1

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3











































Ministerio de Salud
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
J r. Cpac Yupanqui 1400,
J ess Mara Telf. 471-3254,
Fax: 471-7443
Lima, Per, 1995

4

MANUAL DE NORMAS Y PROCEDIMIENTOS EN BACTERIOLOGIA DE
TUBERCULOSIS


.


COMITE RESPONSABLE:
Blgo. Luis Asencios Sols
Blgo. Neyda Quispe Torres
Dr. Hemn Sanabria Rojas.
Dr. Augusto Yi Chu.

REVISION:
Dra. Isabel N. de Kantor
Asesora OPSIOMS

COMITE EDITOR:
Dr. Alfonso Zavaleta Martnez- Vargas
Dr. J aime Chang Neira
Lic. Liliana Vigil Romero












CENTRO NACIONAL DE LABORATORIOS
DE SALUD PUBLICA
Dr. Csar Cabezas Snchez.
Director General

INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
Dr. Carlos Carrillo Parodi
J efe

COLABORACION:
PROGRAMA NACIONAL DE ENFERMEDADES
TRANSMISIBLES: CONTROL DE TUBERCULOSIS
Dr. Pedro Guillermo Surez Aguilar
Director

5

INDICE

PRESENTACIN ........................................................................................................7
INTRODUCCIN .......................................................................................................8
RESOLUCIN JEFATURA.......................................................................................9

CAPITULO I
LAS MUESTRAS

1.0 ASPECTOS GENERALES ................................................................................10

1.1 LA MUESTRA DE ESPUTO: Mtodos de obtencin ........................................10
1.1.1 Expectoracin natural .....................................................................................10
1.1.2 Expectoracin inducida .................................................................................12

1.2 MUESTRAS EXTRAPULMONARES ..............................................................13

1.3 CONSERVACIN Y TRANSPORTE DE LA MUESTRA.............................14

CAPITULO II
LA BACILOSCOPIA (Examen microscpio)

2.1 Ambiente y material de trabajo de laboratorio.......................................................16
2.2 Preparacin de estendido........................................................................................17
2.3 Coloracin ( Tcnica de Ziehl Neelsen).................................................................19
2.4 Observacin microscpica de la muestra coloreada...............................................23
2.5 Mtodo de lectura...................................................................................................23
2.6 Informe de resultados.............................................................................................25
2.7 Eliminacin de los materiales contaminados..........................................................25
2.8 Reutilizacin de las lminas usadas.......................................................................25
2.9 Registro diario de baciloscopas.............................................................................26
2.10 Informe baciloscpico mensual y trimestral...........................................................26
2.11 Conservacin y limpieza del microscpio..............................................................26


CAPITULO III
EL CULTIVO

3.1 Aspectos generales e indicaciones del Mtodo
del cultivo para Mycobacterium tuberculosis...........................................................29
3.2 La muestra para el cultivo.......................................................................................29
3.3 Conservacin de la muestra......................................................................................31
3.4 Descontaminacin de la muestra..............................................................................31
3.5 Descontaminacin sin centrigugacin y empleo
del Medio de Ogawa Acidificado............................................................................31
3.6 Lectura......................................................................................................................32
3.7 Informe de resultados del cultivo.............................................................................32

6
3.8 Envo de cultivos al Laboratorio de Referencia
de tuberculosis (Anexo 7).........................................................................................32
3.9 Requerimientos para la preparacin del medio
a base de huevo.........................................................................................................33

3.10 Preparacin del Medio Ogawa...............................................................................34


CAPITULO IV
REFERENCIAS BIBLIOGAFICAS ..........................................................................36

ANEXOS .......................................................................................................................37

Anexo 1:
Solicitud para la investigacin bacteriolgica en TBC............................................38

Anexo 2:
Registro de muestras para investigacin
bacteriolgica en TBC..............................................................................................40

Anexo 3:
Preparacin de reactivos para baciloscopa..............................................................42

Anexo 4:
Cantidad de reactivos y clculos de mdulo individual
para baciloscopa......................................................................................................43
Anexo 5:
Parmetros para programacin del mdulo individual ............................................44

Anexo 6:
Preparacin del material para Cultivo de Microbacterias........................................46

Anexo 7:
Informe mensual de baciloscopa y cultivo..............................................................48

Anexo 8:
Directiva N 001-95: Prueba de sensibilidad de Micobacterium tuberculosis
a los medicamentos antituberculosos.......................................................................49

PUBLICACIONES DEL INSTITUTO
NACIONAL DE SALUD.............................................................................................51








7
PRESENTACION




En la actualidad la epidemia de Tuberculosis, que produce en el mundo la muerte
de tres millones de personas por ao exige revisar el arsenal disponible en la lucha
contra la Tuberculosis (vacunacin, mtodos de diagnstico y drogas antituberculosas)
que ya se consideran desactualizadas, lo que produce estancamiento en los esfuerzos
para detener la enfermedad. La reemergencia de la TBC, podra deberse a los siguientes
factores: i) incremento de la poblacin susceptible por la aparicin de la infeccin por
VIHISIDA); ii) emergencia de TBC multiresistente; iii) depresin de la estructura
socioeconmica en muchas reas urbanas (y/o rurales) que conllevan a la desocupacin,
desnutricin, drogadiccin, vagancia y otros problemas; iv) la disminucin del apoyo a
las medidas de control y erradicacin por la creencia que la TBC ha sido controlada o
erradicada, situacin que ocurre en muchas partes del mundo. Debemos aceptar
tambin que se conoce poco acerca de la biologa bsica del Mycobacterium
tuberculosis, de los mecanismos de resistencia a drogas y hasta de cmo acta la
isoniazida. Todos sabemos que los mtodos de diagnstico de laboratorio existentes son
demasiado lentos, la confirmacin por cultivo puede tomar tres a seis semanas y la
determinacin de resistencia antibitica varios meses. Es necesario pues, insistir en
discutir los beneficios y problemas del uso del esputo, desarrollar nuevos mtodos de
diagnstico rpido, crear una nueva vacuna contra la TBC y nuevas drogas que sean
efectivas y de accin completa. Este manual sistematiza procedimientos bsicos en el
tratamiento de las muestras de esputo para el diagnstico de la TBC, teniendo como
objetivo el consolidar los procedimientos a nivel nacional, con la perspectiva de su
perfeccionamiento y as alcanzar la excelencia en su calidad y ejecucin. De acuerdo al
desarrollo de los laboratorios de referencia a nivel central (INS), podremos en el futuro
mostrar la aplicacin de tcnicas rpidas y prometedoras como lo es la reaccin en
cadena de la polimerasa (PCR).












Dr. Carlos Carrillo Parodi
Jefe
Instituto Nacional de Salud



8
INTRODUCCION




El Laboratorio de Bacteriologa es importante no solo por el rol que desempea en
el diagnstico de las enfermedades transmisibles como la Tuberculosis, sino tambin en
el control de la evolucin del tratamiento de los pacientes, as como la evaluacin
epidemiolgica y operacional.

El Laboratorio tiene como funcin principal, la deteccin de fuentes de infeccin
tuberculosa a travs de la baciloscopa, una tcnica bsica, sencilla, eficaz y de bajo
costo, que debe ser empleada preferentemente en los sintomticos respiratorios.

El cultivo est orientado al aislamiento e identificacin del grmen causal de la
enfermedad, con miras a estudios de tipificacin y evaluacin de la
sensibilidad antibitica de inobjetable utilidad en salud pblica, al permitir "-
efectuar el seguimiento de la sensibilidad bacteriana a los diferentes agentes
antibiticos, y detectar la emergencia de cepas resistentes.

La eleccin de la tcnica bsica ms conveniente (baciloscopa y/o cultivo), y su
estandarizacin permitir la obtencin de resultados comparables a lo largo de todo el
pas, adems de facilitar la capacitacin as como la ampliacin de la cobertura.

El propsito de este Manual es proporcionar al personal de Laboratorio,
informacin sobre los procedimientos tcnicos aplicables para el diagnstico
bacteriolgico de la Tuberculosis. La aplicacin de estas tcnicas en buenas
condiciones debe garantizar la validez de los resultados obtenidos por los diferentes
laboratorios integrantes de la Red Nacional de Laboratorios de Salud.



















9
















































10
CAPITULO I

LAS MUESTRAS

1.0. ASPECTOS GENERALES

La tuberculosis es una enfermedad infecciosa causada por un bacilo
denominado Mycobacterium tuberculosis, que se transmite a travs de las
gotitas de saliva que los enfermos eliminan al exterior al hablar, toser o escupir.
Esta enfermedad ataca preferentemente a los pulmones, pero puede afectar
tambin a otros rganos del cuerpo humano.

Generalmente se manifiesta por signos y sntomas generales que van
aumentando progresivamente, los que incluyen prdida de peso y de apetito, tos
persistente y fiebre nocturna, entre otras. El diagnstico se realiza por medio de
la observacin del bacilo teido, en el examen directo (baciloscopa) o mediante
cultivos de la muestra.

1.1. LA MUESTRA DE ESPUTO: METODOS DE OBTENCION

1.1.1. EXPECTORACION NATURAL

1.1.1.a. Calidad:

Una buena muestra es aquella que proviene del rbol bronquial, y es
obtenida despus de un esfuerzo de tos. Sin embargo, una muestra con
apariencia de saliva puede ser positiva.

1. 1. 1.b. Calidad:

Para ser considerada suficiente, la muestra debe tener un volumen
aproximado de 5 a 10 ml.

Si el enfermo tiene escasa secrecin, la muestra no debe ser inferior al
esputo obtenido de tres expectoraciones sucesivas, salvo justificadas
excepciones.

1.1.1.c. Nmero de muestras y momento de recoleccin:
I

Se recomienda analizar dos o tres muestras de cada sintomtico
respiratorio. La primera muestra debe obtenerse en el momento de la
consulta y la segunda al da siguiente, al despertar por la maana. Sin
embargo, puede ser necesario una tercera muestra obtenida al momento
de entregar al laboratorio la segunda muestra.

Para el control del tratamiento examinar una muestra mensualmente
11
mientras dure la terapia antituberculosa.

1. 1.1.d. El Envase:

El envase para ser adecuado, debe tener las siguientes caractersticas:

Boca ancha (aproximadamente 5 cm. de dimetro) y 5 cm. de altura. As,
el paciente puede expectorar con facilidad dentro del envase y el
laboratorista al momento de efectuar el examen directo puede extraer la
partcula til fcilmente.

Tapa de rosca: Para disminuir el riesgo de que la muestra se derrame
durante el transporte y tambin para evitar la produccin de aerosoles al
abrirla en el laboratorio. No debe rotularse la tapa.

Cuerpo del envase con pared lisa para favorecer su rotulacin y la
correcta identificacin del envase.

Material desechable, pues favorece su incineracin y evita la
reutilizacin. De no contar con envase desechable con las caractersticas
referidas anteriormente, puede utilizar frascos de vidrio de boca ancha
con tapa rosca; pero antes de desecharlos someterlos a esterilizacin en
autoclave o incinerarlos. Debe evitarse la reutilizacin de los frascos.

1.1.1.e. Obtencin de la muestra:

1.1.1.e.1.En el momento de la consulta:

a) Tomar un envase limpio para esputo y anotar el nmero de orden en
el cuerpo del envase.

b) Entregar el envase rotulado al paciente, pero conservar la tapa.

c) Llevar al paciente al Ambiente de Recoleccin Inmediata de Esputo
(ARIES). Este lugar debe tener buena ventilacin y debe prohibirse
la presencia de otras personas con el paciente en el momento de la
toma de la muestra.

d) Explicar al paciente el motivo por el cual tiene que depositar el
esputo y a continuacin demostrarle cmo hacerlo. Debe explicarse
en forma senci\la e instruir al paciente para que produzca esputo
respirando profundamente, reteniendo aire y lanzndolo
violentamente. Repetir el procedimiento hasta obtener la cantidad
adecuada. Evitar siempre que se derrame el esputo.




12
1.1.1.e.2.Muestra matinal:

Las etapas son en esencia las mismas que las descritas para la
obtencin de las muestras en el momento de la consulta. Debe darse
al paciente otro recipiente numerado, el que llevar a su domicilio,
con instrucciones para que escupa en su interior al levantarse por la
maana y siempre antes del desayuno. El paciente debe colocar el
envase con la tapa bien cerrada en una bolsa plstica y llevarlo al
laboratorio inmediatamente.

1.1.2. EXPECTORACION INDUCIDA

Cuando el paciente no logra expectorar y es necesario el examen del esputo,
puede inducirse la obtencin de muestra de la siguiente forma:

1.1.2.1 Obtencin Postural:
Acostar al paciente boca abajo sobre una camilla o cama, haciendo que
su cabeza rebase el borde; colocar una almohada doblada debajo del
trax para lograr un plano inclinado que facilite el descenso de la
secrecin. El paciente coloca la base del trax sobre la almohada, deja
caer ambos brazos y la cabeza hacia el piso, de modo que la base del
trax quede ms alta que la boca. Estando en la posicin apropiada, se
dice al paciente que inspire, retenga el aire y expire violentamente hasta
conseguir la expectoracin; el envase deber estar sobre un recipiente o
papel peridico en el piso. El ambiente donde se obtiene la muestra debe
tener buena ventilacin y debe prohibirse la presencia de otras personas
con el paciente en el momento de la toma de la muestra.

1.1.2.2 Nebu/izaciones .

Se nebuliza en la garganta con agua destilada. Se recoge la primera
expectoracin producida despus de la nebulizacin y se entrega otro
envase al paciente para que recoja los esputos de las 24 horas siguientes.

1.1.2.3 Lavado Bronquial
Es un procedimiento invasivo y est reservado al mdico especialista
neumlogo; adems de obtener muestras para baciloscopa es preciso
cultivarlas.
Tambin debe instruirse al paciente para que recoja la expectoracin de
las 24 horas siguientes al procedimiento.

1.1.2.4 Hisopado Larngeo:
La toma de muestra debe estar reservada al especialista. Su proceso es
obligatoriamente por cultivo, debido al escaso nmero de bacilos. Debe
tomarse dos hisopados diarios en tres das consecutivos.
La muestra debe procesarse de inmediato y en caso contrario, conservar
en refrigeracin no ms de 24 horas. El procedimiento puede estimular la
expectoracin, por lo que es necesario tener siempre a mano, un envase
13
recolector. El personal que recoge la muestra debe adoptar las medidas
de bioseguridad y las precauciones correspondientes.

1.2. MUESTRAS EXTRAPULMONARES

Deben procesarse por cultivo, pues la escasa cantidad de bacilos as como la
presencia de mycobacterias saprofitas, hacen que la baciloscopa no sea
concluyente.

1.2.1 Orina
La muestra ms recomendada es la muestra de orina obtenida en la
primera miccin de la maana, previa higiene externa con agua y jabn.
Es preferible recolectar entre 300-500 mI. en un envase limpio y estril
de boca ancha, que facilite la recoleccin directa. La muestra debe ser
procesada inmediatamente siempre por cultivo. Se sugiere cultivar por lo
menos tres muestras seriadas.
Debe recordarse que la prueba de baciloscopa efectuada al sedimento
urinario no necesariamente es diagnstico concluyente de
tuberculosis, por cuanto existen mycobacterias saprofitas en orina,
que pueden producir resultados falsos positivos en el examen de
baciloscopa.

1.2.2 Jugo gstrico
La recoleccin se hace por la maana con el paciente en ayunas,
utilizando una sonda nasogstrica por la que se aspira el jugo gstrico.
Utilizar una jeringa de 20 a 50 mI. Vaciar la muestra en un envase
limpio de 50 a 100 mI. de capacidad. Cultivar de inmediato o
conservar en refrigeracin no ms de 6 horas. Mnimo debe tomarse 3
muestras. Su utilizacin es ms frecuente en nios.

1.2.3 Lquidos de serosas (pleura-peritoneo)
La muestra debe ser obtenida por el personal mdico. El cultivo debe
hacerse lo ms rpido posible, as como el estudio baciloscpico.
Debe procesarse todo el lquido extrado por aspirado en jeringas de
50 a 100 mI.

1.2.4 Lquido cefaloraqudeo
La obtencin de la muestra est reservada al personal mdico.
Obtenida la muestra en un volumen de aproximadamente 5 mI., sta
se dividir en dos partes iguales, una de las cuales se centrifugar y
cultivar inmediatamente, no precisando descontaminacin previa. La
segunda se conservar en refrigeracin a 4C. Si la primera parte de la
muestra est contaminada, la otra parte se siembra luego de su
descontaminacin. Si el volumen de la muestra es pequeo, se
siembra toda la muestra. En todos los casos se har baciloscopa del
sedimento luego de centrifugar la muestra.


14
1.2.5 Biopsias y material resecado
Se utiliza un envase estril. La muestra se divide en dos partes: una
parte se enva de inmediato al laboratorio para el cultivo y la otra se
conserva o enva para el estudio histopatolgico en un frasco con
formol al 10%.

1.3. CONSERVACION Y TRANSPORTE DE LA MUESTRA:

1.3.1. Conservacin de la muestra:

La probabilidad de encontrar M. tuberculosis, est en relacin directa
con la rapidez con que la muestra llega al laboratorio. La temperatura
ambiente y el tiempo favorecen la multiplicacin de los grmenes
habituales de la boca, dificultando la eleccin de la partcula til de la
muestra por desnaturalizacin de las protenas con probable destruccin
de los bacilos.
Una vez obtenida la muestra, sta debe procesarse cuanto antes. La
muestra de esputo para baciloscopa mantiene positividad por un tiempo
prolongado; mientras para el cultivo el material debe procesarse de
inmediato, porque habr mayor probabilidad de aislar los bacilos que
pueden existir en la muestra. Si no es posible procesar la muestra el
mismo da de su recepcin, sta debe guardarse en refrigeracin a 4C.
En aquellos casos en que se requiere el cultivo, pero el envo se hace a
temperatura ambiente, el lapso entre la toma de la muestra del esputo y
su procesamiento no debe ser mayor de una semana.
Si el laboratorio no puede procesar ni conservar la muestra para
baciloscopa, se recomienda adicionarle de 5 a 10 gotas de fenol al 5%
antes de realizar el extendido, a fin de evitar riesgos de infeccin al
transportar y manipular lminas extendidas y fijadas. Luego envolver
con papel cada lmina por separado, y enviar al laboratorio ms cercano
adjuntando la nmina correspondiente. No olvidar rotular las lminas
apropiadamente.

1.3.2. Transporte de las muestras:

En el transporte de las muestras debe tenerse en cuenta los
siguientes aspectos:
- Protegerla del calor excesivo.
- Protegerla de la luz solar.
- Acondicionar los envases sellando las tapas con
esparadrapo para evitar que se produzcan derrames.

Para el transporte es conveniente disponer de cajas de madera
u otro material resistente con divisiones interiores.
Indicar con una flecha la posicin que deben mantener los envases y
poner una etiqueta con-la direccin exacta del laboratorio.


15
1.3.3. Recepcin de la muestra:

Comprobar que las muestras estn bien rotuladas y correspondan a las
solicitudes de examen. Si existe un pequeo derrame del contenido,
proceder a limpiar el envase con fenol al 5%. Si el derrame es masivo
debe desecharse la muestra por incineracin o previa esterilizacin en
autoclave.
Notificar al establecimiento de Salud que enva las muestras si hubo
deficiencia en su identificacin, calidad, volumen o en la forma del
envo.





























16
CAPITULO II
LA BACILOSCOPIA
(EXAMEN MICROSCOPICO)

La baciloscopa es un examen bsico para el diagnstico de la tuberculosis, til
para el control de la evolucin del tratamiento administrado al paciente, por lo que su
conocimiento debe alcanzar a los servicios de salud del pas de todos los ni veles. En
el Anexo l se muestra la ficha utilizada para efectuar las solicitudes de investigacin
bacteriolgica de Micobacterias en tuberculosis.

2.1. AMBIENTE Y MATERIAL DE TRABAJO DE LABORATORIO

En los servicios de salud de mayor envergadura debe contarse en lo posible con
un ambiente de tamao suficiente para el laboratorio. Siempre deben aplicarse
las normas de bioseguridad para el manejo de muestras potencialmente
infectantes.

2.1.1. Distribucin adecuada del Laboratorio:
Debe considerarse que el laboratorio debe tener una distribucin
adecuada para lo siguiente:

- Recepcin de muestras.
- Preparacin y fijacin de los extendidos.
- Coloracin de los extendidos.
- Para microscopa y registro de resultados.

Esta distribucin debe evitar los movimientos cruzados y permitir que
el ambiente est despejado en la mitad del espacio. Otras necesidades
importantes que deben satisfacerse son luz apropiada (natural o
artificial), un grifo de agua corriente con salida de drenaje, buena
ventilacin y un lugar de almacenamiento para el equipo y materiales.

2.1.2. Condiciones mnimas del Laboratorio:
El ambiente para laboratorio deber tener las siguientes condiciones
mnimas:
Una mesa de por lo menos 1,00 m. x 0,60 m. de material lavable,
fcilmente desinfectable con soluciones germicidas, como fenol al 5%.
Un lavadero pequeo con su 1lave de agua y desage; sobre los bordes
del lavadero se colocarn 2 varillas de vidrio unidas por sus extremos,
por un tubo de goma. Este lavadero debe estar cerca a la mesa y ser
dedicado a la coloracin de extendidos.
- Microscopio binocular, con objetivo de inmersin.
- Caja para lminas portaobjetos.
- Recipiente con los aplicadores o palitos de madera. Mechero.
- Lpiz para marcar vidrio (graso).
- Papel lente.
- Soporte de varillas de vidrio.
17
- Bandeja de acero inoxidable o fierro enlozado para recepcin de
muestras.
- Tres frascos tipo cuentagotas para los colorantes y decolorantes; de
preferencia 2 juegos.
- Papel carbn (opcional).
- Papel de filtro.
- Un recipiente de latn con tapa para incineracin del material
contaminado.
- Aceite de inmersin.
- Tolueno o bencina.
- Reactivos: fucsina bsica, azul de metileno, fenol en cristales, cido
clorhdrico, alcohol de 95 comercial yagua destilada. Libro de
Registro.

2.2. PREPARACION DEL EXTENDIDO

Antes de empezar el trabajo, el personal encargado debe lavarse las manos y
ponerse un guardapolvo de proteccin lo ms largo posible. Luego cerciorarse que
no le falte ningn reactivo ni material. Todas las fases de preparacin del
extendido deben ser completamente sistematizadas, as como la conservacin del
orden de las muestras.
Procesar las muestras por series, cada serie no debe ser mayor de doce (12)
muestras.
Al hacer el extendido cuidar que las lminas sean nuevas y hayan sido
desengrasadas con alcohol; en lo posible no reutilizar las lminas positivas.

Las etapas de la preparacin del extendido son las siguientes:

2.2.1. Organizacin del rea de Trabajo:

- Colocar sobre la mesa de trabajo una hoja doble de papel peridico o
una bandeja de fierro enlozado o acero inoxidable (dimensiones
recomendadas: 60 x 40 x 10 cm) con papel peridico, humedecido con
fenol al 5%.

- Colocar los envases conteniendo las muestras de esputo previamente
rotulados sobre la mesa de trabajo. De la misma forma colocar las
lminas portaobjetos sobre el soporte de madera, en orden correlativo.










18
2.2.2. Identificacin de muestras y lminas.
- Numerar los envases. Numerar las lminas portaobjetos empleando un
lpiz graso, en forma correlativa. Deber trazarse una lnea en cada
lmina portaobjeto empleando el lpiz graso, la que dividir la
superficie en una tercera parte destinada a la numeracin y dos terceras
partes para hacer el extendido. Esta lnea debe trazarse en la cara
inferior de la lmina a fin de evitar que se borre la numeracin al
momento de efectuar la coloracin.









2.2.3. Realizacin del extendido.
- Destapar cuidadosamente el envase de la muestra que se va a procesar,
manteniendo la boca del envase cerca del mechero encendido.













- Dividir un aplicador de madera (baja lengua) en dos o tres partes y
tomarlo entre el pulgar y el ndice de la mano, para luego seleccionar y
extraer la partcula til, que es la porcin muco-purulenta de color
amarillo verdoso del esputo, enrollndola en el aplicador.











19
- Colocar la partcula til sobre el portaobjeto y extenderla, haciendo
movimientos de vaivn, hasta lograr que el extendido sea homogneo (ni
muy fino ni muy grueso), que no llegue a los bordes de la lmina, para
evitar que el operador se contamine al manipularla. Por ningn motivo
debe calentarse la lmina mientras se haga el extendido, debido a que
por el calor se forman crculos concntricos y precipitados granulosos.
- Pasar por la llama del mechero los bordes de la lmina extendida,
colocar sobre el soporte de madera y dejar secar a temperatura ambiente.
- Terminado el extendido, descartar los aplicadores en el receptculo de
incineracin, cerrar el envase y proseguir en igual forma para las dems
muestras.













2.2.4. Fijacin del extendido.
- Fijar cada lmina, una vez seca, mediante dos o tres pasajes rpidos
sobre la llama del mechero con el extendido hacia arriba.














2.3. COLORACION (TECNICA DE ZIEHL NEELSEN)

La tcnica ms recomendada es la tincin de Ziehl Neelsen. Antes de su uso, todos
los colorantes y soluciones a emplearse deben ser previamente filtrados.
La forma de preparacin de los reactivos, as como los mdulos individuales se
muestran en los anexos 3, 4 Y 5.

20
2.3.1. Primer Paso: Coloracin de bacilos

- Colocar sobre el soporte de coloracin (alambre o varilla de vidrio) la serie
de lminas fijadas con el extendido hacia arriba, el nmero hacia el
operador y la varilla prxima al operador ligeramente ms alta que la otra.











- Cubrir la totalidad de la superficie del extendido con el colorante fucsina
bsica fenicada, filtrada en el momento de efectuar la tincin. No use
colorante sin filtrar












- Calentar suavemente con la llama del mechero de alcohol o un hisopo de
algodn humedecido en alcohol hasta la emisin de vapores, repetir el
proceso por tres veces, no debe hervir la preparacin. Si el volumen del
colorante disminuye por evaporacin, debe agregarse ms hasta cubrir
totalmente el extendido y dejar enfriar.
El tiempo mnimo de coloracin con fucsina es de 5 minutos.











21
- Eliminar la fucsina tomando la lmina por el extremo numerado, entre el
dedo pulgar y el ndice o con una pinza, inclinndola hacia adelante y
dejando caer agua corriente a baja presin sobre la parte que no tiene el
extendido.














2.3.2. Segundo Paso: Decoloracin

- Cubrir la totalidad de la superficie del extendido con la solucin de
alcohol cido durante dos minutos, hasta obtener una coloracin rosa
plido. De ser necesario decolorar nuevamente, efectuando movimientos
en vaivn de la lmina.















- Una vez eliminado el alcohol cido lavar nuevamente la lmina con agua a
baja presin, cuidando de no desprender la pelcula que form el
extendido.













22
2.3.3. Tercer Paso: Coloracin de fondo

- Cubrir la superficie del extendido con el colorante azul de metileno,
previamente filtrado, durante 30 segundos a un minuto.














- Eliminar el azul de metileno y lavar cada lmina con agua a baja presin,
por ambos lados (el que tiene el extendido, como el otro lado).









- Colocar las lminas coloreadas en orden numrico sobre el soporte de
madera y dejar secar al medio ambiente.
- Verificar la numeracin de la lmina antes de su observacin al
microscopio.
















23
2.4. OBSERVACION MICROSCOPICA DE LA MUESTRA COLOREADA

La observacin microscpica, tiene dos objetivos importantes:

a. Determinar si en el extendido hay Bacilos Acido Alcohol Resistentes (BAAR).
b. Establecer su nmero aproximado.

2.4. 1. Condiciones para la observacin de la muestra

- Para la observacin se debe emplear un microscopio que est en buenas
condiciones y cuente con el objetivo de inmersin 100x y un ocular de
10x. Antes de usar el objetivo de 100x, se debe colocar una gota de
aceite de inmersin sobre el extendido.









- Cada campo microscpico, se debe observar en superficie y en
profundidad, para lo cual se utilizar permanentemente el tomillo
micromtrico.















2.5. METODO DE LECTURA

- Los bacilos aparecern como bastoncitos delgados, ligeramente curvos, teidos
de rojo, generalmente con grnulos ms coloreados en su interior, aislados, en
parejas o en grupos sobre un fondo azul claro. (Foto 1).

- Es aconsejable seguir una pauta uniforme de observacin, avanzando de
izquierda a derecha del extendido, y observando un mnimo de 100 campos
24
tiles, lo que un laboratorista capacitado hace en aproximadamente 5 minutos. Se
considera campo microscpico til aquel en el cual se observa elementos
celulares de origen bronquial (leucocitos, fibras mucosas y clulas ciliadas). Los
campos en que no aparezcan dichos elementos no deben contabilizarse en la
lectura.











- El observador ir tomando nota del nmero de bacilos observados y del nmero
de campos microscpicos a observarse, que variar segn la cantidad de bacilos
que contenga la muestra.

- Si en una lmina se encuentra slo de 1 a 9 bacilos en 100 campos microscpicos
observados, debe ampliarse la lectura a otros 100 campos ms. Si persistiese el
resultado, realizar otro extendido de la misma muestra e informar lo encontrado y
solicitar nueva muestra.
























25
Al trmino de la lectura retirar la lmina de la platina del microscopio, limpiar el
aceite de inmersin de la lmina con tolueno y guardar la lmina. Limpiar el exceso
de aceite del objetivo de inmersin del microscopio con papel lente humedecido con
tolueno.
















2.6. INFORME DE RESULTADOS

Se recomienda la siguiente escala semicuantitativa:

- No se encuentran BAAR * en 100 campos microscpicos observados.
+ Menos de un BAAR por campo en 100 campos observados (de 10-99 BAAR).
++ Uno a 10 BAAR por campo, en 50 campos observados.
+++ Ms de 10 BAAR por campo en 20 campos observados.

2.7. ELIMINACION DE LOS MATERIALES CONTAMINADOS

- Los materiales contaminados (envases de esputo, aplicadores, papeles del rea
de trabajo) se deben recoger y colocar en recipientes metlicos para su
incineracin o esterilizacin en autoclave.

Limpiar bien toda la superficie de la mesa de trabajo con una solucin
desinfectante, dejndola secar con las ventanas abiertas

2.8. REUTILIZACION DE LAS LAMINAS USADAS

Las lminas con resultados negativos se hierven durante media hora en
solucin de detergente, luego se lavan con agua corriente, y se enjuagan con
agua destilada. Despus se secan con una toalla limpia y se procede a
seleccionar las lminas que no tienen rayaduras. Posteriormente se sumergen
en alcohol y se secan con una toalla limpia.


* BAAR: Bacilos Acido Alcohol Resistentes
26
2.9. REGISTRO DIARIO DE BACILOSCOPIAS

Los registros son medios prcticos para obtener informacin que ayudan en las
actividades de vigilancia, supervisin y evaluacin del Programa. Adems
ofrecen la informacin necesaria para preparar los informes mensuales y
trimestrales sobre deteccin y control de casos.

Una vez terminadas las lecturas, debe hacerse el registro diario de las
baciloscopas para su informe al Programa Nacional de Control de
Tuberculosis. Utilizar una numeracin correlativa anual (se empezar
anualmente el 2 de enero y terminar el 31 de diciembre del mismo ao, desde
el nmero 1 hasta el ltimo correspondiente).

El registro diario se lleva en un libro. El personal que realiza las baciloscopas
estar obligado bajo responsabilidad a llevar el registro diario de las
baciloscopas efectuadas y velar por la integridad y puesta al da de la
informacin. Cuando la muestra no sea de esputo o cuando se quiera
especificar el aspecto de la muestra, se har en la columna correspondiente.

La informacin mnima a registrarse se muestra en el Anexo 2.

2.10.INFORME BACILOSCOPICO MENSUAL Y TRIMESTRAL

El consolidado mensual (Anexo 7) y trimestral debe llenarse en hoja AdHoc
conforme lo establece el Manual de Normas y Procedimientos del Programa
Nacional de Control de Tuberculosis. As, por ejemplo, el tem diagnstico.
total, comprende el total de baciloscopas realizadas para el diagnstico. El
nmero de baciloscopas positivas, comprende el nmero real de baciloscopas,
considerando una baciloscopa positiva por paciente diagnosticado (Ejemplo: si
al paciente se le realiz dos baciloscopas que fueron positivas, deber
considerarse slo una en el informe).

2.11. CONSERVACION y LIMPIEZA DEL MICROSCOPIO

2.11.1. El microscopio es un equipo ptico de alta precisin y como tal debe
ser tratado con mucho cuidado tanto en el aspecto mecnico como
ptico.

2.11.2. La inspeccin del microscopio antes de su uso y la limpieza despus de
su uso son hbitos que contribuyen a la buena conservacin de este
equipo.

2.11.3. Las partes pticas y las lentes deben limpiarse cuidadosamente con un
trapo de lino fino o piel de gamuza que no desprenda pelusa. Nunca
debe friccionarse el papel o gamuza sobre la lente.

2.11.4. Se debe preservar el equipo de la humedad y el polvo ambiental para
evitar la formacin de hongos y el atascamiento de sus partes por
27
acumulacin de polvo y pelusas. El microscopio debe guardarse en su
estuche de proteccin (con una bolsa conteniendo no menos de 0,5 kg.
de Silicagel seco de color azul) lejos de la humedad y polvo.

En caso que el Silicagel se tome de color rosado cambiar por otro o
calentar hasta que se tome azul para su reutilizacin.

2.11.5. El personal de laboratorio nunca debe desarmar el microscopio para
realizar limpieza o reparacin. Este trabajo debe ser realizado por
personal especializado con la finalidad de garantizar que el equipo
mantenga su eficiencia y precisin.

2.11.6. La superficie exterior de los oculares debe limpiarse diariamente.
Recordar que tanto los prpados como las pestaas tienen grasa, y al
apoyarlos sobre los oculares, las lentes pueden ensuciarse. Para la
limpieza debe emplearse papel lente o un trozo de gamuza seca.

2.11.7. El objetivo de inmersin debe limpiarse despus de su uso con papel
especial para limpieza de lentes (Lens Cleaning llssue 105,10 x 15 cm)
humedecido con tolueno o bencina para eliminar el aceite de inmersin.
Por ningn motivo la lente de inmersin quedar sin limpiarse, caso
contrario el aceite se secara y ocasionara la inutilizacin del objetivo.

2.11.8. Utilizar alcohol etlico 95 para la limpieza de lentes de los oculares, filtro
y todos los elementos y lentes de condensador.

2.11.9. Para la limpieza diaria del microscopio se requiere disponer del siguiente
material:

- Trapo de lino fino.
- Papel lente o bien papel absorbente tipo pauelo descartable. Tambin una
piel de gamuza o trapo del tipo que no desprenda pelusa.
- Tolueno o bencina para limpiar los objetivos.
- Pequea pera de goma.
- Pincel fino.
- Una bolsa conteniendo no menos de 0,5 kg. de Silicage1.

2.11.10. Las partes del microscopio binocular se indican en la figura siguiente.










28
















































29
CAPITULO III

EL CULTIVO

3.1. ASPECTOS GENERALES E INDICACIONES DEL METODO DE
CULTIVO PARA MYCOBACTERlUM TUBERCUWSlS.

El cultivo es en la actualidad el mtodo bacteriolgico ms sensible y especfico
disponible para realizar el aislamiento y tipificacin de mycobacterias en
especial M. tuberculosis de una determinada muestra.

El cultivo se utilizar selectivamente con el siguiente orden de prioridades
(Anexo 8):

a) En el diagnstico difer~ncial de tuberculosis pulmonar de sintomticos
respiratorios con dos baciloscopas negativas y cuadro cInicoradiolgico
sugestivo de tuberculosis.

b) Diagnstico de la tuberculosis infantil con baciloscopa negativa.

c) Diagnstico de tuberculosis extrapulmonar.

d) Para estudio de sensibilidad a medicamentos antituberculosos en muestras
de pacientes con sospecha de fracaso del esquema nico de tratamiento por
persistencia o reaparicin de baciloscopia positiva de esputo al trmino del
quinto mes de tratamiento.

e) En pacientes HIV positivos/Sida.

f) En pacientes multitratados con persistencia de baciloscopia positiva.

g) En muestras pancitacilares de BK (1 a 9 BAAR en ms de 100 campos
microscpicos observados).

h) Para estudios epidemiolgicos de resistencia primaria y secundaria de M.
tuberculosis.

La programacin de materiales para cultivos de micobacterias se muestra en el
Anexo 6.

3.2. LA MUESTRA PARA EL CULTIVO

El procedimiento a seguir depende de la asepsia existente en la muestra, la que
depende de la forma de obtencin, pudiendo clasificarse en dos grupos:

a) Muestras obtenidas aspticamente.
b) Muestras obtenidas no aspticamente (contaminadas).
30
3.2.1. Procedimiento para muestras obtenidas asepticamente:
Las muestras obtenidas aspticamente, que recolectadas en un recipiente
estril pueden cultivarse prescindiendo del proceso de descontaminacin
incluyen a:

3.2.1.1 Muestras obtenidas por puncin: Lquido cefaloraquideo, pleural,
peritoneal y articulares. Si se cuenta con volmenes suficientes deben ser
centrifugadas y el sedimento se sembrar en varios tubos de cultivo, si la
cantidad de la muestra es pequea se sembrar toda la muestra.

3.2.1.2 Materiales de biopsia pleural, heptica y ganglionar: En estos casos el
operador (que debe trabajar protegido con una mascarilla) fraccionar el
material biolgico con instrumento quirrgico estril en un mortero de
porcelana previamente esterilizado. De ser necesario, agregar agua
destilada estril, hasta obtener una suspensin que puede ser inoculada
directamente en el medio de cultivo, siempre que cumpla las condiciones
de esterilidad, de lo contrario se descontaminar antes de sembrar.

3.2.2. Procedimiento a seguir para muestras contaminadas:

Las muestras contaminadas tales como: esputo, orina, contenido gstrico,
entre otras, deben ser descontaminadas antes del cultivo.

En caso de muestras de orina, la primera miccin de la maana es la
recomendada. Se sugiere cultivar por lo menos tres muestras seriadas.

Tanto para la muestra de orina como para el contenido gstrico, se
debern centrifugar el volumen total a 3,000 3,500 RPM. durante 20 a
30 minutos. Eliminar el sobrenadante. Descontaminar y sembrar el
sedimento.


















31




















3.3. CONSERVACION DE LA MUESTRA

Las muestras despus de su obtencin deben procesarse de inmediato. En el caso
de muestras de esputo, si el laboratorio no puede procesarlas el mismo da de su
recepcin, pueden conservarse en refrigeracin a 4C por no ms de una semana.

3.4. DESCONTAMINACION DE LA MUESTRA

La descontaminacin de las muestras se realiza con hidrxido de sodio (NaOH) al
4%, solucin acuosa estril.

La descontaminacin tiene por objeto: Eliminar la flora asociada a M.
tuberculosis, cuyos grmenes se multiplican ms rpido que el bacilo. Asimismo
sirve para homogenizar la muestra especialmente el esputo a fin de liberar al
bacilo del mucus, material celular y tejidos.

3.5. DESCONTAMINACION SIN CENTRIFUGACION Y EMPLEO DEL
MEDIO DE OGAWA ACIDIFICADO

3.5.1. PROCEDIMIENTOS

3.5.1.a. Colocar las muestras numeradas en orden creciente sobre la mesa de
trabajo, poner en una gradilla igual cantidad de tubos estriles
numerados con la misma secuencia de las muestras.

3.5.1.b. Trasvasar en cada tubo 1 mI. de muestra de esputo o de suspensin
obtenida por macerado y en caso de muestras centrifugadas emplear
todo el sedimento (flamear los bordes de los tubos al abrir y cerrar
32
las tapas).Agregar4 mI. de solucin estril de hidrxido de sodio (
NaOH) al 4 %.
3.5.l.c. Dejar a 37C por 20 minutos en estufa (o bao mara).

3.5.1.d. Retirar los tubos de la estufa o bao mara, homogenizar la muestra
con una pipeta e inocular 0.1 mI. (por tubo) en 2 tubos de medio de
Ogawa, y baar toda la superficie del medio.

3.5.1.e. Colocar los tubos en una bandeja de madera de fondo inclinado, e
incubar en estufa a 37C.
3.5.1.f. Despus de 48 horas revisar los tubos y ajustar las tapas, adems de
verificar si algn tubo est contaminado, alcalinizado (color .blanco
amarillento) o acidificado (color azul oscuro) por mala
neutralizacin de la muestra.

El desarrollo de colonias antes de 48 horas es indicativo de
contaminacin, algunas veces el medio se licua por accin de
grmenes proteolticos.

3.5. l .g. Revisiones posteriores se realizarn durante la incubacin, a los 7, 30
Y 60 das.

3.6. LECTURA
El desarrollo de M. tuberculosis generalmente aparece luego de 2 a 3 semanas.
Las colonias tpicas son de color crema, secas, rugosas de aspecto de coliflor.y de
borde irregular. (Fotos 2, 3 Y 4).

Si no se observan colonias en el tiempo antes mencionado se deja los cultivos
hasta las 8 semanas, antes de proceder a informar el resultado como negativo.

3.7. INFORME DE RESULTADOS DEL CULTIVO

Se recomienda la siguiente escala semicuantitativa.

- No se observan colonias.
N... Nmero total de colonias, si hay menos de 20.
+ De 20 a 100 colonias.
++ Colonias separadas ms de 100.
+++ Colonias confluentes (se observa desarrollo en toda la superficie del
medio).
c Cultivo contaminado.
Se debe realizar frotis y coloracin Ziehl-Neelsen de las colonias que no
tienen morfologa tpica. De observarse B.A.A.R.*, se enviar el cultivo
para su tipificacin al I.N.S.

3.8. ENVIO DEL CULTIVO AL LABORATORIO DE REFERENCIA DE
TUBERCULOSIS (ANEXO 8)

33
3.8. l. Objetivos del envo de cultivos al laboratorio referencial:
Las cepas se enviaran al Laboratorio de Referencia para:

* B.A.R.R.: Bacilos Acido Alcohol Resistente.
a) Realizacin de estudios de sensibilidad a medicamentos
antituberculosos.
b) Tipificacin de la Micobacterias.

3.8.2. De las condiciones del transporte de cultivos de BK:
Para el transporte de cultivos se debe tener en cuenta los siguientes
aspectos:

Proteger del calor excesivo Proteger de la luz solar.

Para el transporte de cultivos es conveniente sellar con esparadrapo las
tapas de los tubos, acondicionarlos en cajas de cartn resistente o de
madera, para evitar roturas y/o derrames. Indicar la posicin en que
deben mantenerse los cultivos.

Poner una etiqueta con la direccin correcta del Laboratorio de
Referencia de Tuberculosis-Instituto Nacional de Salud (Capac
Yupanqui 1400, J ess Mara, Lima).

3.9. REQUERIMIENTOS PARA LA PREPARACION DE MEDIO A BASE DE
HUEVO

3.9.l.a. Equipos, materiales y reactivos

3.9.1.a.1. Requerimientos para la preparacin de la solucin de sales.

- Balanza analtica.
- Esptula.
- Papel glacine.
- Erlenmeyer (500 mI), para preparar la solucin.
- Probeta (100 mi), para medir agua destilada, para la solucin de sales.
- Bao mara, para disolver la solucin de sales.
- Fosfato monopotsico (KH
2
PO
4
).
- Glutamato de sodio.
- Agua destilada.

3.9.l.a.2. Requerimientos para la preparacin de huevo homogenizado.

- Huevos frescos
- Algodn, para la limpieza de los huevos
- Baguetas o palillos, para homogenizar los huevos
- Gasa, para filtrar el huevo homogenizado (4 capas de gasa estril)
- Probeta (250 mi), para medir el huevo homogenizado
- Beaker (500 mI), para homogenizar los huevos
34
- Embudo, para filtrar el huevo homogenizado
- Beaker (100 mI), para verificar la calidad de los huevos
- Pipetas (10 mi), para adicionar glicerol y verde de malaquita al 2%
- Glicerol
- Verde de malaquita al 2%

3.9.1.a.3. Requerimientos para la distribucin de medio.

- Tubos de 20 x 125 mm. con tapa de rosca
- Dispensador de medio
- Gradilla

3.9.1.a.4. Requerimientos para la coagulacin y conservacin del medio

- Coagulador
- Bolsas de plstico para guardar los medios
- Refrigeradora

3.10. PREPARACION DEL MEDIO OGAWA

3.10.1. INGREDIENTES:

- Fosfato monopotsico (KH
2
PO
4
) 3g
- Glutamato de sodio 1g
- Agua destilada 100ml.
- Glicerol 6ml.
- Verde de malaquita 2% 6ml.
- Huevo homogenizado 200ml.


3.10.2 PROCEDIMIENTOS

3.10.2.1. Preparacin de Solucin de Sales:

Disolver en 100 ml. de agua destilada, el KH
2
P0
4
y el glutamato de sodio
y colocar en bao mara a 100C por 30 minutos o en autoclave a 121C
por 15 minutos.

3.10.2.2. Preparacin de Huevo Homogenizado:

Lavar los huevos con detergente y enjuagar con agua de cao, dejar secar
en una canastilla de alambre.

Limpiar los huevos con algodn embebido en alcohol al 70% y dejar secar.
Romper los huevos uno por uno y vertir en un vaso pequeo, para
comprobar si estn en buenas condiciones, de 10 contrario descartar y
cambiar de vaso.

35
Vaciar los huevos en un beaker y homogenizar con una bagueta o palillos
estriles, filtrar utilizando cuatro capas de gasa estril.

Adicionar 6 ml de Glicerol y 6 ml de verde de malaquita al 2% a la
solucin de sales enfriada a temperatura de ambiente y mezclar bien.

Agregar el huevo homogenizado lentamente por la pared del Erlenmeyer
evitando la formacin de burbujas.

Mezclar suavemente y dejar reposar por 30 minutos.

3.10.2.3. Distribucin del Medio:

Distribuir el medio en tubos de 20 x 125 mm, en una proporcin de 6 mI
por tubo, evitando la formacin de burbujas.

3.10.2.4. Coagulacin del Medio:

Colocar los tubos inclinados en el coagulador y dejar a 90C por una
hora (el coagulador debe haberse encendido previamente hasta lograr una
temperatura de 90C).

3.10.2.5. Conservacin del Medio:

Despus de la coagulacin, sacar los tubos y dejar enfriar. Luego guardar
en bolsas de plstico y cerrarlas hermticamente, anotando la fecha de
preparacin. Los medios pueden guardarse en el refrigerador hasta por
un mes.




















36
CAPITULO IV

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. CASAL, M. (1990). Microbiologa Clnica de las enfermedades por
Micobacterias: Facultad de Medicina, Universidad de Crdoba, Espaa: 19-42.

2. CEPANZO (1984). Manual de Normas y Procedimientos Tcnicos para la
Bacteriologa de la Tuberculosis OPS/OMS. Nota Tcnica N 26. Buenos Aires,
26 pp.

3. CEPANZO. (1985). Bacteriologa de la Tuberculosis. El Cultivo del
Mycobacterium tuberculosis. Comit Asesor OPS/OMS. Nota Tcnica N27.
Buenos Aires, 24 pp.

4. DE KANTOR, 1; BOLOGNA, H.; FERREIRAM. (1989).Algunos equipos
bsicos del Laboratorio de Bacteriologa: Descripcin, construccin y
mantenimiento. Cepanzo, OPS/OMS, Buenos Aires. Publicacin Especial
N9:1-7

5. DOMNGUEZ, L. (1983). Diagnstico de la Tuberculosis por el examen
microscpico del esputo. Bol. Instituto Nacional de Salud 1 (1): 4-7.

6. J APAN INTERNATIONAL COOPERATION AGENCY. (1985). Minimum
essentials of Laboratory Procedure for Tuberculosis Control. Tokyo, 96 pp.

7. DE KANTOR, 1. (1988). Bacteriologa de la Tuberculosis OPS/OMS. Serie de
Monografas Cientficas y Tcnicas N 11. Buenos Aires, 63 pp.

8. MINISTERIO DE SALUD DEL PERU. Programa Nacional de Control de la
Tuberculosis. (1991). Doctrina, Normas y Procedimientos para el Control de la
Tuberculosis en el Per. Lima: 17-25.

9. ORGANIZACION PANAMERICANA DE LA SALUD. (1979). Control de
Tuberculosis en Amrica Latina: Manual de Normas y Procedimientos para
Programas Integrados. Publicacin Cientfica N 376, : 20-21.

10. ORGANIZACION PANAMERICANA DE LA SALUD. (1987). Bacteriologa
de la Tuberculosis. La Organizacin de los Laboratorios, Medidas de
Bioseguridad. Comit Asesor OPS/OMS. Nota Tcnica N 29, 39 pp.







37




















ANEXOS



























38
















































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INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD

ANEXO 1
INSTRUCTIVO SOLICITUD PARA INVESTIGACION
BACTERIOLOGICA EN TUBERCULOSIS

1. Escribir el nombre de la Regin y/o sub regin y el establecimiento de Salud.

2. Filiacin del paciente: Anotar apellidos y nombres, edad, sexo, historia clnica o fichafamiliar.

3. Marcar con aspa (x) el tipo de muestra. Si es otra diferente a Esputo, mencionar en la lnea
punteada.

4. Antecedentes de tratamiento: Al momento de la identificacin del sintomtico respiratorio
interrogar al paciente si en una anterior oportunidad ha recibido medicamentos antituberculosos y
durante cuanto tiempo (anotar Observaciones).

l. Nunca Tratado: Marca con aspa (x) si no recibi tratamiento en una anterior oportunidad
(virgen al tratamiento).
2. Antes Tratado: Marca con aspa (x) en la categora RECAIDA si el sintomtico respiratorio
identificado recibi un tratamiento completo exitoso (curado) y existe la
sospecha de recada, al solicitar la baciloscopa o en la categora
ABANDONO si el paciente no concurri a recibir tratamiento previo por
ms de 30 das consecutivos.

5. Para diagnsco.- Se consideran dos categoras de diagnstico:
- Sintomtico respiratorio (SR), persona que tiene tos y expectoracin por ms de 15das.
- Rx. Anormal, persona que presenta radiografa de pulmones con imagen sospechosa de
TBC y con muestras de esputo iniciales negativas, debiendo ser cultivada para investigar
Mycobacterias. Ambas categoras son excluyentes.
1ra. M (Primera Muestra) 2da. M (Segunda Muestra)

6. Para control de.- Marcar con aspa (x) el mes de tratamiento actual. En caso de retratamiento,
anotar en la lnea punteada el mes correspondiente.

7. N de caso.- Es el mismo nmero de orden que encontrar en el Libro de Registro y Seguimiento
de Pacientes, para aquellos que estn en tratamiento.

8. Escribir el nombre de la persona y fecha en que solicita la baciloscopa.

RESULTADOS:
- Se marcar en los casilleros correspondientes el resultado: si es Positivo marcar el nmero
de cruces (+) (++) (+++) con tinta roja y Negativa (-) con tinta azul o negra, anotando el
N de Registro que es el mismo N de Orden del Libro de Registro de Muestras para
Investigacin Bacteriolgica enTuberculosis y la fecha correspondiente, tanto para el caso
de baciloscopa como para Cultivo.
- Escribir el nombre del laboratorio y la fecha en que se procesa la muestra.

OBSERVACIONES.- Anotar comentarios y sugerencias, como por ejemplo: Tiempo de tratamiento
anterior recibido: Indicacin de cultivo para casos especiales y otros.





40


























































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42
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD

ANEXO 3

PREPARACION DE LOS REACTIVOS PARA BACILOSCOPIA

1. Para preparar un litro de fucsina fenicada se necesitan 3 g. de fucsina bsica y
100 ml. de alcohol de 95. Se disuelve por agitacin y se agregan 55 ml. de
fenol acuoso. Se agita y se agrega agua destilada hasta completar un litro. Se
deja reposar 24 horas y se filtra (el fenol acuosos se prepara agregando a 100 g.
de fenol cristalizado, 10 ml. de agua destilada. Se calienta en bao mara hasta
la completa disolucin y se enfra. El fenol acuoso se mantiene lquido).

2. Para preparar un litro de azul de metileno se emplea 1 g. de azul de metileno y
100 ml. de alcohol de 95. Se disuelve por agitacin y se agrega agua destilada
hasta completar un litro. Se deja reposar 24 horas y se filtra antes de usar.

3. Para preparar un litro de solucin decolorante se requiere 30 ml. de cido
clorhdrico para anlisis y 970 ml. de alcohol de 95. Con la pipeta se deja
escurrir el cido clorhdrico por las paredes del matraz, que contiene el alcohol,
y se agita suavemente.

4. Cada vez que las soluciones colorantes sean trasvasadas a los pequeos frascos
cuentagotas que se emplean para la tincin, deben filtrarse; esto es
especialmente necesario para la fucsina fenicada, porque con el tiempo se
forman pequeos cristales que son causas de error al hacer la lectura de las
lminas. Los frascos cuentagotas y sus tapas deben ser lavados con todo cuidado
cada vez que se renueve su contenido.

5. Conservacin: Los reactivos deben conservarse en frascos de color mbar. Se
recomienda preparar los colorantes en cantidades para un consumo no mayor de
un mes.















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45
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD

INSTRUCTIVO ANEXO 5

PARAMETROS PARA LA PROGRAMACION DEL MODULO INDIVIDUAL

La Programacin por Mdulo Individual para el PeT, debe realizarse todos los
aos en el mes de J ulio, en la primera quincena e inmediatamente despus remitir al
nivel correspondiente para su consolidacin.

I. ATENDIDOS:

Enfermos con Tuberculosis (E), programar segn la prevalencia local por 100
habitantes y con el too% de la poblacin.

II. ATENCIONES:

Baciloscopas de Diagnstico, 15 por enfermo y 3 de control.

III. INSTRUMENTOS:

Horas Baciloscopista. Rendimiento 5 baciloscopas por hora.


IV. NECESIDADES DE LABORATORIO PARA BACILOSCOPIAS:

1. Envases para esputo, se requiere 18 por enfermo o 1.5 por S.R.
2. Aplicadores de madera, en promedio 5 por enfermo.
3. Lminas portaobjeto: 10 lminas por enfermo, considerando que el 40% se
rompen, rayan o son positivos.
4. Aceite de inmersin, se requiere 0.36 cc. por enfermo o por cada 10 S.R.
5. Fucsina bsica, se requiere 0.10 gr. por enfermo o por 10 S.R.
6. Fenol cristalizado: 1.98 gr. por enfermo o por cada 10 S.R.
7. Alcohol 95, 78.84 cc. por enfermo o por cada 10 S.R.
8. Acido Clorhdrico, 2.16 cc. por enfermo o por cada 10 S.R
9. Azul de Metileno 0.05 gr. por enfermo o por cada 10 S.R.






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INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD

ANEXO 6

PROGRAMACION DE MATERIAL PARA CULTIVOS DE
MICOBACTERIAS

El fortalecimiento de la Red de Laboratorios a nivel nacional con equipos para
el procesamiento de cultivos de Mycobacterium tuberculosis, ha permitido ampliar
la cobertura <1" atencin en los Laboratorios de nivel Intermedio; motivo por el
cual se ha creado un instrumento que permitir a cada laboratorio realizar la
programacin de material para cultivos de mycobacterias correspondiente al
prximo ao, el cual debe ser remitido a la Direccin del Programa de Control de
Tuberculosis a ms tardar el 15 de enero de cada ao, para tal fin se emite la
presente directiva.

MATERIAL PARA 01 CULTIVO CON EL METODO OGAWA

REACTIVOS:
Hidrxido de sodio (NaOH) al 4% : : 0.16g para 4ml.de NaOH al 4%
Glutamato Monosdico : 0.02 g
Fosfato Monopotsico (KHlO.) : 0.06 g
Glicerina : 0.12 ml
Verde Malaquita : 0.0024g
Agua destilada : 2 ml
Huevos de gallina : 4 ml (01 huevo para 10 cultivo
Fenolal5% : 05 ml (01 litros de fenol
Cristalizados da 20 litros
de fenol 5%)

INSTRUMENTAL:

Tubo de vidrio con tapa rosca (25 x 150 mm.)
Tubo de vidrio con tapa rosca (20 x 125 mm.)
Pipeta Pasteur x 6mm. de dimetro por 20 cm. de largo
Bandejas de aluminio 40 x 30 cm. Bombilla de jebe para pipetas











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49
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD

ANEXO 8

DIRECTIVA N 001-95

PRUEBA DE SENSIBILIDAD DE Mycobacterium tuberculosis A LOS
MEDICAMENTOS ANTITUBERCULOSOS

I. INDICACIONES PARA EJECUCION DE LA PRUEBA DE SENSIBILIDAD

Estos estudios se indican en los siguientes casos*:

1) Cultivo positivo obtenido de muestras de pacientes al trmino del quinto
mes de tratamiento con el Esquema Unico.

2) Cultivo positivo obtenido de muestras de pacientes en retratarniento.

3) Cultivo positivo obtenido de muestras de pacientes multitratados.

4) Cultivo positivo obtenido de muestras de pacientes HIV Positivos/Sida.

5) Para estudios epidemiolgicos de resistencia inicial y adquirida del
Mycobacterium tuberculosis. a los medicamentos antituberculosos.

6) Para otros estudios de investigacin operacional.

II. REQUERIMIENTOS PARA ENVIO DE CULTIVOS AL
LABORATORIO NACIONAL DE REFERENCIA DE
TUBERCULOSIS (I.N.S. - LIMA)

Los cultivos deben cumplir con los siguientes requisitos:

1) Estas acompaados de sus respectivas fichas debidamente llenadas
(Anexo 1)

2) Tener anotado en el tubo un nmero de identificacin y la fecha de la
siembra.

3) No tener menos de 30 ni ms de 60 das contados a partir de la fecha de
siembra.

4) El nmero de colonias por tubo no deber ser menor de 10 colonias
claramente diferenciadas.

_________________________________________
* Las indicaciones han sido tomadas y adaptadas de las Directivas 001-94-INS y 014-94
PCT.
50
5) El medio no deber estar alcalinizado (color amarillo), acidificado (color
azulino) ni contaminado con hongos.

6) El tubo de cultivo no deber contener lquido ni el medio licuado.

7) Los tubos de cultivo debern estar sellados con cinta adhesiva para asegurar
el cierre hermtico.

8) Los tubos de cultivo deben enviarse en cajas de material resistente
debidamente acondicionados para evitar la rotura de los tubos. Se indicar
con flecha la posicin en que debe mantenerse la caja.

9) Anotar la direccin del Laboratorio Referencia\.

Laboratorio Nacional de Referencia de Thberculosis
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Capac Yupanqui
1400, Jess Mara, Lima, Per

10) SE RECOMIENDA la utilizacin de tubos con tapa de rosca, que permiten
el cierre hermtico.




























51
PUBLICACIONES DEL INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

SERIE DE INFORMES TECNICOS

CARRILLO, C; AGU/LAR D.,J.; ZAVALETA, A.; ESPINOZA A, A.; GALVAN, H;
HIGUCHI O., E. Y HUAPAYA C,B. (Eds). (1991). Reunin Tcnica de la Red
Metropolitana de Laboratorios de Clera (13-14 de mayo de
1991). Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud. Red Nacional Integrada y
Regionalizada de Laboratorios de Salud. Serie de Informes Tcnicos N 2. Lima,
Ediciones Tcnicas y Cientficas. 80 pgs. .

SERIE DE NORMAS TECNICAS

CARRILLO, C; BRAVO, N; AGU/LAR O.,J.; GU/LLEN, A.; YI CHU, A. (1991).
Manual de Laboratorio de Clera. Procedimientos para el diagnstico de
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OTRAS PUBLICACIONES

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ANOTACIONES

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en mayo de 1995 en los
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