P r o c . N a t L A c a d . S c i .

U S A
V o l . 7 8 , N o . 1 2 , p p . 7 4 5 8 - 7 4 6 2 , D e c e m b e r 1 9 8 1
B i o c h e m i s t r y
M o l e c u l a r a n d f u n c t i o n a l a n a l y s i s o f t h e TOL p l a s m i d p WWO f r o m
P s e u d o m o n a s p u t i d a a n d c l o n i n g o f g e n e s f o r t h e e n t i r e r e g u l a t e d
a r o m a t i c r i n g m e t a c l e a v a g e p a t h w a y
( c a t a b o l i c e n z y m e s / t r a n s p o s i t i o n m u t a g e n e s i s / g e n e t i c o r g a n i z a t i o n / g e n e t i c m a n i p u l a t i o n / g e n e e x p r e s s i o n )
F . C . H . F R A N K L I N * , M . B A G D A S A R I A N , M . M . B A G D A S A R I A N , A N D K . N . TI M M I s *
M a x P l a n c k I n s t i t u t e f o r M o l e c u l a r G e n e t i c s , B e r l i n - D a h l e m , F e d e r a l R e p u b l i c o f G e r m a n y
C o m m u n i c a t e d b y I r w i n C . G u n s a l u s , S e p t e m b e r 3 , 1 9 8 1
A B S TR A C T Th e g e n e t i c o r g a n i z a t i o n o f t h e P s e u d o m o n a s p u -
t i d a p l a s m i d p WWO- 1 6 1 , w h i c h e n c o d e s e n z y m e s f o r t h e d e g r a -
d a t i o n o f t o l u e n e a n d r e l a t e d a r o m a t i c h y d r o c a r b o n s , h a s b e e n
i n v e s t i g a t e d b y t r a n s p o s i t i o n m u t a g e n e s i s a n d g e n e c l o n i n g . C a t a -
b o l i c g e n e s w e r e l o c a l i z e d t o t w o c l u s t e r s , o n e f o r u p p e r p a t h w a y
( h y d r o c a r b o n
- *
c a r b o x y l i c a c i d ) e n z y m e s a n d t h e o t h e r f o r l o w e r
p a t h w a y ( c a r b o x y l i c a c i d - + t r i c a r b o x y l i c a c i d c y c l e ) e n z y m e s , t h a t
a r e s e p a r a t e d b y a 1 4 - k i l o b a s e D N A s e g m e n t . Th e p h y s i c a l o r -
g a n i z a t i o n o f t h e c a t a b o l i c g e n e s t h u s r e f l e c t s t h e i r f u n c t i o n a l o r -
g a n i z a t i o n i n t o t w o r e g u l a t o r y b l o c k s . Th e p WWO- 1 6 1 D N A f r a g -
m e n t s S s t I f r a g m e n t C a n d f r a g m e n t D w e r e c l o n e d i n a b r o a d
h o s t r a n g e v e c t o r t o p r o d u c e p l a s m i d p K T5 3 0 . Th i s h y b r i d e n -
c o d e s t o l u a t e o x y g e n a s e a n d a l l m e t a c l e a v a g e p a t h w a y e n z y m e s ,
a n d i t e n a b l e s P . p u t i d a m t - 2 a n d E s c h e r i c h i a c o l i K - 1 2 c e l l s t o
g r o w o n m - t o l u a t e a s s o l e c a r b o n s o u r c e . Th e p K T5 3 0 p l a s m i d a l s o
c a r r i e s
x y I S ( a g e n e w h o s e p r o d u c t h a s b e e n p o s t u l a t e d t o r e g u l a t e
e x p r e s s i o n o f t h e l o w e r p a t h w a y g e n e s ) a n d t h e c o n t r o l s e q u e n c e s
o f t h e p a t h w a y t h a t i n t e r a c t w i t h t h i s p r o d u c t , b e c a u s e c a t e c h o l
2 , 3 - o x y g e n a s e s y n t h e s i s i s s p e c i f i c a l l y i n d u c e d b y m - t o l u a t e i n b o t h
P . p u t i d a a n d E . c o l i . E v i d e n c e i s p r e s e n t e d t h a t s u g g e s t s t h e p r o -
m o t e r o p e r a t o r o f t h e m e t a p a t h w a y g e n e f u n c t i o n s l e s s e f f e c t i v e l y
w i t h t h e R N A p o l y m e r a s e o r x y I S p r o d u c t o f E . c o l i t h a n w i t h t h e
e n z y m e o r p r o d u c t o f P . p u t i d a .
S o i l m i c r o o r g a n i s m s , p a r t i c u l a r l y b a c t e r i a o f t h e g e n u s P s e u -
d o m o n a s , a r e a b l e t o m e t a b o l i z e a n e n o r m o u s r a n g e o f n a t u r a l
a n d s y n t h e t i c o r g a n i c c o m p o u n d s a n d a r e i m p o r t a n t a g e n t s o f
d e g r a d a t i o n a n d r e c y c l i n g o f o r g a n i c m a t e r i a l s , i n p a r t i c u l a r
t o x i c c o m p o u n d s t h a t p o l l u t e t h e e n v i r o n m e n t . A l t h o u g h t h e
b i o c h e m i s t r y o f a n u m b e r o f c a t a b o l i c p a t h w a y s h a s b e e n e l u -
c i d a t e d , v e r y l i t t l e i n f o r m a t i o n i s a v a i l a b l e o n t h e i r g e n e t i c o r -
g a n i z a t i o n , r e g u l a t i o n , a n d e v o l u t i o n . Wi t h o u t s u c h i n f o r m a -
t i o n , i t w i l l b e d i f f i c u l t t o m a n i p u l a t e k e y m e t a b o l i c f u n c t i o n s
o f s o i l m i c r o o r g a n i s m s a n d s o r e a l i z e t h e i r f u l l p r a c t i c a l p o t e n t i a l
i n a p p l i c a t i o n s s u c h a s p o l l u t a n t d e g r a d a t i o n , b i o m a s s a n d e n -
e r g y p r o d u c t i o n , a n d f o r m a t i o n o f i n d u s t r i a l c h e m i c a l s .
Th e TOL p l a s m i d p WWO f r o m P s e u d o m o n a s p u t i d a m t - 2
i s a 1 1 7 - k i l o b a s e ( k b ) c a t a b o l i c p l a s m i d t h a t e n c o d e s a l l e n z y m e s
n e c e s s a r y f o r b a c t e r i a l u t i l i z a t i o n o f t o l u e n e ( To l ) , m - a n d p - x y -
l e n e ( X y l ) , 3 - e t h y l t o l u e n e , a n d 1 , 2 , 4 - t r i m e t h y l b e n z e n e , p l u s
t h e i r a l c o h o l , a l d e h y d e , a n d c a r b o x y l i c a c i d d e r i v a t i v e s , v i a a
m e t a c l e a v a g e p a t h w a y ( 1 , 2 ) ( F i g . 1 ) . Th e To l / X y l p a t h w a y
g e n e s c o n s t i t u t e t w o r e g u l a t o r y b l o c k s w h o s e e x p r e s s i o n a p -
p e a r s t o b e c o n t r o l l e d b y p r o d u c t s o f g e n e s x y l R a n d x y l S ( 3 ) .
We r e p o r t h e r e a t r a n s p o s i t i o n m u t a g e n e s i s a n d g e n e c l o n i n g
s t u d y o f t h e TOL p l a s m i d p WWO- 1 6 1 a n d d e s c r i b e s o m e f e a -
t u r e s o f i t s g e n e t i c o r g a n i z a t i o n a n d r e g u l a t i o n .
C H 3 C H z OH C H O
x y I A L . : : J x y I B L S
0
C OOH h y d r a l s e
OH
C OOH
x y l C
0 OH
K C OOH . r C OOH TO\x y I D
L o C OOH L C OOH
4 - 0 0
\
H M S O
0 / \~ ~ ~ ~ ~ ~ x y l G
0 OH OH
C OOH *
H M S H
h C OOH C 2 3 0 h OH
x y l
C H O x y , E
R
I a l d o t a s e
C H 3 C OC OOH + R . C H z C H O
F I G . 1 . To l / X y l c a t a b o l i c p a t h w a y e n c o d e d b y p l a s m i d p WWO o f
P . p u t i d a m t - 2 . X O, x y l e n e o x y g e n a s e ; B A D H , b e n z y l a l c o h o l d e h y -
d r o g e n a s e ; B Z D H , b e n z a l d e h y d e d e h y d r o g e n a s e ; TO, t o l u a t e / b e n -
z o a t e o x y g e n a s e ; C 2 3 0 , c a t e c h o l 2 , 3 - o x y g e n a s e ; H M S H , h y d r o x y m u -
c o n i c s e m i a l d e h y d e h y d r o l a s e ; H M S D , h y d r o x y m u c o n i c s e m i a l d e h y d e
d e h y d r o g e n a s e ; 4 - OT, 4 - o x a l o c r o t o n a t e t a u t o m e r a s e ; 4 - OD , 4 - o x a l o -
c r o t o n a t e d e c a r b o x y l a s e ; x y l A t o x y l G , g e n e s f o r t h e X y l / To l p a t h w a y
e n z y m e s .
M A TE R I A L S A N D M E TH OD S
B a c t e r i a l s t r a i n s u s e d i n t h i s s t u d y w e r e S K 1 5 9 2 ( E s c h e r i c h i a
c o l i K - 1 2 F - e n d A g a l h s d R 4 h s d M + s b c B 1 5 t h i Tl ) ( 4 ) , K T7 5 9
( E . c o l i K - 1 2 C 6 0 0 t h r l l e u 6 t h i l s u p E 4 4 l a c Y l Tn 5 ) ( u n p u b -
l i s h e d d a t a ) , K T2 4 4 0 ( P . p u t i d a m t - 2 h s d R l h s d M + ) ( 5 ) , K T2 4 4 2
( s p o n t a n e o u s r i f r m u t a n t o f K T2 4 4 0 ) , P a W3 9 ( P . p u t i d a m t - 2
x y l A ) ( 3 ) , a n d P a W2 1 0 ( P . p u t i d a m t - 2 x y l R ) ( 3 ) . P l a s m i d s u s e d
w e r e p WWO ( TOL ) ( 6 ) , p WWO- 1 6 1 [ TOL : : Tn 4 0 1 , w h i c h e n -
c o d e s r e s i s t a n c e t o a m p i c i l l i n ( A p r ) a n d c a r b e n i c i l l i n ( C b r ) ] ( 7 ) ,
p WWO- 3 9 ( a x y l A m u t a n t o f p WWO; i n P a W3 9 ) , p WWO- 2 1 0
( a x y l R m u t a n t o f p WWO; i n P a W2 1 0 ) , R P 4 ( 8 ) , p K T2 3 4 ,
p K T2 1 0 , p K T2 3 0 , a n d p K T2 3 1 . Th e l a t t e r t h r e e p l a s m i d s a r e
c l o n i n g v e c t o r s d e r i v e d f r o m t h e b r o a d h o s t r a n g e p l a s m i d
R S F 1 0 1 0 a n d s p e c i f y s t r e p t o m y c i n a n d c h l o r a m p h e n i c o l r e s i s -
t a n c e ( S m r , C m r ) , S m r a n d k a n a m y c i n r e s i s t a n c e ( K m r ) , a n d S m r
a n d K m r , r e s p e c t i v e l y ( 5 , 9 , 1 0 ) . U n i q u e c l e a v a g e s i t e s f o r X h o
I a n d H i n d I I I a r e l o c a t e d i n t h e K m r g e n e s , a n d u n i q u e s i t e s
f o r E c o R I a n d S s t I a r e l o c a t e d i n t h e S m r g e n e s o f t h e s e v e c t o r s .
Th e p K T2 3 4 p l a s m i d i s a n A p r , K m r E . c o l i c l o n i n g v e c t o r d e -
r i v a t i v e o f C o l D w h i c h u n d e r g o e s e x t e n s i v e a m p l i f i c a t i o n o f
c o p y n u m b e r w h e n h o s t b a c t e r i a e n t e r t h e s t a t i o n a r y p h a s e o f
A b b r e v i a t i o n s : k b , k i l o b a s e ( s ) ; To l , t o l u e n e ; X y l , x y l e n e ; A p r , a m p i c i l l i n
r e s i s t a n c e ; C b r , c a r b e n i c i l l i n r e s i s t a n c e ; S m r , s t r e p t o m y c i n r e s i s t a n c e ;
C m r , c h l o r a m p h e n i c o l r e s i s t a n c e ; K m r , k a n a m y c i n r e s i s t a n c e .
*
P r e s e n t a d d r e s s : D e p t . M e d i c a l B i o c h e m . , U n i v . G e n e v a , G e n e v a ,
S w i t z e r l a n d .
7 4 5 8
Th e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g e
p a y m e n t . Th i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d v e r t i s e -
m e n t " i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .
P r o c . N a t l A c a d . S c i . U S A 7 8 ( 1 9 8 1 ) 7 4 5 9
g r o w t h a n d t h e r e b y r e s u l t s i n i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f c l o n e d
g e n e s v i a g e n e d o s a g e ( u n p u b l i s h e d d a t a ) .
M e d i a u s e d f o r c u l t i v a t i o n o f E . c o l i ( 1 1 ) a n d P . p u t i d a ( 6 )
b a c t e r i a h a v e b e e n d e s c r i b e d , a s h a v e c o n d i t i o n s f o r p l a s m i d
D N A i s o l a t i o n ( 1 1 , 1 2 ) , t r a n s f o r m a t i o n ( 5 ) , a n d c l e a v a g e b y r e -
s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e s , a n a l y s i s b y a g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ,
a n d l i g a t i o n ( 1 3 ) . I n i t i a l c l o n i n g o f TOL D N A f r a g m e n t s w a s
c a r r i e d o u t i n E . c o l i S K 1 5 9 2 . S p e c i f i c h y b r i d p l a s m i d s t h e r e b y
g e n e r a t e d w e r e s u b s e q u e n t l y t r a n s f e r r e d t o P . p u t i d a K T2 4 4 2
b y R P 4 - m e d i a t e d m o b i l i z a t i o n .
R E S U L TS
Tr a n s p o s i t i o n M u t a g e n e s i s o f TOL w i t h Tn 5 . Th e TOL : : Tn 4 0 1
p l a s m i d , p WWO- 1 6 1 , w a s t r a n s f e r r e d b y c o n j u g a t i o n f r o m P .
p u t i d a m t - 2 ( p WWO- 1 6 1 ) t o a n E . c o l i K - 1 2 C 6 0 0 d e r i v a t i v e
t h a t c a r r i e s a c h r o m o s o m a l Tn 5 i n s e r t i o n ( K T7 5 9 ) , w i t h s e l e c -
t i o n f o r A p r , K m r t r a n s c o n j u g a n t s . Tw e n t y C 6 0 0 Tn 5 ( p WWO-
1 6 1 ) c l o n e s w e r e s e p a r a t e l y p r o p a g a t e d f o r 6 0 - 7 0 g e n e r a t i o n s
i n L ' b r o t h a n d u s e d a s d o n o r s i n m a t i n g s w i t h P . p u t i d a m t - 2
( K T2 4 4 0 ) , w i t h s e l e c t i o n o f p r o t o t r o p h i c t r a n s c o n j u g a n t s c a r -
r y i n g p WWO- 1 6 1 : : Tn 5 p l a s m i d s o n m i n i m a l g l u c o s e a g a r p l a t e s
c o n t a i n i n g K m ( 1 5 0 , g / m l ) a n d C b ( 2 m g / m l ) . Tr a n s c o n j u g a n t
c l o n e s o b t a i n e d i n t h i s m a n n e r w e r e c h a r a c t e r i z e d p h e n o t y p i -
c a l l y b y t h e i r a b i l i t y t o u t i l i z e To l / X y l p a t h w a y s u b s t r a t e s a s
c a r b o n s o u r c e s . Of a t o t a l o f 1 4 8 Tn 5 i n s e r t i o n d e r i v a t i v e s o f t h e
p WWO- 1 6 1 p l a s m i d e x a m i n e d , 8 8 h a d l o s t t h e a b i l i t y t o m e -
t a b o l i z e m - X y l . R e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e f r a g m e n t a t i o n a n a l y -
s i s o f p l a s m i d s i s o l a t e d f r o m 9 0 t r a n s c o n j u g a n t c l o n e s r e v e a l e d
t h a t a l l i n s e r t i o n s t h a t c a u s e d t h e X y l - p h e n o t y p e w e r e c l u s -
t e r e d i n o n e o f t w o d i s t i n c t r e g i o n s o f t h e p l a s m i d g e n o m e , d e -
f i n e d b y t h e X h o I G a n d t h e X h o I
J , I , E , a n d D f r a g m e n t s ,
t h a t a r e s e p a r a t e d b y a D N A s e g m e n t 1 4 - k b l o n g ( F i g . 2 ) . Tn 5
i n s e r t i o n s t h a t m a p p e d w i t h i n t h e i n t e r v e n i n g s e g m e n t d i d n o t
i n a c t i v a t e c a t a b o l i c f u n c t i o n s .
I n s e r t i o n s t h a t m a p p e d i n t h e X h o I G ( 4 . 2 k b ) a n d H i n d I I I .
D ( 9 . 8 k b ) f r a g m e n t s p r e v e n t e d b a c t e r i a l u t i l i z a t i o n o f m - X y l
a n d To l a n d t h e i r a l c o h o l a n d a l d e h y d e d e r i v a t i v e s b u t n o t c a r -
b o x y l i c a c i d s u b s t r a t e s . E n z y m e a s s a y s w i t h t w o b a c t e r i a l c l o n e s
c o n t a i n i n g i n s e r t i o n d e r i v a t i v e p l a s m i d s o f t h i s t y p e r e v e a l e d
a l a c k o f b e n z y l a l c o h o l d e h y d r o g e n a s e a n d b e n z a l d e h y d e d e -
h y d r o g e n a s e b u t t h e p r e s e n c e o f c a t e c h o l 2 , 3 - o x y g e n a s e ,
w h i c h i s c o n s i s t e n t w i t h t h e c o n c l u s i o n t h a t g e n e s f o r t h e u p p e r
p a t h w a y e n z y m e s a r e c l u s t e r e d i n t h i s r e g i o n .
I n s e r t i o n s t h a t m a p p e d i n t h e X h o I J , I , E , a n d D r b g i o n o f .
t h e TOL g e n o m e g e n e r a l l y p r e v e n t e d b a c t e r i a l g r o w t h o n a l l
p a t h w a y s u b s t r a t e s a n d t h e r e f o r e l o c a l i z e d g e n e s f o r t o l u a t e
o x y g e n a s e a n d t h e m e t a c l e a v a g e p a t h w a y e n z y m e s . Tw o e x -
c e p t i o n s t o t h i s w e r e i n s e r t i o n d e r i v a t i v e p l a s m i d s 6 3 a n d 1 0 6 , -
w h o s e Tn 5 e l e m e n t s m a p p e d i n X h o I f r a g m e n t E a n d w h i c h
p e r m i t t e d h o s t b a c t e r i a t o m e t a b o l i z e m e t a - b u t n o t p a r a - s u b -
s t i t u t e d s u b s t r a t e s . Th i s p h e n o t y p e i s c o n s i s t e n t w i t h m u t a t i o n s
t h a t i n a c t i v a t e d g e n e s f o r e n z y m e s o f t h e 4 - o x a l o c r o t o n a t e
b r a n c h o f t h e m e t a c l e a v a g e p a t h w a y ( F i g . 1 ) . S p r a y i n g o f c o l -
o n i e s o f t r a n s c o n j u g a n t c l o n e s w i t h c a t e c h o l ( 3 ) d e m o n s t r a t e d
t h a t m o s t w e r e a b l e t o c o n v e r t t h i s c o m p o u n d ( c o l o r l e s s ) t o 2 -
h y d r o x y m u c o n i c s e m i a l d e h y d e ( y e l l o w ) - i . e . , c o n t a i n e d a c t i v e
c a t e c h o l o x y g e n a s e - a n d h e n c e c a r r i e d p l a s m i d s w i t h m u t a -
t i o n s i n g e n e s f o r e n z y m e s l o w e r d o w n t h e p a t h w a y .
A p p r o x i m a t e l y 1 0 % o f a l l p l a s m i d s e x a m i n e d t h a t n o l o n g e r
p e r m i t t e d h o s t b a c t e r i a t o c a t a b o l i z e m - X y l w e r e f o u n d t o h a v e
s u f f e r e d d e l e t i o n s ; i t h a s b e e n o u r e x p e r i e n c e t h a t d e l e t i o n o c -
c u r s f r e q u e n t l y w h e n Tn 5 - c o n t a i n i n g p l a s m i d d e r i v a t i v e s a r e
t r a n s f e r r e d f r o m E . c o l i t o P . p u t i d a ( s e e a l s o b e l o w ) . C o m p a r -
i s o n o f t h e TOL p l a s m i d D N A p r e s e n t i n t h e s e d e r i v a t i v e s , b y
r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e c l e a v a g e a n a l y s i s , s h o w e d t h a t a l l
r e t a i n e d X h o I f r a g m e n t s A a n d H . Th i s r e g i o n o f TOL m u s t
t h e r e f o r e e n c o d e a u t o n o m o u s r e p l i c a t i o n a n d c o n j u g a l t r a n s f e r
f u n c t i o n s . A t t e m p t s t o l o c a l i z e t h e r e p l i c a t i o n r e g i o n o f TOL
m o r e a c c u r a t e l y b y i n v i t r o c o n s t r u c t i o n o f m i n i p l a s m i d s b y
s t a n d a r d p r o c e d u r e s ( 1 3 , 1 6 ) w e r e u n s u c c e s s f u l , i n d i c a t i n g t h a t
t h e r e p l i c a t i o n d e t e r m i n a n t s o f TOL , l i k e t h o s e o f o t h e r b r o a d
h o s t r a n g e p l a s m i d s s u c h a s R K 2 ( 1 7 ) a n d R S F 1 0 1 0 ( u n p u b l i s h e d
d a t a ) , a r e n o t c l u s t e r e d o n t h e p l a s m i d g e n o m e .
C l o n i n g o f t h e X y l Ox y g e n a s e G e n e x y l A . Th e Tn 5 t r a n s -
p o s i t i o n m u t a g e n e s i s a n a l y s i s o f p WWO- 1 6 1 i n d i c a t e d t h a t t h e
g e n e s o f u p p e r p a t h w a y e n z y m e s a r e l o c a t e d o n i t s X h o I f r a g -
m e n t G a n d H i n d I I I f r a g m e n t D ( c a r r i e s Tn 4 0 1 ) ( F i g . 2 ) . Th e s e
w e r e c l o n e d i n t o t h e p K T2 3 0 a n d p K T2 3 1 v e c t o r s , r e s p e c t i v e l y ,
t o p r o d u c e h y b r i d p l a s m i d s p K T5 4 1 a n d p K T5 4 5 . I n t r o d u c t i o n
o f t h e s e h y b r i d s i n t o t h e P . p u t i d a x y l A m u t a n t s t r a i n P a W3 9
e n a b l e d i t t o g r o w o n m - X y l .
M u t a n t TOL p l a s m i d d e r i v a t i v e s c o n t a i n i n g Tn 5 i n s e r t i o n s
i n t h e X h o I G a n d H i n d I I I D f r a g m e n t s d o n o t e n a b l e h o s t
b a c t e r i a t o u t i l i z e t h e a l c o h o l a n d a l d e h y d e p a t h w a y s u b s t r a t e s
a s c a r b o n s o u r c e s . Th i s s u g g e s t s t h a t e i t h e r t h e x y l B a n d x y l C
g e n e s o r t h e p a t h w a y r e g u l a t o r g e n e , x y l R , i s l o c a t e d o n t h e s e
f r a g m e n t s o r t h a t t h e i n s e r t i o n s a r e i n o r n e a r x y l A a n d a r e p o l a r
o n x y l B a n d x y l C . E n z y m e a s s a y s d e m o n s t r a t e d t h a t b a c t e r i a
c a r r y i n g t h e p K T5 4 1 a n d p K T5 4 5 p l a s m i d s d i d n o t c o n t a i n b e n -
z y l a l c o h o l d e h y d r o g e n a s e a n d b e n z a l d e h y d e d e h y d r o g e n a s e .
M o r e o v e r , i n t r o d u c t i o n o f t h e s e p l a s m i d s i n t o t h e P . p u t i d a
x y l R m u t a n t s t r a i n P a W2 1 0 d i d n o t r e s t o r e i t s a b i l i t y t o g r o w
o n m - X y l . Th e X h o I G a n d H i n d I I I D f r a g m e n t s o f TOL t h u s
c o n t a i n t h e x y l A g e n e b u t n o t t h e x y l B , x y l C , a n d x y l R g e n e s ,
w h i c h m u s t b e i n a c t i v a t e d b y p o l a r i t y f r o m i n s e r t i o n s i n t h e s e
f r a g m e n t s . We c o n c l u d e t h a t x y l A , x y l B , a n d x y l C f o r m a n o p -
e r o n a n d t h a t x y l B a n d x y l C a r e l o c a t e d p a r t l y o r e n t i r e l y o n a
D N A f r a g m e n t t h a t i s c o n t i g u o u s w i t h X h o I f r a g m e n t G .
H i n d I I I f r a g m e n t D c o m p l e t e l y c o n t a i n s X h o I f r a g m e n t G a n d
t h e a d j a c e n t X h o I f r a g m e n t F b u t o v e r l a p s w i t h < 1 k b o f t h e
o t h e r a d j a c e n t f r a g m e n t , X h o - I f r a g m e n t C ( F i g . 2 ) . Th i s
s t r o n g l y s u g g e s t s t h a t t h e X h o I f r a g m e n t G p r o x i m a l s e g m e n t
o f X h o I f r a g m e n t C , w h i c h i s d e l i n e a t e d b y i n s e r t i o n 5 8 , c a r r i e s
p a r t o r a l l o f x y l B a n d x y l C a n d t h a t t r a n s c r i p t i o n o f x y U A - x y l B -
x y l C i s c l o c k w i s e o n t h e m a p s h o w n i n F i g . 2 , i n a g r e e m e n t w i t h
r e s u l t s o f N a k a z a w a e t a L ( 1 4 , 1 8 ) .
C l o n i n g o f t h e C a t e c h o l 2 , 3 - Ox y g e n a s e G e n e x y l E . On e o f
t h e m o s t i m p o r t a n t c l a s s e s o f e n z y m e i n v o l v e d i n t h e c a t a b o l i s m
o f a r o m a t i c c o m p o u n d s i s t h e r i n g - c l e a v a g e e n z y m e w h i c h , i n
t h e c a s e o f t h e m e t a c l e a v a g e p a t h w a y e n c o d e d b y t h e TOL
p l a s m i d , i s c a t e c h o l 2 , 3 - o x y g e n a s e . Tr a n s p o s o n m u t a g e n e s i s
a n a l y s i s o f p WWO- 1 6 1 i n d i c a t e d t h a t t h e x y l E g e n e i s l o c a t e d
o n X h o I f r a g m e n t I . X h o I f r a g m e n t s o f p WWO- 1 6 1 D N A w e r e
i n s e r t e d i n t o t h e p K T2 3 0 v e c t o r p l a s m i d , a n d t r a n s f o r m a n t
c l o n e s c a r r y i n g h y b r i d p l a s m i d s t h e r e b y g e n e r a t e d w e r e
s c r e e n e d w i t h t h e c a t e c h o l s p r a y t e s t f o r t h e p r e s e n c e o f t h e
c a t e c h o l o x y g e n a s e . E n z y m e a s s a y s o n b a c t e r i a l c l o n e s p o s i t i v e
f o r t h i s t e s t c o n f i r m e d t h e p r e s e n c e o f t h e e n z y m e . R e s t r i c t i o n
e n d o n u c l e a s e c l e a v a g e a n a l y s i s o f p l a s m i d D N A i s o l a t e d f r o m
f o u r o x y g e n a s e p o s i t i v e c l o n e s r e v e a l e d t h a t t h e x y l E g e n e i s
c o n t a i n e d o n t h e X h o I I f r a g m e n t o f p WWO- 1 6 1 ( 2 . 2 5 k b ) . C e l l s
o f P . p u t i d a a n d E . c o l i c a r r y i n g o n e s u c h h y b r i d , p K T5 0 2 , c o n -
t a i n e d h i g h l e v e l s o f e n z y m e , 5 0 0 0 - 7 0 0 0 m i l l i u n i t s / m g o f p r o -
t e i n , w h e t h e r o r n o t t h e y h a d b e e n s p e c i f i c a l l y i n d u c e d w i t h
m - To l ( Ta b l e 1 ) ; t h e x y l E g e n e i n p K T5 0 2 i s t h u s e x p r e s s e d c o n -
s t i t u t i v e l y f r o m t h e a c t i v e K m r g e n e p r o m o t e r o f t h e v e c t o r ( r e f .
1 3 ; u n p u b l i s h e d d a t a ) .
C l o n i n g o f t h e G e n e s o f t h e m e t a C l e a v a g e P a t h w a y E n -
z y m e s a n d R e g u l a t o r . I n t h i s s t u d y , w e w e r e p a r t i c u l a r l y i n -
t e r e s t e d i n c l o n i n g t h e m e t a p a t h w a y g e n e s . We t h e r e f o r e a n a -
l y z e d t h e f r a g m e n t a t i o n p a t t e r n s o f t h e p WWO- 1 6 1 p l a s m i d a n d
s e v e r a l p WWO- 1 6 1 : : Tn 5 d e r i v a t i v e s d e f e c t i v e i n m e t a c l e a v a g e
B i o c h e m i s t r y :
F r a n k l i n e t a L
7 4 6 0 B i o c h e m i s t r y : F r a n k l i n e t a t
5 4 l o , 1 8
7 4 8 6 6 0 5
x f A
m - X y l - n - To t "
p a t h w a y f u n c t i o n s , o b t a i n e d w i t h a r a n g e o f r e s t r i c t i o n e n d o -
n u c l e a s e s , t o i d e n t i f y t h o s e t h a t c o u l d b e u s e f u l f o r c l o n i n g . S s t
I g e n e r a t e d o n l y s e v e n f r a g m e n t s f r o m p WWO- 1 6 1 D N A a n d
t w o o f t h e s e , f r a g m e n t s C ( 1 4 k b ) a n d D ( 9 . 6 k b ) , w e r e s h o w n
t o c o n t a i n a l l s i t e s o f t h e Tn 5 i n s e r t i o n s t h a t i n a c t i v a t e d m e t a
c l e a v a g e p a t h w a y g e n e s . Th e l o c a t i o n s o f t h e S s t I c l e a v a g e s i t e s
i n p WWO- 1 6 1 , r e l a t i v e t o t h e X h o I a n d H i n d I I I s i t e s p r e v i -
o u s l y m a p p e d ( 1 4 , 1 5 ) , w e r e d e t e r m i n e d b y d i g e s t i o n o f a n u m -
b e r o f w e l l - c h a r a c t e r i z e d p WWO- 1 6 1 : : Tn 5 m u t a n t p l a s m i d s
w i t h S s t I a n d w i t h S s t I / X h o I a n d S s t I / H i n d I I I c o m b i n a t i o n s .
S s t I f r a g m e n t s C a n d D c o m p l e t e l y c o n t a i n X h o I f r a g m e n t s
J , I , E , a n d D , a n d s l i g h t l y o v e r l a p f r a g m e n t s C a n d B ( F i g . 2 ) .
I n o r d e r t o c l o n e S s t I f r a g m e n t D , S s t I - g e n e r a t e d D N A f r a g -
m e n t s o f p WWO- 1 6 1 w e r e i n s e r t e d i n t o t h e p K T2 3 1 v e c t o r , a n d
t r a n s f o r m a n t c l o n e s c o n t a i n i n g h y b r i d p l a s m i d s w e r e s c r e e n e d
f o r t h e p r e s e n c e o f t h e x y l E g e n e b y s p r a y i n g w i t h c a t e c h o l . On e
h y b r i d p l a s m i d , p K T5 0 5 , w a s i s o l a t e d f r o m a p o s i t i v e c l o n e a n d
s h o w n , b y c l e a v a g e w i t h S s t I , t o c o n t a i n t h e S s t I f r a g m e n t D .
Th e TOL : : Tn 5 i n s e r t i o n d e r i v a t i v e 1 1 c o n t a i n e d a Tn 5 e l e -
m e n t i n t h e S s t I f r a g m e n t C , a l t h o u g h i t s p e c i f i e d a f u n c t i o n a l
m e t a c l e a v a g e p a t h w a y ; t h e i n s e r t i o n t h e r e f o r e w a s l o c a t e d o u t -
s i d e o f t h e g e n e c l u s t e r f o r c a t a b o l i c e n z y m e s . Th i s S s t I f r a g -
m e n t C : : Tn 5 ( Tn 5 c o n t a i n s n o S s t I c l e a v a g e s i t e ) w a s s p e c i f i c a l l y
c l o n e d b y l i n k a g e o f S s t I - g e n e r a t e d f r a g m e n t s o f t h e p WWO-
1 6 1 : . Tn 5 - 1 1 d e r i v a t i v e t o t h e C m r S m r c l o n i n g v e c t o r p K T2 1 0 ,
f o l l o w e d b y d i r e c t s e l e c t i o n o f t r a n s f o r m a n t c l o n e s c o n t a i n i n g
C m r K m r h y b r i d p l a s m i d s . On e h y b r i d t h a t w a s s h o w n t o c o n t a i n
t h e S s t I f r a g m e n t C : : Tn 5 w a s d e s i g n a t e d p K T5 0 6 .
F I G . 2 . F u n c t i o n a l m a p o f t h e TOL
p l a s m i d p WWO. Th e l o c a t i o n s o f X h o
I a n d H i n d m c l e a v a g e s i t e s a r e t a k e n
f r o m r e f s . 1 4 a n d 1 5 . S o l i d t r i a n g l e s ,
Tn 5 i n s e r t i o n s t h a t i n a c t i v a t e a l l o r
p a r t o f t h e X y l / To l d e g r a d a t i o n p a t h -
w a y ; o p e n t r i a n g l e s , i n s e r t i o n s t h a t
h a v e n o i n f l u e n c e o n t h e c a t a b o l i c
f u n c t i o n s . L o c a t i o n s o f s p e c i f i c g e n e s
a r e b a s e d o n c l o n i n g s t u d i e s . R e p /
Tr a , d e t e r m i n a n t s o f a u t o n o m o u s r e p -
l i c a t i o n a n d c o n j u g a l t r a n s f e r f u n c -
t i o n s . m - To t , m e t a - t o l u a t e .
Th e p K T5 0 5 a n d p K T5 0 6 p l a s m i d s w e r e t r a n s f e r r e d t o P .
p u t i d a a n d a s s a y s w e r e c a r r i e d o u t t o d e t e r m i n e w h i c h p l a s m i d
e n c o d e d t h e e a r l y e n z y m e s o f t h e m e t a c l e a v a g e p a t h w a y ( Ta b l e
1 ) . P l a s m i d p K T5 0 5 w a s s h o w n t o s p e c i f y c a t e c h o l 2 , 3 - o x y g e n -
a s e , 2 - h y d r o x y m u c o n i c s e m i a l d e h y d e d e h y d r o g e n a s e , a n d 2 -
h y d r o x y m u c o n i c s e m i a l d e h y d e h y d r o l a s e . A d d i t i o n o f t h e p a t h -
w a y i n d u c e r m - t o l u a t e t o t h e m e d i u m u s e d f o r g r o w t h o f b a c -
t e r i a c o n t a i n i n g p K T5 0 5 d i d n o t c a u s e a n i n c r e a s e i n e n z y m e
l e v e l s b u t d i d r e s u l t i n a n a c c u m u l a t i o n o f y e l l o w 2 - h y d r o x y -
m u c o n i c s e m i a l d e h y d e . Th e c o n v e r s i o n o f m - t o l u a t e t o 2 - h y -
d r o x y m u c o n i c s e m i a l d e h y d e r e q u i r e s b o t h t o l u a t e o x y g e n a s e
a n d c a t e c h o l o x y g e n a s e a c t i v i t i e s ; t h u s , S s t I f r a g m e n t D c o n -
t a i n e d t h e x y l D , - E , - F , a n d - G g e n e s w h i c h c o d e f o r t h e f i r s t
f o u r e n z y m e s o f t h e m e t a c l e a v a g e p a t h w a y . B a c t e r i a c a r r y i n g
t h e p K T5 0 6 p l a s m i d c o n t a i n e d n o n e o f t h e s e e n z y m e s b u t p r e -
s u m a b l y s o m e o f t h o s e f u r t h e r d o w n t h e p a t h w a y .
To d e t e r m i n e w h e t h e r t h e t w o TOL f r a g m e n t s p WWO- 1 6 1
S s t I f r a g m e n t D a n d p WWO- 1 6 1 S s t I f r a g m e n t C : : Tn 5 t o -
g e t h e r e n c o d e d a l l o f t h e m e t a p a t h w a y e n z y m e s , D N A p r e p -
a r a t i o n s o f p l a s m i d s p K T5 0 5 a n d p K T- 5 6 w e r e m i x e d , d i g e s t e d
w i t h S s t I , a n d l i g a t e d , a n d t h e l i g a t i o n m i x t u r e w a s u s e d t o
t r a n s f o r m S K 1 5 9 2 b a c t e r i a . N i n e t r a n s f o r m a n t c l o n e s w e r e o b -
t a i n e d t h a t w e r e C m r a n d K m r a n d p o s i t i v e f o r c a t e c h o l o x y -
g e n a s e a n d - c a r r i e d p l a s m i d s o f a s i z e ( 3 5 k b ) t h a t c o r r e s p o n d e d
t o a p K T2 1 0 h y b r i d c o n t a i n i n g t h e t w o r e q u i r e d f r a g m e n t s .
B e c a u s e t h e g e n e s f o r t h e m e t a p a t h w a y e n z y m e g e n e s m i g h t
b e t r a n s c r i b e d a s a s i n g l e u n i t , a n d b e c a u s e t h e S s t I s i t e b e -
t w e e n S s t I f r a g m e n t s C a n d D m i g h t b e l o c a t e d w i t h i n a c a t -
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 7 8
( 1 9 8 1 )
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 7 8 ( 1 9 8 1 ) 7 4 6 1
Ta b l e 1 . M e t a c l e a v a g e p a t h w a y e n z y m e a c t i v i t i e s i n b a c t e r i a
c a r r y i n g h y b r i d p l a s m i d s c o n t a i n i n g TOL D N A f r a g m e n t s
H o s t G r o w t h E n z y m e a c t i v i t y
P l a s m i d * s t r a i n t s u b s t r a t e t C 2 3 0 H M S D H M S H
p K T5 0 2 E G l c 7 , 3 0 0 - -
E G l c + m - t o l u a t e 6 , 8 0 0
- -
p K T5 0 2 P G l c 5 , 5 0 0 - -
P G l c + m - t o l u a t e 5 , 0 0 0 - -
p K T5 0 3 1 E G l c 1 2 , 5 0 0 - -
p WWO P A c O 9 0 < 1 0 < 1 0
p WWO P A c O + m - t o l u a t e 1 , 5 0 0 5 0 2 5 0
p WWO P A c O + m - M e B A 3 , 2 0 0 9 0 3 0 0
p WWO- 1 6 1 E A c O + m - t o l u a t e 2 4 0 1 2 2 0
p K T5 0 5 P A c O 9 0 0 2 3 4 5
p K T5 0 5 P A c O + m - t o l u a t e 8 5 0 2 0 4 0
p K T5 0 6 P A c O + m - t o l u a t e < 1 0 < 5 < 5
p K T5 3 0 P A c O 6 5 0 - -
p K T5 3 0 P A c O + m - t o l u a t e 3 , 0 0 0
- -
p K T5 3 0 P m - t o l u a t e 2 , 5 0 0
- -
p K T5 3 0 P A c O + m - M e B A 6 9 0
- -
p K T5 3 0 P A c O + m - X y l 6 0 0 - -
p K T5 3 0 E A c O 1 7 0 - -
p K T5 3 0 E A c O + m - t o l u a t e 7 0 0
- -
*
p K T5 0 2
=
p K T2 3 0 / p WWO- 1 6 1 X h o I f r a g m e n t I ; p K T5 0 3
=
p K T2 3 4 /
p WWO- 1 6 1 X h o I f r a g m e n t I ; p K T5 0 5
=
p K T2 3 1 / p WWO- 1 6 1 S s t I
f r a g m e n t D ; p K T5 0 6 = p K T2 1 0 / p WWO- 1 6 1 : : Tn 5 - 1 1 S s t I f r a g m e n t
C ; p K T5 3 0 = p K T2 1 0 / p WWO- 1 6 1 S s t I f r a g m e n t D - p WWO- 1 6 1 : : Tn 5
S s t I f r a g m e n t C * ( d e l e t i o n d e r i v a t i v e o f S s t I f r a g m e n t C ) .
t
P , P . p u t i d a m t - 2 2 4 4 0 ; E , E . c o l i K - 1 2 S K 1 5 9 2 .
t m - M e B A , m - m e t h y l b e n z y l a l c o h o l .
S h o w n a s m i l l i u n i t s / m g o f p r o t e i n . A s s a y s w e r e c a r r i e d o u t a c c o r d -
i n g t o M u r r a y e t a l . ( 1 9 ) . - , E n z y m e w a s n o t a s s a y e d . S e e F i g . 1 f o r
a b b r e v i a t i o n s .
I
A s s a y s w e r e c a r r i e d o u t w i t h c e l l s i n m i d - s t a t i o n a r y p h a s e o f g r o w t h .
a b o l i c g e n e , w e a n t i c i p a t e d t h a t o n l y o n e - f o u r t h o f t h e h y b r i d s
w o u l d c o n t a i n S s t I f r a g m e n t s C a n d D i n t h e r e q u i r e d o r i e n -
t a t i o n w i t h r e s p e c t t o o n e a n o t h e r . I n o r d e r t o i d e n t i f y p l a s m i d s
c o n t a i n i n g a f u n c t i o n a l m e t a p a t h w a y o p e r o n , a l l w e r e m o b i -
l i z e d b y R P 4 t o P . p u t i d a , w i t h s e l e c t i o n f o r t r a n s c o n j u g a n t s o n
m i n i m a l m e d i u m c o n t a i n i n g m - t o l u a t e . A l l p l a s m i d s t r a n s f e r r e d
e f f i c i e n t l y t o P . p u t i d a ( s h o w n b y s e l e c t i o n f o r C m r K m r t r a n s -
c o n j u g a n t s ) b u t o n l y o n e p e r m i t t e d g r o w t h o n m - t o l u a t e . Th i s
r e s u l t c o n f i r m e d o u r s u s p i c i o n t h a t a l l g e n e s o f t h e m e t a c l e a v -
a g e p a t h w a y e n z y m e s a r e l o c a t e d o n S s t I f r a g m e n t s C a n d D
a n d i n d i c a t e d t h a t t h e s e f r a g m e n t s m u s t b e l i n k e d i n n a t i v e
o r i e n t a t i o n i n o r d e r t o s p e c i f y a f u n c t i o n a l c a t a b o l i c p a t h w a y .
R e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e c l e a v a g e a n a l y s i s o f p l a s m i d s f r o m a
n u m b e r o f m - t o l u a t e - p o s i t i v e P . p u t i d a t r a n s c o n j u g a n t c l o n e s
r e v e a l e d t h a t a l l h a d u n d e r g o n e d e l e t i o n s w h i c h i n c l u d e d t h e
Tn 5 e l e m e n t a n d a l l o r p a r t o f t h e S s t I f r a g m e n t C r e g i o n t h a t
d o e s n o t e n c o d e m e t a p a t h w a y e n z y m e s . On e m - t o l u a t e - p o s i -
t i v e h y b r i d p l a s m i d , p K T5 3 0 , w h i c h h a d a d e l e t i o n o f 9 k b , w a s
s t u d i e d f u r t h e r .
R e g u l a t i o n o f E x p r e s s i o n o f t h e C l o n e d m e t a C l e a v a g e P a t h -
w a y E n z y m e G e n e s . I n o r d e r t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e c l o n e d
m e t a c l e a v a g e p a t h w a y g e n e s a r e r e g u l a t e d , w e h a v e a s s a y e d
t h e l e v e l s o f c a t e c h o l 2 , 3 - o x y g e n a s e i n p K T5 3 0 - c a r r y i n g c e l l s
o f P . p u t i d a 2 4 4 0 a n d E . c o l i S K 1 5 9 2 g r o w n i n m i n i m a l m e d i u m
c o n t a i n i n g v a r i o u s To l / X y l p a t h w a y i n d u c e r s ( Ta b l e 1 ) . Th e
p r e s e n c e o f m - t o l u a t e a s i n d u c e r o r s o l e c a r b o n s o u r c e i n m e d i a
u s e d t o g r o w P . p u t i d a ( p K T5 3 0 ) r e s u l t e d i n a 4 - t o 5 - f o l d i n -
c r e a s e i n o x y g e n a s e a c t i v i t y o v e r t h a t o b t a i n e d w i t h a c e t a t e
( 3 0 0 0 v s . 6 5 0 m i l l i u n i t s / m g o f p r o t e i n ) , w h e r e a s t h e p r e s e n c e
o f m - X y l o r m - m e t h y l b e n z y l a l c o h o l c a u s e d n o i n c r e a s e i n e n -
z y m e a c t i v i t y ( t h e h i g h b a s a l l e v e l o f c a t e c h o l o x y g e n a s e i n n o n -
i n d u c e d c e l l s c a r r y i n g p K T5 3 0 i s p r o b a b l y c a u s e d b y t r a n s c r i p -
t i o n o f x y l E f r o m a v e c t o r p r o m o t e r ) . Th i s r e s u l t d e m o n s t r a t e d
t h a t t h e p K T5 3 0 p l a s m i d c a r r i e s n o t o n l y a l l m e t a p a t h w a y e n -
z y m e g e n e s a n d t h e i r p r o m o t e r b u t a l s o t h e r e g u l a t o r y g e n e x y l S
p o s t u l a t e d b y Wo r s e y e t a t ( 3 ) a n d t h e c o n t r o l s e q u e n c e s t h a t
i n t e r a c t w i t h t h e x y l S p r o d u c t p l u s c o i n d u c e r b u t n o t x y l R .
C o n s i s t e n t w i t h t h i s c o n c l u s i o n w a s t h e f i n d i n g - t h a t i n t r o d u c -
t i o n o f t h e p K T5 3 0 p l a s m i d i n t o t h e P . p u t i d a x y l R m u t a n t s t r a i n
P a W2 1 0 f a i l e d t o r e s t o r e i t s a b i l i t y t o g r o w o n m - X y l . E x p r e s s i o n
o f x y l E c o u l d n o t b e i n d u c e d b y m - t o l u a t e i n c e l l s c a r r y i n g t h e
p K T5 0 5 p l a s m i d ( Ta b l e 1 ) ; t h i s i s a s t r o n g i n d i c a t i o n t h a t x y l S
i s l o c a t e d o n t h e S s t I f r a g m e n t C o f TOL , p r o b a b l y d o w n -
s t r e a m f r o m t h e m e t a p a t h w a y g e n e s , a n d t h a t i t e n c o d e s a
p o s i t i v e r e g u l a t o r .
E . c o l i c e l l s c a r r y i n g t h e p K T5 3 0 p l a s m i d w e r e a b l e t o g r o w
o n m - t o l u a t e a s s o l e c a r b o n s o u r c e b u t w i t h a d o u b l i n g t i m e
a b o u t 1 0 t i m e s l o n g e r t h a n t h a t o f P . p u t i d a ( p K T5 3 0 ) . S u c h c e l l s
a l s o s h o w e d a p a t t e r n o f r e g u l a t i o n o f c a t e c h o l o x y g e n a s e a c t i v -
i t y s i m i l a r t o t h a t o b s e r v e d i n P . p u t i d a , a l t h o u g h b o t h u n i n -
d u c e d a n d i n d u c e d e n z y m e l e v e l s w e r e 1 / 4 t h t h o s e t y p i c a l f o r
t h e l a t t e r . Th e i n d u c e d l e v e l s o f c a t e c h o l o x y g e n a s e i n c e l l s o f
E . c o l i c a r r y i n g p K T5 3 0 w e r e a b o u t 4 - f o l d h i g h e r t h a n i n t h o s e
c a r r y i n g TOL . Th i s s u g g e s t s t h a t t h e i n a b i l i t y o f t h e l a t t e r t o
g r o w w i t h m - t o l u a t e a s s o l e c a r b o n s o u r c e r e f l e c t s t h e l o w c o n -
t e n t o f TOL - s p e c i f i e d c a t a b o l i c e n z y m e s r a t h e r t h a n a p a r t i c u -
l a r m e t a b o l i c d e f e c t i n E . c o l i K - 1 2 w h i c h p r e v e n t s t h e u p t a k e
o r m e t a b o l i s m o f t h i s s u b s t r a t e .
I t w a s r e p o r t e d p r e v i o u s l y t h a t t h e c a t a b o l i c g e n e s o f TOL
a r e e x p r e s s e d p o o r l y i n E . c o l i ( 2 0 , 2 1 ) ( s e e a l s o Ta b l e 1 ) a l t h o u g h
t h e r e a s o n f o r t h i s w a s n o t d e t e r m i n e d . Th e c a t e c h o l o x y g e n a s e
l e v e l s i n E . c o l i c e l l s c a r r y i n g p K T5 0 2 a r e a b o u t 3 0 - f o l d a n d 4 -
t o 5 - f o l d h i g h e r t h a n t h o s e f o u n d i n m - t o l u a t e - i n d u c e d TOL
p l a s m i d - c a r r y i n g E . c o l i a n d P . p u t i d a b a c t e r i a , r e s p e c t i v e l y ,
a n d 1 0 - f o l d a n d 2 - f o l d h i g h e r t h a n i n s i m i l a r b a c t e r i a c a r r y i n g
p K T5 3 0 . M o r e o v e r , w e h a v e b e e n a b l e t o o b t a i n E . c o l i c e l l s
t h a t c o n t a i n e d < 1 2 , 0 0 0 m i l l i u n i t s o f e n z y m e p e r m g o f p r o t e i n
b y c l o n i n g t h e X h o I f r a g m e n t i n t o t h e C o l D - b a s e d v e c t o r
p K T2 3 4 ( Ta b l e 1 ) . A c c o r d i n g t o a p u b l i s h e d e s t i m a t e o f t h e s p e -
c i f i c a c t i v i t y o f c a t e c h o l 2 , 3 - o x y g e n a s e ( 1 8 ) a n d p r e l i m i n a r y e x -
p e r i m e n t s i n v o l v i n g t h e r a d i o l a b e l i n g o f t o t a l p r o t e i n o f E . c o l i
b a c t e r i a c a r r y i n g t h e p K T2 3 4 h y b r i d p l a s m i d ( u n p u b l i s h e d
d a t a ) , t h o s e e n z y m e l e v e l s c o r r e s p o n d t o a b o u t 5 % o f t h e s o l u b l e
c e l l u l a r p r o t e i n . Th i s s u g g e s t s t h a t t h e p o o r e x p r e s s i o n o f P s e u -
d o m o n a s To l / X y l - c a t a b o l i c g e n e s i n E . c o l i r e s u l t s f r o m i n e f -
f i c i e n t t r a n s c r i p t i o n f r o m t h e c a t a b o l i c g e n e p r o m o t e r s , p r e -
s u m a b l y b e c a u s e t h e s e p r o m o t e r s f u n c t i o n l e s s e f f i c i e n t l y w i t h
t h e R N A p o l y m e r a s e o r x y l S p r o d u c t o f E . c o l i t h a n w i t h t h a t
o f P . p u t i d a , a n d n o t f r o m i n a d e q u a c i e s o f t h e E . c o l i t r a n s l a t i o n
a n d p r o c e s s i n g s y s t e m s . Th e r e p l a c e m e n t o f n a t u r a l p r o m o t e r s
b y s t r o n g p r o m o t e r s t h a t a r e a c t i v e i n E . c o l i t h e r e f o r e s h o u l d
e n a b l e t h i s h o s t t o b e u s e d f o r t h e p r o d u c t i o n o f l a r g e q u a n t i t i e s
o f c a t a b o l i c e n z y m e s f r o m P s e u d o m o n a s a n d o t h e r s o i l b a c t e r i a .
A l t h o u g h m u c h i n f o r m a t i o n i s n o w a v a i l a b l e o n t h e l e v e l s o f
e x p r e s s i o n o f p r o d u c t s f r o m s i n g l e g e n e s c l o n e d i n e x p r e s s i o n
v e c t o r s , n o n e h a s b e e n p u b l i s h e d o n t h e e x p r e s s i o n o f w h o l e
p a t h w a y s e n c o d e d b y 1 0 a n d m o r e g e n e s . Th e c l o n e d m e t a
c l e a v a g e p a t h w a y g e n e s o n b r o a d h o s t r a n g e v e c t o r s p r o v i d e a
c o n v e n i e n t s y s t e m t o i n v e s t i g a t e t h i s .
D I S C U S S I ON
I n t h i s r e p o r t , w e d e s c r i b e a m o l e c u l a r c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e
TOL p l a s m i d , p WWO- 1 6 1 , a n d t h e c l o n i n g o f g e n e s o f a n e n t i r e
f u n c t i o n a l , r e g u l a t e d , b i o d e g r a d a t i o n p a t h w a y . Tr a n s p o s o n
m u t a g e n e s i s o f p WWO- 1 6 1 w i t h Tn 5 r e v e a l e d t h a t g e n e s f o r
To l / X y l c a t a b o l i c e n z y m e s a r e o r g a n i z e d i n t w o c l u s t e r s o n t h e
p l a s m i d w h i c h , s u r p r i s i n g l y , a r e s e p a r a t e d b y a D N A s e g m e n t
B i o c h e m i s t r y :
F r a n k l i n e t a L
7 4 6 2 B i o c h e m i s t r y : F r a n k l i n e t a L
1 4 k b l o n g . On e g e n e b l o c k c o n t a i n s t h e g e n e s o f t h e u p p e r
p a t h w a y e n z y m e s w h e r e a s t h e o t h e r c o n t a i n s t h e g e n e s o f t o l u -
a t e o x y g e n a s e a n d e n z y m e s o f t h e m e t a r i n g c l e a v a g e p a t h w a y .
Th e p h y s i c a l o r g a n i z a t i o n o f t h e To l / X y l c a t a b o l i c g e n e s t h e r e -
f o r e r e f l e c t s t h e b i o c h e m i c a l f u n c t i o n i n g o f t h e p a t h w a y . I t
s e e m s u n l i k e l y t h a t t h e D N A s e g m e n t t h a t s e p a r a t e s t h e g e n e
c l u s t e r s o n TOL f o r t u i t o u s l y i n s e r t e d p r e c i s e l y b e t w e e n g e n e
b l o c k s t h a t w e r e o r i g i n a l l y c o n t i g u o u s b u t s e p a r a t e l y r e g u l a t e d .
I t i s m o r e p r o b a b l e t h a t t h e p l a s m i d e v o l v e d b y i n s e r t i o n s e -
q u e n c e - m e d i a t e d a s s e m b l y o f d i s c r e t e D N A s e g m e n t s ( " m o d -
u l e s " ) w h i c h e n c o d e d d i s t i n c t f u n c t i o n a l p a r t s o f t h e d e g r a d a t i o n
p a t h w a y ( 2 2 , 2 3 ) a n d p e r h a p s a r o s e f r o m d i f f e r e n t b a c t e r i a .
A s i m i l a r s e p a r a t i o n o f c a t a b o l i c g e n e c l u s t e r s o n t h e N A H
( n a p h t h a l e n e d e g r a d a t i o n ) p l a s m i d h a s a l s o b e e n f o u n d ( I . C .
G u n s a l u s , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) . . I f d i s p e r s i o n o f g e n e s f o r
e n z y m e s o f c a t a b o l i c p a t h w a y s o v e r l o n g s e g m e n t s o f g e n o m e
( p l a s m i d o r c h r o m o s o m e ) i s a g e n e r a l p h e n o m e n o n , i t w i l l h a v e
i m p o r t a n t c o n s e q u e n c e s f o r t h e i r . c l o n i n g , a n d h e n c e m a n i p u -
l a t i o n , f o r s c i e n t i f i c , e n v i r o n m e n t a l , o r c o m m e r c i a l p u r p o s e s .
Tr a n s p o s o n m u t a g e n e s i s m a p p i n g o f c a t a b o l i c g e n e s o f i n t e r e s t
w o u l d t h u s s e e m t o b e a p r u d e n t f i r s t s t a g e i n p r o g r a m s f o r t h e
c l o n i n g o f m u l t i p l e g e n e p a t h w a y s . Th e Tn 5 i n s e r t i o n s i n t h e
p WWO- 1 6 1 d e r i v a t i v e p l a s m i d s p r o v i d e d e x t r e m e l y u s e f u l r e f -
e r e n c e p o i n t s , n o t o n l y f o r g e n e s t h a t t h e y i n a c t i v a t e d - b u t a l s o
f o r l o c a l i z a t i o n o f n e a r b y r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e c l e a v a g e s i t e s
a n d h e n c e f o r p l a n n i n g o f o p t i m a l c l o n i n g s t r a t e g i e s .
Th e To l / X y l c a t a b o l i c g e n e s a r e o r g a n i z e d i n t w o r e g u l a t o r y
b l o c k s w h o s e e x p r e s s i o n a p p e a r s t o b e p o s i t i v e l y c o n t r o l l e d b y
t h e p r o d u c t s o f t w o g e n e s t h a t h a v e b e e n d e s i g n a t e d x y l R a n d
x y l S ( 3 ) . I t h a s b e e n p o s t u l a t e d t h a t t h e h y d r o c a r b o n , a l c o h o l ,
a n d p r o b a b l y a l d e h y d e p a t h w a y s u b s t r a t e s i n t e r a c t w i t h t h e
x y l R p r o d u c t t o i n d u c e t h e s y n t h e s i s o f a l l c a t a b o l i c e n z y m e s ,
w h e r e a s t h e c a r b o x y l i c a c i d s u b s t r a t e s i n t e r a c t w i t h t h e x y l S
g e n e p r o d u c t t o i n d u c e t h e s y n t h e s i s o f t o l u a t e o x y g e n a s e a n d
e n z y m e s o f t h e m e t a p a t h w a y . Th e p r o m o t e r o f t h e u p p e r p a t h -
w a y o p e r o n i s t h o u g h t t o b e a c t i v a t e d b y t h e x y l l I p r o d u c t p l u s
c o i n d u c e r , w h e r e a s t h e p r o m o t e r o f t h e l o w e r . p a t h w a y o p e r o n
i s a s s u m e d t o b e a c t i v a t e d b y t h e x y l S p r o d u c t p l u s i t s c o i n d u c e r
a n d b y t h e x y l R p r o d u c t p l u s c o i n d u c e r . M o l e c u l a r c h a r a c t e r -
i z a t i o n o f t h e o r g a n i z a t i o n a n d r e g u l a t i o n o f t h e To l / X y l p a t h -
w a y g e n e s a n d d i s s e c t i o n o f t h e f u n c t i o n a l r o l e s o f t h e t w o r e g -
u l a t o r y e l e m e n t s r e q u i r e s t h e s e p a r a t e c l o n i n g o f t h e u p p e r
p a t h w a y o p e r o n p l u s x y l R a n d t h e l o w e r ( m e t a c l e a v a g e ) p a t h -
w a y . o p e r o n p l u s x y l S .
Ou r c l o n i n g o f S s t I f r a g m e n t s C a n d D f r o m t h e TOL p l a s m i d
t h a t c o n t a i n t h e l o w e r p a t h w a y o p e r o n p r o v i d e s t h e m o s t c r u c i a l
o f t h e s e t w o c o m p o n e n t s . Th e f i n d i n g t h a t e x p r e s s i o n o f x y l E
o n p K T5 3 0 i n b o t h P . p u t i d a a n d E . c o l i h o s t b a c t e r i a i s s p e -
c i f i c a l l y i n d u c e d b y m - t o l u a t e , b u t n o t b y m - X y l o r m - m e t h y l -
b e n z y l a l c o h o l , d e m o n s t r a t e d t h a t p K T5 3 0 c a r r i e s t h e e n t i r e
m e t a p a t h w a y o p e r o n , i n c l u d i n g c o n t r o l l i n g s e q u e n c e s a n d x y l S
b u t n o t x y l R . Th e p K T5 3 0 p l a s m i d t h u s p r o v i d e s a u n i q u e o p -
p o r t u n i t y t o c h a r a c t e r i z e t h e x y l S g e n e p r o d u c t a n d i t s m e c h -
a n i s m o f r e g u l a t i o n o f t h e c a t a b o l i c p a t h w a y . N o t e t h a t i n d u c t i o n
o f x y l E g e n e e x p r e s s i o n b y m - X y l i n c e l l s c a r r y i n g p K T5 3 0 c o n -
s t i t u t e s a s p e c i f i c t e s t f o r c l o n e d D N A f r a g m e n t s t h a t c a r r y x y l R
( a n d h a s - b e e n u s e d t o l o c a l i z e x y l R t o t h e X h o I D a n d S s t I C
f r a g m e n t s ) , w h e r e a s i n d u c t i o n o f x y l E e x p r e s s i o n b y m - t o l u a t e
i n c e l l s c a r r y i n g p K T5 0 5 i s a s p e c i f i c t e s t f o r c l o n e d D N A f r a g -
m e n t s c a r r y i n g x y l S . C l o n e d X h o I f r a g m e n t G o f TOL i n t h e
p K T5 4 1 p l a s m i d w h i c h c o n t a i n s x y l A a l m o s t c e r t a i n l y c o n t a i n s
t h e p r o m o t e r - o p e r a t o r c o n t r o l s e q u e n c e s o f t h e . u p p e r p a t h w a y
o p e r o n . C o m p a r i s o n o f t h e p o l y n u c l e o t i d e s e q u e n c e o f t h i s c o n -
t r o l r e g i o n w i t h t h a t o f t h e l o w e r p a t h w a y o p e r o n s h o u l d p r o v i d e
i m p o r t a n t i n f o r m a t i o n o n t h e f u n c t i o n i n g a n d i n t e r a c t i o n s o f t h e
x y l S a n d x y l R p r o d u c t s i n t h e r e g u l a t i o n o f t h e t w o c a t a b o l i c
g e n e b l o c k s . F u r t h e r m o r e , c o m p a r i s o n o f t h e i n t e r a c t i o n o f
t h e s e p r o m o t e r s w i t h R N A p o l y m e r a s e s o f P . p u t i d a a n d E . c o l i
s h o u l d e x p l a i n t h e d i f f e r e n c e s i n e x p r e s s i o n o f TOL g e n e s i n
t h e s e t w o h o s t s .
I t s h o u l d b e e m p h a s i z e d t h a t t h e m e t a c l e a v a g e p a t h w a y i s
a n i m p o r t a n t a n d w i d e s p r e a d r o u t e f o r t h e m e t a b o l i s m o f a r o -
m a t i c c o m p o u n d s . I t s c l o n e d g e n e s r e p r e s e n t o n e c r u c i a l c o m -
p o n e n t o f g e n e m a n i p u l a t i o n s t r a t e g i e s w h o s e g o a l s a r e t h e c o n -
s t r u c t i o n o f n o v e l h y b r i d p a t h w a y s f o r t h e d e g r a d a t i o n o f
a r o m a t i c e n v i r o n m e n t a l p o l l u t a n t s o r f o r t h e s y n t h e s i s o f p a t h -
w a y i n t e r m e d i a t e s t h a t a r e o f c o m m e r c i a l i n t e r e s t .
Th i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y t h e B u n d e s m i n i s t e r i u m f u r F o r s c h u n g
u n d
Te c h n o l o g i e .
1 . Wo r s e y , M . J . & Wi l l i a m s , P . A . ( 1 9 7 5 ) J . B a c t e r i o t 1 2 4 , 7 - 1 3 .
2 . K u n z , D . A . & C h a p m a n , P . J . ( 1 9 8 1 ) J . B a c t e r i o l 1 4 6 , 1 7 9 - 1 9 1 .
3 . Wo r s e y , M . J . , F r a n k l i n , F . C . H . & Wi l l i a m s , P . A . ( 1 9 7 8 ) J .
B a c t e r i o L 1 3 4 , 7 5 7 - 7 6 4 .
4 . K u s h n e r , S . R . ( 1 9 7 8 ) i n G e n e t i c E n g i n e e r i n g , e d s . B o y e r , H . W.
& N i c o s i a , S . ( E l s e v i e r / N o r t h - H o l l a n d , A m s t e r d a m ) , p p . 1 7 - 2 3 .
5 . B a g d a s a r i a n , M . & Ti m m i s , K . N . ( 1 9 8 1 ) i n C u r r e n t To p i c s o f
M i c r o b i o l o g y a n d I m m u n o l o g y , e d s . G o e b e l , W. & H o f s c h n e i -
d e r , P . H . ( S p r i n g e r , B e r l i n ) , p p . 4 7 - 6 7 .
6 . Wi l l i a m s , P . A . & M u r r a y , K . ( 1 9 7 4 ) J . B a c t e r i o l 1 2 0 , 4 1 6 - 4 2 3 .
7 . F r a n k l i n , F . C . H . , B a g d a s a r i a n , M . & Ti m m i s , K . N . ( 1 9 8 1 ) i n
M i c r o b i a l D e g r a d a t i o n o f X e n o b i o t i c s a n d R e c a l c i t r a n t C o m -
p o u n d s , e d s . H u i t t e r , R . & L e i s i n g e r , T. ( A c a d e m i c , L o n d o n ) ,
p p . 1 1 1 - 1 3 2 .
8 . D a t t a , N . , H e d g e s , R . W. , S h a w , E . J . , S y k e s , R . B . & R i c h -
m o n d , M . ' H . ( 1 9 7 1 ) J . B a c t e r i o L 1 0 8 , 1 2 4 4 - 1 2 4 9 .
9 . B a g d a s a r i a n , M . , L u r z , R . , R u c k e r t , B . , F r a n k l i n , F . C . H . , B a g -
d a s a r i a n , M . M . , F r e y , I . & Ti m m i s , K . N . , G e n e , i n p r e s s .
1 0 . B a g d a s a r i a n , M . , B a g d a s a r i a n , M . M . , C o l e m a n , S . & Ti m m i s ,
K . N . ( 1 9 7 9 ) i n P l a s m i d s o f M e d i c a l , E n v i r o n m e n t a l a n d C o m -
m e r c i a l I m p o r t a n c e , e d s . Ti m m i s , K . N . & P u h l e r , A . ( E l s e v i e r /
N o r t h - H o l l a n d , A m s t e r d a m ) , p p . 4 1 1 - 4 2 2 .
1 1 . Ti m m i s , K . N . , C a b e l l o , F . & C o h e n , S . N . ( 1 9 7 8 ) M o l G e n . G e -
n e t . 1 6 2 , 1 2 1 - 1 3 7 .
1 2 . H a n s e n , J . B . & Ol s e n , R . H . ( 1 9 7 8 ) J . B a c t e r i o L 1 3 5 , 2 2 7 - 2 3 8 .
1 3 . A n d r e s , I . , S l o c o m b e , P . M . , C a b e l l o , F . , Ti m m i s , J . , L u r z , R . ,
B u r k a r d t , H . J . & Ti m m i s , K . N . ( 1 9 7 9 ) M o l G e n . G e n e t . 1 6 8 ,
1 - 2 5 .
1 4 . N a k a z a w a , T. , I n o u y e , S . & N a k a z a w a , A ; ( 1 9 8 0 ) J . B a c t e r i o L
1 4 4 , 2 2 2 - 2 3 1 .
1 5 . D o w n i n g , R . & B r o d a , P . ( 1 9 7 9 ) M o l G e n . G e n e t . 1 7 7 , 1 8 9 - 1 9 1 .
1 6 . Ti m m i s , K . N . , C a b e l l o , F . & C o h e n , S . N . ( 1 9 7 5 ) P r o c . N a t l
A c a d . S c i . U S A 7 2 , 2 2 4 2 - 2 2 4 6 .
1 7 . F i g u r s k i , D . & H e l i n s k i , D . R . ( 1 9 7 9 ) P r o c . N a t l A c a d . S c i . U S A
7 6 , 1 6 4 8 - 1 6 5 2 .
1 8 . I n o u y e , S . , N a k a z a w a , A . & N a k a z a w a , T. ( 1 9 8 1 ) J . B a c t e r i o L
1 4 5 , 1 1 3 7 - 1 1 4 3 .
1 9 . M u r r a y , K . , D u g g l e b y , C . J . , S a l a - Tr e p a t , J . M . & Wi l l i a m s , P .
A . ( 1 9 7 2 ) E u r . J . B i o c h e m . ' 2 8 , 3 0 1 - 3 1 0 .
2 0 . J a c o b y , J . A . , R o g e r s , J . E . , J a c o b , A . E . & H e d g e s , R . W. ( 1 9 7 8 )
N a t u r e ( L o n d o n ) 2 7 4 , 1 7 9 - 1 8 0 .
2 1 . R i b b o n s , D . W. , Wi g m o r e , G . J . & C h a k r a b a r t y , A . M . ( 1 9 7 9 )
S o c . G e n . M i c r o b i o L 6 , 2 4 - 2 5 .
2 2 . C o h e n , S . N . ( 1 9 7 6 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 2 6 3 , 7 3 1 - 7 3 8 .
2 3 . F a r r e l l , R . & C h a k r a b a r t y , A . M . ( 1 9 7 9 ) i n P l a s m i d s o f M e d i c a l ,
E n v i r o n m e n t a l a n d C o m m e r c i a l I m p o r t a n c e , e d s . Ti m m i s , K . N .
& P u h i l e r , A . ( E l s e v i e r / N o r t h H o l l a n d , A m s t e r d a m ) , p p . 9 7 - 1 0 9 .
P r o c . N a d A c a d . S c i . U S A 7 8
( 1 9 8 1 )