TUJUAN

1. Mahasiswa dapat mengoperasikan kromatografi HPLC dengan baik sesuai dengan SOP
2. Memahami cara kerja instrumen HPLC untuk analisis kuantitatif.
3. Dapat melakukan preparasi dengan tepat dan akurat, serta dapat mengikuti manual
pengoperasian HPLC.
DASAR TEORI
Kromatografi Cair Berperforma Tinggi (high performance liquid
chromatography, HPLC) merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zat cair yang
biasanya disertai dengan tekanan tinggi. Seperti teknik kromatografi pada umumnya, HPLC
berupaya untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap
zat padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan fasa cair dan zat padatnya
merupakan fasa diam (stasioner). Teknik ini sangat berguna untuk memisahkan beberapa
senyawa sekaligus karena setiap senyawa mempunyai afinitas selektif antara fasa diam
tertentu dan fasa gerak tertentu. Dengan bantuan detektor serta integrator kita akan
mendapatkan kromatogram. Kromatorgram memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu
senyawa.
HPLC adalah alat untuk mengalisa kandungan bahan kimia, baik secara kualitatif
maupun secara kuantitatif. HPLC sendiri singkatan dari High Performance Liquid
Chromatography. Mulanya HPLC digunakan untuk mengidentifikasi kandungan antibiotik
pada susu dan daging udang, terutama kroramfenikol. Tetapi HPLC kini digunakan pula
untuk kegiatan perikanan lainnya.
Kromatografi cair kinerja tinggi (High Performance Liquid Chromatography,
HPLC) Metode pemisahannya didasarkan pada perbedaan keseimbangan distribusi
komponen sampel antara dua fasa: diam (kolom) dan gerak (sistem pelarut yang mengalir).
Tekanan tinggi diperoleh dari pompa, meningkatkan mobilitas eluant. Tipe-tipenya adalah
absorpsi, partisi, pertukaran ion dan permeasi gel. Deteksi yang digunakan al.
spektrofotometrik (absorpsi sinar UV atau tampak, fluorometri, penggunaan senyawa
pendar/fluoresen, senyawa elektrokhemis yang dapat teroksidasi atau tereduksi)


Prinsip kerja HPLC
Dengan bantuan pompa fasa gerak air dialirkan melalui kolom ke detector. Cuplikan
dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi
pemisahan komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara
solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam
akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solute-solut yang kuat berinteraksi dengan
fasa diam maka solute-solut tersebut akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen
campuran yang keluar kolom dideteksi oleh detector kemudian direkam dalam bentuk
kromatogram.

Kromatografi HPLC ini digunakan untuk mengidentifikasi suatu sampel secara
kualitatif dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut secara
kuantitatif.
Penentuan Kualitatif
HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi.
Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan
standar.
Penentuan Kuantitatif
Beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk penentuan
secara kuantitatif adalah:
1. Parameter percobaan sama antara standar dan sampel
2. Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama
3. Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan menggunakan
larutan standar seri pada waktu retensi tertentu.
4. Berdasarkan area kromatogram
5. Berdasarkan tinggi puncak kromatogram
Umumnya hasil analisis HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam
kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen
dalam sample.
Instrumen alat
Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk
memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase
gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam. Diagram skematik sistem
kromatografi cair seperti ini :

a. Fasa gerak
Fasa gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelarut.
Selain berfungsi sebagai pembawa komponen-komponen campuran campuran menuju
detector, fasa gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu, fasa gerak dalam
HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan.


Persyaratan fasa gerak HPLC:
1. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan
dianalisis.
2. Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat
mengganggu interpretasi kromatografi.
3. Zat air harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom.
4. Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun.
5. Zat air tidak kental. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0,5 cP (centi Poise).
6. Sesuai dengan detector.
Jenis fasa gerak berdasarkan kepolaran fasa diam dan fasa gerak:
a) HPLC fasa normal: HPLC dengan kombinasi antara fasa diam polar dan fasa gerak
non-polar. Fasa diam yang digunakan seperti silica, alumina, atau trietilenaglikol yang
dilapiskan pada partikel silica. Sedangkan fasa gerak yang digunakan adalah heksana
atau i-propileter.
b) HPLC fasa terbalik: HPLC dengan kombinasi antara fasa diam non-polar dan fasa
gerak polar. Fasa gerak yang digunakan seperti air, methanol, atau asetinitril.
Fasa gerak yang baik memberikan factor kapasitas k pada rentang yang sesuai. Untuk
cuplikan dengan 2-3 komponen, sebaiknya menggunakan fasa gerak yang memberikan k
antara 2-5.
b. Pompa
Pompa dalam HPLC dapat dianalogkan dengan jantung pada manusia yang berfungsi untuk
mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang berisi serbuk halus.
Persyaratan pompa yang digunakan dalam HPLC:
1. Menghasilkan tekanan sampai 600psi (point/in
2
)
2. Keluaran bebas pulsa
3. Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 ml/menit
4. Bahan tahan korosi
Tiga jenis pompa yang digunakan dalam HPLC:
a) Pompa reciprocating
Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan
piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa gelas dan berkontak langsung
dengan pelarut. Ketika piston mundur maka bola gelas bawah terangkat dan pelarut masuk,
sebaliknya ketika piston maju maka bola bawah menutup saluran pelarut dan pelarut yang
telah berada di ruang pompa didorong masuk ke dalam kolom.


b) Pompa displacement
Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi
pendorong yang digerakkan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung
tidak bergantung pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut.
c) Pompa pneumatic
Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis ini murah
dan bebas pulsa. Akan tetapi mempunya keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan
(<2000 psi) serta kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan takanan balik kolom.

c. Injector Sample
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikan secara langsung ke dalam fase gerak yang
mengalir dibawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari
tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop)
internal atau eksternal.
Salah satu jenis penyuntik untuk memasukan sampel ke dalam sistem (kolom)
kromatografi adalah penyuntik loop. Dalam prakteknya, loop tidak perlu diisi penuh, tapi bila
tidak diisi penuh akan mengakibatkan lebih jeleknya presisi hasil eksperimen dan
ketergantungan presisi tersebut kepada bagaimana si-operator menggunakan penyuntik.
Perlu diingat, bahwa penyuntik tidak boleh dicabut sebelum pegangan (handle) penyuntik
diputar dari posisi load (pengisap) ke posisi inject (suntik). Karena sampel akan mengalir
ke saluran pembuangan. Hal yang terakhir ini tentunya tidak diinginkan, pegangan penyuntik
harus diputar cepat agar pemutusan aliran ke dalam diinginkan. Pegangan penyuntik harus
diputar cepat agar pemutusan aliran ke dalam kolom, antara posisi pengisian (load) dan posisi
penyuntikan (inject) berlangsung cepat.
Yang menjadi faktor ketidak tepatan pengukuran HPLC salah satunya terletak pada
keterulangan pemasukan cuplikan kedalam paking kolom. Masalahnya kebanyakan
memasukan cuplikan kedalam kolom dapat menyebabkan band broadening. Oleh karen itu
cuplikan yang dimasukkan harus sekecil beberapa puluh mikroliter. Beberapa teknik
pemasukan cuplikan kedalam sistem dapat diuraikan sebagai berikut :

1. Injeksi syringe
Syringe disuntikan melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang syringe yang tahan
tekanan sampai 1500 psi. akan tetapi keterulangan injeksi syringe ini sedikitb lebih baik dari
2-3% dan sering lebih jelek.
2. Injeksi stop-flow
Injeksi ini adalah jenis injeksi syringe kedua tapi di sini aliran pelarut dihentikan sementara,
sambungan pada ujung kolom dibuka dan cuplikan disuntikan langsung ke dalam ujung
kolom. Setelah menyambungkan kembali kolom maka pelarut dialirkan kembali.
3. Kran cuplikan
Jenis pemasukan uplikan ini disebut juga loop. Untuk memasukkan cuplikan ke dalam aliran
fasa gerak perlu dua langkah:
a) Sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dalam posisi load, cuplikan
masih berada dalam loop
b) Kran diputar untuk mengubah posisi load menjadi posisi injeksi dan fasa gerak
membawa cuplikan ke dalam kolom.
d. Kolom dan Fase diam
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom
merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses
pemisahan solut/analit.
Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom
konvensional, yakni:
a) Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan
kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat
(10 -100 l/menit).
b) Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika
digabung dengan spektrometer massa.
c) Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis
kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.
Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom
konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi,
silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan
silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat
dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-
reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus
fungsional yang lain.
Contoh Pembuatan fasa diam dengan reaksi antara silika dengan alkilklorosilana (reaksi
silanisasi) :

Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena
mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun
tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar.
Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang
tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang
bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan.

e. Detektor
Ada dua jenis detektor yaitu detektor selektif, adalah detektor yang peka terhadap
golongan senyawa tertentu saja. Dan detektor universal, yaitu detektor yang peka terhadap
golongan senyawa apapun kecuali pelarutnya. Diantara detektor yang digunakan dalam
KCKT adalah
a) Detektor Universal
Detektor Ultra Violet Visible (Sinar Tampak)
Si OH + + HCl Cl Si R
CH
3
CH
3
Si O R Si
CH
3
CH
3
Detektor UV terutama digunakan untuk pendeteksian senyawa-senyawa organik. Detektor
UV dilengkapi dengan pengatur panjang gelombang, sehingga panjang gelombang UV yang
digunakan dapat dipilih sesuai dengan jenis cuplikan yang diukur.
Detektor UV-Visible (uv-sinar tampak) paling banyak digunakan, karena
sensitivitasnya yang baik mudah menggunakannya, tidak merusak senyawa yang di
analisis, dan memungkinkan untuk melakukan elusi bergradien. Ada yang dipasang pada
panjang gelombang tetap yaitu pada panjang gelombang 254 nm, dan ada yang panjang
gelombangnya dapat dipilih sesuai dengan diinginkan antara 190-600 nm. Detektor
dengan panjang gelombang variabel ini ada yang dilengkapi alat untuk memilih panjang
gelombang secara otomatis dan dapat me-nol-kan sendiri (allto zero). Detektor jenis ini
juga ada yang menggunakan drode erray (sebagai pengganti photo tube), sehingga dapat
melakukan pembacaan absorban yang kontinyu pada berbagai panjang gelombang.

Detektor Indeks Bias
Detektor indeks bias memberi respons terhadap senyawa yang dianalisis apapun,
termasuk pelarutnya sendiri. Prinsip dasar kerja detektor ini adalah perubahan indeks
bias karena adanya komponen sampel dalam pelarut. Detektor ini bersifat tidak merusak
(non-destruktif), sensitivitasnya cukup tinggi (minimum 10
-6
g) dan umumnya digunakan
dalam pekerjaan preparatif. Dengan detektor ini tidak dapat dilakukan elusi bergradien.
Detektor ini digunakan dalam kromatografi eklusi dan dalam analisis karbohidrat.
Beberapa hal yang harus diperhatikan dalam menggunakan detektor indeks bias :
Bila digunakan lebih dari satu pelarut, maka campuran dahulu hingga homogen dan
bebaskan dari gas terlarutnya.
Setelah detektor dihidupkan, tunggu beberapa lama sebelum digunakan sampai detektor
stabil.
Bila digunakan lebih dari satu detektor yang dipasang berurutan, maka tempatkanlah
detektor indeks bias pada urutan terakhir.
Untuk saluran pembuangan, gunakanlah selang teflon berdiameter dalam (inner diameter)
yang besar tapi pendek.
Tempatkan detektor pada kondisi suhu yang dipelihara tetap.
Jaga agar sel indeks bias selalu bersih.
Sel pembanding harus diisi dengan pelarut yang telah dilewatkan melalui kolom,
Detektor Spektrometer Massa
Detektor Spektrometer Inframerah
b) Detektor Selektif
Detektor Fluoresensi
Didasarkan kepada prinsip bahwa molekul-molekul tertentu dapat menyerap energi
pada panjang gelombang yang lebih pendek membentuk suatu keadaan tereksitasi dan
kemudian secara hampi bersamaan turun kembali ke keadaan dasar (ground state) dengan
memancarkan energi pada panjang gelombang yang lebih panjang.

Detektor Konduktivitas Listrik
Detektor elektrokimia biasanya didasarkan pada daya hantar listrik (konduktometri) dan
polarografi. Detektor jenis konduktometri biasanya digunakan untuk mendeteksi solut-solut
yang dapat mengalami reaksi redoks baik senyawa organik maupun anorganik. Adapun
persyaratan detektor yaitu: cukup sensitif, stabilitas, dan keterulangan tinggi, tidak erusak
cuplikan, respon linier terhadap solut, reliabilitas tinggi dan mudah digunakan.
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut :
1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprousibel
2. Mempunyia sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar sangat
kecil
3. Stabil dalam pengoperasiannya
4. Mempunyia sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita
5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas
6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fasa gerak

f. Rekorder
Rekorder adalah alat untuk mencetak hasil percobaan pada lembar berupa kumpulan
puncak (kromatogram) kromatogram HPLC yang didapat berguna untuk analisis kualitatif
dan kuantitatif. Luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran dan jumlah
peak menyatakan jumlah komponen. Analisis kualitatif dapat dilakukan dengan cara
membandingkan waktu retensi (r
t
) analit atau sampel dengan waktu retensi standar.
Sedangkan analisis kuantitatif depat dilakukan dengan didasarkan pada luas peak atau tinggi
peak dengan metode standar kalibrasi.