APNDICE G Identificacin bioqumica de enterobacterias por el sistema API 20E OBJETIVO: - Establecer la metodologa en la identificacin de enterobacterias por medio

de pruebas bioqumicas estandarizadas y miniaturizadas. GENERALIDADES: El sistema API 20E (Biomriux 2010) es un sistema de pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de la familia Enterobacteriaceae y otros bacilos Gram-negtivos, mediante 23 pruebas bioqumicas estandarizadas y miniaturizadas y una base de datos. Este sistema puede identificar 108 gneros y 104 especies de estas bacterias. La galera API 20E consta de 20 microtubos que contienen los sustratos deshidratados de las pruebas bioqumicas tradicionales. Se inoculan con una suspensin bacteriana que rehidrata los medios y despus de la incubacin se observan los cambios de color con o sin adicin de reactivos (Tabla 1). La lectura de las reacciones se hace de acuerdo con la tabla de lectura y la identificacin mediante la tabla de identificacin Analytical Profile Index API 20E o el software APILAB. MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y SOLUCIONES 1 caja de agar MacConkeya Colorantes y reactivos para tincin de Grama Tiras para prueba de oxidasaa 1 tubo de 16 x 150 mm con 5 ml de solucin salina isotnica 0.85% (P/V)b 1 tubo de 16 X 150 mm con solucin de MacFarland (mezlcar 0.3 ml de BaCl2 al 1% y aadir 9.7 ml de H2SO4 al 1%)b Tiras API 20E (1 por colonia que se desee identificar)b Aceite mineral estrilb Agua para llenado de la cmara hmedab Reactivo de cloruro frrico (TDA)c Reactivo de Kovacs (IND)c Reactivo para VP1 (potasa alcohlica al 40%)c Reactivo para VP2 (-naftol)c MATERIAL - 1 pipeta Pasteur estrilb - Mecheroa, b - asa microbiolgicaa, b

- Incubadora 352Ca, b - Bulbo o propipetab NOTAS: a Material necesario al inicio de la tcnica. b Material necesario a las 24 horas de iniciada la tcnica. c Material necesario a las 48 horas de iniciada la tcnica. PROCEDIMIENTO * Resembrar las colonias seleccionadas por estra en Agar MacConkey. * Incubar a 352C durante 18 a 24 h. * Realizar tincin de Gram y observar caractersticas morfo-coloniales de la cepa con el objetivo de verificar pureza de la colonias seleccionadas. En caso de tener un carcter Gram-negativo y observar uniformidad en morfologa y tamao de bacterias proceder con el siguiente paso. * Efectuar la prueba de la oxidasa. En caso de ser negativa proceder con el siguiente paso. * Suspender el crecimiento obtenido en 5 ml de solucin salina al 0.8% (P/V) (NaCl 0.8 %) hasta igualar turbidez del tubo 3 de MacFarland (preparar mezclando 0.3 ml de BaCl2 al 1% y aadir 9.7 ml de H2SO4 al 1%). * Proceder a inocular el sistema API 20E de acuerdo con la siguiente metodologa: * Llenar el tubo y la cpula de las pruebas CIT, VP, GEL con la suspensin bacteriana. * Llenar los tubos pero no las cpulas de las dems pruebas. * Llenar la cpula de las pruebas ADH, LDC, ODC, URE y H2S con aceite mineral estril para obtener anaerobiosis. * Incubar a 352C durante 18 a 24 h. INTERPRETACIN DE RESULTADOS Pasado el tiempo de incubacin consultar el Cuadro 1, para la adicin de reactivos en los tubos respectivos y para la interpretacin de resultados. Consultar el Cuadro 2 para obtener un nmero de identificacin caracterstico para cada especie. Consultar la Tabla de identificacin del sistema API 20E (API 20E Analytical Profile Index, Bio-Mriux 2019) o el software APILAB (Bio-mriux), para determinar el gnero y la especie de la cepa aislada (En caso de no contar con la bibliografa mencionada, se podr consultar el Bergeys Manual para la identificacin de la cepa aislada con base en los resultados de las pruebas bioqumicas). Cuadro 1. Tabla de lectura para las pruebas bioqumicas del sistema API 20E.
Pruebas Sustratos Reacciones/Enzimas Resultados Negativo Positivo

ONPG ADH LDC ODC CIT H2S URE TDA

ortonitrofenol-galactsido arginina lisina ornitina citrato sdico tiosulfato sdico urea triptofano

-galactosidasa arginina dehidrolasa lisina descarboxilasa ornitina descarboxilasa utilizacin de citrato produccin de H2S ureasa triptofano deaminasa

incoloro amarillo amarillo amarillo verde plido/amarillo incoloro/grisceo

amarillo (1) rojo/naranja (2) naranja rojo/naranja(2) azul-verde/verde (3) depsito negro

IND

triptofano

produccin de indol

VP GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA

piruvato sdico gelatina de Kohn glucosa manitol inositol sorbitol ramnosa sacarosa melibiosa amigdalina arabinosa

produccin de acetona gelatinasa fermentacin/oxidacin (4) fermentacin/oxidacin (4) fermentacin/oxidacin (4) fermentacin/oxidacin (4) fermentacin/oxidacin (4) fermentacin/oxidacin (4) fermentacin/oxidacin (4) fermentacin/oxidacin (4) fermentacin/oxidacin (4)

amarillo rojo/naranja TDR/lectura inmediata despus de agregar el reactivo TDA (5) amarillo marrn oscuro IND/lectura 2 min despus de agregar el reactivo IND (5) amarillo anillo rojo VP1 mas VP2/lectura 10 min despus de agregar los reactivos VP1 y VP2 (5) incoloro rosado/rojo no ha difusin de difusin de pigmento negro pigmento negro azul/azul-verdoso amarillo azul/azul-verdoso azul/azul-verdoso azul/azul-verdoso azul/azul-verdoso azul/azul-verdoso azul/azul-verdoso azul/azul-verdoso azul/azul-verdoso amarillo amarillo amarillo amarillo amarillo amarillo amarillo amarillo

(1) Un amarillo muy plido debe considerarse como positivo. (2) Un color naranja despus de 24 h de incubacin debe considerarse negativo. (3) La lectura debe hacerse en la cpula (aerobiosis). (4) La fermentacin empieza en la parte inferior de los tubos, la oxidacin en la cpula. (5) TDA:cloruro frrico; IND: reactivo de Kovacs; VP1: hidrxido de potasio 40%; VP2: -naftol. Fuente: Manual del sistema de identificacin para Enterobacteriaceae y otros bacilos Gram-negativos mediante 23 tests bioqumicos estandarizados y miniaturizados, y una base de datos, (1989).

Cuadro 2. Sistema de numeracin de las pruebas positivas, para determinar el nmero de identificacin de enterobacterias por el sistema de identificacin bioqumica API 20E.
VAL OR ASIG NAD O
a

ONP G

ADH

LDC

ODC

CIT

H2S

URE

TDA

IND

VP

GEL

GLU

MAN

INO

SOR

RHA

SAC

MEL

AMY

ARA

OX

4 sumar valores

4 sumar valores

4 sumar valores

4 sumar valores

4 sumar valores

4 sumar valores

4 sumar valores

Se le asigna este nmero si el resultado de la prueba fue positivo; si el resultado fue negativo el valor asignado es cero.

Fuente: Giles M. (1995) Estudio sobre las interacciones microbianas importantes para el incremento de protena durante la fermentacin del pozol. Tesis de licenciatura. Facultad de Qumica, UNAM. 73 p.

BIBLIOGRAFA. Bio-mriux (1989) API 20E SISTEMA DE IDENTIFICACIN PARA Enterobacteriaceae Y OTROS BACILOS GRAM-NEGATIVOS. No. 20100. Biomriux S.A. (de.). Francia. 24 pp. Giles M. (1995) Estudio sobre las interacciones microbianas importantes para el incremento de protena durante la fermentacin del pozol. Tesis de Licenciatura. Facultad de Qumica, UNAM. 73 pp.