante. Precauciones: La prueba debe realizarse en cultivos hasta de 24 horas, cultivos ms viejos pueden perder su actividad catalasa dando un falso negativo. Adems evitar el contacto de perxido de hidrogeno con la piel.

INTERPRETACION Formacin de burbujas o efervescencia No formacin de burbujas y efervescencia : Catalasa Positiva. : Catalasa Negativa.

Nota: Algunas bacterias poseen enzimas diferentes a la catalasa que descomponen el H2O2 dando pocas burbujas diminutas durante 20 30, estas no son Catalasa positiva. III. PRUEBA DE LA CITOCROMO OXIDASA

Los Citocromos son hemoprotenas que actan como ltimo eslabn de la cadena respiratoria aerobia, transfiriendo electrones (H) al oxigeno con formacin de agua. Este sistema de citocromos se encuentran en los microrganismos aerobios y anaerobios facultativos, permitindonos identificar a los microrganismos que carecen de la enzima y los anaerobios anaerobios estrictos. En laboratorio se ahce reaccionar a la bacteria con un sustrato oxidable como el dimetil o tetrametil - p fenilendiamina (Reactivo de Kovacs), y que se presenta en solucin, discos o tiras llamados comnmente oxidasa.

MATERIAL Cepa control: sembrada previamente en agar nutritivo. Reactivo oxidasa. Goteros.

PROCEDIMIENTO Mtodo Directo: Se aade directamente a las placas sobre las colonias bacterianas 02 o 03 gotas del reactivo oxidasa.

INTERPRETACION Colonias bacterianas con actividad citocromo oxidasa viran a color lavanda : Oxidasa Positivo Colonias bacterianas sin actividad citocromo oxidasa no viran de color : Oxidasa Negativo PRUEBA DEL MANITOL

IV.

Para esta prueba se utiliza el agar manitol salado, medio de cultivo selectivo y diferencial que permite el crecimiento de estafilococos, y que en su composicin cuenta con el sustrato Manitol, el cual tras su fermentacin se libera cidos que sern detectados por el indicador rojo fenol el cual har viraje a color amarillo. Esta prueba permite diferenciar Staphylococcusaureus del Staphylococcusepidermidis y otras especies perteneciente a este gnero bacteriano. MATERIAL Cepas de S.aureus y S. epidermidis. Placas Petri con agar manitol salado. Asas de siembra.

PROCEDIMIENTO Realizar siembra por estra simple de ambas cepas bacterianas. Rotular e incubar a 37C por 24 horas.

INTERPRETACION :A la observacin macroscpica de las colonias bacterianas en agar manitol salado: Presencia de colonias amarillas y medio con halos de color amarillo : Manitol Positivo Presencia de colonias blancas o cremas con medio sin cambio de color: Manitol Negativo

V.

PRUEBA DE LAS HEMOLOSINAS

Algunos microorganismos tienen la capacidad de producir enzimas y toxinas que pueden ser detectadas al sembrar los microorganismos en placas con Agar Sangre, produciendo la lisis de los eritrocitos. Esta capacidad de los microorganismos se relaciona directamente con su virulencia y patogenicidad. Ahora segn el tipo de lisis que producen se pueden clasificar en Hemolisinas Alfa, que producen una lisis parcial o incompleta de eritrocitos; y Hemolisinas Beta, productoras de una lisis total o completa. MATERIAL Cepa bacteriana. Placas con Agar Sangre.

PROCEDIMIENTO Con el asa de klle realizar una siembra por estria simple en una placa con agar sangre. Incubar a 37C por 24 horas.

INTERPRETACION Hemlisis Parcial ------- Presencia de halos verduzcos grisceos -------- Hemlisis Alfa Hemlisis Total ------- Presencia de halos transparentes -------- Hemlisis Beta No hemlisis ------- No presencia de halos -------- Hemlisis Gamma En la hemolisis alfa, el enverdecimiento del medio se debe a la salida de un derivado del tipo de la metahemoglobina, que al ser oxidado ser convierte en un compuesto del tipo de la biliverdina. VI. PRUEBA DE LA COAGULASA

La coagulasa es una protena producida por varios microorganismos que permite la conversin del fibringeno en fibrina. En el laboratorio, se usa para distinguir entre diferentes tipos de Staphylococcus. Un resultado de coagulasa positivo indica que la muestra contiene S. aureus. La coagulasa reacciona con la protrombina en la sangre. El complejo resultante se llama staphylothrombina, y permite que la enzima proteasa convierta el fibringeno en fibrina. Esto hace que se coagule la sangre. La coagulasa est estrechamente relacionada con la superficie de la bacteria S. aureus y puede revestir su superficie con fibrina al entrar en contacto con la sangre. Se cree que est cubierta de fibrina del Staphylococcus es capaz de resistir la fagocitosis haciendo que esta bacteria tenga un factor de virulencia mayor.

MATERIALES VII. Cepa de S.aureus y S. epidermidis. Tubos con plasma sanguneo. Asas de siembra.

PROCEDIMIENTO Con el asa de klle, realizar una siembra por inoculacin en los tubos de plasma sanguneo. Incubar a 37C por 4 horas.

INTERPRETACION Si hay coagulacin de plasma ------No hay coagulacin de plasma ------PROTOCOLO Coagulasa Positivo Coagulasa Negativo

PRUEBA BIOQUIMICA TSI: a) b) c) d) Glucosa: Lactosa: H2S Gas

MEDIO DE CULTIVO

REACTIVO O INDICADOR

LECTURA

CATALASA

CITOCROMO OXIDASA

MANITOL

HEMOLISINAS

COAGULASA

CUESTIONARIO: Esquematice y grafique los resultados obtenidos en la lectura de las pruebas bioqumicas anteriormente realizadas.

PRCTICA N07 ACCIN DE AGENTES FISICOQUMICOS SOBRE EL CRECIMIENTO BACTERIANO ANTIBIOGRAMA OBJETIVOS: Reconocer e identificar los factores fsicos qumicos que influyen sobre el crecimiento bacteriano. Conocer e identificar el uso del antibiograma para determinar sensibilidad bacteriana a frmacos antibiticos.

INTRODUCCIN Hasta ahora hemos venido considerando el crecimiento de las bacterias en funcin de su fondo gentico, en relacin con los nutrientes, y en unas hipotticas condiciones ideales (ptimas). Sin embargo, el trabajo experimental con microorganismos ha de tener en cuenta los factores ambientales, es decir, una serie de agentes fsicos y qumicos que: 1. Modifican la velocidad de crecimiento, provocando cambios que, a determinados valores de dichos factores pueden llegar a ocasionar la muerte de microorganismos; 2. Condicionan la distribucin de los microorganismos en sus ecosistemas y hbitats naturales. 3. Permiten a los humanos controlar el crecimiento microbiano, por medio de la fijacin de parmetros para: a) La mutagnesis. b) La esterilizacin y desinfeccin. c) La quimioterapia. No todos los microorganismos toleran del mismo modo un determinado factor ambiental. As, unas determinadas condiciones pueden ser nocivas para una especie bacteriana, y en cambio ser neutras o beneficiosas para otra. Adems conviene distinguir entre los efectos que un determinado agente puede tener sobre la viabilidad y los efectos que pueden simplemente afectar al crecimiento, a la capacidad de diferenciacin (si la hubiera) o de reproduccin.Los principales tipos de factores a considerar son: Agentes Fsicos Temperatura Desecacin Radiaciones Ondas sonoras Presin hidrosttica Presin osmtica Agentes Qumicos Desinfectantes y antispticos Quimioterpicos de sntesis Antibiticos

El Antibiograma es una prueba en laboratorio clnico que se utiliza para medir la actividad antibacteriana de los antibiticos y quimioterpicos empleados, permite por lo tanto seleccionar el antibitico o quimioterpico mas adecuado para la terapia de enfermedades infecciosas. Consiste en sembrar la muestra de estudio sobre la superficie de una placa de Agar MellerHinton o TSA, y luego colocar discos de sensibilidad que contienen antibiticos y despus de una incubacin de 24 horas se observan las zonas de inhibicin alrededor del disco. En la presente prctica, el mtodo utilizado es le Difusin en Agar, segn Kirby Bauer y col. MATERIALES Placas con Agar TSA. Placas con Agar MellenHinton Tubos con caldo nutritivo Tubos y placas con cultivo bacterianos Asas de siembra. Hisopos estriles. Discos de papel filtro. Discos de sensibilidad antibitica para grampositivos. Discos de sensibilidad antibitica para gramnegativos Pinza porta algodn. Mechero. Vasos dapen Agua oxigenada Eugenol Savlon Alcohol medicinal Alcohol yodado

PROCEDIMIENTO 01: DISCOS IMPREGNADOS CON DESINFECTANTES Y ANTISEPTICOS . Hacer siembra por difusin en una placa con agar TSA. Con la pinza porta algodn, coger los discos y sumergirlos en los vasosdapenconteniendo los desinfectantes y antispticos. Colocar los discos impregnados con los diferentes desinfectantes y antispticos sobre la superficie del agar, en forma equidistante. Incubar a 37C durante 24 horas Lectura y medicin en mm de las zonas de inhibicin.

PROCEDIMEINTO 02: TUBOS INOCULADOS VS TEMPERATURA Inocular los tubos con caldo nutritivo. Colocar el Tubo 1 en bao maria a 37C durante 15 minutos.

Colocar el Tubo 2 en bao maria a 70C duarnte 15 minutos. Incubar ambos tubos a 37C durante 24 horas. Lectura de crecimiento bacteriano.

PROCEDIMEINTO 03: ANTIBIOGRAMA Sumergir los hisopos estriles en los cultivos bacterianos, escurrirlos en las paredes del tubo y sembrar uniformemente sobre la superficie del Agar MellenHinton. Dejar reposar 5 minutos a temperatura ambiente. Con la pinza estril, colocar los discos impregnados con antibiticos sobre la superficie del agar. La distancia entre los discos debe ser de 20 mm. Incubar a 37C durante 24 horas. Lectura: o Medir en mm el dimetro de las zonas de inhibicin del desarrollo bacteriano alrededor de los discos, incluyendo el dimetro del disco. o Comparar con la tabla el dimetro de las zonas de inhibicin obtenidas y determinar la sensibilidad del microorganismo: Resistente (R), Intermediio (I) o Susceptible (Sensible) (S), a los diferentes antimicrobianos utilizados. o Anotar e interpretar los resultados.

CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4. 5. Desarrollar y esquematizar un cuadro indicando los resultados obtenidos en la prctica. Mediante dibujos o fotografas, fundamentar los resultados del cuadro anterior. Cual es la importancia de la aplicacin del antibiograma? Qu indica la Resistencia o Susceptibilidad de un microrganismo en un antibiograma? Qu indica un resultado Intermedio en esta prueba?

PRCTICA N08 INMUNOLOGIA REACCION ANTIGENO ANTICUERPO - FAGOCITOSIS OBJETIVOS: Reconocer, identificar y describirlas fases de la fagocitosis. Reconocer la aglutinacin como una reaccin antgeno anticuerpo.

INTRODUCCION La aglutinacin es un proceso inmunolgico resultante de una reaccin antgeno anticuerpo, en el que uno de los reactantes es de naturaleza particulada, de tamao grande. Estas partculas pueden ser bacterias, eritrocitos, partculas de ltex, etc., y se encuentran recubiertas en forma natural o artificial por antgenos o anticuerpos. Al ser suspendidas en un medio salino y mezclarse con antisueros o antgenos especficos, formaran los respectivos complejos Ag-Ac observables a simple vista o con lentes de poco aumento. Existen muchos mtodos para demostrar la aglutinacin, de los ms conocidos son la Determinacin del Grupo Sanguneo y la Prueba de Widal (aglutinacin bacteriana). REACCION ANTIGENO ANTICUERPO I. DETERMINACION DE GRUPO SANGUINEO

Es un mtodo para decirle cul es el tipo especfico de sangre que usted tiene. El tipo de sangre que usted tenga depende de si hay o no ciertas protenas, llamadas antgenos(Aglutingenos), en sus glbulos rojos, los cuales al ponerse en contacto con los Anticuerpos (Aglutininas), van a formar el complejo Ag-Ac que ser visible a travs de la aglutinacin.La sangre a menudo se clasifica de acuerdo con el sistema de tipificacin ABO. Este mtodo separa los tipos de sangre en cuatro categoras:Tipo A, Tipo B, Tipo AB y Tipo O. El tipo de sangre (o grupo sanguneo) depende de los tipos que haya heredado de sus padres. MATERIALES 01 Lanceta. 01 Micropipeta. 01 Placa de toque. Antisueros Anti A, Anti B y Anti D. Palitosmondadientes. Alcohol yodado. Algodn.

PROCEDIMIENTO Con una lanceta realizar un pequea injuria en el pulpejo del ndice derecho. Con una micropipeta tomar 03 gotas de sangre y colocarlas en la placa de toque. Colocar una gota de cada uno de los antisueros (Anti A, Anti B y Anti D) en las gotas respectivas. Mezclar con la ayuda de un mondadiente distinto para cada una de las gotas. Rotar la placa de toque durante 2 o 3 minutos y observar la presencia de aglutinacin.

INTERPRETACION Tipificacin ABO: Si sus glbulos sanguneos se pegan o aglutinan al mezclarse con:

Suero anti-A, usted tiene sangre tipo A. Suero anti-B, usted tiene sangre tipo B. Sueros anti-A y anti-B, entonces usted tiene sangre tipo AB.

Si los glbulos sanguneos no se pegan o aglutinan cuando se agrega suero anti-A y anti-B, usted tiene sangre tipo O. Tipificacin del Rh:

Si los glbulos sanguneos se pegan o aglutinan al mezclarlos con suero anti-Rh (Anti D), usted tiene sangre de tipo Rh positivo. Si la sangre no coagula al mezclarse con suero anti D, usted tiene sangre de tipo Rh
negativo.

PRUEBA DE WIDAL La reaccin de Widal demuestra la presencia de anticuerpos aglutinantes (aglutininas) contra los antgenos H (flagelar) u O (somtico) de la Salmonella typhi en el suero de los pacientes con fiebre tifoidea. En la reaccin de Widal, tambin hay que considerar los falsos negativos como toda prueba de laboratorio, entre sus causas tenemos: Antibioticoterapia temprana, la cual, retrasa la aparicin de anticuerpos (descrito principalmente con cloranfenicol). Utilizacin de corticosteroides. Medicin temprana de anticuerpos (primera semana). Inmunodeficiencias adquiridas y congnitas. Portadores crnicos de Salmonella typhi. Relacionadas a estandarizacin de la prueba.

MATERIALES Lmina excavada para aglutinacin. Antgenos bacterianos: Tifico O y Tifico H. Suero del paciente. Piepetas serolgicas de 0.2 ml. Palitos mondadientes.

PROCEDIMIENTO Con la pipeta colocar una gota del suero problema, en cada uno de los pocillos de una lmina de vidrio excavada. Agregar una gota de cada uno de los antgenos a cada gota de suero del paciente. Mezclar con ayuda de un mondadiente distinto para cada gota. Hacer rotar la lmina por espacio de 2 a 3 minutos y realizar observacin.

INTERPRETACION La aglutinacin se observa por la aparicin de grumos de tamao variable que tienden a agruparse en la periferia de la gota. II. FAGOCITOSIS

Esun tipo de endocitosis por el cual algunas clulas rodean con sumembrana citoplasmtica partculas slidas y las introducen al interior celular, formando alrededor de l una vescula, llamada fagosoma, la cual se fusiona posteriormente con lisosomas ( fagolisosoma) para degradar el antgeno fagocitado. Es un fenmeno inespecfico, que se incrementa cuando intervienen anticuerpos especficos y complementos. Entre las clulas fagociticas se encuentran los polimorfonucleares y los macrfagos (monocitos libres). A estas sustancias que demuestran habilidad para hacer a los antgenos ms susceptibles a la fagocitosis de les denomina Opsoninas. Las fases de la fagocitosis son: a) Quimiotaxis: las clulas fagocitarias se acercan a los antgenos. b) Adherencia: La unin a receptores sobre la membrana de los leucocitos y otros fagocitos actan como mecanismos de adherencia sobre los microorganismos, sea a productos microbianos especficos o sobre opsoninas del sistema inmune del hospedador. c) Ingestin:La unin a receptores de adherencia promueve seales de comunicacin intracelular que resultan en la evaginacin de la membrana del fagocito rodeando al receptor y su ligando patognico, formando el Fagosoma. d) Digestin:Intervienen los lisosomas, los cuales se unen al fagosoma conformando un fagolisosoma, y liberando enzimas hidrolticas que destruirn al antgeno. e) Excrecin: La forma de deshacerse de estos residuos es mediante la exocitosis.

FAGOCITOSIS IN VIVO MATERIALES Cultivo de Candida. Ratones. Estuche de diseccin. Lminas portaobjetos. Jeringa de tuberculina. Cmara de ter. Colorante Wright. Agua tamponada. Alcohol yodado. Algodn.

PROCEDIMIENTO Inocular un ratn albino con 0.5 ml de cultivo de candida calentado por viaintraperitoneal. Dejar el ratn en reposo por unas 03 horas, controlndosele peridicamente. Sacrificar el ratn con la ayuda de la cmara de ter y ubicarlo de cubito dorsal sobre un campo e papel kraft de 30x30. Realizar una incisin vertical a lo largo del abdomen y exponer las vsceras. Con la lmina portaobjeto hacer una impronta del lquido peritoneal y fijarla a temperatura ambiental. Realizar Coloracin Wright. Observar al microscopio con el objetivo de inmersin. Identificar las clulas fagocitarias y las fases de la fagocitosis.

CUESTIONARIO 1. Elabore un cuadro con los resultados obtenidos en la prctica. 2. Grafique los procedimientos realizados en la prctica de laboratorio.

PRCTICA N09 EXAMEN PARCIAL

PRCTICA N10 BACTERIAS GRAMPOSITIVAS OBJETIVOS: Reconocer, identificar y describir los principales gneros y especies bacterianas grampositivas. Identificar y describir las principales pruebas bioqumicas utilizadas para el reconocimiento delas bacterias grampositivas.

GNERO STAPHYLOCOCCUS Los estafilococos pertenecen a la Familia Micrococcaceae, y son microorganismos grampositivos en cultivos jvenes, de forma esfrica o redonda, agrupados generalmente en forma de racimos, no esporulados y anaerobios facultativos. Son habitantes naturales de la flora nasofarngea, piel e intestinos; y relacionado con procesos infecciosos supurativos (fornculos y abscesos), intoxicaciones alimentarias hasta septicemias mortales.Las especies ms conocidas son S. aureus, S. epidermidis y S. saprophyticus; siendo la primera la ms patgena y la nica en producir Coagulasa. MATERIALES Tubos con secrecin purulenta. Tubos estriles. Placas Petri con agar manitol salado. Placas con agar sangre. Tubos con caldo nutritivo. Lminas portaobjetos. Set coloracin Gram. Asa de siembra en aro. Microscopio y aceite de inmersin.

PROCEDIMIENTO Sembrar la muestra problema en placas con agar manitol salado y agar sangre, empleando el mtodo de estra por agotamiento. Llevar las placas sembradas a incubacin a 37C por 24 horas. Realizar un frotis de la muestra y colorearla con Gram. Sembrar por inoculacin los tubos con caldo plasma e incubar a 37C, para la prueba d elacoagulasa. Realizar la prueba de la catalas Observar las placas incubadas, identificando las caractersticas de las colonias (tamao, forma, borde, cromognesis, manitol, hemlisis, etc).

RESULTADOS Caractersticas macroscpicas de la muestra. Observacin microscpica de coloracin Gram. Resultado de la Reaccin de Coagulasa. Resultado de la reaccin de catalasa. Resultado de la reaccin de manitol. Observar la presencia de hemlisis.

PROTOCOLO Realizar un protocolo de trabajo indicando: especie bacteriana, tamao de la colonia, forma, pigmento, hemolisis y otras caractersticas que crea conveniente. Complete el cuadro con lo realizado durante la prctica. CEPA BACTERIANA TRABAJADA

MS

AS

COAGULASA

CATALASA

GRAM

MORFOLOGIA

GNERO STREPTOCOCCUS Este gnero comprende muchas especies agrupadas segn la clasificacin de Lancefield en los grupos A (S. pyogenes), B (S.agalactiae), C (S.equi), D (Enterococos), G (S.canis), H (S.sanguis), K (S. salivarius) y Streptococcuspneumoniae (no pertenece a ningn grupo). Son esfricos o redondos, grampositivos, adoptan forma de cadenas y son generalmente anaerobios facultativos pero tambin existen algunas especies anaerobias estrictas (Peptoestreptococcus). Algunos son patgenos para el hombre y los animales, otros forman parte de la flora normal o transitoria del cuerpo humano y otros son saprofitos. Los estreptococos se desarrollan en medios enriquecidos como el agar sangre, que permite diferenciar algunas especies en base a la hemlisis producida ( hemlisis, hemlisis o hemlisis). Asimismo son numerosas las pruebas bioqumicas que permiten la diferenciacin de las especies de Streptococcus. Es necesario destacar la existencia del Grupo Estreptococos Viridans donde se incluyen a todos los estreptococos de la cavidad oral. Son hemolticos MATERIALES Cultivo de Estreptococos. Placas con agar sangre. Hisopos estriles. Bajalenguas. Viales estriles. Set de coloracin Gram. Asas de siembra. Microscopio y aceite de inmersin.

PROCEDIMIENTO Sembrar la muestra de estreptococos en la placa Petri con agar sangre. Tomar muestra de secrecin farngea y sembrar en agar sangre. Incubar ambas placas a 37C por 24 horas. Realizar frotis de la muestra en una lmina portaobjeto y colorearla con Gram.

RESULTADOS Observar las placas con agar sangre y determinar que colonias son sospechosas de estreptococcus. Realizar frotis y colorear con Gram. Determinar el tipo de hemlisis. A la observacin microscpica determinar tipo de Gram y morfologa.

PROTOCOLO

MICROORGANISMO

AS

TIPO DE HEMLISIS

MORFOLOGA DE COLONIA

GRAM

MORFOLOGIA BACTERIANA

S. pyogenes

S.agalactiae

S. pneumoniae

Grupo Viridans

CUESTIONARIO 1. Qu factores determinan la patogenicidad de Staphylococcusaureus? 2. Qu caractersticas fisiolgicas identifican aStaphylococcusaureus? 3. Mediante un mapa conceptual identifique los cuadros infecciosos producidos por las especies de estafilococos. 4. Fundamente Usted los tipos hemlisis producidas por los Streptococcus. 5. Qu patologa producen los estreptococos hemolticos? 6. Mediante un mapa conceptual identifique los cuadros infecciosos producidos por las especies de estreptococos.

PRCTICA N11 BACTERIAS GRAMNEGATIVAS OBJETIVOS Identificar y diferenciar las especies de Neisserias mediante las diferentes tcnicas de laboratorio. Identificar y diferenciar las diferentes enterobacterias utilizando diferentes tcnicas de laboratorio. INTRODUCCION GNERO NEISSERIA El gnero Neisseria agrupa a microorganismos de inters estomatolgico ya que se les encuentra en gran nmero en la mucosa orofarngea, adems la especie N. gonorrhoeae puede producir lesiones a nivel de la mucosa oral. Son cocos gramnegativos que se disponen en pares (diplococos) de aspecto arrionado de 0.6 a 1.5 micras, poco resistentes a las condiciones ambientales y de requerimientos nutricionales exigentes y requieren de temperatura ptima de 37C. Son aerobias estrictas (en su mayora), microaerfilas y anaerobias facultativas. Todas las Neiserias son Oxidasa positiva, no esporulados, no presentan movilidad y algunas especies son encapsuladas y presentan fimbrias. La mayora fermentan carbohidratos, producen cidos y no producen gas. De acuerdo a su patogenicidad, se clasifican en: a) Neisserias de Flora Oral Normal (No Patgenas): Forman parte de la microbiota normal de la mucosa nasofarngea, destacndose N. flavescens, N. cirenea, N. elongata, N. sirca, N. subflava, N. mucosa y N. lactamica. b) Neisserias Patgenas para el Hombre: N. gonorrhoeae, agente etiolgico de la Gonorrea; y N. meningitidis, agente etiolgico de la meningitis. Ambas especies patgenas se encuentran relacionados con leucocitos polimorfonucleares o dentro de los mismos. Adems gonococos y meningococos tienen una homologa de ADN en 70%. MATERIALES Muestra biolgica: Secreciones uretrales, secreciones de cuello uterino,recto, orofaringe, conjuntiva y sangre (solo en infecciones generalizadas) para Neisseriagonorrhoeae. Muesra biolgica: LCR, sangre (para hemocultivo), hisopado nasofarngeo (para investigar portadores). Placas con Agar Thayer Martin. Placas con Agar Chocolate. Lminas portaobjetos. Set de coloracin Gram.

Asas de siembra en aro. Microscopio y aceite de inmersin. Agua destilada Suero fisiolgico.

PROCEDIMIENTO Obtencin de las muestras biolgicas. Siembra de las muestras en placas con agar thayermartin y agar chocolate. Incubas las placas a 37C y jarra de anaerobiosis. Realizar frotis en una lmina portaobjeto por cada muestra biolgica y colorearlas con Gram. Observacin microscpica a 1000x con aceite de inmersin.

RESULTADOS A la observacin microscpica, determinar morfologa bacteriana y tipo de Gram. Lectura de las caractersticas morfolgicas de las colonias en las placas de thayermartin y agar chocolate.

PROTOCOLO

MUESTRA BIOLOGICA

MEDIO DE CUTLIVO

MORFOLOGA DE COLONIA

GRAM

MORFOLOGIA BACTERIANA

FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE En el intestino del hombre existe una flora bacteriana constituida por Enterobacterias (Escherichiacoli, Salmonella, Shigella, Klebsiela, entre otras), microorganismos anaerobios faculattivos y aerobios, algunos de los cuales son patgenos para el hombre y causantes de diferentes enfermedades. El diagnstico y aislamiento del microorganismo causante de la enfermedad se realiza mediante el Coprocultivo, es decir el cultivo de heces en la fase evolutiva de la enfermedad, para el aislameinto del agente patgeno bacteriano. La mayora de las enterobacterias tiene una accin invasiva penetrando en la mucosa intestinal produciendo ulceraciones o abscesos, y el modo de transmisin es generalmente por ingesta de alimentos contaminados con heces humanas. Escherichiacoli, es un bacilo gramnegativo no esporulados, es miembro de la flora intestinal y en determinadas condiciones patgena para el hombre, poseen factores de virulencia que les permite causar infecciones en el tracto gastrointestinalasi como en el sistema urinario. La E.colienterotoxigenico (ECET) es la causa comn de la Diarrea del viajero y produce en el organismo enterotoxinas potentes y poseen factores de colonizacin; la E.colienteroinvasiva (ECEI) y la E.colienterohemorragica (ECEH) son causantes de diarrea sanguinolenta. Klebsiellapneumoniae, bacilos gramnegativos a veces con capsula, producen infecciones oportunistas en el husped comprometido. El tracto respiratorio y urinario son loslugares de infeccin ms frecuentes. Es difcil distinguir entre colonizacin e infeccin y son productoras de endotoxinas. Salmonella typhi, bacilo gramnegativo mvil peritrico. Son exclusivas del hombre y causan fiebre tifoidea; otras, causan infecciones intestinales y a veces septicemias como la Salmonella paratyphi A, B o C. El gnero Shigella, comprende especies bacilos gramnegativos inmviles, causan Disentera bacteriana, enfermedad que produce diarrea, moco, sangre, calambres abdominales y fiebre. La especie S. dysenteriae e la ms virulenta. El gnero Proteus, presenta especies que son bacilos gramnegativos rectos, mviles, peritricos, anaerobio facultativo. Son habitantes de la flora intestinal y otras causantes de infecciones urinarias, heridas crnicas adquiridas en ambiente nosocomial. MATERIALES Muestra de heces Muestras bacterianas diversas

Placas con Agar McConkey. Placas con Agar SS. Tubos con Agar TSI Tubos con Agar LIA. Set de coloracin Gram Lminas portaobjetos. Microscopio con aceite de inmersin. Asas de siembra en aro y en aguja. Agua destilada. Suero fisiolgico. Goteros.

PROCEDIMIENTO Realizar un estudio macroscpico de la muestra de heces (aspecto, color, presencia de sangre, moco, etc). Realizar un estudio microscpico de las muestras con tincin Gram. Realizar la siembra de las muestras en: o Placas con agar Mac Conkey, por estra por agotamiento. o Placas con agar SS, por estra por agotamiento. o Tubos con TSI, por picadura. o Tubos con LIA, por picadura. Incubar las placas y tubos a 37C por 24 horas.

RESULTADOS A la observacin microscpica, determinar morfologa bacteriana y tipo de Gram. Lectura de las caractersticas morfolgicas de las colonias en las placas y tubos con los diferentes medios utilizados. Observar los resultados de las diferentes pruebas bioqumicas en los diferentes medios utilizados.

PROTOCOLO : DIFERENCIACIN BIOQUMICA

ENTEROBACTERIA ESPECIE BACTERIANA E. coli

TSI

LIA

MC

SS

Colonia

Glu

Lac

H2S Gas

Desc. Desa.

Lactosa

Crec.

Morfologa

Klebsiella

Salmonella typhi

Shigella

Proteus

CUESTIONARIO 1. Realice esquemas de los procedimientos y resultados de lo observado en la prctica. 2. Fundamente mediante mapas conceptuales las pruebas bioqumicas referidas en la presente prctica de laboratorio.

PRCTICA N12 MICOLOGA - VIROLOGA OBJETIVOS Reconocer la metodologa para diagnosticar micosis en el laboratorio. Reconocer las principales caractersticas macro y microscpicas de los hongos. Identificar las especies de inters mdico estomatolgico. Reconocer la metodologa para el diagnstico de laboratorio para virus. Identificar virus de inters mdico estomatolgico. INTRODUCCION MICOLOGIA Ciencia que estudia a los hongos, organismos eucariotas, cuyas paredes celulares estn compuestas principalmente por Quitina, y adems porglucano, manano, celulosa, etc; es decir carbohidratos complejos. Adems son seres hetertrofos, no realizan fotosntesis (no tiene clorofila). Existen aproximadamente 150000 especies de hongos, de ellos 100 ms o menos son patgenos, otros son no patgenos y un gran grupo son utilizados en diversas industrias. Desde el punto de vista celular, los hongos pueden ser de dos tipos: Unicelulares o Levaduriformes. Pluricelulares o Miceliales.

MATERIALES Placas con Agar Sabouraud. Azul de lactofenol. Lminas portaobjetos. Microscopio binocular.

PROCEDIMIENTO Observacin de caractersticas de hongos superficiales de frutas o pan. Obtener parte de la muestra anterior y realizar coloracin con azul de lactofenol. Siembra de muestra de esputo y saliva en placa con agar sabouraud e incubar a 37C por 72 horas. Toma de muestra ambiental en placa con agar sabouraud y mantener a temperatura ambiente por 72 horas.

RESULTADOS Determinar las caractersticas morfolgicas macro y microscpicas.

Determinar las caractersticas macroscpicas de los hongos que han crecido en las placas con agar sabouraud.

VIROLOGA Ciencia que estudia a los virus, organismos parsitos intracelulares obligados, que poseen un solo cido nucleico (ADN o ARN), protegido por una estructura denominada Cpside y algunos presentan Envoltura. Para estudio en laboratorio se utiliza a los bacterifagos, descubiertos en 1915 por Twort, quien aport mucho en los estudios de organizacin y replicacin del material gentico. Existe un bacterifago para cada especiebacteriana, debida a los receptores especficos existente en las bacterias. La accin de los bacterifagos en ellas puede ser: Interaccin Ltica, donde se multiplica el virus causando lisis de la bacteria. Interaccin Transformadora, donde el genoma viral se integra al genoma del husped.

El ciclo de multiplicacin viral se divide en: Absorcin : Atraccin cnica y receptores especficos. Penetracin: Ingreso del citoplasma viral al husped. Multiplicacin, en la bacteria receptora.

Los virus respiratorios son los principales responsables de las afecciones respiratorias, que incluyen: Cuadros respiratorios altos: Virus de la Influenza y el Adenovirus. Producen resfriado comn y gripe: Rhinovirus. Afecciones de vas respiratorias bajas y bronquitis: Virus Respiratorio Sincisal. Producen Traqueitis y neumonitis: Virus de Parainfluenza.

PROCEDIMIENTO: INOCULACIN DE HUEVOS EMBRIONADOS Va Alantoidea: Visualizar al embrin en el ovoscopio, marcar el ojo del embrin y la cmara de aire. Perforar la cscara en el borde de la cmara de aire. Usando una jeringa de 01 cc con aguja calibre 22, inocular a travs de la perforacin de la cscara y en un ngulo de 45 en relacin al eje longitudinal del huevo y alejado del embrin en la zona libre de vascularizacin, inyectar 0.1 de cristal violeta como muestra.

Va Amnitica: Visualizar en la forma anterior. Perforar la cscara en el centro de la cmara de aire.

Usando una jeringa de 01 cc con aguja calibre 22, inocular a travs de la perforacin de la cscara y en direccin del embrin, inyectar 0.1 de safranina como muestra.

RESULTADO Observar sus resultados depositando el contenido del huevo embrionado en una placa Petri.

CUESTIONARIO 1. Esquematizar los resultados de los procedimientos realizados en Micologa. 2. Esquematizar los resultados de las inoculaciones realizadas.

PRCTICA N13 PARASITOLOGIA PROTOZOARIOS - METAZOARIOS

OBJETIVOS Identificar, reconocer y describir las caractersticas morfolgicas bsicas de los parsitos. Reconocer los principales parasitos protozoos. Reconocer los principales parsitos metazoos. Identificar las mtodos de diagnstico de labopratorio usados para identificar protozoos y metazoos. INTRODUCCION Las enfermedades asociadas a protozoos tienen en la actualidad una elevada incidencia en la poblacin mundial algunas de ellas acompaadas de una alta tasa de mortalidad, tal es el caso del paludismo y la tripanosomiasis africana, entre otras. Algunos protozoos intestinales como Giardialamblia y Entamoebahistolytica son causa de mal nutricin, prdida de peso y diarreas severas; otros, como Plasmodiumsp, Trypanosomasp y Leishmaniaproducen afecciones cardacas y del SNC, daan las membranas mucosas, la piel y diferentes rganos de la economa. Los ciclos de vida de los protozoos son muy variados y complejos. El conocimiento de stos permite realizar una toma de la muestraen el momento adecuado con el fin de observar el agente biolgico y con ello realizar el diagnstico certero de la enfermedad. Demostrar e identificar el agente infectante se considera la regla de oro en el diagnstico parasitolgico.

Diagnstico de los protozoos sanguneos: Dentro de los protozoos sanguneos se destacan por su incidencia e importancia epidemiolgica Plasmodiumsp, Trypanosomacruzi, Trypanosomabrucei y Leishmaniadonovanii.

Toma de la muestra: Es necesario tener en cuenta el perodo en el cual el parsito de acuerdo a su ciclo de vida, transita por la sangre (parasitemia) o se encuentra presente en determinados rganos y/o tejidos (sitios de inoculacin) en los que produce lesiones caractersticas. Atendiendo a ello las muestras pueden ser: Sangre perifrica, Tejidos, LCR, Exudado de las lesiones, Aspirado del chancro inicial o del ganglio linftico.

Mtodos de diagnstico: Pueden ser indirectos o directos. Los primeros se basan en la determinacin de la respuesta inmune del organismo ante la infeccin parasitaria a travs de pruebas inmunoserolgicas y los directos se sustentan en la observacin de las formas parasitarias. Los mtodos directos son los ms empleados. Estos pueden ser:
o

Examen en fresco de la sangre: se coloca una gota de sangre entre cubre y portaobjetos y se observa al microscopio con objetivo seco de 40x.

Frotis de la sangre: se extiende una gota de sangre sobre un portaobjeto, se seca al aire y se fija con metanol. Teimos por el mtodo de Giemsa y observamos al microscopio con objetivo de inmersin (100x).

Dentro

de

los

protozoos

intestinales

se

destacan

por

su inters clnico Entamoebahistolytica y Giardialamblia.

Toma de la muestra: La muestra ideal son las heces las que deben ser colectadas preferiblemente en un recipiente de cristal o plsticocorrectamente lavado y seco. Deben ser adems frescas (recin emitidas) y procesadas rpidamente en particular cuando queremos observar los trofozotos de estos parsitos. De no ser posible el procesamiento inmediato se deben conservar por diferentes medios que pueden ser:refrigeracin a 4C, en formol al 5 10 %, alcohol polivinlico (PVA) en una solucin de Mertiolato-yodoformol (MIF). La muestra debe ser recogida directamente sobre un papel limpio colocado en el suelo para evitar que se mezcle con la orina ya que las sustancias aqu presentes pueden daar los trofozotos. En los parasitismos es comn que no se excreten constantemente las formas parasitarias, este fenmeno est estrechamente relacionado con el ciclo de vida del parsito y se conoce como fase de excrecin negativa, por tal motivo se recomienda siempre indicar de tres a seis exmenes de heces con un periodo de dos a tres das entre uno y otro (exmenes seriados). En los casos de alta sospecha clnica de giardiosis se puede obtener tambin una muestra de aspirado duodenal o de biopsia duodenal para realizar el diagnstico, siempre que los anlisis de las heces hayan resultado negativos.

Mtodos de diagnstico:
o

Examen directo entre cubre y portaobjeto: Se coloca una pequea porcin de las heces en un portaobjeto mezclada con una gota de eosina, lugol o solucin salina

fisiolgica, se coloca sobre la preparacin una lmina cubreobjeto y se examina al microscopio con objetivo de 40x.

Los metazoarios o helmintos son mucho ms complejos que los protozoos, sus clulas se agrupan formando rganos y tejidos; se reproducen sexualmente pudiendo ser hermafroditas o presentar sexos separados. Son ovparos con excepcin de filarias, Dracunculusspp y Trichinellaspp, que son vivparos. Los helmintos incluyen dos Phylum o clases: Platelmintos: gusanos de cuerpo plano, entre los que se incluyen:

Cestodos: Son hermafroditas, tienen el cuerpo plano y segmentado, y cuando parasitan al hombre en su estadio adulto, se ubican en intestino delgado. El rgano de fijacin es el esclex, provisto de estructuras especialmente adaptadas para esta funcin, estas pueden ser ventosas y btrides o ganchos. Del esclex surge un cuello del que se genera el cuerpo, por brotacin, constituido por segmentos, denominados progltides. Cada progltide es una unidad funcional completa; a medida que se alejan del cuello van madurando, denominndose a los ms distantes progltides maduros. En ellos el tero ocupa casi su totalidad y se encuentran repletos de huevos, los que se liberarn al romperse los segmentos. Se los conoce como tenias por ejemplo Taeniasaginata, Taeniasolium, Echinococcusgranulosus, etc.

Trematodos: A excepcin del gnero Schistosoma, tambin son hermafroditas y su cuerpo es chato pero indiviso. El estadio adulto es parsito de vertebrados, est cubierto por una cutcula resistente y presentan discos suctorios, rganos de fijacin, en la cara ventral. Poseen un tubo digestivo incompleto que se inicia en la boca, llamada citostoma. Poseen un poro genital por donde se eliminan los huevos. El ciclo evolutivo es indirecto y cumplen parte de l en el agua. Los huevos, a excepcin del gnero Schistosoma, presentan un oprculo por el que se libera la larva, denominada miracidio. El primer husped intermediario es un molusco, puede haber un segundo husped intermediario dependiendo de la especie.

Nematelmintos o Nematodos: Son gusanos cilndricos, tienen sexos separados. Su cuerpo est recubierto por una cutcula, con cavidad pseudocelmica, tubo digestivo completo que se inicia en

la boca y termina en el ano. La boca est rodeada por tres labios, salvo en las uncinarias que presentan una cpsula bucal con elementos cortantes; estas estructuras producen pequeos pero mltiples traumas en la mucosa intestinal que contribuyen a la produccin de la anemia macroctica que suele asociarse a estas parasitosis. Los huevos tienen diferentes caractersticas que son tiles para el diagnstico de las diversas especies. Del huevo se liberar una larva, en el tubo digestivo o en el medio ambiente. Los estadios larvarios son varios y se producen mudas entre estadio y estadio. El hombre se infecta por va oral, como en el caso de Ascarislumbricoides, por va cutnea, como en el caso de las uncinarias o por va parenteral, como por ejemplo las filarias. Slo unas pocas especies son parsitos del hombre y existen, a diferencia de los cestodes y trematodes, muchos nematodos de vida libre.

MATERIALES Frotis de sangre perifrica teido con Giemsa. Lminas portaobjetos y cubreobjetos Microscopio ptico Muestras de heces conservadas en formol Aplicadores Guantes Lugol

PROCEDIMIENTO Para el examen de las heces, guarde las medidas adecuadas de bioseguridad, colquese los guantes y mascarilla antes de proceder:

Coloque en la lmina portaobjeto una gota de reactivo de lugol. Con un aplicador tome una pequea porcin de heces y mezclela con la gota de lugol en el portaobjetos haciendo un pequeo crculo. (Utilice una lmina para cada muestra).

Coloque encima una lmina cubreobjetos. Lleve la lmina al microscopio ptico y enfoque con objetivo de 10x. Al lograr una imagen ntida, pase al objetivo de 40x.

Observe detenidamente las caractersticas de los quistes observados y realice en su cuaderno un esquema de las diferentes formas parasitarias. Para observar la lmina de sangre perifrica:

Adicione sobre la preparacin una gota de aceite de inmersin Enfoque con objetivo de inmersin 100x Realice en su cuaderno un esquema de las caractersticas de las formas de Plasmodium observadas.

RESULTADOS Realice un esquema de lo observado en cada una de las preparaciones. CUESTIONARIO 1. Cules son las formas infectantes de Giardialamblia y Entamoebahistolytica y cules son sus caractersticas ms sobresalientes? 2. Qu requisitos deben cumplir las muestras de heces para estudio parasitolgico y en particular para la bsqueda de protozoos intestinales? Qu otra muestra puede ser til para el diagnstico de la giardiosis? 3. Ante un paciente con sospecha clnica de paludismo, Qu examen usted indicara? qu muestra sera necesaria para el estudio? Basado en el ciclo de vida de este parsito, qu formas parasitarias pudiera encontrar en dicha muestra?. 4. Elabore un cuadro comparativo entre los platelmintos y nematelmintos. 5. Elabore un cuadro comparativo entre cestodos y trematodos.

PRCTICA N14 SEGUNDA PRCTICA CALIFICADA

PRCTICA N15 MICROBIOLOGA ORAL DIAGNOSTICO DE CARIES DENTAL Y ENFERMEDAD PERIODONTAL

OBJETIVOS Reconocer y describir los gneros y las especies de microorganismos asociados con el inicio y progresin de la caries dental. Identificar y fundamenta el concepto de pH crtico en la cariognesis. Describe los gneros y las especies de microorganismos asociados con el inicio y progresin de las enfermedades periodontales INTRODUCCION La caries es una enfermedad multifactorial que se caracteriza por la destruccin de los tejidos del diente como consecuencia de la desmineralizacin provocada por los cidos que genera la placa bacteriana a partir de los restos de alimentos, que se exponen a las bacterias que fabrican ese cido, de la dieta. La destruccin qumica dental se asocia a la ingesta de azcares y cidos contenidos en bebidas y alimentos. La caries dental se asocia tambin a errores en las tcnicas de higiene as como pastas dentales inadecuadas, falta de cepillado dental, ausencia de hilo dental, as como tambin con una etiologa gentica. Se estudia an la influencia del pH de la saliva en relacin a la caries. Tras la destruccin del esmalte ataca a la dentina y alcanza la pulpa dentaria produciendo su inflamacin, pulpitis, y posterior necrosis (muerte pulpar). Si el diente no es tratado puede llevar posteriormente a la inflamacin del rea que rodea el pice (extremo de la raz) producindose una periodontitis apical, y pudiendo llegar a ocasionar un absceso, una celulitis o incluso una angina de Ludwig. MATERIALES 01 Incubadora 06 Microscopios pticos 01 Jarra Gaspak 18 Placas de agar mitis salivarius(con telurito de potasio 1%, bacitracina) 18 Placas de agar sangre 06 pH metros

12 Tubos estriles. 12 Asas de siembra redondas 06 Cajas metlicas con 03 curetas para dentina y 03 espejos bucales c/u esterilizadas para la toma de muestra en paciente(tem 4.1). Por mesa de trabajo. 06 Cajas metlicas con 05 curetas para dentina y 05 espejos bucales c/u esterilizadas para la toma de muestra in situ(tem 4.3). Por parejas. 08 Conos de papel estriles, por mesa de trabajo 04 kits Coloracin GRAM 06 frascos con agua destilada 06 Frascos con aceite de inmersin 06 goteros 02 Pares de guantes descartables por cada miembro de mesa. 01 Caja de lminas portaobjetos por mesa 06 Mecheros con alcohol

PROCEDIMIENTO A. TOMA DE MUESTRA DE CARIES DENTAL EN PACIENTE Acudir, 48 horas antes de la prctica de laboratorio, a la Clnica Estomatolgica del Adulto (CIA), con uniforme blanco y las barreras de bioseguridad completos, y con previa autorizacin del responsable de turno, proceder a la toma de muestra. A cuatro manos y dentro del rea de seguridad otorgada por el mechero de alcohol, con 03 curetas para dentina y espejos bucales estriles diferentes, se tomar 03 muestras de caries dental: La primera de caries de esmalte, la segunda de caries de dentina y la tercera de caries radicular. Cada una de las muestras, siempre dentro del rea de seguridad del mechero, sern colocadas en frascos estriles conteniendo caldo de tioglicolato, que sern recogidos 24 horas antes de la toma de muestra. Cada frasco conteniendo la muestra ser rotulado y llevado al Laboratorio Central para ser ingresados a la Incubadora (Estufa) a 37C por 48 horas. El da de la prctica de laboratorio las muestras sern entregadas en la mesa de trabajo.

B. TINCIN, SIEMBRA Y CULTIVO DE MUESTRAS Desinfeccin de la mesa de trabajo. Cada una de las muestras de caries dental se siembran por la tcnica de estra por agotamiento sobre 01 placa petri con agar sangre y 01 placa con agar mitis salivarius (con telurito de potasio al 1% y bacitracina al) La placa con agar sangre ser colocada en la estufa (incubadora) a 37C por 48 horas. Pasada las 48 horas se realizar la observacin macroscpica y microscpica de las colonias crecidas en el medio de cultivo. La placa con agar mitis salivarius, ser colocada en la Jarra Gaspak, para lograr anaerobiosis, y llevada a la estufa a 37C por 48 horas. Pasada las 48 horas se realizar la observacin macroscpica y microscpica de las colonias crecidas en el medio de cultivo. De cada una de las muestras, se har extendido y fijacin al calor en una lmina portaobjeto, y se realizar Tincin Gram, para luego realizar la observacin microscpica a 1000x con el objetivo de inmersin. Tomar nota de las caractersticas de los microorganismos observados y emitir conclusiones. C. TOMA DE MUESTRA CARIES DENTAL IN SITU. Desinfeccin de la mesa de trabajo. Formar parejas y mantener las normas de bioseguridad correspondientes. Preparacin de la mesa de trabajo: Por pareja colocar sobre la mesa 01 campo, 02 lminas portaobjeto, 01 frasco con agua destilada estril, 01 gotero y 01 caja metlica estril conteniendo 02 curetas para dentina y 02 espejo bucal estriles; y 02 pares de guantes descartables. Cada miembro de la pareja dentro del rea de seguridad que brinda el mechero y con la ayuda de una cureta para dentina y un espejo bucal tomar una muestra de lesin cariosa de preferencia de dentina, la cual ser colocada en el centro de una lmina portaobjeto y a la cual con el gotero se le agregar una gota de agua destilada, hacindose el extendido y fijacin. Una vez fijada la muestra se le realizar coloracin GRAM, tras la cual se observar al microscopio a 1000x con el objetivo de inmersin.

Tomar nota de las caractersticas de los microorganismos observados y comprelas con las observaciones del tem 4.2.Emitir conclusiones.

D. TOMA DE MUESTRA DE SALIVA Y DETERMINACIN DE PH Desinfeccin de la mesa de trabajo. Por mesa escoger un participante para la prueba. El participante, dentro del rea de seguridad que brinda el mechero, verter saliva en un primer tubo de ensayo estril, procedindose de inmediato a determinar el pH salival inicial. Luego el participante estimular la produccin de saliva mediante el consumo de un caramelo (rico en sacarosa) durante 10 minutos, tras los cuales verter la saliva en un segundo tubo de ensayo estril, procedindose de igual manera a determinar el pH salival final. Determinar la diferencia de pH. Tomar nota y emitir conclusiones.

ENFERMEDAD PERIODONTAL Las enfermedades periodontales son un conjunto de patologas que afectan al Periodonto, es decir al conjunto de tejidos que rodean y sujetan a los dientes de los maxilares. Son enfermedades de naturaleza inflamatoria y de causa infecciosa (causadas por bacterias) y dependiendo de su grado de afectacin denominamos gingivitis, cuando slo afecta al periodonto superficial (enca) o periodontitis cuando se destruye hueso y ligamento que sujetan a los dientes. Si la periodontitis no se trata evoluciona destruyendo todo el soporte del diente y se acaba perdiendo la pieza dentaria. PROCEDIMIENTO A. TOMA DE MUESTRA DE ENFERMEDADES PERIODONTALES EN PACIENTE Acudir, 48 horas antes de la prctica de laboratorio, a la Clnica Estomatolgica del Adulto (CIA), con uniforme blanco y las barreras de bioseguridad completos, y con previa autorizacin del responsable de turno, proceder a la toma de muestra.

A cuatro manos y dentro del rea de seguridad otorgada por el mechero de alcohol, con 02 pinzas para algodn, 02 espejos bucales estriles diferentes y 02 conos de papel estriles, se tomar 02 muestras de enfermedades periodontales: La primera de surco gingival de un cuadro de gingivitis y la segunda bolsa periodontal producida por un cuadro de periodontitis. Dejando el cono de papel 5 minutos en los lugares mencionados para que tenga contacto con los microorganismos y lquido gingival.

Cada cono de papel con la muestra, siempre dentro del rea de seguridad del mechero, ser colocado en un frasco estril conteniendo caldo de tioglicolato, que sern recogidos 24 horas antes de la toma de muestra en el Laboratorio Central.

Cada frasco conteniendo la muestra ser rotulado y llevado al Laboratorio Central para ser ingresados a la Incubadora (Estufa) a 37C por 48 horas. El da de la prctica de laboratorio las muestras sern entregadas a cada mesa de trabajo. B. TINCIN, SIEMBRA Y CULTIVO DE MUESTRAS

Cada una de las muestras se siembran por la tcnica de estra por agotamiento sobre 02 placa petri con agar sangre Una placa con agar sangre ser colocada en la estufa (incubadora) a 37C por 48 horas. Pasada las 48 horas se realizar la observacin macroscpica y microscpica de las colonias crecidas en el medio de cultivo.

La segunda placa con agar sangre, ser colocada en la Jarra Gaspak, para lograr anaerobiosis, y llevada a la estufa a 37C por 48 horas. Pasada las 48 horas se realizar la observacin macroscpica y microscpica de las colonias crecidas en el medio de cultivo.

De cada una de las muestras, se har extendido y fijacin al calor en una lmina portaobjeto, y se realizar Tincin Gram, para luego realizar la observacin microscpica a 1000x con el objetivo de inmersin.

Tomar nota de las caractersticas de los microorganismos observados y emitir conclusiones. C. TOMA DE MUESTRA PERIODONTAL IN SITU. Desinfeccin de la mesa de trabajo.

Formar parejas y mantener las normas de bioseguridad correspondientes. Preparacin de la mesa de trabajo: Por pareja colocar sobre la mesa 01 campo, 02 lminas portaobjeto, 01 frasco con agua destilada estril, 01 gotero y 01 caja metlica estril conteniendo 02 pinzas para algodn y 02 espejo bucal estriles; 04 conos de gutapercha estriles y 02 pares de guantes descartables.

Cada miembro de la pareja dentro del rea de seguridad que brinda el mechero y con la ayuda de una pinza para algodn y un espejo bucal, colocar un cono de papel en el surco gingival de la pieza 3.6 o 4.6, dejndola 5 minutos; despus de retirarla ser colocada dentro de un vial con caldo de tioglicolato, rotulado y llevado a la incubadora por 30 minutos a 37C. Luego con la ayuda de un asa de siembra, parte de la muestra ser colocada en el centro de una lmina portaobjeto y a la cual con el gotero se le agregar una gota de agua destilada, hacindose el extendido y fijacin.

Una vez fijada la muestra se le realizar coloracin GRAM, seguida a continuacin de la observacin microscpica a 1000x con el objetivo de inmersin. Tomar nota de las caractersticas de los microorganismos observados y comprelas con las observaciones del tem 4.2.Emitir conclusiones.

CUESTIONARIO 1. Mencione y describe los factores de virulencia del Streptococcus mutans en la cariognesis. 2. Mencione y describa los factores de virulencia del Actinomyces spp en la cariognesis. 3. Mencione y describa los factores de virulencia del Lactobacillus spp en la cariognesis 4. Describa la lesin cariosa en esmalte 5. Describa la lesin cariosa en dentina 6. Describa la lesin cariosa radicular 7. Fundamente el concepto de pH crtico en la cariognesis. 8. Mencione los principales microorganismos asociados con las diferentes formas clnicas de enfermedad periodontal. 9. Describa los mecanismos de formacin de las placas supragingival y subgingival. 10. Describa los determinantes bioqumicos de la virulencia de los microorganismos potencialmente periodontopatgenos.

PRCTICA N16 MICROBIOLOGA ORAL DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO DE LAS ENFERMEDADES PULPARES

OBJETIVOS Reconocer y describir los gneros y las especies de microorganismos asociados con el inicio y progresin de las enfermedades pulpares INTRODUCCION En la actualidad, gran parte de los tratamientos que se realizan en la clnica son debidos a condiciones patolgicas que afectan la pulpa y al peripice del diente. Aunque la pulpa dental comparte muchas propiedades con otros tejidos conectivos del organismo, su peculiar localizacin la dota de importantes caractersticas especiales. La pulpa reacciona ante mecanismos directos e inmunitarios. Dentro del primer grupo se

relacionan los microorganismos que llegan al tejido pulpar, ya sea por caries, traumatismos o factores irritantes (productos bacterianos, bacterias, endotoxinas, etctera), que al penetrar a travs de los tbulos dentinarios, destruyen los odontoblastos y las clulas subyacentes, y los inmunolgicos responden factores del complemento e inmuno-globulinas. Ambos mecanismos desencadenan el proceso inflamatorio conocido como pulpitis. Ante las injurias de cualquier etiologa, el paquete vsculo nervioso inicia su defensa, inflamndose. Esta reaccin inicialmente es local y circunscrita, si no se elimina el estmulo, el mecanismo inflamatorio contina destruyendo en forma lenta e incesante la pulpa. En estas condiciones, las pulpitis as constituidas, sern reversibles o no, independientemente de su vitalidad. Despus las bacterias y sus bioproductos bacterianos y otros irritantes del tejido necrtico se diseminaran por el conducto radicular a los tejidos periapicales, y provocan el desarrollo de lesiones inflamatorias periapicales.

MATERIALES 01 Incubadora 06 Microscopios pticos 01 Jarra Gaspak 12 Placas de agar sangre 12 Asas de siembra redondas 06 Cajas metlicas con 02 pinzas para algodn y 02 espejos bucales c/u

esterilizadas para la toma de muestra en paciente (tem 4.1). Por mesa de trabajo. 08 Conos de papel estriles, para tems 4.1 y 4.3. Por mesa de trabajo 04 kits Coloracin GRAM 06 frascos con agua destilada 06 Frascos con aceite de inmersin 06 goteros 02 Pares de guantes descartables por cada miembro de mesa. 01 Caja de lminas portaobjetos por mesa 06 Mecheros con alcohol

PROCEDIMIENTO A. TOMA DE MUESTRA DE ENFERMEDADES PULPARES EN PACIENTE Acudir, 48 horas antes de la prctica de laboratorio, a la Clnica Estomatolgica del Adulto (CIA), con uniforme blanco y las barreras de bioseguridad completos, y con previa autorizacin del responsable de turno, proceder a la toma de muestra. A cuatro manos y dentro del rea de seguridad otorgada por el mechero de alcohol, con 02 pinzas para algodn, 02 espejos bucales estriles diferentes y 02 conos de papel estriles, se tomar 02 muestras de enfermedades pulpares: La primera de conducto radicular de un tratamiento de biopulpectomia y la segunda de conducto radicular de un tratamiento de necropulpectomia. Dejando el cono de papel 5 minutos para que tenga contacto con los microorganismos y restos orgnicos de los conductos radiculares.

Cada cono de papel con la muestra, siempre dentro del rea de seguridad del mechero, ser colocado en un frasco estril conteniendo caldo de tioglicolato, que sern recogidos 24 horas antes de la toma de muestra en el Laboratorio Central.

Cada frasco conteniendo la muestra ser rotulado y llevado al Laboratorio Central para ser ingresados a la Incubadora (Estufa) a 37C por 48 horas. El da de la prctica de laboratorio las muestras sern entregadas a cada mesa de trabajo B. TINCIN, SIEMBRA Y CULTIVO DE MUESTRAS

Desinfeccin de la mesa de trabajo. Cada una de las muestras se siembran por la tcnica de estra por agotamiento sobre 02 placa petri con agar sangre Una placa con agar sangre ser colocada en la estufa (incubadora) a 37C por 48 horas. Pasada las 48 horas se realizar la observacin macroscpica y microscpica de las colonias crecidas en el medio de cultivo.

La segunda placa con agar sangre, ser colocada en la Jarra Gaspak, para lograr anaerobiosis, y llevada a la estufa a 37C por 48 horas. Pasada las 48 horas se realizar la observacin macroscpica y microscpica de las colonias crecidas en el medio de cultivo.

De cada una de las muestras, se har extendido y fijacin al calor en una lmina portaobjeto, y se realizar Tincin Gram, para luego realizar la observacin microscpica a 1000x con el objetivo de inmersin.

Tomar nota de las caractersticas de los microorganismos observados y emitir conclusiones.

NOTA IMPORTANTE: Debido al caso especial que conlleva sustraer una muestra de enfermedad pulpar es necesario tomar las precauciones debidas para encontrar pacientes que reciban los tratamientos de biopulpectomia y necropulpectomia.

CUESTIONARIO 1. Mencione los principales microorganismos asociados con las diferentes formas clnicas de enfermedad pulpar. 2. Describa los mecanismos bioqumicos que determine la virulencia de los microorganismos productores de enfermedades pulpares.

PRCTICA N17 EXAMEN FINAL