Resumen: E-072

UNI V E RS I D AD N ACI ON AL DE L NORDE S T E

Co mu n i c a c i o n e s Ci e n t f i c a s y T e c n o l g i c a s 2 0 0 4
Modelo dinmico para el crecimientro de bacterias lcticas
sobre emulsiones crnicas

Cayr, Mara E.
1
- Vignolo, Graciela
2
- Garro, Oscar
1


1.Facultad de Agroindustrias, UNNE. Cte Fernndez 755 (3700)- Senz Pea, Chaco.
e-mail: ecayre@fai.unne.edu.ar
2.CERELA CONICET, Chacabuco 145 (3400), Tucumn.


ANTECEDENTES
El crecimiento microbiano en los alimentos est gobernado por la accin simultnea de diferentes factores fsicos y
qumicos limitantes, la capacidad de sobrevivir e iniciar el crecimiento de cada tipo de microorganismo se ve influida
por la accin conjunta de los mismos. Por este motivo resulta difcil evaluar la respuesta microbiolgica en sistemas
reales y complejos como son los alimentos.
La microbiologa predictiva de alimentos, de gran crecimiento en los ltimos aos, constituye un enfoque
interdisciplinario en el que se conjugan la microbiologa, la matemtica, la estadstica y la tecnologa de alimentos, con
el objeto de describir, por medio de ecuaciones matemticas, el comportamiento de los microorganismos frente a
combinaciones de condiciones ambientales definidas y controladas. De esta capacidad de describir, surge la posibilidad
de predecir la respuesta fisiolgica de los microorganismos sobre la base de parmetros fsico-qumicos relevantes.
En la actualidad existen muchos modelos matemticos que permiten predecir el crecimiento de un amplio rango de
microorganismos patgenos y alteradores de alimentos bajo distintas combinaciones de factores ambientales,
intrnsecos y extrnsecos. El modelado matemtico es realizado, generalmente, asumiendo condiciones constantes para
determinar los valores de los parmetros cinticos de crecimiento. Varios de estos modelos muestran el efecto de la
temperatura sobre los parmetros cinticos de crecimiento de distintos microorganismos y han sido construidos sobre la
suposicin de que la temperatura se mantiene constante en el tiempo (Gianuzzi, et al., 1998; Devlieghere et al., 1998,
Aggelis et al., 1998, Augustin and Carlier, 2000).
Sin embargo, condiciones tales como temperatura, pH o composicin de la atmsfera gaseosa no se mantienen
constantes durante el almacenamiento refrigerado de los alimentos (Labuza and Taoukis, 1992). Debido a este hecho, en
la actualidad el modelado matemtico est orientado a la obtencin de modelos dinmicos, es decir, modelos que
permitan predecir la seguridad o vida til de los alimentos bajo condiciones fluctuantes. Uno de los factores que ms
flucta es la temperatura de almacenamiento y es el ms investigado (Fu et.al., 1991; Dickson et.al.,1992; Li and
Torres, 1993; Roos and McMeekin, 1994; Baranyi et.al., 1995; Van Impe et.al., 1995; Sovoleva et.al., 2001).
Por lo tanto, para que los modelos puedan ser aplicables a alimentos almacenados en condiciones reales, es decir, en
condiciones donde la temperatura u otros factores cambian con el tiempo es necesario considerar, dentro del modelo, el
efecto de los cambios de las variables externas sobre el crecimiento microbiano a fin de obtener predicciones ms
precisas en cuanto a la inocuidad y vida til de los mismos.
El objetivo del presente trabajo fue generar los datos necesarios para la construccin de un modelo dinmico y
proponer un modelo dinmico que permita analizar la influencia de las fluctuaciones de la temperatura de
almacenamiento sobre el crecimiento de bacterias lcticas en emulsiones crnicas cocidas.

MATERIALES Y MTODOS
a-Muestras y Ensayos Microbiolgicos
Se utilizaron muestras de emulsiones crnicas cocidas (salchichas) suministradas por una industria local las cuales
fueron envasadas al vaco en pelcula plstica con permeabilidad al oxgeno de 70 cm
3
/m
2
/24h/1atm usando
envasadora RAPI-VAC S-750 y almacenadas bajo condiciones estticas a 0, 8 y 15 C durante 60 das. Peridicamente
se tomaron muestras a partir de las cuales se determin el nmero de Unidades Formadoras de Colonias por gramo
(UFC / g) de bacterias lcticas por siembra sobre agar MRS. Los ensayos se realizaron por triplicado.
b- Modelado del crecimiento microbiano en funcin del Tiempo
Las curvas de crecimiento a cada temperatura se generaron por ajuste de los datos experimentales a la ecuacin
modificada de Gompertz (Zweitering et al., 1990) cuya expresin matemtica es:

( ) ( ) ( )

+ = = 1
*
exp exp * exp exp * t
A
e
A ct b a y
max

(1)

Donde
0
log
N
N
y = , con N
0
= Nmero de microorganismos al tiempo t=0 y, N = nmero de microorganismos al tiempo t=t
A a = = mxima poblacin alcanzada (2)
Resumen: E-072
UNI V E RS I D AD N ACI ON AL DE L NORDE S T E
Co mu n i c a c i o n e s Ci e n t f i c a s y T e c n o l g i c a s 2 0 0 4
A
e
c
max

= ,con
max
= mxima velocidad especfica de crecimiento [das
-1
] y, e = exp(1) (3)
1 + =

A
e
b
max
, con = tiempo de latencia [das] (4)

c- Modelado del Crecimiento Microbiano en funcin de la Temperatura
Los valores de
max
obtenidos a cada temperatura fueron ajustados al modelo de raz cuadrada (Ratkowsky et.al., 1982)
cuya expresin es:

) ( *
min max
T T m = (5)
donde T
min
es la temperatura mnima terica para el crecimiento, T es la temperatura de almacenamiento en C y m es un
parmetro.
Para modelar el efecto de la temperatura sobre el tiempo de latencia se utiliz la siguiente ecuacin:

( ) T q p * ln + = (6)
donde p y q son parmetros a ser estimados y T es la temperatura de almacenamiento en C.

d- Modelo Dinmico para el Crecimiento Microbiano
Se utiliz la metodologa propuesta por Van Impe et.al . (1995). De acuerdo a esta metodologa derivando la ecuacin
(1) se obtiene:

( ) ( ) ( ) ( ) ( )( ) c ct b ct b a
dt
dy
= exp exp exp

=
y
a
cy
dt
dy
ln (7)
Con el objeto de solucionar los inconvenientes presentados por la ausencia del parmetro b en la expresin (7) y el
problema numrico al considerar como condicin inicial para la integracin el valor y=0, los autores definieron la
siguiente variable:

( )
0
ln
) ln(
N n y
N n
=
=

dt
dn
dt
dy
=
( )

=
0
0
ln
n n
a
n n c
dt
dn
(8)
Usando como condicin inicial: ( ) ( ) ( ) b a n t n exp exp 0
0
+ = =
De esta manera y considerando las expresiones (2), (3), (4), (5) y (6) la ecuacin diferencial (8) permite analizar el
comportamiento de la poblacin microbiana bajo condiciones de temperatura variable.

e- Mtodos Estadsticos y Numricos
Los datos experimentales se ajustaron a los modelos utilizando el mtodo de mnimos cuadrados y algoritmo
Marquardt para regresin lineal y no lineal respectivamente usando STATGRAPHICS

Plus version 4.0. Los valores

residuales se analizaron a fin de determinar si se cumplen las hiptesis estadsticas que permiten el uso correcto de
modelos.
Se utiliz anlisis de varianza (ANOVA) y Test de Tukey para determinar la significancia de la influencia de la
temperatura sobre los parmetros cinticos de crecimiento.
La integracin de la ecuacin diferencial (8) se realiz con el mtodo de Runge-Kutta usando Matlab

Versin 5.3.

RESULTADOS Y DISCUSIN

El crecimiento de bacterias lcticas sobre emulsiones crnicas cocidas envasadas al vaco y almacenadas a 0, 8 y 15C
fue monitoreado durante un perodo de 60 das. Los recuentos obtenidos fueron usados para estimar el tiempo de
latencia y la velocidad mxima de crecimiento por ajuste de los valores experimentales a la ecuacin (1). En todos los
casos, el modelo explic un alto porcentaje de la variacin de los recuentos con el tiempo (0,96 R
2
0,99).
Resumen: E-072
UNI V E RS I D AD N ACI ON AL DE L NORDE S T E
Co mu n i c a c i o n e s Ci e n t f i c a s y T e c n o l g i c a s 2 0 0 4
El anlisis de varianza mostr una significativa influencia (Pv<0,05) de la temperatura de almacenamiento sobre los
parmetros cinticos. Cuanto mayor es la temperatura, mayor es la velocidad mxima de crecimiento y menor el tiempo
de latencia del grupo de bacterias lcticas.
En la Figura 1 (a) y (b) se muestra el ajuste de los parmetros cinticos de crecimiento
max
y a las ecuaciones (5) y
(6) respectivamente. En ambos casos, los modelos fueron estadsticamente adecuados para describir los datos.
Figura 1. Efecto de la temperatura de almacenamiento sobre los parmetros cinticos
max
(a) y (b) estimados para
bacterias lcticas creciendo en emulsiones crnicas cocidas envasadas al vaco.

Por combinacin de las ecuaciones (5) y (6) con la (1) se obtiene un modelo explcito que permite obtener, para
cualquier temperatura entre 0 y 15C, una curva de crecimiento. Sin embargo, los valores predichos por este modelo
slo son vlidos cuando la temperatura es mantenida en un valor constante. El modelo no es aplicable bajo condiciones
de temperatura variable puesto que provoca discontinuidades en la curva de crecimiento que biolgicamente no son
posibles (Van Impe et.al., 1995). Esta situacin est ejemplificada en los resultados de la simulacin presentados en la
Figura 2. Para la simulacin se usaron los datos obtenidos en los ensayos bajo condiciones isotrmicas y un perfil de
temperatura variando en el tiempo entre 0 y 8C y luego regresa a 0C.















Figura 2. Predicciones del modelo explcito y dinmico para el crecimiento de bacterias lcticas sobre emulsiones
crnicas cocidas bajo condiciones no isotrmicas.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
0 5 10 15
Temperatura (C)
(

m
a
x
)
^
1
/
2
-1
-0,5
0
0,5
1
1,5
0 5 10 15
Temperatura (C)
l
n
(

)
m= 0,062
T
min
=-6,7
R
2
=0,97
p= 1,04
q=-0,11
R
2
=0,95
0 10 20 30 40 50 60 70
0
2
4
6
8
l
o
g
(
N
/
N
o
)
0 10 20 30 40 50 60
0
2
4
6
8
T

(

C
)
tiempo (dias)
Resumen: E-072
UNI V E RS I D AD N ACI ON AL DE L NORDE S T E
Co mu n i c a c i o n e s Ci e n t f i c a s y T e c n o l g i c a s 2 0 0 4
Curvas de crecimiento predichas por el modelo explcito a temperatura constante de 0 y 8C (), Predicciones del
modelo explcito() y dinmico (-- --) para el perfil tiempo- temperatura propuesto.

En la figura puede observarse que cuando la temperatura cambia el modelo explcito predice un cambio instantneo en
el tamao de la poblacin lo cual evidencia que este modelo no puede explicar de forma adecuada los cambios en la
poblacin microbiana cuando la temperatura cambia en el tiempo. Por ejemplo cuando pasa de 0 a 8C el modelo pasa
al valor que le correspondera como si hubiese permanecido todo el tiempo a 8C y sigue la curva de esa temperatura.
Y cuando la temperatura regresa al valor inicial de 0C , el modelo predice una disminucin del nmero de clulas al
valor que debera tener si hubiese permanecido todo el tiempo a 0C. Este comportamiento claramente no se condice
con la realidad, ya que los microorganismos formados no pueden aparecer y desaparecer en un instante de tiempo.
La curva predicha por el modelo dinmico (Fig. 2), integrado por mtodos numricos, si tiene un comportamiento que
se condice con la realidad prctica: ante un aumento de temperatura , se puede observar un aumento en la velocidad de
crecimiento y viceversa, cuando la temperatura disminuye se verifica una disminucin de la velocidad de crecimiento.
Es decir en todo el intervalo considerado el nmero de microorganismos es una funcin continua del tiempo.
En conclusin el modelo dinmico utilizado responde en forma realstica porque tiene en cuenta la historia previa de la
poblacin que se est modelando.


REFERENCIAS

Aggelis, G., Samelis, J. and Metaxopoulos, J. (1998). A novel modeling approach for predicting microbial growth in
a raw cured meat product stored at 3C and at 12C in air. Int. J. Food Microbiol. 43: 39-52.
Augustin, J.C. and Carlier, V. (2000) Modelling the growth rate of Listeria monocytogenes with a multiplicative
type model including interactions between environmental factors. Int. J. Food Microbiol. 56:53-70.
Baranyi, J., Robinson, T.P., Kaloti, A. and Mackey, B.M. (1995). Predicting growth of brochotrix thermosphacta at
changing temperature. Int. J. Food Microbiol. 27: 61-75.
Devlirghere, F., Debevere, J. and Van Impe, J. (1998) Effect of dissolved carbon dioxide and temperature on the
growth of lactobacillus sake in modified atmosphere. Int. J. Food Microbiol. 41:231-238.
Dickson, J.S., Siragusa, G.R. and Wray, J.E. Jr. (1992) predicting the growth of Salmonella typhimirium of beef by
using the temperature function integration technique. Appl. Environ. Mocrobiol. 58: 3482-3494.
Fu, B., Taoukis, P.S. and Labuza, T. (1991) Predictive microbiology for spoilage of dairy products with time-
temperature integrators. J. Food Sci. 56: 1209-1215.
Giannuzzi, L., Pinotti, A. and Zaritzky, N. (1998) Mathematical modeling of microbial growth in packaged
refrigerated beef stored at different temperatures. Int. J. Food Microbiol. 39: 101-110.
Labuza, T.P., Fu, B. And Taoukis, P. (1992) Prediction for shelf life and safety of minimally processed CAP/ MAP
chilled foods: a review. J. Food Prot., 55-74.
Li, K.Y. and Torres, J.A. (1993) Microbial growth estimation in liquid media exposed to temperature fluctuations. J.
Food Sci. 58:644-648.
Ratkowsky, D.A., Olley, J, McMeekin, T.A. and Ball, A. (1982) relationship betwen temperature and growth rate of
bacterial cultures. J. Bacteriol.149:1-5.
Roos, T. and McMeekin, T.A. (1994) Predictive microbiology. Int. J. Food Microbiol. 23: 241-246.
Sovoleva, T.K., Filippov, A.E., Pleasants, A.B., Jones, R.J. and Dykes, G.A. (2001) Stochastics modeling of the
growth of a microbial population under changing temeparture regimes. Int. J. Food Microbiol. 64: 317-323
Van Impe, J.F., Nicola, B.M., Schellekens, M., Martens, T. and De Baerdemaeker, J. (1995) Predictive
microbiology ina dynamic envionment: a system theory approach. Int.J.Food Microbiol. 25:227-249.
Zwietering, M.H., Jongen Burger, I., Rombouts, F.M., vant Riet, K. (1990) Modeling of the bacterial growth curve.
Appl. Environ. Microbiol. 56: 1875-1881.