DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA ALFA AMILASA VEGETAL

I.

OBJETIVO: - Determinar l actividad enzimtica de una amilasa extrada de trigo germinado, usando almidn residual - Determinar la actividad especfica de la amilasa vegetal. MARCO TEORICO: Las enzimas son catalizadores orgnicos que disminuyen la energa de activacin de las reacciones metablicas, por lo que aumentan la velocidad, y permiten que se produzcan a temperaturas y presiones a las que normalmente no tendran lugar. En una curva de saturacin de una reaccin enzimtica, al inicio, la velocidad permanece constante denominndose velocidad inicial (Vo), la cual va disminuyendo hasta llegar a un plateau que da a conocer una saturacin de la enzima por el sustrato. AMILASA: Cataliza la -1,4 glucosidicos de la regin central de la cadena de amilosa y amilopeptina, exceptuando las molculas cercanas a la ramificacin, obteniendo como resultado maltosa y oligosacridos de varios tamaos. La actividad de la enzima se determina cualitativamente mediante la disminucin de la capacidad de la solucin de almidn para formar el color azul caractersticos con el yodo o midiendo la disminucin de la viscosidad de la suspensin de almidn. La alfa-amilasa cataliza la hidrlisis de la cadena lineal (amilosa) y la ramificada (amilopectina) del almidn, rompiendo enlaces 1,4 interiores (endoamilasa) para formar una mezcla de dextrinas; por ello se la conoce como enzima dextrinognica (mezcla de amilodextrina, eritrodextrina, acrodextrina y maltodextrina) con poca produccin de maltosa. ALMIDON DE CEBADA: El almidn es un polmero semicristalino de glucosa de gran abundancia en la naturaleza. La cantidad de almidn contenido en el grano de cereal varia, pero generalmente oscila entre el 60 y 75 % del peso del grano. El almidn presente en los granos es el ms importante de los carbohidratos para fines industriales resultando preciso degradarlo enzimticamente con una gelatinizacin previa por accin de calor o sometindolo a un intenso trabajo mecnico. El almidn consta de dos fracciones: amilosa y amilopectina.
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II.

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III.

MATERIALES: Equipos: Estufa Espectrofotmetro

Materiales y reactivo: IV. Germinados: trigo y cebada Solucin de almidn 0.1% cido clorhdrico 0.5N Lugol Reactivo de Biuret Tubos de ensayo Embudos Mortero Pipetas de 1,5,10 ml

PROCEDIMIENTO: - Extraccin de la amilasa:

Germinar 50 semillas de trigo y cebada por 3 dias.

Triturar las semillas, adicionando 10 ml de buffer + cloruro de calcio

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Filtrar en gasa o algodn. Demostracin de la actividad enzimtica: armar el siguiente sistema. ALMIDON INICIAL I 1.0 --1.0 9.9 0.5

TUBOS (ml) SUSTRATO Incubar: 30C 5 min. EXTRACTO DE ENZIMA Incubar: 30C 15 min. ACIDO CLORHIDRICO 0.5N Reposar: T. ambiente 5 min. AGUA DESTILADA LUGOL

ALMIDON RESIDUAL II 1.0 0.1 1.0 9.8 0.5 III 1.0 0.2 1.0 9.7 0.5 IV 1.0 0.3 1.0 9.6 0.5

Medir las absorbancias despus de 5 min a 6.20nm Determinacin de la actividad especfica: Determinar el contenido proteico del extracto crudo de la enzima con el reactivo de Biuret de acuerdo al siguiente esquema: TUBO (ml) Preparado enzimtico Agua destilada Reactivo de Biuret I --1.0 4.0 II 0.2 0.8 4.0 III 0.1 0.9 4.0 IV 0.05 0.95 4.0

Mezclar e incubar por 30 min a 37C.

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V.

CALCULOS Y RESULTADOS: - Determinacin de la actividad enzimtica: N TUBO I II III IV ABSORVANCIA TRIGO 0.872 0.526 1.860 3.054 CEBADA 0.063 1.197 1.587 2.792

CALCULO: Determinar la concentracin del almidn (mg/ml) multiplicando la absorbancia por el factor de calibracin. Obtener el promedio N TUBO I II III IV Promedio Concentracin (mg/ml) TRIGO CEBADA 8.72 0.63 5.26 11.97 18.60 15.87 30.54 27.92 18.13 18.59

CALCULO: Calcular Las Unidades De Enzima (U) De La Siguiente Forma. N TUBO I II III IV PROMEDIO Unidad enzimtica (mg/min) TRIGO CEBADA 0.5810 0.0420 0.3507 0.7980 1.2400 1.0580 2.0360 1.8613 1.2089 1.2391

CALCULO: Determinar mg de protena /ml = absorbancia x factor N TUBO I II III IV Promedio Protena (mg/ml) TRIGO CEBADA 8.72 0.63 5.26 11.97 18.60 15.87 30.54 27.92 18.13 18.59

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CALCULO: determinar la actividad especfica de la siguiente manera.

N TUBO I II III IV

ACTIVIDAD ENZIMATICA TRIGO CEBADA

0.06662844 0.066673 0.06666667 0.06666667

0.06666667 0.06666667 0.06666667 0.06666547

ELABORA UN DIAGRAMA DE FLUJO DE LA OBTENCION DE LA AMILASA

50 Semillas de trigo

TRIRUTAR

(Mortero)

Buffer: 10 ml Cloruro de Calcio

AGREGAR

Buffer: 10 ml Cloruro de Calcio

FILTRAR

(Embudo + gasa)

AMILASA

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VI.

DISCUSION: (Almonte, 2010) La alfa-Amilasa se encuentra ampliamente distribuida en el reino vegetal, particularmente en la semillas con reservas de hidratos de carbono como el trigo, la cebada, de donde ha sido posible aislarla en forma pura. Su peso molecular es alrededor de 60.000, esta se secreta al endospermo amilceo de las semillas de cereales por dos tejidos, el cotiledn y la capa de aleurona, degradando las macromolculas de amilosa y amilopectina en pequeos fragmentos de 6 a 7 unidades de glucosa. (Barbado, 2001) La amilosa se colorea de azul en presencia de yodo, debido a la absorcin o fijacin del yodo en la superficie de la molcula de amilosa, lo cual solo ocurre en frio. Es conveniente aclarar que este proceso no es una reaccin qumica, ya que no se producen sustancias nuevas, como reactivo para identificar el almidn se usa una solucin denominad lugol. (Lopez, 2006) La prueba del Lugol se realiza para identificar la presencia de polisacridos, si despus de aadir los digeridos a los tubos de lugol se observa que tiene un color azul ,eso significa que hay presencia de almidn por lo tanto la reaccin no tuvo lugar, por otro lado si la reaccin da un color amarillo intenso, eso quiere decir que no hay presencia de almidn por lo tanto, hay si tuvo lugar la actividad de la enzima. (Foster,1998)La amilasa es una de las enzimas mas estudiadas debido a su rol de degradacin del almidn, ya que permite una germinacin de las semillas, el cual es degradado por los enlaces 1-4 del interior (endoamilasa) en diferentes dextrinas, que debido a su disminucin en tamao puede ser hidrolizada por la B-amilasa, sin embargo la -amilasa es una enzima que se encuentra regulada tanto por hormonas, o diferentes factores, tales como la temperatura y el pH, adems posee un peso molecular de 50 Kda aproximadamente .La germinacin se lleva con la hidratacin y posterior liberacin de giberelinas, las cuales inducen la sntesis de las enzimas hidrolticas, que hidrolizan el almidn que se encuentra el endosperma, produciendo glucosa que es transportada por difusin, para generar energa.

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VII.

CONCLUSIONES:
Logramos determinar la actividad enzimtica en las dos experiencias realizadas con semillas germinadas de trigo y cebada, en los cuatro tubos pudimos notar la formacin de anillos y tambin la formacin de precipitado en pequeas y grandes cantidades.

Identificamos y obtuvimos de los ndices de absorbancia con la ayuda del espectrofotmetro en el caso del trigo fueron de 0.872; 1.860 entre otros y en el caso de la cebada fueron de 0.063; 1.587, estos datos nos indican un comportamiento similar de la actividad enzimtica en ambas semillas.

Logramos determinar la actividad especfica del preparado enzimtico del trigo, y esto lo pudimos notarlo por la formacin de anillos de color anaranjado oscuro y de color azul fuerte que se presento en el primer tubo. Aprendimos el procedimiento que se debe utilizar para extraer la amilasa de vegetales, en nuestro caso fue con las semillas de trigo y cebada, donde utilizamos las races de las semillas adicionadas con reactivos que permitieron obtener el preparado enzimtico para trabajar.

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VIII.

CUESTIONARIO:

CUESTIONARIO
1.- En la sntesis de arginina a partir de acido glutmico se observaron las siguientes reacciones
1 2 3 4

Glu ------ N ac. Glu ------ Orn ------ Cit ------ Arg Siendo 1, 2, 3,4 enzimas Indica cuales son los sustratos y productos correspondientes para estas enzimas mediante un cuadro.

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2.-Por que se sometieron las raicillas del cereal a un proceso fsico y qumico en el proceso de extraccin? El proceso de extraccin se basa en la obtencin de amilasa, por lo que es necesario que las raicillas de los cereales sufran un proceso fsico donde se van a fragmentar en pedazos ms pequeos con la ayuda de un mortero pero aun as siguen conservando su naturaleza, luego se da el proceso qumico donde se va a filtrar la parte liquida que seria la amilasa de las semillas con la ayuda de una gasa ,luego a este extracto se le van agregando una seria de reactivos lo cual permitirn transformarla en un preparado enzimtico para posteriormente utilizarla en diferentes pruebas. 3.- Si se te da una solucin que supuestamente contiene una enzima, Cmo determinaras en la solucin la presencia de una enzima que cataliza la hidrolisis de almidn? Para determinar la presencia de una enzima en una solucin y a la vez observar que cataliza la hidrolisis de almidn solo se podra lograr a travs de una va ,la cual consiste en agregar reactivos que permitan evidenciar tal presencia como es el caso del lugol , adems porque mientras el color de la mezcla sea mas intenso significa que la actividad enzimtica que ejerce la amilasa sobre el almidn ser un poco mas baja , adems tambin la podemos notar ya que en la solucin se va a observar la formacin de anillos en la parte superior de dicho liquido o sustancia.

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4.- Represente mediante un flujograma el proceso de extraccin de una amilasa de una fuente diferente a la utilizada en prctica.

RACES DE YUCA Agua LAVADO Cascarilla

RALLADO

Agua

TAMIZADO

Afrecho

SEDIMENTACION

Mancha de agua

FERMENTACION

SECADO

SECADO

Almidn nativo

Almidn agrio

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5.- Como se puede incrementar la actividad especfica de una enzima? La actividad especfica de las enzimas se calcula dividiendo la actividad enzimtica (por ejemplo; U/mL) entre la concentracin de protenas (mg/mL). El resultado final indica la cantidad de enzima por milgramos de protenas presente. Se supone que si purificas la enzima normalmente la actividad especfica de la misma debe aumentar, ya que la proporcin de enzima del total de las protenas presentes debe tambin irse incrementando. A veces esto no ocurre. En ese caso debe revisar el procedimiento otra vez ya que algo puede estar saliendo mal. Por ejemplo que se desnaturalice la enzima en el proceso de purificacin por empleo de algn solvente o pH o fuerza inica inadecuada. Tambin debe tener en cuenta si la protena en milimtrica, ya que la prdida de una subunidad puede reducir significativamente su actividad.

IX.

BIBLIOGRAFIA:

Foster, N; Burchett, L and Paulsen, Bioquimica,Editorial Reverte, Espana,G. 1998. Benech-Arnold, R. and Sanchez,Biologia de las Plantas,Primera Edicion,Editorial Bermejo . 2004. Almonte.Carlos,Manual de Quimica Organica,Quinta Edicion, 2010. Barabado.Oscar,Microbiologia Alimentaria,Tercera Edicion,2001.

11

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