MAKALAH ANALISIS PROTEOMIK

Kajian literatur

Methodology for Glutathione S-Transferase Purification and
Localization In Two-Dimensional Gel Electrophoresis Performed
on The Pollen Beetle, Meligethes aeneus (Coleoptera: Nitidulidae)

(Tomas Erban & Jitka Stara, 2014)



Dibuat untuk memenuhi salah satu tugas
Matakuliah Analisis Proteomik dan Genomik

Dosen Pengasuh :
Dr. Purkan, M.Si.

Disusun Oleh :
Sylvia Aulia Rahmah (081324253001)


UNIVERSITAS AIRLANGGA
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOLOGI
PROGRAM MAGISTER KIMIA
2014
A. PENDAHULUAN
Glutathione S-transferase (GSTs, EC 2.5.1.18) adalah protein
multifungsi yang memiliki sejumlah peran fungsional termasuk detoksifikasi
sel, termasuk senyawa xenobiotic dan endobiotik. GSTs pada serangga sangat
penting terutama dalam hal resistensinya terhadap insektisida Peningkatan
aktivitas GSTs berhubungan dengan resistensi atau ketahanan terhadap
insektisida di banyak spesies serangga. GSTs pertama kali terlibat dalam
resistensi terhadap organofosfat (Ops) pada lalat, Musca domestica (Wei et al.,
2001) dan 1,1,1-trichloro-2,2-bis-(p-chlorophenyl)ethane (DDT) pada lalat
buah, Drosophila melanogaster (Tang dan Tu, 1994). Baru-baru ini, dilaporkan
adanya peningkatan kadar GSTs dalam kaitannya dengan resistensi pyrethroid
(PYR) pada wereng, Nilaparvata lugens (Vontas et al, 2001.; Vontas et al.,
2002), ulat kubis, Plutella xylostella (Dukre et al., 2009), hama gudang,
Sitophilus zeamais (Fragoso et al., 2007), tungau pada jeruk, Panonychus ulmi
( Kumral et al., 2009), nyamuk demam berdarah Aedes aegypti ( Pimsamarn et
al., 2009) dan kutu keras, Rhipicephalus bursa ( Enayat i et al., 2010). Baru-
baru ini GSTs juga dikarakterisasi dari Panonychus citri yang terpapar
fenpropathrin, hasilnya menunjukkan bahwa enam transkrip gen GSTs
meningkat sebanding dengan waktu (Liao et al., 2013).
Di Eropa, kumbang serbuk sari Meligethes aeneus, (Coleoptera:
Nitidulidae) adalah hama penting pada tumbuhan penghasil minyak yaitu rapa
atau kanola., Brassica napus L. Selama lebih dari dua puluh tahun, kumbang
serbuk sari secara efektif dapat dikendalikan dengan insektisida pyrethroid.
Namun demikian, penggunaan insektisida pyrethroid secara terus menerus
dapat menyebabkan timbulnya resistensi. Laporan tentang resistensi kumbang
serbuk sari terhadap pyrethroid pertama kali terjadi di Perancis pada tahun
1999 ( Ballanger dan Detourne , 2011). Sejak itu resistensi juga telah diamati
di bagian lain Eropa ( Hansen, 2003; Derron et al, 2004.; Heimbach et al, 2006.
; Tiilikainen dan Hokkanen, 2008). Menurut penelitian Li et all detoksifikasi
pada serangga disebabkan oleh tiga sistem enzim, yaitu sitokrom P450s,
esterase, dan GSTs ( Li et al., 2013). Keterlibatan GSTs pada resistensi
pyrethroid M. aeneus belum banyak dilaporkan, oleh karena itu dilakukan
penelitian tentang GSTs pada tingkat proteomik. Dalam penelitian ini
dilakukan pemurnian dan karakterisasi dari GSTs dari M. aeneus., serta
identifikasi GSTs dengan elektroforesis dua dimensi (2D-E).

B. KAJIAN TEORI
Glutathione S-transferase
Glutathione S-transferase (GSTs), sebelumnya dikenal sebagai ligan,
merupakan enzim yang diketahui bagus untuk reaksi katalitik dalam konjugasi
glutathione (GSH) dalam kaitannya dengan tujuan detoksifikasi. GSTs terdapat
hingga 10% dalam sitosol protein pada beberapa organ mamalia. GSTs
mengkatalisis konjugasi GSH melalui sulfhydryl grup ke pusat-pusat
elektrofilik pada berbagai substrat untuk membuat senyawa lebih larut.
Urutan protein dan struktur yang penting
dalam klasifikasi untuk tiga superfamilies
(sitosol, mitokondria, dan MAPEG): pada
sitosol GSTs memiliki lebih dari 40% urutan
yang homolog, sedagkan yang lain hanya
kurang dari 25%. Pada sitosol, GSTs dibagi
menjadi 13 kelas berdasarkan struktur
mereka: alpha, beta, delta, epsilon, zeta,
theta, mu, nu, pi, sigma, tau, phi, dan omega. Mitokondria GSTs berada di
kelas kappa. Superfamili MAPEG dari microsomal GSTs terdiri dari subgrup I-
IV, dimana urutan asam amino kurang dari 20% identitas. Sitosol GSTs pada
manusia memiliki kelas alpha, zeta, theta, mu, pi, sigma dan omega, sementara
enam isozymes kelas I, II, dan IV dari superfamili MAPEG juga diketahui ada.

Kromatografi
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan
perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan
komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan. Molekul yang terlarut
dalam fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan fase diam. Molekul
yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih
lambat dibanding molekul yang berikatan lemah.

Dengan ini, berbagai macam
tipe molekul dapat dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom.
Setelah komponen terelusi dari kolom, komponen tersebut dapat
dianalisis dengan menggunakan detektor atau dapat dikumpulkan untuk
analisis lebih lanjut.

Beberapa alat-alat analitik dapat digabungkan dengan
metode pemisahan untuk analisis secara on-line (on-line analysis) seperti:
penggabungan kromatografi gas (gas chromatography) dan kromatografi cair
(liquid chromatography) dengan mass spectrometry (GC-MS dan LC-MS),
Fourier-transform infrared spectroscopy (GC-FTIR), dan diode-array UV-
VIS (HPLC-UV-VIS).
Pemurnian dengan teknik kromatografi afinitas disebut juga dengan
pemurnian satu tahap (one step purification). Prinsip kromatografi afinitas
adalah pengikatan spesifik ligan dengan reseptor. Jadi, dalam kromatografi
afinitas minimum harus ada dua senyawa yang berikatan spesifik. Dalam
proses pemurnian satu tahap menggunakan kromatografi afinitas diperlukan
interaksi spesifik antara protein rekombinan dengan suatu ligan. Keterbatasan
metode ini adalah protein rekombinan yang akan dimurnikan harus berinteraksi
secara spesifik dengan suatu ligan. Jadi, jika tidak diketahui ligan yang dapat
berinteraksi secara spesifik maka tidak dapat dilakukan pemurnian satu tahap.
Keterbatasan ini sekarang dapat diatasi dengan adanya teknologi fusi protein.
Idenya adalah membuat suatu protein fusi yang terdiri dari protein yang akan
dimurnikan dengan protein yang diketahui dapat berikatan spesifik dengan
ligan tertentu.

Elektroforesis Dua Dimensi (2D-E)
2D-E adalah suatu teknik analisis protein dengan melakukan pemisahan
protein menggunakan dua dimensi. Teknik ini sering digunakan untuk studi
proteomika (analisis molekular terhadap keseluruhan protein yang dihasilkan
dari ekspresi gen dalam sel), deteksi marker penyakit, penelitian kanker dan
obat, pemeriksaan kemurnian, dan juga purifikasi (pemurnian) protein skala
mikro.

Hal ini dikarenakan, elektroforesis 2-D mampu memisahkan hingga
ribuan protein secara bersamaan.
Dalam elektroforesis 2-D, dimensi pertama dalam pemisahan protein
dilakukan berdasarkan titik isoelektrik protein tersebut. Sedangkan, pada
dimensi kedua, protein akan dipisahkan berdasarkan berat molekulernya.
Pemisahan protein dengan teknik ini dilakukan dalam kondisi terdenaturasi.
Pada dimensi pertama, protein yang akan dianalisis dilarutkan dalam urea
untuk memutuskan ikatan hidrogen pada protein (agen pendenaturasi). Urea
umum digunakan karena senyawa ini tidak mengubah dalam muatan protein
sehingga pemisahan protein dapat dilakukan berdasarkan muatannya. Dengan
menggunakan medan listrik, protein dipisahkan melalui gel yang memiliki
gradien pH. Protein akan bergerak hingga berhenti pada titik (pH) dimana
muatan protein tersebut netral (titik isoelektriknya). Setelah melalui dimensi
pertama, protein dipisahkan kembali melalui dimensi kedua. Biasanya tahap ini
dilakukan dengan gel poliakrilamida dan sodium dodesil sulfat (SDS). SDS
akan membuat seluruh protein bermuatan negatif sehingga pemisahan bisa
dilakukan hanya berdasarkan bobot molekulernya.

Teknik elektroforesis 2-D
yang sering digunakan adalah: untuk dimensi pertama dapat menggunakan
elektroforesis pemfokusan isoelektrik (isoelectric focusing, IEF) dan
nonequilibrium pH gradient electrophoresis (NEPHGE). Sedangkan untuk
dimensi kedua, biasanya digunakan elektroforesis gel poliakrilamida SDS
(SDS-PAGE).
Untuk melihat hasil pemisahan protein menggunakan elektroforesis 2-
D, dapat dilakukan pewarnaan gel dengan coomasie atau pewarnaan perak.
Teknik visualisasi lain yang dapat digunakan adalah fluorografi dan
autoradiografi (penggunaan radioaktif). Di dalam satu gel, bisa terdapat ribuan
titik protein yang dapat dianalisis atau diambil (dipisahkan) menggunakan
perangkat lunak tertentu. Setelah dilakukan pemilihan dan pemisahan protein
(berupa titik pada gel), analisis lebih lanjut biasanya dilakukan dengan
melakukan digesti protein dan kemudian melalui tahap analisis menggunakan
spektofotometer massa (MALDI-TOF).

Meligethes aeneus
Meligethes aeneus adalah salah satu kumbang serbuk sari yang
populasinya sangat banyak di dunia. Merupakan hama yang juga memberikan
kontribusi untuk penyerbukan dari tanaman. Panjang kumbang dewasa sekitar
2-3 mm, sedangkan pada Larva sekitar 3 mm. Larva kumbang dapat
berkembang dalam bunga dan hal ini dapat merusak bunga tersebut.
Kalsifikasi :
Scientific classification

Kingdom: Animalia
Phylum: Arthropoda
Class: Insecta
Order: Coleoptera
Superfamily: Cucujoidea
Family: Nitidulidae
Genus: Meligethes
Species: M. aeneus
Binomial name
Meligethes aeneus
(Fabricius, 1775)


C. BAHAN DAN METODE
Serangga
Populasi M. aeneus yang berada di tanaman yang sudah masak
digunakan sebagai sampel dan dimbil dengan metode sweeping. Metode ini
dilakukan dengan prinsip menangkap serangga yang terbang atau beraktivitas
di udara menggunakan jaring dengan panjang dan lebar tertentu.

Ekstraksi Protein
Homogenisasi M. aeneus yang sudah dewasa dilakukan dalam
homogenizer kaca Potter-Elvehjem (Art. No. 6305; Kartell Labware division).
yang telah disterilkan. Dengan cepat 100 mg sampel dari seluruh tubuh
kumbang yang sudah homogen diekstraksi menggunakan buffer yang terdiri
dari 0,2 L phosphate buffered saline (PBS) yang telah disaring (pH 7,4), 0,1%
(m/v) serta campuran deterjen zwiterionik nondenaturing CHAPS (Cat No.
C9426; Sigma-Aldrich) dan 10 L inhibitor protease (Cat. No. 80-6501-23; GE
Healthcare Life Sciences). Sampel yang telah dihomogenkan 3 kali selama 2
menit, kemudian didiamkan selama 20 menit dalam es. Supernatan
dipindahkan ke tabung sentrifuge 15 mL (Orange Scientific; Brainel'Alleud;
Belgium) kemudian dibilas dengan PBS (menghasilkan pengenceran
homogenat 1:1), selanjutnya disentrifugasi pada 10.000 g selama 15 menit pada
suhu 4C dalam centrifuge MR23i (Jouan Industries; France). Setelah
sentrifugasi selesai, supernatan dipindahkan ke jarum suntik kaca Luer-lock
dan disaring dengan 0,45 m regenerated cellulosa filter (RC) (OmniPeak;
Teknokroma). Satu mililiter supernatan disimpan untuk analisis lebih lanjut
sebagai "sample protein sebelum pemurnian (i)".

Pemurnian GSTs
Pemurnian GSTs menggunakan kolom GSTrap 4B (Cat. No. 28-4017-
47; GE Healthcare Life Sciences) dengan sampling pelarut menggunakan
jarum suntik kaca Luer-lock. Kolom ini dikalibrasi dengan PBS (10 column
volume) kemudian 10 mL supernatan, dialirkan setetes demi setetes pada
kolom GSTrap 4B. Fraksi yang tidak terikat disimpan untuk analisis lebih
lanjut. Kolom dicuci dengan PBS (15 column volume) dan protein yang terikat
dielusi dengan 10 mL buffer pengelusi yang terdiri dari 50 mM Tris-HCl dan
10 mM L-glutathione yang tereduksi (Cat. No. G6529; Sigma-Aldrich) (pH
8,0).

Pengolahan sampel (Sample processing)
Tiga sampel yang diperoleh setelah ekstraksi dan pemurnian, yaitu (i)
supernatan dari ekstrak kasar (supernatan sebelum pemurnian); (ii) fraksi yang
tidak terikat (supernatan setelah pemurnian); dan (iii) protein yang terikat pada
matriks kolom GSTrap 4B (protein murni). Sampel yang didapat kemudian
dicampurkan, 1 mL supernatan sebelum pemurnian (i), 1 mL fraksi yang tidak
terikat (ii) dan 10 mL protein murni kemudian dihilangkan garamnya
menggunakan PD MidiTrap G-25 (Item No 28-9180-08; GE Healthcare Life
Sciences) dan konsentrasi protein ditentukan dengan menggunakan uji
Bradford (Cat. No B6916, Sigma-Aldrich). Produk tersebut kemudian
dimasukkan ke dalam tabung sentrifuge, dibekukan dan dikeringkan dalam
PowerDry LL3000 (Thermo). Sampel kemudian disimpan dalam freezer pada
(-28C) sampai digunakan untuk proses selanjutnya.

Elektroforesis dua-dimensi (2D-E)
Untuk pemisahan dua dimensi, digunakan 50 g dari total protein
sebelum pemurnian dan fraksi yang tidak terikat. Seluruh hasil protein murni
dibagi menjadi dua bagian untuk proses 2D-E. Iso electrofocusing (IEF)
dijalankan pada strip 13 cm Ettan IPG Phor 3 (GE Healthcare Bio-Science
AB). Pemisahan ini dilakukan di ceramic strip holder 13 cm menggunakan
Immobiline DryStrip dengan kisaran pH 3-10 (Cat. No. 17-6001-14, GE
Healthcare Life Sciences). DeStreak Larutan Rehidrasi (Cat. No. 18-1168-31,
GE Healthcare Life Sciences) mengandung buffer IPG 0,5%, pH 3-10 (Cat.
No. 17-6000-87, GE Healthcare Life Sciences). Proses pemisahan adalah
sebagai berikut: Langkah 1-30 V, 10 Vh; Langkah 2-500 V, 500 Vh; Langkah
3-Grad 1000 V, 800 Vh; Langkah 4-Grad 6000 V, 15.000 Vh; dan Langkah 5-
6000 V, 16.000 Vh. Isoelectrofocusing dilakukan selama 19 jam. Setelah IEF
selesai, strip didiamkan selama 15 menit dalam buffer yang mengandung
dithiothreitol (Item No 43817, Sigma-Aldrich), selanjutnya 15 menit dalam
buffer yang mengandung Iodoacetamide (IAA) (Item No 57670, Sigma-
Aldrich ). Strip ditempatkan pada gel SDS-PAGE yang telah dicampur dengan
1% agarose (Item No A7431, Sigma-Aldrich). Gel ini disusun sesuai dengan
petunjuk penggunaanya 37.5:1 akrilamida/bisacrylamide (Item No A3699,
Sigma-Aldrich). Nanopure water (0,2 m-fi disaring) (Barnstead, Thermo)
digunakan selama penelitian. Sepuluh mikroliter Full Range Rainbow
protein marker (Item No RPN800E, GE Healthcare, Life Sciences) digunakan
untuk memperkirakan berat molekul dari protein murni. Elektroforesis
dijalankan pada tegangan konstan 100V selama 30 menit dalam SE 600 Ruby
elektroforesis instrument (GE Healthcare Life Sciences). Setelah itu protein
dipisahkan pada tegangan konstan 350V dalam kondisi dingin.

Prosedur Pewarnaan Gel
Untuk Coomassie staining, gel tersebut dilarutkan dalam larutan
campuran (40% LC-MS grade metanol, 10% asam asetat dingin, nanopure
water 50%) dibiarkan selama satu malam dan diwarnai dengan 0,02%
PhastGel Blue R (Item No 17-0518-01, GE Healthcare Life Sciences). Hasil
pewarnaan ini nantinya dapat diarsipkan dengan scanner (CanoScan 8800F,
Canon).
Untuk fluorescence staining, gel tersebut dilarutkan dalam larutan
campuran (50% LC-MS grade metanol, 7% asam asetat dingin, nanopure water
43%) dibiarkan selama satu malam dan dengan Sypro ruby (Item No S21900;
Invitrogen). Gel dihilangkan warnanya (destained) selama 30 menit
menggunakan larutan destaining (10% LC-MS kelas metanol, 7% asam asetat
dingin, nanopure water 80%) dan difoto menggunakan sistem dokumentasi
ingenius (Syngene). Sebuah Transilluminator (Syngene) 300 nm digunakan
dalam dokumentasi ini.

NanoLC-ESI-QUAD-TOF-MS/MS protein identification
Untuk identifikasi menggunakan spektrometri massa (MS), spots secara
manual dipotong pada gel Coomassie yang bernoda biru dan ditempatkan
dalam 0,5 mL Eppendorf Protein LoBind Tube (Kat. No Z666491, Sigma-
Aldrich). Penguraian protein menjadi asam amino oleh tripsin dianalisis
dengan menggunakan NanoLC-ESI-QUAD-TOF-MS/MS. Spektrum
dicocokan dengan database NCBI (NCBInr) menggunakan MASCOT (Matrix-
SCIENCE) (11112683 urutan; 3786819628 residu).

D. Hasil
Perbandingan 2D-E sebelum dan sesudah pemurnian
Gambar. 1 menunjukkan tahapan yang digunakan untuk memurnikan,
identifikasi dan lokalisasi protein murni di 2D-E. Protein murni yang telah
dipisahkan menggunakan kolom GSTrap 4B yang ditunjukkan pada Gambar.
2, serta supernatan sebelum pemurnian yang ditunjukkan Gambar. 3A dan
fraksi yang tidak terikat yang ditunjukkan pada Gambar. 3B telah berhasil
dipisahkan menggunakan 2D-E. Setelah dibandingkan dengan noda Sypro ruby
2D-E yang dihasilkan dari supernatan sebelum pemurnian (Gambar. 3A) dan
fraksi tidak terikat (Gambar. 3B), maka dapat diidentifikasi spot 5 intensitasnya
meningkat setelah proses pemurnian protein. Posisi yang teridentifikasi di 2D-
E dari supernatan sebelum pemurnian (Gambar. 3A) berhubungan dengan pola
spot di 2D-E dari protein murni ( Gambar. 2).

Gambar 1. Skema pemurnian, identifikasi dan lokalisasi GSTs pada 2D-E.


Gambar 2. Hasil pemurnian protein dengan kromatograsi afinitas (kolom
GSTrap 4B. Spot 2a dan 4a diidentifikasi sebagai GSTs dengan klas sub
family Delta dan Epsilon, namun spot 1a; 3a dan 5 tidak teridentifikasi
dalam database NCBInr.


Gambar 3. Hasil 2D-E dari supernatant sebelum pemurnian (A) dan fraksi
yang tidak terikat (B). Peningkatan intensitas spot mengindikasi protein
murni dari hasil pemurnian dengan kromatografi afinitas (kolom GSTrap
4B). Spot 2a dan 4b diidentifikasi sebagai GSTs dengan klas sub family
Delta dan Epsilon, namun spot 5 tidak terdeteksi dalam data base NCBInr.

Analisis NanoLC-ESI-QUAD-TOF-MS/MS protein purification
Seperti ditunjukkan pada Gambar. 2, lima spot protein yang
menunjukkan kelimpahan tertinggi ternyata sesuai dengan fraksi 2D-E protein
murni. Namun analisis NanoLC-ESI-QUAD-TOF-MS/MS mengidentifikasi
hanya dua dari lima spot tersebut (Spots 2a dan 4a di Gambar. 2, Tabel 1).
Pencarian Database NCBInr menggunakan MASCOT mengungkapkan bahwa
dua spot protein ini paling homolog dengan GSTs dari serangga Cydia
pomonella glutathi-satu S-transferase 1 (gi|196052743) (Spot 2a) dan hipotetis
protein Tribolium castaneum TcasGA2_TC007571 (gi|270005507) (Spot 4a)
baik dengan daerah untuk kelas Delta dan Epsilon subfamilies ( Marchler-
Bauer et al, 2013). Sesuai dengan data dari protein murni, hasil analisis protein
dari supernatan sebelum dimurnikan dengan MS juga teridentifikasi masuk ke
dalam kelas GST Delta dan Epsilon subfamilies (Marchler-Bauer et al., 201 3)
(Spots 2b dan 4b di Gambar. 3, Tabel 1). Meskipun identitas dua spot protein
tersebut sesuai, pencarian NCBInr menunjukkan ketidakcocokan tiga spot yang
dianalisis dari kedua fraksi protein murni dan supernatan sebelum pemurnian.

E. Diskusi
Tujuan penelitian ini adalah untuk memurnikan dan melokalisasi GSTs
dari M. aeneus dan untuk menunjukkan metodologi untuk identifikasi GSTs
pada elektroforesis dua dimensi. Pertama, pemurnian GSTs dari M. aeneus
melalui kromatografi afinitas glutathione (GSTrap 4B) kemudian
membandingkan 2D-E dari supernatan sebelum pemurnian dengan fraksi yang
tidak terikat. Strategi ini untuk lokalisasi yang spesifik untuk spot protein
murni dalam 2D-E, juga dapat digunakan untuk kuantifikasi ekspresi GSTs
dalam penelitian di masa yang akan datang dan untuk analisis serupa namun
pada organisme lain.
Ada beberapa metode yang digunakan untuk menganalisis aktivitas
GSTs melalui analisis substrat. Yang paling umum adalah uji kolorimetri yang
memanfaatkan substrat sintetik 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) dan 1,2-
dichloro-4-nitrobenzene (DCNB). Selain substrat kolorimetri, serangkaian
fluorescence telah dikembangkan dengan peningkatan sensitivitas ( Huang et
al., 2012). Baru-baru ini, sebuah substrat fluorescent seperti pyrethroid telah
dikembangkan untuk mendeteksi dengan cepat dan sangat sensitive terhadap
aktivitas GSTs yang tinggi, yang berhubungan dengan resistensinya terhadap
pyrethroid ( Huang et al., 2012). Selain metode analisis substrat ini, metode
lain yang digunakan untuk mendeteksi dan mengukur GSTs adalah
menggunakan analisis MS ( Burns et al, 2004.; Zhang et al., 2004). Level yang
tinggi dari GSTs serta protein lain dapat diukur dengan menggunakan
gabungan 2D-E dengan MS untuk menyediakan metode yang lebih kuat untuk
analisis kuantitatif dan kualitatif dari enzim ( Alias dan Clark, 2010). Untuk
mengkarakterisasi GSTs lebih lanjut, digunakan isolasi protein berdasarkan
afinitasnya menggunakan kolom GSTrap 4B untuk memurnikan dan
mengkarakterisasi GSTs dari M. aeneus dewasa.



F. KESIMPULAN
Kesimpulan yang dapat diberikan dari studi litelatur ini adalah :
1. Metode elektroforesis gel dua dimensi dapat digunakan untuk memurnikan
dan melokalisasi glutathione S-transferase dari Meligethes aeneus.
2. GSTs dari Meligethes aeneus dapat diidentifikasi dengan 2D-E, ditandai
dengan terdapatnya 2 spot pada yang teridentifikasi dalam sub familis Delta
dan Epsilon.

G. DAFTAR PUSTAKA

Anonim. Elektroforesis Dua Dimensi, (Online), (http://id.wikipedia.org/wiki
/Elektroforesis_dua_dimensi), diakses 20 April 2014.

Anonim. Glutathione S-transferase, (Online), (http://en.wikipedia.org/wiki/
Glutathione_S-transferase), diakses 20 April 2014.

Anonim. Kromatografi, (Online), (http://id.wikipedia.org/wiki/Kromatografi),
diakses 20 April 2014.

Anonim. Meligethes aeneus, (Online), (http://en.wikipedia.org/wiki/
Meligethes_aeneus), diakses 20 April 2014.

Anonim. 2007. Instructions 28-9225-30 AB: PD MidiTrap G-25
(www.gelifesciences.com/trap, diakses 20 April 2014.

Anonim. 2009. Data fi le 28-9488-45 AA: Improved Immobiline DryStrip gels
and IPG Buffer, (www.gelifesciences.com/2DE), diakses 20 April 2014.

Erban, Tomas. dan Stara, Jitka. 2014. Methodology for Glutathione S-Transferase
Purification and Localization In Two-Dimensional Gel Electrophoresis
Performed on The Pollen Beetle, Meligethes aeneus (Coleoptera:
Nitidulidae). Journal of Asia-Pasific Entomology, (Online), 17: 369-373,
(http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1226861514000351),di
akses 10 April 2014.

Liao, C.Y., Zhang, K., Niu, J.Z., Ding, T.B., Zhong, Rui., Xia, W.K., Dou, Wei
dan Wang, J.J. 2013. Identification and Characterization of Seven
Glutathione S-Transferase Genes from Citrus Red Mite, Panonychus citri
(McGregor). International Journal of Molecular Sciences, (Online), 14:
24255-24270, (http://www.mdpi.com/1422-0067/14/12/24255), diakses 16
April 2014.


H. LAMPIRAN
Alat Nama Keterangan

homogenizer kaca
Potter-Elvehjem
Digunakan untuk
menghomogenasi
serangga.

Centrifuge MR23i
Sentrifuge multifungsi
yang didukung dengan
RCF yang tinggi
hingga 30.000 g
dengan 48 rotor.

Jarum suntik kaca
Luer-lock
Untuk mengambil
supernatant saat
ekstraksi protein.

Regenerated Cellulose
0,45 m
Untuk menyaring
protein.

Kolom GSTrap 4B
Untuk pemurnian
protein

PD MidiTrap G-25
Untuk menghilangkan
garam pada protein

PowerDry LL3000
Merupakan model
standart dalam hal dry
freeze yang mudah

Ettan IPGphor 3
Merupakan rangkaian
tahapan pertama dalam
2D-E

Immobiline DryStrip
Digunakan untuk
isoelectricfocusing
(IEF), dijalankan pada
proses 2D-E

Sistem Dokumentasi
Ingenius (Syngene).
Untuk
mendokumentasikan
hasil analisis dengan
pewarnaan gel dan
2D-E

Transilluminator
(Syngene)
Salah satu bagian
dalam system
dokumentasi Ingenius

NanoLC-ESI-QUAD-
TOF-MS/MS
Untuk memurnikan
protein dengan lebih
akurat.